Jhon Alexander Bello Sergio Alejandro Daz Oscar Andrs Jaimes Oscar Javier Larrotta FERMENTACION ACETICA Objetivos

Elaborar cido actico a nivel de laboratorio, mediante fermentacin tipo feed-batch, a partir de vino de pia, aprovechando la maquinaria metablica de Acetobacter sp y Gluconobacter sp. Analizar la cintica de crecimiento de las bacterias durante el tiempo de duracin de la fermentacin y conocer los factores que intervienen en el desarrollo de estos microorganismos. Comprender la importancia de la medicin y control de variables como pH, concentracin del sustrato y del metabolito, recuento celular y acidez, durante todo el experimento. Entender el funcionamiento de un biorreactor y los parmetros bsicos que se deben tener en cuenta para la fabricacin del mismo. Caracterizar el vinagre evaluando caractersticas qumicas y organolpticas del producto obtenido. Introduccin El cido actico tambin conocido como cido metilencarboxlico, se puede encontrar en forma de ion acetato. ste es un cido que se encuentra en el vinagre, siendo el principal responsable de su sabor y olor agrios. El vinagre es definido como un lquido ajustado para el consumo humano, producido por materias primas de origen agrcola, que contienen almidn y azcares, por un proceso de doble fermentacin (alcohlica y actica) y conteniendo una cantidad especfica de cido actico. Es utilizado como sustrato, en su forma activada, en reacciones catalizadas por las enzimas conocidas como acetiltransferasas, y en concreto histona acetiltransferasas. El cido actico actualmente es producido por sntesis y por fermentacin bacteriana. Hoy en da, la ruta biolgica proporciona cerca del 10% de la produccin mundial, pero sigue siendo importante en la produccin del vinagre, dado que las leyes mundiales de pureza de alimentos estipulan que el vinagre para uso en alimentos debe ser de origen biolgico. El cido actico tiene diversas aplicaciones en una gran variedad de campos de la industria como la apicultura, la industria qumica, equivale biotecnologa, los campos de la medicina y en la industria alimentos. Desde sus inicios el cido actico, en la forma de vinagre, ha sido preparado por bacterias del gnero Acetobacter. En presencia de suficiente oxgeno, estas bacterias pueden producir vinagre a partir de una amplia variedad de alimentos alcohlicos. El mtodo de como una solucin diluida de alcohol, inoculada con Acetobacter y mantenida en un lugar clido y aireado se har vinagre en el transcurso de algunos meses, ha sido mejorado industrialmente en donde sistemas alimentados aceleran este proceso al implementar suministro de oxgeno a las bacterias.

Pensamiento Continuo El cido actico es un producto que se obtiene despus de 2 etapas de fermentacin, en la primera fase se logra una fermentacin alcohlica en este caso de la pia a la cual se le agrego azcar y que es trasformada en alcohol en ausencia de oxigeno; en la segunda etapa se logra una fermentacin en la que el alcohol e oxidado y trasformado en cido actico en presencia de oxgeno. Eliminacin de la levadura Una vez finalizada la fermentacin alcohlica, el jugo se deja en reposo y se le agrega gelatina sin sabor para flocular la levadura y as poder separar el lquido alcohlico. Fermentacin Actica Esta fermentacin es la trasformacin del etanol, producido anteriormente en cido actico y agua, esta fermentacin se puede llevar a cobo por diferentes bacterias y microorganismos pero se emplea generalmente las bacterias del genero Acetobacter que se caracterizan por producir este metabolito, la temperatura optima y el pH es de 30C y entre 5,4 y 6,3 respectivamente. La fermentacin se puede iniciar inoculando cierta cantidad de bacterias acticas al medio o adicionando una cantidad de vinagre ya preparado y sin pasteurizar. Determinacin de Alcohol Durante el desarrollo de la actividad se tuvo que evaluar la cantidad de alcohol presente en el reactor, esto con el fin de determinar si la bacteria estaba oxidando el etanol presente, para esto usamos un densmetro, es un instrumento que sirve para determinar la densidad relativa de los lquidos sin tener que calcular antes la masa y el volumen. Normalmente est hecho de vidrio y consiste en un cilindro y un bulbo pesado para que flote derecho. El lquido se vierte en una jarra alta, y el hidrmetro se baja gradualmente hasta que flote libremente. El alcoholmetro tiene 3 escalas: Una escala mide la gravedad especfica, que indica la relacin entre gramo/mililitro o kilogramo/kilolitro de la solucin. La segunda escala mide el por ciento en volumen de alcohol potencial en la solucin. La tercera escala, sacarmetro, indica la cantidad de azcar en por ciento, en peso de la solucin. Determinacin de pH La determinacin de pH consiste en medir el potencial que se desarrolla a travs de una fina membrana de vidrio que separa dos soluciones con diferente concentracin de protones. En consecuencia se conoce muy bien la sensibilidad y la selectividad de las membranas de vidrio delante el pH.

