INFORME FINAL DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

TABLA DE CONTENIDO: INTRODUCCCION 1. GENERALIDADES. 1.1 Generalidades a tener en cuenta en el laboratorio. 1.2 Estudio microscpico de las bacterias. 1.3 Procedimiento para las coloraciones. 1.4 Tcnicas tintorales. 2. COLORACIONES. 2.1 Laboratorio N 1 tcnica de coloracin de Gram. 2.2 Laboratorio N 2 coloracin de esporas. 2.3 Laboratorio N 3 coloracin de ziclh-neelsen (clsica). 2.4 Laboratorio N 4 coloracin de ziclh-neelsen (modificada). 2.5 Laboratorio N 5 coloracin de la cpsula. 2.6 Laboratorio N 6 coloracin de grnulos de volutina. 3. MEDIOS DE CULTIVO. 4. DESINFECTANTES. 5. RECUENTO BACTERIANO 6. ANTIBIOGRAMA. 7. MARCHAS BIOLOGICAS. 8. HONGOS. BIBLIOGRAFIA.

INTRODUCCION:
El siguiente trabajo ha sido realizado con el fin de presentar un informe sobre las diferentes tcnicas de las coloraciones realizadas en el laboratorio de microbiologa, as como las diferentes tcnicas de cultivo. En la parte inicial del trabajo se explica algunos factores a tener en cuenta para el manejo del personal, materiales y sustancias utilizadas en el laboratorio. Luego se hace una explicacin de las tcnicas tintorales y la coloracion de gram. Enseguida se realiza una explicacin detallada de cada uno de los laboratorios realizados. Cada laboratorio contiene objetivos, marco terico, materiales, discusin y conclusiones. Despus, viene el desarrollo de los distintos laboratorios de medios de cultivo, desinfectantes, antibiograma, marchas biolgicas. La microbiologa estudia, como su nombre lo indica, los microorganismos, en toda su extensin teniendo en cuenta sus estructuras y fisiologa. Para este estudio la microbiologa actualmente usa varios mtodos para llevar a cabo sus estudios, entre estos mtodos esta el de las coloraciones, usadas comnmente en el laboratorio. Dichas coloraciones determinan la morfologa del microorganismo estudiado, habiendo un colorante especial para determinar una caracterstica esencial de la bacteria o de microorganismos en estudio, sin embargo para poder observar dichos organismos se necesita la ayuda de un microscopio, con el cual se observan las estructuras coloreadas y facilitan su estudio. Las principales estructuras que se analizan en un laboratorio por medio de las coloraciones son entre otras: esporas, flagelos, cpsulas, grnulos metacromaticos o de volutina, pared celular, etc.

1. GENERALIDADES: 1.1 GENERALIDADES A TENER EN CUENTA EN EL LABORATORIO:

1.1.1 VAS DE INFECCIN: Los microorganismos pueden penetrar en el

organismo a travs de la boca (ingestin), por los pulmones (inhalacin), a travs de la piel (inyeccin), o por los ojos.

1.1.2 PREVENCION DE LAS ENFERMEDADES ADQUIRIDAS EN EL LABORATORIO:

principios de contencin suponen la creacin de: a. Barreras primarias alrededor de los microorganismos para impedir su dispersin en el laboratorio. b. Barreras secundarias alrededor del operador para que acten como una red de seguridad si se rompieran las barreras secundarias. c. Barreras terciarias que impidan alcance a la comunidad cualquier germen que no sea contenido por las barreras primarias y secundarias.

1.1.3 EQUIPO DE LABORATORIO:

MICROSCOPIO: Devn estar provistos de oculares condensadores de gran campo. Los mas tiles para bajar aumentos son los de X 5 y X 10 y para microscopio de grandes aumentos (Inmersin en aceite) son aconsejables los objetivos fluorados X 50 y X 100. ESTUFAS: En los laboratorios mdicos y veterinarios las estufas operan generalmente solo a 35-37 C. El laboratorio de microbiologa alimentaria y el industrial requieren aparatos que trabajan a 55, 28-32, 15-20 C. BAOS: El contenido de un tubo de ensayo introducido en un bao Mara alcanza la temperatura deseada muchos mas rpidamente que en una estufa. Por esto dichos instrumentos se utilizan en incubaciones de corta duracin.

CENTRIFUGAS: Para microbiologa es necesario una centrifuga capas de llevar portatubos de 15 y 50 ml. Y de funcionar a una velocidad mxima de 4.000 rev/min.

Cabinas de seguridad: Utilizadas para aprensar y retener partculas infectadas transmitidas por el aire que se liberan en el curso de determinadas manipulaciones, por lo tanto protege a la persona del laboratorio.

1.1.4 TRATAMIENTO DE MATERIALES:

Se deben llevar puestos guantes, tapabocas y delantales para su manipulacin, para su desinfeccin se utiliza hipocloro Na. Dividido 1-5 o 1-10, formol al 10%, fenol, jabn tejo entre otros. Eliminacin de Materiales: Lquidos : se evacuan por desage las salidas de lquidos a caerias Materiales Contaminados: se esteriliza en un autoclave, tubos. Material Slido: Caja Petri, se retira el material con una esptula y se coloca en bolsas negras. El material patgeno se coloca en bolsas rojas y luego se esteriliza las cajas de Petri Lavado de material: El material se lava en agua caliente y se utiliza jabn tego como bactericida neutro. Despus se hace dos lavados con agua corriente y luego se lava con agua destilada. Secado de material: Tiene dos tratamientos. Colocar el material al medio ambiente y destaparlo para eliminar los residuos de agua. Colocar el material en una estufa u horno. Pipetas : se envuelven en un papel mantequilla o papel kraft que soportan temperaturas de esterilizacin 120-180C luego se pega con una cinta control a cinta de autoclave, cuando llega a temperaturas de esterilizacin aparecen franjas negras. Se le debe marcar la fecha de esterilizacin y el volumen de la pipeta. Cajas Petri: se encuentran en papel mantequilla o kraft, en paquetes hasta de 10 cajas. Esterilizacin del Material: Se matan la bacteria por dos mtodos principales: Vapor hmedo: se coloca el material en un autoclave a 121C por 20 seg.

Calor seco: se coloca el material en un horno a 180-200C por 2 horas, solamente material de vidrio o metlico.

Almacenamiento de material: El material se debe guardar en sitios cubiertos como bodegas o alacenas.

1.2 ESTUDIO MICROSCOPICO DE LAS BACTERIAS:

1.2.1 OBSERVACION DE CELULAS SIN TEIR:

Leeuwenhoek en su siglo, y otros microbiologos de la mitad de siglo pasado, tuvieron que observar bacterias sin teir. Las ventajas del estudio directo de las clulas vivas en su forma, disposicin y tamao natural fueron antagonizadas por el hecho de que el ndice de refraccin del protoplasma de microbios se acerca al agua y por ello las clulas y sus estructuras no pueden diferenciarse en forma neta entre s y del liquido en que estn incluidas.

1.2.2 EL MONTAJE HUMEDO:

Tipo corriente de presentacin de las bacterias que se emplea aun. Se coloca en un portaobjetos una gota de cultivo de caldo y se le pone un cubre objetos. Pueden examinasen el organismo vivo con el objetivo de poca potencia y objetivo seco de alta potencia (esto es, 43X). El diagrama del condensador de abbe se cerrara parcialmente para que el haz luminoso sea de poco dimetro, por lo contrario, las clulas no se distinguirn del medio si se desea el estudio de los organismos se prefiere el mtodo de gota suspendida. Se emplea un portaobjetos especial con una cavidad en uno de los lados. Se coloca el cultivo en un cubreobjetos limpio y se invierte para quedar sobre la depresin que obtura con agua, aceite o petrolato estudia con el objeto de poco aumento. Este tipo de montaje tiene utilidad especial para la observacin continua de la movilidad bacteriana o para observar el crecimiento de clulas individuales de un microcultivo.

1.2.3 COLORACIONES BACTERIANAS:

El estudio microscpico de las bacterias se facilitan notablemente al tratarlas con colorantes o tintes. Con mas facilidad se aprecia la forma y tamao relativo de los microorganismos teidos; el colorante tambin permite la observacin de ciertas estructuras celulares.

1.3 PROCEDIMIENTOS PARA LAS COLORACIONES: 1.3.1 RADICALES DE CROMOFORO Y AUXOCROMO:

Los colorantes son compuestos orgnicos que contienen radicales cromoforos, esto es, que producen color, y grupos de auxocromos que forman sales. Los grupos nitro (-NO2) y azo (-N=N) son cromoforos; los radicales hidrxido (-OH) y amino (-NH) es grupos auxocromo permiten la coloracin de una de las fibras o tejidos, muchos colorantes de comercio son sales, pero se denominan colorantes basicossi la porcin coloreada acta como base, o cidos si acta como cido. Pueden obtenersen colorantes bsicos en forma de sales de sodio. Los colorantes cidos en forma de sales de sodio. Los colorantes cidos se emplean para teir materiales bsicos; v.gr; citoplasma, en tanto que los colorantes bsicos coloran ncleos, algunos grnulos y otras sustancias cidas.

1.3.2 MECANISMOS DE COLORACION:

La coloracin de clulas y tejidos quiz sea una combinacin de fenmenos fsicos y qumicos. Los fenmenos fsicos de absorcin, a pilaridad y osmosis participan en cierto grado. Por otra parte, la afinidad de los colorantes bsicos por los tejidos cidos y viceversa indica que hay reacciones qumicas que conducen a la formacin de nuevos compuestos.

1.3.3 PREPARACION DE FROTIS BACTERIANOS PARA COLORACION:

Antes de la tincion, las bacterias suelen encontrarse en agua u otro liquido en un portaobjeto limpio y fueron extendidas en una pelcula uniforme y delgada. Se hace que la pelcula seque en el aire, y los microorganismos son "fijados" al portaobjeots por substancias qumicas o por calor moderado. Se conoce a dicha preparacin como frotis o extensin fija.

1.3.4 COLORANTES SIMPLES:

Un colorante simple es una solucin de colorante, por lo regular en agua o alcohol o agua. Muchas bacterias contienen material cido distribuido en forma mas o menos uniformes en su clula. En consecuencia se coloran intensamente con colorantes bsicos; v.gr; azul de metileno, violeta de cristal o fucsina carbolico (solucin de fuscina bsica en cida carbolico por 100). El tiempo necesario para la coloracin varia con la dilucion del colorante: de uno a cinco minutos para el azul de metileno, 15 segundos para el violeta de cristal. Las extensiones teidas son lavadas brevemente con agua, para quitar el exceso de colorante, secadas en el aire y despus de ello quedan lista para el examen. Se emplean colorantes sencillos para apreciar la forma, la disposicin y el tamao relativo de las bacterias y son tiles para identificarlas. No obstante, no muestran detalles finos de la estructura interna.