Una celda para la medida de pH consiste en un par de electrodos, uno de calomel (mercurio, cloruro de mercurio) y otro de vidrio, sumergidos en la disolucin de la que queremos medir el pH.La varita de soporte del electrodo es de vidrio comn y no es conductor, mientras que el bulbo sensible, que es el extremo sensible del electrodo, esta formado por un vidrio polarizable (vidrio sensible de pH]). Materiales Recipiente de 10 litros, adaptado con llave de toma de muestras Vino o alcohol rebajados a 5-7% Bomba de recirculacin Fosfato diamnico libre de arsnico o urea Lecho fijo para reactor aerobio Aspersores Cepa de Acetobacter sp y Gluconobacter sp pHmetro Alcoholmetro Gay Lussac 15C Bureta de 25ml Soporte y pinza de bureta 2 Vasos de precipitados de 250ml 2 Vasos de precipitados de 100ml NaOH, 0,1N Fenolftaleina Microscopio Equipo de filtracin por membrana Filtros de 0,8m Balanza Probetas de 100ml Probetas de 250ml Benceno o tolueno Embudo de separacin

Pensamiento Estructural Semana 1

Acondicinami ento del bioreactor

Limpieza del bioreactor

Realizacin de clculos y formulacin de medio de cultivo

Semana 2

Instalacin de los accesorios.

Tapar el recipiente evitando fugaz

Adicionar la cepa e Iniciar la fermentacin

Realizar las primeras mediciones respectivas (pH, Acidez, densidad ptica)

Se deja realizar la fermentacin por 15 das.

Semana 3

Interrupcin de la fermentacin

Recuperacin del producto

Registrar y analizar los datos

Pensamiento Cientfico Hiptesis nula: No se logr obtener vinagre con buenas caractersticas durante el proceso fermentativo, debido a que las cepas usadas Acetobacter sp y Gluconobacter sp, posiblemente fueron afectadas por cambios abruptos en las condiciones fisicoqumicas del medio. Adems, la contaminacin con otros microorganismos impidi que los microorganismos expresaran toda su capacidad metablica de forma ptima durante el periodo de fermentacin por ende se vio perturbada la cintica de crecimiento y el rendimiento en cuanto al producto. Hiptesis alternativa: Las cepas usadas para el proceso fermentativo son ampliamente recomendadas por la literatura, para el desarrollo de procesos de obtencin de cido actico; stas mostraron una cintica de crecimiento adecuada durante todo el proceso, que se evidencio en la concentracin final

vinagre y densidad ptica, pues se observ que a medida que trascurra el tiempo el nmero de clulas en el biorreactor aumentaba. Vale recalcar tambin que las buenas medidas que se tomaron para evitar la contaminacin del medio fue parte clave en que el proceso se diera de forma adecuada. Pensamiento Operacional Volumen final: 7,5 L Fuente de Nitrgeno (fosfato diamnico urea) Entre e 0.25 g/L a 0.5 g/L = 3,75g/7,5L Fuente de Carbono (azcar-sacarosa): Entre 16% a 24 % (Grados Brix: de 16 a 24): 20%= 200gL = 1500g/7,5L

Tiempo Hrs

Acidez Acidez GL GL (ml corregida corregidos NaOH) 1 5,8 6,85 0,5 0,3 25 22,2 96 19,35 6,81 1 0,6 23 20,6 120 21,54 6,80 1,02 0,612 20 17,2 216 26,35 6,79 0,4 0,24 19 16,2 240 8,47 6,6 0,3 0,18 13 10,6 336 8,51 6,50 0,4 0,24 16 18,4 Tabla 1. Se muestran los resultados obtenidos durante el tiempo de fermentacin

cell/ml x108

pH

T (C) 22 21 22 22 22 19

Crecimiento Vs Tiempo
1.6 1.4 Log10 Crecimiento 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Tiempo (Horas)

Grafica 1. Crecimiento en el tiempo de fermentacin Los datos obtenidos para el crecimiento por densidad ptica fueron modificados usando la siguiente ecuacin: Con el fin de obtener una relacin lineal entre el crecimiento y el tiempo.