1.3.5 COLORANTES DIFERENCIALES O POR CONTRASTE:

Los mtodos de tincion diferenciales hacen que distingan las estructuras intracelulares o distinguen un tipo de clulas de otro. Pueden empleasen dos colorantes, y en la preparacin final algunas estructuras celulares tipos de clulas tienen un color, y el resto otro. El primer aplicado es el colorante primario. Despus de el puede hacer la difenciacion: aplicacin de una solucin que quita el colorante primario a algunas clulas o estructuras. El otro colorante, conocido como el colorante secundario o de contraste, se aplica. Para diferenciacin de bacterias se emplea ampliamente la coloracin o tincion diferencial.

1.4 TECNICAS TINTORALES:

Las coloraciones se basan en la utilizacin del benceno (C6H6) que es una substancia que de acuerdo a la carga negativa que se utilice se pueden diferenciar los colorantes bsicos. l termino cido o bsico indica la parte del cronogeno por los grupos positivos o negativos que estn en la bacteria, se utilizan radicales bsicos. Los colorantes cidos o anionicos actan de preferencia con Elion colorante (-) sobre los radicales de la bacteria. Los colorante bsico o cationicos actuan como carga positiva sobre las partes (-) de las bacterias.

En las coloraciones se emplean mordientes, que son sustancias qumicas que fijan los colorantes o facilitan la penetracin dentro de la estructura bacteriana. Los mordientes ms comunes son a base de : Yodo, cido tnico, anilina, Yodoro de potasio y fenol.

1.4.1 DECOLORANTES:
Sustancias que se emplean para decolorar el colorante principal como: alcohol, acetona cidos ( clorhdrico sulfrico).

1.4.2 PROCEDIMIENTO PARA COLORACION:

(medio de cultivo slido): Las bacterias pueden crear en medios slidos. a. b. c. d. Desengrasar la lamina portaobjetos Colocar una gota de agua destilada dentro de la lamina. Quemar el asa y luego enfriar en el sitio donde no hay cultivo (caja Petri). Tomar la muestra superficialmente y luego difundirla sobre la gota de agua destilada. e. Fijar al calor hasta que se seque el frotis (para que las protenas se adhieran a la lamina). f. Marcar la lamina, en la parte de atrs a la que se encuentra la muestra. ( medios de cultivo liquido): a. b. c. d. e. f. g. Desengrase la lamina portaobjetos. Colocar la gota de agua dentro de la lamina. Quemar el asa y tomar la muestra. Colocar dos gotas de cultivo en la lamina y luego difundirla. Fijar al calor hasta que seque el frotis. Marcar la lamina por detrs de donde esta la muestra. Iniciar la coloracin.

COLORACIONES:

2.1 LABORATORIO N 1 tcnica de coloracin de gram. OBJETIVOS:

Diferenciar bacterias gram (+) y gram (-) Observar la pared de esta bacterias. Reconocer la coloracin de estas bacterias.

MARCO TEORICO:
Coloracin de gram: por cristian gram en 1984. Sirve para diferenciar grupos de bacterias. El primer grupo bacterias gram (+) que tiene la pared gruesa y pueden fijar el colorante principal. El segundo grupo gram (-) que tiene la pared delgada y no pueden fijar el colorante principal. Las bacterias gram (+) son de color violeta basado en la teora de benians, que aseguro y demostr que el cristal violeta como colorante principal se mezcla con el yodo y forman un complejo yodo violeta, los cuales se muestran dentro del peptidoglucano y no pueden ser coloreado en las bacterias gram (-) no se forma grumos y son lavados fcilmente al agregarle el colorante de contraste. La pared de estas bacterias va a tomar el color rojo. TINCION DE GRAM: El de coloracin de gram es l mas empleado en bacteriologa. Segn se dividan las bacterias en dos grandes clases gram positivas y gram negativas; aun ms, la reaccin de gram guarda relacin con otras propiedades de un microorganismo. Despus de aplicar el colorante primario, violeta cristal, se aplica una solucin de yodo que acta como mordiente y fija el colorante primario a los organismos gram positivos.

Despus de ello se decolora la extensin por lo regular con alcohol 95% y de colora diferencialmente con un colorante de contraste v.gr : Safranina. Los microorganismos que conservan el colorante primario violceo se llaman gram positivos; las clulas gram negativas pierden el colorante primario al decolorarse con alcohol y se coloran con el colorante secundario, SAFRANINA.

MECANISMO DE LA COLORACION DE GRAM: En el pasado se propusieron las teoras qumicas y de permeabilidad de la pared celular excitar el mecanismo de tincion diferencial de gram. En la actualidad se sabe que la permeabilidad de las pares celulares de las bacteria gram positivas y gram negativas difieren con las circunstancia en la etapa de coloracin y este factor permite la perdida de colorante primario en los ltimos microorganismos. Los constituyentes protoplasmticos de la clula gram positivas y gram negativas se combina con violeta de cristal por un enlace ionico entre grupos cidos y un grupo bsico del colorante. El colorante, al quitarlo de la protena celular o al aadirlo al complejo de la protena celular o al aadirlo al complejo de protena colorante. Se piensa que el alcohol al 95% deshidrata las paredes de la clula gram positivas recibieron el mordiente y forma una barrera que incluye el complejo yodo-violeta cristal. Dicha "barrera" no se forma en las clulas gram negativas. Se sabe que las paredes de los microorganismos contiene un porcentaje alto de lpidos en comparacin con los muchos microorganismos gram positivos, y en consecuencia, la solubilidad de los lpidos superficiales en alcohol quizs sea un factor que participe en la mayor facilidad de decoloracin de las clulas gram positivas. No obstante, se necesita estudios anteriores para detectar estas cifras. No hay linea neta de demarcacion entre los microorganismos gran positivos y gram negativos, hay una graduacion continua entre las especies que conservan el colorante primario, incluso despues de colorarlas varias horas, hasta hasta las especies que se decoloran en terminos de segundos. Los cultivos envejecidos de muchos microorganismos considerados gram positivos contienen numeros cresientes de celulas gram negativas. Algunos frotis individuales contienen celulas gram negativas y gram positivas, se han demoninado dichos cultivos GRANVARIABLES, conviene estardarizar los metodos cuidadosamente para obtener resultados constantes y fidedignos, y es necesario valorar y estudiar los resultados con los microorganismos, testigos de los que se conozcan la reaccion de gram, especialmente el trabajo critico de importancia.

MATERIALES:

Asa Lamina porta objetos Lapiz de cera Cinta de enmascar Microscopio Papel absorvente

REACTIVOS:
Cristal violeta Lugol Alcohol acetona Fucsina fenicada

PROCEDIMIENTO:
1. Despues de realizar los pasos de prosedimiento para la coloracio. 2. Adicionar el colorante principal (cristal violeta gram) y dejarlo durante 1 minuto. 3. Lavar con agua corriente. 4. Agregar mordiente (lugol) y dejarlo durante un minuto. 5. Lavar con agua corriente. 6. Adicionar el decolorante (alcohol acetona) dejarlo durante 20 segundos. 7. Lavar con agua corriente para retirar los residuos del colorante. 8. Agregar el colorante de contraste (fucsina o safranina gram) dejarlo por un minuto. 9. Lavar con H2O corriente. 10. Secar al medio ambiente o envolver la lamina suavemente en papel absorvente. 11. Colocar una gota de aceite de inmersion de microscopio. 12. Observar al microscopio.

RESULTADOS Y DUSCUCIONES:
Al observar la lamina en el microscopio se observaron formaciones bacterianas de clor violeta y rojo que son los colores que toman las bacterias gram (+) y (-) respectivamente; al adicionarles, debido al complejo que forman o no de yodo-violeta.

DIFERENCIAS ENTRE GRAM POSITIVAY GRAM NEGATIVAS:

Bacterias gram positivas. Contienen ribonucleato de magnesio. Muy sencibles a los colorante de trifenilmetano (v.gr. violrta cristal). Sencibles a la penicilina. No son disueltos por KOH al 1% Su punto isoelectrico esta entre ph de 2 a 3. Cilindricos que forman esporas, muchos cocos (tambien las especies de lactobacillis y corynebacterium). Toxinas (siaparen): exotoxinas. Bacterias gram negativas. No contienen ribonucleato de magnesio. Son menos sencibles a los colorantes de trifenilmetano. Sencibles a la estreptomicina. Son disueltos por KOH al 1% Punto isoelectrico entre ph de 4 a 5 La mayor parte son basilos. Espirilas y cocos que no forman esporas.

CONCLUSIONES:
Las formaciones bacterianas observadas de color violeta, corresponden a bacterias gram (+). Las formaciones bacterianas observadas de color rojo corresponde a bacterias gram (-). Se observo que las bacterias gram (+) tienen una pared mas gruesa que las gram (-).

2.2 LABORATORIO N 2 Coloracion de esporas: OBJETIVOS:

Identificacion de las siguientes esporas: Bacillos: Anthacis, subtilis, cereus. Bacillaccae: Clastridiun: chavvoi, septicon, tetani, butulinou.

MARCO TEORICO:
Endosporas Presentacion: Las esporas son cuerpos de gran resistencia producidas en el interior de las celulas de ciertas bacterias. Se encuentrantodas especies de la familia bacteriacceae, que se divide en dos generos. Bacillus (cilindros esporangidos) y clostridium (cilindros maerobios esporangenos). Una bacteria generalmente produce solamente una espora. No conviene considerar a la esporulacion como un metodo de manipulacion de las bacterias como lo es en los mohos y levaduras.

CARACTERISTICAS FISICAS Y FISIOLOGICAS:

Las endosporas tienen forma esferica o eliptica y pueden estar situadas en cualquier sitio de la celula original o esporangio. Su diametro puede ser menor del resto del esporangio, igual al mismo, o mayor. Una celula con endospora central muy grande se asemeja a un, y por ello no se le denomina clostridio. Un plectridio es un esporangio, que contiene una endospora terminal de mayor tamao. El tamao de las endosporas difiere de una especie a otra; esta caracteristica suele tener cierta utilidad para clasificasion.

Las endosporas bacterianas no teidas tiene gran capacidad de refraccion cuando se observan en el microscopio. Los metodos corrientes de coloracion tien solamente la capa esterna del revestimiento de la espora. El minterior de la espora puede ser teida si se aplica calor. Este metodo aumenta la permeabilidad de la cubierta de la espora y permite la penetracion del colorantes intensos; por ejemplo: verde de malaquita o carbolfucsina y la coloracion intensa del citoplasma. Las endosporas teidas resiten la decoloracion y pueden distinguirsen facilmente de las celulas vegetales u otras partes de los esporangios.

La estructura fina de las endosporas difiere algo de una especie a otra. En terminos generales, no obstante hay un centro rodeado por una membrana fina, la pared de la espora. En muchas especies se transformara en la pared celular del basilo futuro. Arededor de la pared se encuentra una segunda capa, esta capa esta incluida en dos cubierta de la espora (segn la especie). Una cubierta de la espora puede ser lisa, arrugada o elevada en bordes, a veces con forma geometrica. (v. gr. Haxagonal). Por utimo todo lo anterior puede estar incluido en un EXOSPORIO, que se une intimamente a los lados pero que sobresale en el extremo de la espora. Las esporas son, de los cuerpos vivos, las que mas resisten la accion del calor, desecacion y substancias quimicas toxicas, pero hay gran variacion entre las especies, algunas endosporas mueren en un termino de minutos a 80 a 90 C, en tanto que otras especies a la ebullacion duradera. Las esporas de un bacilo resisten 100 C. Incluso 20 horas. Hay variaciones entre las endosporas de un cultivo, algunas sobreviven la exposicion a un agente mortal, mas que las demas. La resistencia notable de las endosporas indica su composicion quimica o estructura fisica diferente radicalmente de la de las celulas originales. El analisis quimico muestra que las endosporas contienen DNAY RNA, proteinas, lipidos, carbohidratos varias enzimas y minerales. Su concentracion hidrica es aproximadamente 25% menor que la de las celas vegetativas. Se ha sugerido que la proporcion de agua "unida", en relacion con el agua libre en las esporas, es mayor que en las celulas vegetativas. Ademas de ello, las esporas contienen mayor cantidad de calcio. Algunas de las proteinas son identicas a las que se encuentran en vegetativas, pero tambien se han encontrado proteinas peculiares de las endosporas. La formacion de una endospora, en consecuencias, entraa nueva sintesis e incorporacion de los constituyentes de la celula vegetativa. Uno de los caracteres mas probables de las endosporas es la presencia de un compuesto acido dipicolinicoque se encuentra en todas las esporas examinadas y falta en las celulas. Comprende de 5 a 15% del peso seco de la espora. El acido dipicolimpeptido y otras sustancias, son producidas las esporas en germinacion y en forma simultanea se pierde la resistencia de las mismas. En consecuencia, parece que el acido dipicolinico depende la resistencia de la espora. La actividad metabolica de las endosporas es bastante reducida. Incluyendo 3 o 4 enzimas y otras que estan enestado inactivo.

Se cuenta con datos que algunas de las enzimas y otras sustancias termolabiles en las endospras normalmente esta unidas en forma de compuestos quimicos con el acido dipicolinico y quiza con peptidos y calcio, estos complementos son noatblemente resistentes a la resistencia y a la baja actividad metalica de las esporas contribuyen con otros factores. La impermeabilidad del revestimiento de la espora impide la entrada de sustancias quimicas nocivas. El citoplasma deshidratado de la esfera no es util para calcular tipo de actividad quimica. Se ha mencionado este factor en la explicacion parcial de la imposibilidad de teir las esporas, inactivas.

El primer signo de la formcion de esporas suele apreciarse como una cubierta eliptica de poca intencidad o una mancha clara en el citoplasma granuloso en un extremo de la celula. Esta zona poco a poco se hace mas densa que el resto del citoplasma y se colorea mas intensamente con los colorantes basicos hasta que forma una cubierta de la espora. Se demomina esta estructura primordio de la espora. Aumenta la capacidad y la viscosidad locales, y en termino de poco tiempo se desarrolla la pared de la espora, los revestimientos y la corteza. El acido dipicolinoco es sintetizado anteriormente en el femomeno de formacion de la espora. Las celulas vegetativas estan mas o menos llenas de cromatina en forma de filamentos granulosos o de una barra larga. Un fragmento corto de cromatina en forma de filamentos granulosos o de una barra larga. Un fragmento corto de cromatina cerca del extremo de la celula se desplaza a la punta. Y este puede teirse intensamente, y despues de transforma en un filamento helicoidal. en algunas especies hay datos de division y fasion de los cuerpo cromatinicos. A medida que se alarga el primordio de la expora en cresimiento, el filamento de cromatina se arroya en forma de 8 y su capacidad de coloracion poco a poco disminuye por la presencia de un material que se colora fuertemente y que quiza no es DNA, corriente. Este fenomeno se puede suele durar media hora.son dificiles apreciar los cuerpos cetonicos pero parece encontrarce serca de la superficie del citoplasma de la espora en forma de filamentos o cordones unidos. Las esporas, en este momento tienen capacidad de refreccion caracteristica y resistencia la coloracion. La etapa final o de maduracion y liberacion de la endopora, quiza necesita algunas horas. El esporangio, por lo regular esta vivo y es metabolicamente activo poco despues que se forma la endospora, peropor ultimo inicia la autolisis, es el metabolismo dirigen el propio protoplasma.

COLORACION DE SHAFFER- FULTON: PROCEDIMIENTO:

1. que se absorva el colorante. 2. Calentar al mechero durante 5 minutos, procurarno no dejar hevir, el calor es el Adicionar colorante principal (verde de malaquita.) debe cubrir bien el frotis para mordiente. 3. Lavar con agua corriente. 4. Adicionar el colorante de contraste (safranina) y dejarlo en contacto por 30 segundos. 5. Lavar con H20 corriente. 6. Secar la lamina al medio ambiente. 7. Observar al medio ambiente.

MATERIALES:
Asa. Lamina porta objeto. Lapiz de cera. Cinta de enmascarar. Microscopio. Papelabsorvente.

REACTIVOS:
Verde de malaquita. Safranina. Fucsina fenicada. Alcohol acido. Azul de matileno.

COLORACION DE HANSEN: PROCEDIMIENTO:

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Adiciodar el colorante principal (fucsina fenicada.) Calentar durante 5 minutos sin dejar hervir. Lavar con agua corriente. Decolorar con acido ascetico por 20 segundos. Lavar con agua corriente. Adicionar el colorante de contraste ( azul de metileno.) por 5 minutos. Lavar conagua corriente. Dejar secar la lamina. Observar al microscopio.

RESULTADOS Y DISCUSIONES:
En la lectura de la coloracion de shaffer-fulton se observaron formaciones de color verde que corresponde a las esporas; ese color es devido a la adicion del colorante principal que es el verde de malaquita. Las formas vegetativas se observaron de color rojo. Debido a la adicion de safranina. En la lectura de la coloracion de hansen se observaron de color rojo, que corresponde a las esporas; el color es debido a la adicion de fucsina fenicada. Que es el colorante principal. Las formaciones vegetativas se observan de color azul, debido a la adicion de azul de metileno como colorante de contraste.

CONCLUSIONES:
En la coloracion de shaffer - fulton, las bacterias se observaron de color verde. En la coloracion de hansen, las bacterias se observaron de color rojo.

2.3 LABORATORIO N 3 Coloracion de zielh-neelsen (clasica). OBJETIVO:

Determinar microorganismos que no se puedan detectar con la coloracion de gram.

MARCO TEORICO:
Coloracion acidorresistente. Las microbacterias (v.gr; : M. Tuberculosis y M. Leprae) a semejanza de las endosporas, son dificiles de teir, pero una vez teidas con el colorante en forma permanente y pueden resistir el lavado con acido diluido. En el metodo de ziehl- neelsen el colorante primario, carbofucsina, se calienta hasta la ebullicion durante cinco minutos; despues se decolora el frotis brevemente con H2SO4 o HCI alcoholico diluido y se colora con contraste con azul de metileno para revelar la presencia de organismos no acidorresistentes. Las bacterias acidorrecistentes conservan el colorante primario color de rosa o rojo; los demas microorganismos son decolorados por el acido y toman color azul. La propiedad de acidorresistencia parece parese asociarse con la presencia de grandes cantidades de material lipoide, que puede comprender incluso 40% de la sustancia celular de M. Tuberculosis. Se ha dicho que el complejo colorante - fenol de la carbofucsina es mas soluble en los constituyentes celulares lipoides, que las mismas bacterias lo conservan pero no son el agente de decoloracion; en coosecuencia, microorganismos que caresen de gran concentracion de lipidos.

MATERIALES:
Asa Lamina porta objetos Lapiz de cera Cinta de enmascarar

Papel absorvente. Microscopio.

REACTIVOS:
Fucsina fenicada. Alcohol acido. Azul de metileno.

PROCEDIMIENTO:
Despues de realizar los pasos del procedimiento de coloracion: 1. adicionar colorante principal (fucsina fenicada). 2. Soleter a calentamiento sin dejar hervir. ( solo, formacion de gases), durante 5 minutos. 3. Lavar con agua corriente. 4. Decolorar con alcohol acido y dejarlo 20 segundos. 5. Lavar con agua corriente. 6. Adicionar azulde metileno y dejarlo durante 30 segundos. 7. Lavar co agua corriente. 8. Dejar secar al medio ambiente. 9. Observar al microscopio.

RESULTADOS Y DISCUCIONES:
Al observar al microscopio la lamina de la coloracion de zielh - neelsen se observaron unos mocrorganismos de color azul y otros de color rojo. El color rojo corresponde a las bacterias, acidorresistentes, los demas microorganismos son decolorados por el acido y toman el color azul.

CONCLUSIONES:
Cuando son teidas las microbacterias conservan el colorante y pueden resistir el lavado con acido mineral. La propiedad de acidorresistencia se asocia a la cantidad del material lipoide.

2.4 LABORATORIO N4 zielh - neelsen (modificada): OBJETIVOS:

Coloracion de brucella. Reconocimiento de brucella.

MARCO TEORICO:
El genero brucella contiene microorganismos patogenos del grupo de riego III. (patogeno que produce generalmente enfermedad humana grave, pero que no se difunden de ordinario de un individuo afectado a otro); todas las manipulaciones que pueden producir aerosoles deben hacerse en cabinas bacteriologicas de seguridad en laboratorios y pruevas de gas. Hay en este genero tres especies importantes y otras varias mas pequeas bacilos regulares gram - negativas. No son moviles, reducen los nitratos, pero no atacan a los carbohidratos cuando se emplea metodos de cultivo normales.

IDENTIFICACION:
Las colonias en los medios primarios son pequeas, plantas o ligeramente elevadas y translucidas. Se hacen subcultivos en tubos inclinados de agar triptona glucosado con un papel de acetato de plomo humedecido en la parte superior del tubo. Para comparar la produccion del sulfuro de hidrogeno. Se hacen ensayos de inhibicion por cabrantes. En los laboratorios de referencia se utilizan tres concentraciones de tionina. (1:25.000;1:50.000 y 1: 100.00) y dos de fuchina basica (1:50.000 y 1: 100.000) para identificar los giotipos. Con fines diagnosticos, se siembran tubos de medios preparados brucella fionina y brucella fionina y brucella fudrina o se emplea agar suero triptona glucosado que contenga: 1- 1: 50.000 de tionina. 2- 1: 50.000 de fuchina basica.