El crecimiento fue exponencial hasta la hora 216 en donde ya podia empezar a observarse un inicio de la fase estacionaria. Despues se observa un descenso en el conteo celular, causado por un error durante el proceso de alimentacin.

pH Vs Tiempo
6.9 6.85 6.8 6.75 6.7 6.65 6.6 6.55 6.5 6.45 0 100 200 Tiempo (Horas) 300 400

pH

pH

Grafica 2. Variacin de pH en el tiempo La variacin del pH dursnte el proceso fermentativo no tuvo csmbios drasticos, se refleja una disminucion constante hasta la hora 216, luego el descenso fue abrupto pero no significativo.

Acidez Vs Tiempo
0.7 0.6 0.5 Acidez 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 100 200 Tiempo (Horas) 300 400 Acidez

Grafica 3. Acidez Para calculsr la acidez se tuvo en cuenta el factor psrs este proceso con acido acetico a 0,1N de NaOH, cuyo fsctor corresponde a 0,6. Los resultsdos obtenidos presentaban fluctuacin.

GL Vs Tiempo
25 20 15 GL 10 5 0 0 100 200 Axis Title 300 400 GL corregidos

Grafica 4. Grados alcohlicos Se observo un descenso progresivo en el nivel del alcohol en el biorreactor. En la hora 216 se observo un momento abrupto.

T (C) Vs Tiempo
22.5 22 Temperatura C 21.5 21 20.5 20 19.5 19 18.5 0 100 200 Tiempo (Horas) 300 400 T (C)

Grafica 5 Temperatura La temperatura fue siempre constante excepto en la ultima medicin . Pensamiento generalizador La grfica 1, que presenta el crecimiento microbiano, muestra una curva tpica en la cual se pueden caracterizar e identificar las diferentes fases del crecimiento. Los puntos en rojo muestran una disminucin celular considerable debido a que se agreg medio de cultivo en exceso, afectando las mediciones realizadas posteriormente. El descenso es debido a un aumento en el volumen que diluyo la muestra reduciendo el conteo celular. La grfica 2, presenta concentraciones descendentes del pH a pesar de la de haberse sobrecargado el sistema con el error de alimentacin que se tuvo.

La grafica 3, presenta un modelo de altos y bajos de la acides, posibles errores iniciales en donde no se homogenizo la muestra en las primeras mediciones y al final empez a ascender la acidez en donde se haba encontrado ya contaminacin y predominancia del medio por otro microorganismo. Los exmenes microscpicos (Gram y directo) mostraron una posible contaminacin del cultivo con un microorganismo levaduriforme, posiblemente inoculado con el vino usado como sustrato para el proceso fermentativo. La grafica 4, muestra inicialmente una disminucin de los grados de alcohol, pero luego aumentan estos debido probablemente a que el microorganismo contaminante inicio procesos fermentativos en el medio. La grafica 5, muestra la temperatura del medio, hay que tener en cuenta que esta variaba debido a la exposicin de la temperatura en el laboratorio; en donde en algunos casos el termostato estaba con temperaturas variables.

Conclusiones La produccin del cido actico no fue favorable debido a las fallas instrumentales y a los errores operarios que ocurrieron durante el proceso. La cepa usada para la obtencin de cido actico no fue la mejor ya que no mostro durante el lapso de tiempo caractersticas notables que favorecieran este tipo de proceso, adems la contaminacin por parte de otro microorganismo interrumpi el proceso. El error en la alimentacin del sistema enmarco datos demasiado variables, se debe procurar mejor atencin en el proceso, ya que de inicio a fin se tena mal entendido los pasos a seguir en el modelo del proceso. A pesar de los errores finales, inicialmente se mostraban caractersticas de que el desarrollo se diriga por buen camino. Bibliografa RAMON PARES FARRAS. ANTONIO JUAREZ GIMENEZ Bioqumica de Los Microorganismos. 1997. Madigan, T.M., et al. Biologa de los microorganismos. Dcima edicin. Pearson Educacin S.A. Madrid, 2005.Production report. Chem. Eng. News: pp. pp. 6776. Suresh, Bala (2003), Acetic Acid, Chemicals Economic Handbook, SRI International, pp. 602.5000,