Se siembran los tubos o placas con un asa pequea de un cultivo de 24 horas.

ESPECIES DE BRUCELLA:
Tipo de brucella B. Melitensis B. Abortus B. suis Crecimiento en: Fuchina tionina + + + + necesita CO2 + H20 + +

BRUCELLA MELITENSIS:
crecen en agar. Sangre y agar suero triptona glucosado aerobicamente en 3 o 4 dias, no precisa dioxido de carbono para iniciar el crecimiento. Produce sulfuro de hidrogeno y no se inhibe por la fuchina o tionina. En las concentracciones utilizadas en los mdios comerciales. Este organismo causa la brucelosis humana, fiebre mediterranea o de malta o fiebre ondulante. Los reservorios son las ovejas y las cabras y la infeccion se produce por la ingestion de la leche.

BRUCELLAS ABORTUS:
precisa de 5 - 10% de dioxido de carbo par inicir el crecimiento, form sulfuro de hidrogeno y se inhibe por la tionina pero no la fuchina. Causa el aborto contagioso del ganado vacuno. La ingesta de leche puede producir leche ondulante en el hombre enel hombre, siendo frecuentamente afectados los veterinarios y ganaderos por los aerosoles liberados durante el parto del aborto de los animales infectados.

BRUCELLA SUIS:
Esta especie no requiere dioxido de carbono para su crecimiento primario. Las cepas americanas producen abundante sulfuro de hidrogeno pero las cepas daneses no lo forman. Se inhibe por la fuchina, pero no por la tionina. Produce el aborto contagiosos del ganado y puede infectar al hombre, renos y gasos.

MATERIALES:
Asa. Lamina porta objetos. Lapiz de cera. Cinta de enmascarar. Papel absorvente. Microscopio.

REACTIVOS:
Fuchina fenicada. Acido sulfurico. Azul de metileno.

COLORACION ZEELH NEELSEN (MODIFICADA): PROCEDIMIENTO:

Despues de realizar los pasos del procedimiento de coloracion: 1. Adicionar colorante pricipal ( fuchina fenicada) y dejarlo durante 10 minutos. (mordiente). 2. Lavar con agua corriente. 3. Lavar suavemente con agua corriente. 4. Decolorar con acido sulfurico y dejarlo durante 20 segundos . 5. Adicionar azul de metileno y dejarlo durante 30 segundos. 6. Lavar con agua corriente. 7. Agregar aceite de inmersion. 8. Observar al microscopio.

RESULTADOS Y DISCUSION:
Al observar la coloracion de koster al microscopio, se observaron formaciones de color rojo rosado que correspondian a la brucella; el color de la brucella, era debido a que conservaba el colorante principal y el resto de la bacterias se observaron de color azul por que fueron decoloradas por azul de metileno.

CONCLUSIONES:
La brucellas no se tie facilmente, pero cuando es teida por el colorante principal; lo mantiene. La brucellas es un coco - bacilo generalmente aislado.

2.5 LABORATORIO N 5 Coloracion de la capsula. OBJETIVO:

observacion y reconocimiento de capsula.

MARCO TEORICO:
Fuera de la pared celular de casi todas las bacterias se encuentra una capa material a la que se le demomina segn su espesor, composicion y solubilidad, microcapsula, capsula o material laxo. La microcapsula es una capsula bastante delgada compuesta de proteinas, polisacaridos y lipidos. La sustancia laxa es semejante a las capsulas pero no es mas soluble en el medio en el que se encuentran y tienen menor integridad extructural. Las capsula son estructuras gruesas, viscosa y gelatinosas que rodean las celulas de algunas especies. Algunas, capsula tiene extructuras precisas; otras quizas sean amorfas. Se coloran debilmente y suelen demostrarsen por un metodo de coloracion por contraste o negativo en que se coloran el fondo y las demas extructuras celulares y las capsulas que dan en colores. Las capsulas de los neumococos de algunos estreptococos incluyen polisacaridos; algunos de los distintos tipos de neumococos tienen un polisacarido distinto desde el punto de vista quimico. La capsula y la sustencia laxa de algunas de las bacterias esporogenas gram (+) son polipeptidos. La capa extramural no es parte integral o esencial de la celula. Puede quitarse sin lesionarse y la celula la substituye. La presencia y cantidad de material capsular y el laxo depende de la composicion genetica del organismo y del medio. Las formas mutantes pueden tener mayor o menor grado dicho material que las forman normales. La formacion de la capsula y de la sustancias laxa son facilidades por medio que contengan azucares adecuados por ejemplo sacarosa desencadena la producion de capsula o sustancias laxa en algunos organismos que pueden utilizar la porcion de

fructosa de la molecula, la porcion de destrosa no acumula un dextramo de alto peso molecular. Las capsulas protegen a las bacterias contra la desecacion y otras agentes nocivos, resisten la fagocitosis, fenomeno de defensa en el leucocitos u otras celulas tisolares ingieren los cuerpos extraos y los dirigen. Las variantes no capsudas de los microorganismos a los que se les quitan las capsulas son ineridos facilmente por celulas fagociticas.

Las capsulas de las bacterias son causas de perdidas monetarias en las industrias alimenticas y de la leche, los jarabes y otras soluciones sacarinas presentan aglutinacion cuando se contaminan algunas bacterias encapsuladas.

MATERIALES:
Asa. Lapiz de cera. Lamina porta objetos. Cinta de enmascarar. Papel absorvente. Microscopio.

REACTIVOS:
Coloracon de Hiss. Cristal violeta. Sulfato de cobre. Coloracion de antony. Cristal violeta. Sulfato de cobre.

HAY DOS TIPOS DE COLORACIONES: COLORACION DE HISS: PROCEDIMIENTOS:

Despues de realizar los pasos de procedimientos de coloracion: 1. Fijar el frotis al calor. 2. Adicionar colorante principal ( cristal violeta). 3. Calentar durante un minuto (mordiente) en formacion de vapor pero sin dejar hervir.

4. 5. 6. 7.

Addicionar el colorante de contraste (sulfato de cobre) para retirar un poco el cristal. Secar al medio ambiente. Adicinar una gota de aceite de inmersion. Observar al microscopio.

RESULTADOS Y DICUSION:
Cuando se obsevo la coloracion al microscopio, la capsula se observo como un halo de color azul; translucido, alrededor de la bacteria se observo de color violeta.

COLORACION DE ANTHONY.
Despues de realizar los pasos del prosedimiento de coloracion:

PROCEDIMIENTO:
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Hacer frotis y NO fijar. Secar al medio ambiente. Adicionar el contraste principal (cristal - violeta) y dejarlo durante 2 minutos. Adicionar el colorante de contraste (sulfato de cobre). Secar al ambiente. Adicionar una gota de aceite de inmersion. Observar al microscopio.

RESULTADOS Y DISCUSION:
Al observa al microscopio la coloracion, se observo que las capsulas aparecen como halos ligeramente traslucidos y las bacterias aparecen teidas de color azul y se encuentran ligeramente en el centro. Coloraciones debidas a los colorantes y a que el frotis no se fijo al calor.

CONCLUSIONES:
En la coloracion de hiss; la capsula se observo como un halo azul translucido y la bacteria de color violeta. En la coloracion de anthony; la capsula se observa como un halo transparente y la bacteria de color azul.

2.6 LABORATORIO N 6 Coloracion de granulos de volutina. OBJETIVOS:

Identificar los granulos de volutina en las bacterias.

MARCO TEORICO:
Es un cultivo envegecido de varios granulos o incluso aparecen en las celulas. Las inclusiones son cuerpos inhertes en las celulas. Muchas de ellas son materiales alimenticios de reserva, dado que se acumulan durante tiempo de aporte nutricional y disminuye la duracion de la inanicion. El carcter de las inclusiones varia con el organismo. En muchas especies bacterianas y en hongos, algas y protozoarios apatrecen granulos de bolutina, llamados granulos metecromaticos; se les colocan intensamente con colorantes basicos y estan integrados por acido fosforico polimerizado, conocido como polifosfato. Tamao: Las dimensiones de los cuerpos cromatinicos varian con las especies y en la misma especie en distintas epocas. Las celulas de una especie shapylococus posee cuerpos acromaticos de aproximadamente de una micra de diametro.

MATERIALES:
Asa Lamina portaobjetos Cinta de enmascarar Lapiz de crea Microscopio Papel absorvente

REACTIVOS:
Colorante de Loeffler Colorante de Von Stoltemberg

Hay dos tipos de coloraciones:

COLORACION DE LOEFFLER:
Tiene la caracteristica que el colorante tiene la afinidad por carbohidratos o almidones.

PROCEDIMIENTO:
Despues de realizar los pasos del procedimiento de coloracion: 1. 2. 3. 4. 5. Adicionar el colorante de Loeffler y dejarlo durante 10 min. Lavar con agua corriente. Secar al medio con papel absorvente. Aadir aceite de imercion Observar en el microscopio.

RESULTADOS Y DISCUSIONES
Al hacer la lectura al microscopio se observo una coloracion de azul intenso ya que el colorante de loeffler tie el ADN. Las bacterias se observaron de un color azul tenue.

COLORACION DE VON STOLTEMBERG: PROCEDIMIENTO:

1. Agregar el colorante de Von Stoltemberg y dejarlo durante 15 min. 2. Lavar con agua corriente

3. Secar al medio ambiente 4. Agregar una gota de aceite de imercion 5. Observar al microscopo

RESULTADOS Y DISCUSIONES
Al hacer la lectura al microscopio se observo una coloracion roja intensa casi morada que correspondia a los granulos de volutina y el resto de la bacteria se observo de color rojizo.

CONCLUSIONES:
En la coloracion de Loeffler se observaron granulos de volutina de color azul intenso debido al colorante utilizado de Von Stoltemberg ocurrio lo mismo, pero el color fue mas intenso.

3. MEDIOS DE CULTIVO:

INTRODUCCION Las bacterias contenidas en un producto patolgico necesitan una serie de compuestos para su desarrollo ( una fuente de carbono, nitrgeno, elementos minerales y factores de crecimiento). Un medio de cultivo es un sustrato o solucin de nutrientes, en los que crecen y se multiplican los microorganismos en el laboratorio, con objeto de aislar las diferentes especies bacterianas, proceder a su identificacin y llevar a cabo una serie de estudios complementarios. Los sustratos energticos y plsticos pueden ser suministrados por sustancias nutritivas contenidas en la maceracin de la carne y vsceras. Los aminocidos o pptidos son aportados por las peptonas, que contienen todos los productos de degradacin de las protenas, sin vitaminas, y su composicin exacta es variable segn el tipo de sustrato y la enzima utilizados ( pepsina, tripsina o papaina). Los factores de crecimiento son suministrados por maceracin y la adicin de sangre, suero, extracto de levadura, liquido asctico.

OBJETIVOS:
Conocer que es un medio de cultivo, como prepararlo, manera de conservarlo y la utilidad de ste para el crecimiento y desarrollo de los microorganismos. Con la preparacin de los medios de cultivo, poder adquirir destreza en la siembra de microorganismos en diferentes medios de cultivo.

A partir de un cultivo, aprender a extender microorganismos Previamente cultivados, en un portaobjetos, para luego ser fijado, coloreado y observado al microscopio.

MARCO TEORICO
Los medios de cultivo puede dividirse segn diferentes criterios: consistencia, origen, composicin, utilizacin, etc.

POR SU CONSISTENCIA:

Medios Lquidos Contiene los nutrientes normales de un medio de cultivo, con adicin de algn tampn, capaz de mantener el ph.

Medios Slidos Un medio slido se prepara aadiendo agar-agar a un medio lquido determinado. Este conjunto convenientemente esterilizado, se vierte en la caja de petri o en tubos. Las exigencias nutritivas y las condiciones fisico-quimicas son similares a las de medios lquidos, pero a diferencia de ellos, presentan la posibilidad de obtener colonias aisladas. Semisolidos

Para observar la motilidad de las bacterias se encuentran en un 35% de agar y 45% de gelatina.

POR SU ORIGEN

Medios Sintticos Son aquellos que poseen unos compuestos qumicos definidos disueltos en agua y se usan para los estudios metablicos. Entre ellos se encuentran los medios mnimos con los que se intenta comprobar el crecimiento de una bacteria, con muy pocos nutrientes. Los medios semisintticos son sintticos a los que se aade factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgnico completo como por ejemplo el extracto de levadura. Medios Naturales Son los preparados a partir de sustancias naturales animales o vegetales, de su composicin no rigurosamente constante, por ejemplo el suero de la leche.

POR SU COMPOSICIN
Medios Comunes

Son aquellos cuya nica finalidad es el crecimiento de los microorganismos poco exigentes. Medios Enriquecidos

Son medios comunes u ordinarios a los que se aaden ciertos productos ( suero, sangre, liquido asctico, glucosa,) que permiten el aporte de factores de crecimiento o sustancias que neutralizan agentes inhibitorios de crecimiento, en bacterias exigentes.

OTROS MEDIOS

Medios de Enriquecimiento

Son medios lquidos que favorecen o permiten la multiplicacin de unas bacterias, inhibiendo parcialmente la de otras.

Medios Selectivos

Son slidos en los que la " selectividad" se consigue alterando las condiciones fsicas del medio o aadiendo compuestos qumicos, que sea nocivo para las bacterias cuyo crecimiento no interesa. Entre los principales tenemos: cambio en el ph del medio, temperatura, altas concentraciones osmticas, antispticos, antibiticos.

Medios Especiales

Son aquellos que se emplean para el cultivo de ciertas bacterias muy particulares , por ejemplo para micobacteria. Medios para identificacin o Diferenciales

Son aquellos donde no solo crecen determinadas bacterias, sino que, adems, stas al actuar sobre alguno de los componentes especficos del medio, demuestran algunas de sus propiedades. Dentro de ellos existen dos tipos: aquellos en los que solo vamos a poder demostrar una determinada caracterstica del microorganismo, que se denominan nicos o simples, y aquellos en los que se detectan varias caractersticas de una forma simultnea, que se llama mltiples o combinados.

Medios de Transporte

Son los utilizados para asegurar la viabilidad de las bacterias desde el momento de la toma hasta su posterior siembra en el laboratorio.

Medios de Conservacin

Intentan mantener la viabilidad y los caracteres morfolgicos, fisiolgicos, etc. Hoy se tiende a utilizar los mtodos fsicos de conservacin : congelacin, desecacin y principalmente liofilizacin.

 METODOS DE SIEMBRA EN LAS BACTERIAS

Son todas aquellas tcnicas que se utilizan para la transferencia de grmenes en forma directa ( muestras de pus o de sangre). Pasajes o subcultivos: tomar un germen de medio selectivo o diferencial y sembrarlo en otra caja. Repique: tomar de las colonias una muestra, y la siembra se realiza en un medio diferencial o selectivo. Siembra Se efecta con una asa bacteriolgica, se utilizan cuatro medios de cultivo: MEDIOS SOLIDOS : Existen varias tcnicas.

Tcnica de rejilla: se coloca la muestra en un extremo de la caja y con el asa se difunde. Tcnica del espiral Tcnica estra Tcnica combinacin rejilla con espiral:

1. MEDIOS SOLIDOS EN TUBO

Se hace con el asa desde el fondo del tubo hacia fuera en espiral

2. MEDIOS LIQUIDOS
Siembra vertical, se introduce el asa hasta el fondo y se gira, se hace en movimiento de big-ben.

3. MEDIO SEMISOLIDO
Para sembrar el asa debe estar recta, y por el centro del tubo se introduce el filamento hasta el fondo sin tocar pared y se retira igual.

ESTUDIO CUALITATIVO

Las siembras sobre medios slidos, en superficie, dan lugar a la formacin de colonias, masa constituida por muchos millones de bacterias que se aprecian a simple vista. El tamao, as como el aspecto, es bastante constante para cada gnero y especie bacterianos y de ah que pueden utilizarse como caractersticas diferenciales, a la hora del diagnostico, las siguientes cualidades:

FORMA CIRCULARES AMEBOIDA FILAMENTOSA FESTUNADA

FUSIFORME

RIZOIDE

IRREGULAR

HALOLIFORME

ESPESOR
PLANA CONVEXA PLANOCONVEXA

ACUMINADA

PAPILADA

UMBILICADA

BORDE LISA ONDULADO DENTADO

LOBULADO

FILAMENTOSO

RUGOSO

CONSISTENCIA Grasa Seca En forma de mantequilla Viscosa

TRANSPARENCIA Translcidas Opacas PIGMENTACION Rojo Amarillo Amarillo-verdoso

La pigmentacin puede ser interna o externa de la colonia.

OLOR Colonias que producen olor aromtico. Colonias que producen olor ftido. Colonias que producen olor dulce.

HEMOLISIS Algunas bacterias producen una hemlisis beta, que es transparente alrededor de la colonia, otras producen hemlisis alfa, que es de color verdoso , y otras hemlisis delta, que es de color ms oscuro.

MATERIALES
Asa E. Colli Mechero Cajas petri Agar nutritivo Tapabocas Lpiz de cera Cinta de enmascarar

 PROCEDIMIENTO
Agregar el agar nutritivo a las cajas de petri Dejar en reposo hasta completa solidificacin Esterilizar el asa Tomar la muestra de E. Colli Realizar la siembra ( se utiliz la tcnica de estra). Marcar la caja Incubacin a 37 C, por 48 horas

RESULTADOS
Se observ: Colonias brillantes translcidas espesor: colonias planas. Bordes de colonias: dentados Colonias grandes Forma irregular Consistencia seca.

CONCLUCIONES

1. Se reconoci las diferentes formas de colonias que se pueden observar en un medio de cultivo. 2. Se logr realizar correctamente la siembra de un microorganismo en un medio de cultivo. 3. Por medio de las practicas se determin los constituyentes principales que debe tener un medio de cultivo, para un excelente crecimiento de los microorganismos sembrados.

4.DESINFECTANTES: INTRODUCCION
Para la desinfeccin puede utilizarse una gran variedad de sustancias qumicas y todas aquellas reciben el nombre comn de desinfectantes. Algunos de ellos son reactivos ordinarios, otros son formulaciones especiales, registradas con nombres comerciales. Generalmente hay diferencias marcadas entre la actividad de algunos desinfectantes cuando se ensayan en condiciones ptimas por la tcnica de Rideal- Walker u otras menos acreditadas. Los efectos de tiempo, temperatura, ph, y la naturaleza qumica y fsica del artculo que se va a desinfectar y la materia orgnica presente, no son a menudo totalmente considerada. Existe un espectro aproximado de sensibilidad de los microorganismos a los desinfectantes. Los ms sensibles son las bacterias vegetativas, los hongos y los virus que no contienen lpidos. Las micobacterias y los virus que no contienen lpidos son menos sensibles y los esporos son por lo general resistentes. En la eleccin de los desinfectantes, deben tenerse en cuenta algunas consideraciones a cerca de su toxicidad y de los efectos perjudiciales que puede tener sobre la piel, ojos, y vas respiratorias.

Los desinfectantes ms utilizados en los trabajos de laboratorio son los fenoles y los hipocloritos. Los aldehidos tienen una aplicacin limitada y el alcohol y las mezclas de alcoholes son menos populares.

OBJETIVOS
Reconocer las caractersticas y la utilizados en el laboratorio. importancia de los principales desinfectantes

Comprobar el efecto de los desinfectantes sobre las bacterias que se encuentran en el medio ambiente. Observar la accin de diferentes desinfectantes, sobre una o varias clases de bacterias.

MARCO TEORICO
Los desinfectantes son aquellas sustancias qumicas capaces de destruir en 10 a 15 minutos los grmenes depositados en un material inerte o vivo, alterando lo menos posible el sustrato donde residen y abarcando en aquella destruccin todas las formas vegetativas de la bacterias, hongos y virus ( excepto el de la hepatitis ). En la practica, los desinfectantes son potentes microbicidas, pero hasta cierto punto txicos o irritativos para los tejidos vivos, por lo que se aplican en superficies, ambientes u objetos contaminados. La velocidad a la que se realiza la esterilizacin de un producto contaminado bacteriolgicamente al que se le ha agregado un desinfectante se ha visto que est en funcin de una serie de factores como lo son, la concentracin de la sustancia , la temperatura, el ph, la composicin qumica del medio donde se aplica el agente qumico, la especie bacteriana que contamina el producto, etc. En general se ha visto que, para una circunstancia determinada, las bacterias mueren e progresin geomtrica con relacin al tiempo de exposicin; El tiempo en que se obtiene la esterilizacin completa de un producto por un desinfectante vara mucho de unas bacterias a otras dentro de la misma concentracin de producto activo.

Las condiciones que debe reunir un buen desinfectante son: Que se pueda utilizar en condiciones altas Que se homogenice uniformemente en un diluyente, sea esta agua o alcohol, para que tenga el producto activo la misma concentracin en toda su masa. Que su preferencia o su actividad se manifieste en soluciones acuosas que penetren en los exudados, pus, sangre, etc. Donde los organismos puedan estar ocultos. No ser txico para los tejidos humanos sin que precise el uso de guantes o el lavado inmediato de superficies vivas con la que haya entrado en contacto. Que no resulte corrosivo para metales, madera, superficies pintadas, etc. Que su tensin superficial sea baja para que penetre fcilmente en las rendijas, hendiduras, de las superficies vivas o inertes.

Que sea econmico. Accin efectiva en presencia de materia fecal y sustancias grasas. Poder desodorante.

VALORACION DE DESINFECTANTES
La valoracin del poder antibacteriano de un desinfectante qumico puede efectuarse determinado su poder bacteriosttico o bactericida. El primero se obtiene mediante el coeficiente de inhibicin ( CMI) , es Decir, determinado la concentracin mnima de dicha sustancia capaz de inhibir el crecimiento y reproduccin de una determinada bacteria. El poder bactericida o concentracin mnima bactericida se determina calculando la cantidad mnima de dicha sustancia capaz de producir la muerte de una suspensin patrn en un tiempo determinado; si se trata de formas vegetativas, obtenemos el coeficiente letal mnimo, y si son bacterias esporuladas, el coeficiente letal mximo.

Las bacterias ms utilizadas para os diferentes mtodos para valoracin de desinfectantes suele pertenecer a colecciones internacionales y son las ms usadas enel medio ambiente: s. Aureus, E. Colli, P. Vulgaris, P. Aeruginosa, S. Faecalis.

RESISTENCIA A LOS DESINFECTANTES

La sensibilidad mayor o menor de las distintas bacterias a los compuestos qumicos vara segn el mecanismo de accin de estos. La pared celular ms compleja, de los gram explicara su mayor resistencia a los desinfectantes. La especial resistencia de p. Aeruginosa parece deberse a su pared celular, estabilizada por iones de Mg. El alto contenido de ceras y la naturaleza hidrfoba de la pared celular explican tambin la resistencia del genero Mycobacterium. Las consecuencias de estos hechos en el uso de sustancias germicidas en los hospitales son patentes; de ah la necesidad de determinar el valor de los desinfectantes en cada centro sanitario, segn las tcnicas antes descritas.

MATERIALES
Perxido de hidrgeno. Mechero Lpiz de cera Cinta de enmascarar Hisopos estriles Tapabocas Asa bacteriolgica. Glutarex Mertiolate.

Creolina Hipoclorito Perxido de hidrgeno. Formol Alcohol. Cajas de agar nutritivo.

PROCEDIMIENTO
Frotar la mano en algn sitio sucio del laboratorio. Trazar una lnea imaginaria en el centro de la mano. La mitad de la mano se desinfecta con creolina y la otra mitad se deja infectada. Con el lpiz de cera trazar una lnea en la mitad de la caja con agar nutritivo, para que este quede dividido en dos. Se toma un hisopo estril y se toma una muestra de la parte de la mano infectada. Esta muestra se siembra en una de las dos mitades de la caja con agar nutritivo. Se toma otro hisopo estril y se toma una muestra de la parte de la mano desinfectada con creolina.

Esta muestra se siembra en la otra mitad de la caja con agar nutritivo. Se marca la caja, y se incuba a 37C por 48 horas.

RESULTADOS
El comportamiento de los diferentes desinfectantes utilizados fue variado, se pudo observar que los desinfectantes que obtuvieron una mejor respuesta fueron alcohol, hipoclorito, glutarex.

Desinfectan Alcohol Te/ Grupo 1 + 2 3 4 5 6 7 8 + 9 10 11 12

HipocloritoGlutarex + +

Mertiolate Formol

creolina

Perxido de hidrgeno

+ + + + + +

(+) cuando acta el desinfectante (-) cuando no acta el desinfectante En la caja que se sembr el desinfectante, se tomo una muestra y se realiz la coloracin de Gram, se observ que crecieron bacilos Gram (+). proteus Desinfectant Mertioliateperxido hipoclorito glutarex Grupo 2 +++ ++ + ++ 4 +++ ++ +++ + 6 +++ +++ +++ ++ 8 +++ ++ + + 10 +++ ++ + + 12 +++ + + + Creolina + ++ + ++ + ++ formol + +++ +++ +++ Alcohol + -

Para el proteus los mejores desinfectantes fueron el mertiolate y el hipoclorito. 1. Mertiolate +++ 2. Hipoclorito ++ 3. Perxido + 4. Glutarex

CONCLUSIONES
Se identificaron las caractersticas que debe tener un desinfectante ideal.

Mediante las pruebas realizadas a cada desinfectante, se conoci cuales de ellos son los ms efectivos. Por medio de la coloracin de gram se identific el tipo de bacterias que no fueron destruidas por el desinfectante.

5. RECUENTO BACTERIANO: INTRODUCCION

Frecuentemente es necesario determinar el tamao y la cantidad de la poblacin bacteriana de una muestra. Si se requiere un recuento total, debe tenerse presente que muchos a de los grmenes contados pueden estar muertos o que son indistinguibles de otras partculas materiales. El recuento de grmenes vivos se funda en que se desarrolla de cada germen una colonia visible. Sin embargo, las bacterias estarn raras vez separadas por completo de sus vecinas y se agrupan frecuentemente en racimos de gran nmero, en especial cuando se reproducen activamente. Por ello, una colonia aislada puede originarse de un solo organismo o de cientos an de miles de organismos. Cada colonia se desarrolla a partir de una unidad viable; puesto que cualquier agitacin, como sucede en la preparacin de diluciones puede deshacer o inducir la formacin de racimos, es naturalmente difcil obtener resultados

reproducibles. Rara vez las bacterias se hallan distribuidas uniformemente en una muestra y como por lo general, se examinan solamente muestras pequeas, pueden introducirse grandes errores. No son raros los errores de mas o menos el 90% en recuentos del orden de 10000 a 100000 por ml, an con la mejor tcnica con una interpretacin liberal de los resultados. Carecen de valor las cifras que se obtienen de una prueba aislada.

OBJETIVOS
Exponer la importancia que tiene el recuento bacteriano en la determinacin de colonias formadas por un microorganismo sembrado Explicar la forma correcta de realizar un recuento directo. Reconocer los diferentes grupos de bacterias que se buscan en el recuento directo.

MARCO TEORICO

El recuento se denomina, tambin, recuento de grmenes viables, se detectan la mayora de los grmenes patgenos que hay en una muestra determinada de alimentos, orina, o agua. Existen varios grupos de bacterias que se buscan en el recuento bacteriano. Mesfilas aerbicas : todas aquellas bacterias que encuentran alimentos y se puede aislar en un medio aerobio. Coliformes : bacterias que se originan en el tracto intestinal; E. Colli, klepsiela, proteus, contaminacin de origen fecal. Clostriduim : bacterias anaerobias indican un proceso trmico insuficiente. Staphylococos : si hay presencia es por contaminacin en el proceso.

Para realizar el recuento en un contados de colonias simples se escogen placas que presenten entre 30 y 300 colonias. Se pone la placa abierta, con la base de vidrio hacia arriba, sobre una superficie iluminada. Se cuentan las colonias con una lupa de 75mm y un contador de mano. Se marca el vidrio sobre cada colonia con la punta de un rotulados. Se calculan las colonias o el recuento de organismos vivos/ ml multiplicando el numero medio de las colonias por placa contable por el recproco de la dilucin. Se da el informe como "unidades formadoras de colonias/ml" (ufc) o como " recuento de organismos vivos/ml".

Si todas las placas contienen ms de 300 colonias, se divide la placa en sectores, por ejemplo, un cuarto o un octavo de la placa, se cuentan las colonias en esos sectores y se incluye el valor del sector en los clculos. Para trabajo en gran cantidad, son esenciales los contadores semi o totalmente automticos. En el primero la pluma empleada para marcar el vidrio sobre la colonia se conecta a un contador electrnico que indica el nmero contado en una pequea pantalla. En modelos totalmente automticos una cmara de tv o un haz de lser examina la placa y el resultado se muestra o se registra en una pantalla o en un mecanismo de lectura.

PREPARACION PARA DILUCIONES

Cuando se haga diluciones de lquidos por ejemplo leche, para recuentos bacterianos, se procede de la siguiente manera: Se mezcla la muestra por agitacin. Con una pipeta recta, se hunde en la muestra, se toma 1 ml. Se deja caer en el primer blanco de dilucin,; se espera 3 segundos. Esta pipeta se elimina. Con una pipeta limpia se mezcla el contenido del primer tubo y dejando caer 10 veces el lquido; se toma 1 ml que se transfiere al siguiente blanco de dilucion; se procede de la misma forma para todas las diluciones que se requieran, recordando que cada vez deba eliminarse la pipeta despus de vaciarla de su contenido, ya que de otra forma el lquido de la superficie externa producir un error acumulativo.

DISTRIBUCION DE LA MUESTRA

Con una varilla de vidrio: colocar en cada caja 0.1 ml de la muestra y distribuirla con una varilla. ( tcnica de superficie). Tcnica por profundidad: colocar 1 ml en cada caja de petri, y luego se le adiciona en el medio de cultivo a una temperatura de 40 C, a cada caja se le adiciona 15 ml del medio, luego se agita suavemente y se espera a que endurezca. Tcnica de emparedado: primero se tiene el medio de cultivo preparado en la caja, luego se adiciona 1 ml de la muestra y despus se la agrega ms medio de cultivo.

MATERIALES
Medio de cultivo Cajas de petri Pipetas estriles. Tubos de ensayo con 9 ml de solucin peptonada al 0.1 % Tapabocas Asa bacteriologica Lpiz de cera Cinta de enmascarar Mechero

PROCEDIMIENTO

Hacer diluciones hasta 10-4, se utilizan dos pipetas una para dilucion y otra para sembrar, para sembrar se toma la dilucin ms alta. Despus marcar las caja de petri como 2, 3, y 4, a cada caja se le coloca 1 ml de la dilucin correspondiente, luego se lleva a incubacin por 48 horas. Si la placa tiene pocas ufc se cuentan todas y se anota. Cuando son superiores a 300 ufc se puede hacer una divisin de 7 cuadrados ( horizontales), por 6 cuadrados (verticales); y la sumatoria se multiplica por 5 porque el rea total del medio de cultivo es de 65 cm cuadrados. Cuando es superior a 10 ufc, se sacan 4 cuadrados y se suman ejemplo. 35+25+30+30=120/4=30*65 (rea). Cuando es mayor de 2 se coloca el resultado de la menor dilucin, se suman las 2 y se saca la media aritmtica.

Siempre se expresa el recuento estimado con 2 nmeros enteros, mas la divisin del logaritmo.

RESULTADOS

Muestra de leche
10 10 10 = 40 =3 =2 47900000 514000 960000 -----------------6264000 RF 63 * 10 UFC/ml

Grupo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Ufc 14*10 36*10 18*10 60*10 51*10 32*10 17*10 19*10 31*10 63*10 35*10 34*10

Muestra de yoghurt
10 =300000 10 = 5000000 10 =90000 --------------------305090000 RE = 31 * 10 ufc/ml Grupo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Ufc 37*10 31*10 40*10 71*10 22*10 30*10 49*10 34*10 52*10 57*10 46*10 31*10

Muestra morcilla ( SOLIDO) Morcilla - proteus Papel reynols Pinzas desinfectadas

10gr morcilla + 90 sln peptonada se mezcla = 10 1 ml

Grupo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Ufc 14*10 36*10 18*10 60*10 51*10 32*10 17*10 19*10 31*10 63*10 35*10 34*10 CONCLUCIONES se reconocieron las diferentes unidades formadoras de colonias formadas en la siembra de cualquier microorganismo. Se logr cuantificar las unidades formadoras de colonia formadas despus de la siembra de leche y orina

6. ANTOBIOGRAMA: INTRODUCCION
Se ha desarrollado muchos mtodos nuevos para la determinacin de la sensibilidad de los microorganismos a los agentes antibacterianos y de anlisis de tales agentes en los fluidos corporales. Las tcnicas ordinarias de difusin para la determinacin de la sensibilidad a los antibiticos de organismos aislados de especmenes clnicos han sufrido gravemente las dificultades de la estandarizacin. Se duda si los ensayos con el mismo organismo, hechos en diferentes lugares, conduciran a recomendaciones para el tratamiento constante. La tcnica de difusin clsica exige que se aplique una fuente del agente antimicrobiano a la superficie de un medio slido. La difusin del agente a travs del medio inhibe el crecimiento de un organismo sensible que crezca en o sobre l hasta un grado determinado parcialmente por la receptividad del organismo. Sin embargo, se sabe actualmente que un

cierto nmero de otros factores puede afectar el tamao de las zonas de inhibicin y que estos factores deben ser controlados.

OBJETIVOS
Identificar los antibiticos ms utilizados que pueden o no inhibir el crecimiento de ciertos microorganismos. Conocer la funcin y correcta utilizacin del antibiograma. Para el tratamiento de una infeccin. Utilizar el antibiograma como una tcnica adecuada para establecer la susceptibilidad de las bacterias a los antibiticos.

MARCO TEORICO
Los antibiticos son sustancias orgnicas producidas por microorganismos, que fueran capaces de actuar sobre otros microorganismos inhibiendo su crecimiento o destruyndolos. Para ser antibiticos debe cumplir las siguientes condiciones: Especificidad: consiste en su actuacin frente a un grupo determinado y limitado de microorganismos. Este comportamiento se debe a que los antibiticos actan en un lugar anatmico concreto de la bacteria. Elevada potencia biolgica: Es decir, que sea activo a pequeas concentraciones, actividad que suele expresarse como concentracin mnima inhibitoria ( CMI), equivalente a la ms baja concentracin de antibitico, dada en ug/ml, capaz de inhibir el crecimiento bacteriano.

Toxicidad selectiva: los antibiticos, cuya toxicidad para las clulas del organismo humano debe ser mnima, son, sin embargo, tan activos que pueden destruir las bacterias patgenas en el interior del organismo humano( sangre u otros tejidos).

ACCIN DE LOS ANTIBITICOS SOBRE LAS BACTERIAS Sobre cocos y bacilos gram + y - : son los antibiticos llamados de "amplio espectro" , pues actan sobre la mayora de especies bacteriana. En este grupo se encuentra el clorafenicol, las tetraciclinas, betalactaminas de amplio espectro, aminoglicsidos, rifampicina, sulfamidas, y nitrofuranos. Los dems amplio espectro son el clorafenicol, y las teraticlinas. Sobre cocos y bacilos gram +: El antibitico principal de este grupo es la penicilina, cuya baja toxicidad y uso indiscriminado han dado lugar a la aparicin de microorganismos resistentes a su accin, en especial estafilococos. El otro antibitico principal de este grupo es la fosfomicina que acta sobre bacilos gram -. Sobre cocos gram - : Se incluyen algunos antibiticos, por lo general de corto espectro, que se emplean en el tratamiento de las infecciones por estafilococos resistentes a la penicilina, como la vancomocina, ristocetina y novoblocina.

MECANISMO DE ACCIN
Para que un antimicrobiano ejerza su accin, es necesario que llegue al foco infeccioso, penetre en las bacterias y alcance intracelularmente la concentracin necesaria. La entrada en la bacteria se puede lograr por difusin o transporte activo. Una vez dentro del organismo, la actividad del antibitico puede ser: Bacteriosttica, inhibiendo la multiplicacin de forma reversible, o bactericida, determinando un efecto letal. En general, cada grupo de antibiticos acta preferentemente de una forma u otra. Son antibiticos bacteriostticos: tertaciclinas, clorafenicol y macrlidos; y bactericidas: aminoglicsidos, polipeptidos,y fosfomicina.

VALORACIN DE LOS ANTIBITICOS

Se lleva a cabo mediante dos mtodos:

Dilucion:
Consiste en obtener diluciones dobles y progresivas de un antibitico. El procedimiento se puede realizar en medio lquido o slido. Si se cultiva en una suspencin bacteriana sobre estos medios, en un momento determinado se obtiene concentraciones de antibitico suficientes que no permiten el desarrollo de los grmenes. Recibe el nombre de concentracin mnima inhibitorio la mejor cantidad de concentracin de antibitico, que es capaz de inhibir el crecimiento de la bacteria. Sobre medio liquido, con diluciones progresivas de antibiticos en los tubos, al aadir una cantidad fija de bacterias, en aquellos tubos donde la bacteria desarrolla y multiplica aparece turbidez. Cuando el antibitico inhibe el crecimiento, aparece un aclaramiento de toda la masa lquida del medio de cultivo.

DIFUSIN EN AGAR
Mediante este sistema se prueba la eficacia de varios antibiticos a partir de una siembra en superficie sobre un medio slido de una suspencin bacteriana, depositando a continuacin sobre ella discos de papel de filtro impregnados de antimicrobianios.

Como el agar est suficiente hmedo, los antibiticos difunden y se crean as concentraciones progresivamente decrecientes a partir del disco. En aquella zona donde la concentracin de antibiticos es capaz de impedir el crecimiento de la bacteria, aparece un halo de inhibicin. La valoracin de los halos se hace por patrones obtenidos de forma que se hayan correlacionado la CMI, el dimetro del halo de inhibicin y la carga de antibitico del disco.

MATERIALES
Medio de cultivo Pipetas de 1 ml estriles

Hisopos de algodn estriles Sensidiscos de antibticos Tubos de caldo nutritivo Tapabocas Asa bacteriolgica Cinta de enmascarar Lpiz de cera Mechero

PROCEDIMIENTO
Se toma la muestra( orina, sangre, pus, etc) luego se siembra en un agar sangre o BHT, luego se observa unas UFC de distintos tamaos y colores a la UFC se le hace un repique en agar sangre y se hace un cultivo puro, luego del cultivo puro se saca un poco y se siembra en un tubo con caldo nutritivo que se lleva a incubacin * 1 hora a 37 C, luego se coloca en cajas que contengan medio Muller Hilton y se coloca 0.3 de caldo nutritivo, luego se difunde con el hisopo por toda la caja, se deja al ambiente por 5 minutos, para que se seque , luego se colocan los sensidiscos ( 4 ) en la caja y se lleva a incubar a 37C por 48 horas.

RESULTADO

Se utilizaron diferentes antibiticos para observar la eficacia ante el B. Antracis, y se obtuvo: Antibiotico. Cefalotiniana. Eritromicina. Ac. Nadicidico. Bacitricina. Amoxacilina. Asteronan. Amicacina. Penicilina. Cloxacilina. Cefalin. Neomicina. Licomicina Halo de inhibicin : Menor de 15: resistencia a los antibiticos Mayor de 20 : sensible a los antibiticos. Accion. 30-25 20-21-21 20-r-15 10-r-10 25-25-27-25 R 30-35 30 r-20 r-r 30 25

Escherichia colli gram Antibitic Lincomici cefaperaz cloxacicli Oxacilin Etreptomi gentamici amoxacili minacin ceftalizin o n grupo 1 R 15 r R 2 15 r r 12 3 R R r 10 4 R 15 r 10 5 R 15 r R 6 25 r 20 30

Staphilococos gram +

Antibiotico cefa cloxaciligentamiciminacin Ceftacili cefalotineritromici Ac novomioc Grupo pipemid i 7 20 10 20 12 8 25 r 20 25 9 r r 15 r 10 11 15 r 10 r 12 20 r 20 r

CONCLUCIONES
Por medio de la tcnica del antibiograma se conoci la susceptibilidad del B. Antraciis a determinados antibiticos. Se logr una adecuada interpretacin del antibiograma. Mediante la realizacin del antibiograma se conoci el fundamento, la tcnica, y la aplicacin del mismo.

7. MARCHAS BIOQUIMICAS: INTRODUCCION

Las bacterias producen enzimas que metabolizan diversos sustratos. Estas enzimas han sido usadas tradicionalmente como marcadores para diferenciar grupos de especies y han sido cuidadosamente seleccionados por los diferentes sistemas de identificacin: Oxidacin : se traduce a un cambio de color en la parte superior del tubo, debido a una produccin de cido en aerobiosis, revelada por el indicador de ph del medio elegido. Fermentacin: se traduce por un cambio de color en el tubo, debido a una produccin de cido en anaerobiosis, revelado por el indicador de ph del medio elegido.

Asimilacin : se traduce en un comportamiento del microorganismo, en la parte superior del tubo cuando el sustrato es utilizado como nica fuente de carbono presente. Los tubos contienen medios deshidratados tales como: urea, citratos, vp, nitritos, indol, motilidad, tda, etc. Otros son azucares como: glucosa, sacarosa, lactosa, manitol, arabinosa, subitol, etc. Los diferentes tubos se inoculan como una suspencin bacteriana, luego durante la incubacin el metabolismo produce cambios de color espontneos o bien a la adicin de reactivos especficos. Se realiza la lectura de dichas reacciones con una tabla de lectura y de este manera se identifica el genero y especie de la bacteria.

OBJETIVOS
Identificar por medio de las marchas bioqumicas los diferentes procesos metablicos que tienen las bacterias sobre determinados sustratos. Reconocer los diferentes medios de reaccin que tienen las marchas bioqumicas. Reconocer el fundamento y la aplicacin de las marchas bioqumicas.

MARCO TEORICO
Las marchas bioqumicas son tcnicas de laboratorio que son de gran ayuda para diferenciar unas bacterias de otras cuando son muy parecidas. Se aplican especialmente para el diagnostico de bacterias gram -. Las marchas tienen como fundamento la accin o procesos metablicos que tienen las bacterias sobre determinados sustratos, se estudia: Catabolismo proteico: Proceso natural de las bacterias, que actan desdoblando o produciendo proteasas, ureasas, o gelatinasas.

Metabolismo glcido: Accin o capacidad que tienen las bacterias para desdoblar carbohidratos, azucares, almidn, etc. Metabolismo lipdico: lecitinas. Propiedad que tiene una bacteria para producir lipasas o

MEDIOS
Citratos : determina la capacidad de un microorganismo para utilizar como fuente nica de carbono, en su metabolismo, el citrato. Empleado para diferenciar microorganismos de genero enterobacterias de otros. Sulfuros: determinar la capacidad de un microorganismo para producir, mediante reaccin enzimtica, sulfuro de hidrgeno a partir de aminocidos. Indol: Determinar la capacidad de un microorganismo para producir indol a partir de triptfano presente en agua peptonada. Empleada para ayudar a la diferenciacin de bacilos gram - . Rojo de metilo: Determinar la capacidad de un microorganismo para producir cido en caldo dextrosa fosfatado. Empleada como ayuda en la identificacin de entrobacterias. Nitritos: Determinar la capacidad de un microorganismo para reducir los nitratos a nitritos, anitrgeno gas o a hidroxilamina. Empleada para la identificacin de gneros de enterobacterias y otros. Ureasa: Determinar la capacidad de un microorganismo para producir ureasa que transformara la urea en amoniaco. Se utiliza para la identificacin de gneros de proteus y otros.

Voges proskauer: Determinar la capacidad de un microorganismo para producir un compuesto final de carcter neutro, de la fermentacin de la glucosa. Se utiliza para la diferenciacin de microorganismos gram -. En la actualidad para la diferenciacin de microorganismos existen los API; es un sistema da identificacin que asocia una galera bioqumica miniaturizada, estandarizada y una base de datos. Las galeras API constan de 20 microtubos que contienen los medios deshidratados, los primeros 10 microtubos son bioqumicas convencionales, los 10 restantes son azucares. Durante la incubacin de la galera, el metabolismo de las bacterias producen cambios de color, espontneos o bien, la adicin de reactivos especficos.

MATERIALES
Medios cs, tsi, mr-vp, sim, simons, y citratos. Asa bacteriolgica. Tapabocas Cinta de enmascarar Mechero Reactivo de kovacs Rojo de metilo KOH Alfanaftol.

PROCEDIMIENTO
El cultivo de las bacterias sospechosas se siembra sobre los medios de cultivo especficos de las marchas bioqumicas; luego se lleva a incubacin a 37 C por 48 horas, y se observan las reacciones.

RESULTADOS
Para evidenciar la presencia de indol se agrega 3 gotas de kovacs; la reaccin positiva se evidencia por un anillo rojo en la superficie del tubo, cuando es negativa no se observa ningn anillo.

Para produccin de sulfuros, si la reaccin es positiva se observa de un color negro, si la reaccin es negativa permanece del mismo color al medio especfico. La reaccin de motilidad se identifica por turbidez del medio especfico. Para la identificacin de citratos se presenta turbidez en el tubo o la aparicin de un color azul intenso en el agar. Para la identificacin de ureasa, si toma un color rosado intenso es positiva, y cuando permanece de color amarillo es negativa. Para el rojo metilo, se agregan 3 gotas de rojo de metilo al medio MR-VP, si la bacteria produce la reaccin cido mixta se observa un anillo rojo en la superficie del tubo, si es negativa permanece amarilla. Para la reaccin de butilemglicol, se agregan 2 gotas de KOH y 2 de alfanaftol; cuando es positiva forma un anillo de color rojo en la superficie de tubo, cuando es negativa permanece amarilla.

PROTEUS

Reaccin medio S.C LIA TSI S I M UREA

7 + + + + + -

8 + + + + + -

9 + + + + + -

10 + + + + + -

11 + + + + + -

12 + + + + + -

M.R VP

+ -

+ -

+ -

+ -

+ -

+ -

E. COLI
Reaccin medio SC LIA TSI S I M UREA MR VP 1 + + + + + + 2 + + + + + + 3 + + + + + + 4 + + + + + + 5 + + + + + 6 + + + + + -

KLEBSIELLA

Reaccin medio SC S I M LIA TSI UREA

1 + + +

2 + + + +

3 + + +

4 + + + + +

5 + + + + +

6 + + + + +

7 + + + +

MR VP

+ -

+ -

+ -

+ -

+ -

+ -

+ -

E. COLI
REACCIN MEDIO SC S I M LIA TSI UREA MR VP 8 + + + + 9 + + + + + + 10 + + + + + 11 + + + + 12 + + + + + -

CONCLUCIONES
Por medio de las marchas bioqumicas se identific que tipo de bacterias reconoce cada medio.

Se reconoci la importancia y utilizacin de las marchas bioqumicas.

Por medio de la practica se logr una adecuada manipulacin de esta tcnica.

8. HONGOS
De ms de 100000 especies existentes de hongos en la naturaleza, la mayora son saprofitos y no llegan a 100 las que han demostrado su capacidad de producir enfermedades en el hombre. Los hongos son beneficiosos por su papel en el ciclo natural del carbono, en la nutricin de la plantas o en la produccin industrial de bebidas ( vino, cerveza) alimentos ( pan, queso), y los mas variados productos qumicos incluidos los antibiticos. Algunos pueden alterar los alimentos o utensilios humanos, pero muy pocos son patgenos.

Son conocidos desde hace mucho tiempo las intoxicaciones por setas venenosas, ms recientemente, las producidas por toxinas elaboradas por hongos contaminantes de alimentos ( micotoxinas). Pero el grupo ms importante en medicina es el constituido por hongos que producen infecciones clnicas por crecer en tejido cutneo o subcutneo, o ms profundamente.

OBJETIVOS
Realizar una siembra de hongos a partir de una caja contaminada.

Observar las caractersticas morfolgicas de los hongos

Reconocer los diferente medios de cultivo para el crecimiento de los hongos.

MARCO TEORICO

Los hongos poseen una estructura celular eucariota y se han incluido dentro del reino protista, con las algas y protozoos. Hoy por sus caractersticas morfolgicas, fisiolgicas, bioqumicas y ecolgicas forman un nuevo reino, FUNGI. Los hongos se caracterizan por ser clulas eucariotas y heterotrofas ( necesitan compuestos orgnicos como nutrientes), se presentan en forma de levadura, o de hifas poseen una pared rgida y se reproducen sexual o asexualmente. Las hifas pueden tener una serie de elementos con diversas misiones, como rganos apresorios ( para fijacin ), depredadoras ( para captura), estolones ( para bsqueda de

nuevas zonas nutritivas), rizoides( que penetran en el sustrato primitivo para buscar alimento). La parte de micelo que penetra en el sustrato y absorbe sustancias para la alimentacin, se conoce como micello vegetativo; la que se proyecta por encima de la superficie del sustrato se llama micello areo o reproductor, porque tiene entre otras la funcin reproductora o de dispersin de la especie, mediante esporas. Por su forma y superficie se distinguen diversos tipos de esporas, que pueden ser pigmentadas y proporcionar un determinado y caracterstico color a la colonia o talo del hongo

Clasificacin : El reino de los hongos se clasifica en dos grandes grupos: Myxomicota, en el que no se encuentran patgenos humanos, y Eumycota, en el que se distinguen cuatro subgrupos por la formacin de esporas sexuales y que son de inters patgeno: zygomycotina, ascomicotina, basidiomycotina, deuteromicotina.

MEDIOS DE CULTIVO PARA EL CRECIMIENTO DE HONGOS

Saboureaud: Contiene un 4-5% de azcar y esta constituido por una base de extracto de levadura y algunos extractos de carne, este medio se usa para el aislamiento de hongos. Patata - Dextrosa: para la produccin de esporas.

Mycosel: Patata- Dextrosa + antibitico, son de 2 clases : clorafenicol y cicloexamida, los antibiticos se usan para evitar el crecimiento de bacterias gram + y gram -; ideal para detectar hongos patgenos en uas, piel, cabello, etc. OGY: ( oxitetraciclina-glucosa-yeast), se usa para el control de alimentos ms que todo carnes y tambin para detectar hongos.

PARA OBSERVAR LOS HONGOS EN EL LABORATORIO SE DEBE TENER EN CUENTA:

1. las caractersticas de la colonia: color, olor. 2. El aspecto de la colonia: algodonoso, seco, etc.

MATERIALES
Medio A. Saboureaud Caja contaminada de hongos Caja de petri en forma de v Laminilla

Lamina portaobjeto Asa bacteriolgica Agua destilada KOH al 10% Lactofenol Microscopio Cinta de enmascarar Mechero.

PROCEDIMIENTO
La primera parte el A. Saboureaud se deja abierto por 5 minutos donde se pueda contaminar, luego se hace el repique de una caja contaminada. La segunda parte en la caja de petri en forma de v se coloca una lamina portaobjeto, luego se saca un trozo de agar y se pone sobre la lamina, luego se siembra el hongo en el trozo de agar oprimindolo con el asa, luego se agrega agua destilada alrededor y empapando la toalla dentro de la caja, por ultimo se tapa y se sella con cinta se incuba a 37 grados por 48 horas.

COLORACIN DE HONGOS TCNICAS:

En una lamina portaobjeto colocar KOH al 10%, luego se mezcla en el centro de la lamina con la muestra de hongos, luego se coloca una laminilla cubriendo esta solucin y se observa al microscopio.

En una lamina portaobjeto se coloca la muestra con una gota de azul de lactofenol, luego se coloca una laminilla cubreobjetos, y se observa al microscopio.

CONCLUCIONES
Se reconoci las diferentes formas de crecimiento de los hongos en un medio nutritivo.

Se conocieron cuales son os requerimientos que tienen los hongos para obtener un excelente crecimiento.

BIBLIOGRAFIA

MICROBIOLOGIA Y PARASITOLOGIA MEDICA; A Pumarola; Editorial Salvat, segunda edicin; 1987. MANUAL DE TECNICAS DE MICROBIOLOGIA MEDICA; F.J. Baker , Editorial Acribia. TOXICOLOGIA DE LOS ALIMENTOS. 2 edicin Ernest Linder. HIGIENE Y TOXICOLOGIA DE LOS ALIMENTOS. Bettu. C Hobbs. Editorial Acribia MTODOS MICROBIOLOGICOS; C. H Collins; editorial Acribia.

 MICROBOLOGA MDICA. JAWETZ, MELNICK Y ADELBERG. Ed. El Manual Moderno. Santaf de Bogot. 1996.