Anda di halaman 1dari 90

Instituto Oswaldo Cruz Curso de Vero 2013

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo

21 de janeiro a 01 fevereiro de 2013

Horrio: 8:00h s 17:00h

Coordenadores: Dr. Reginaldo Peanha Brazil Dr. Fabiano Borges Figueiredo Professores: Cristian Ferreira de Souza Andressa Alencastre Fuzari Rodrigues Camila Mesquita Rodrigues Tuanne Rotti Abrantes Jonathan Gonalves de Oliveira

Rio de Janeiro Janeiro/2013

- NDICE -

Captulo 1. OS PRIMEIROS PASSOS PARA SE DESENVOLVER UM PROJETO DE PESQUISA.............................................................................................................................. 5 1.1. Introduo .................................................................................................................... 5 1.2. Pesquisa de artigos cientficos .................................................................................. 5 1.3. Titulo do projeto .......................................................................................................... 6 1.4. Resumo do projeto...................................................................................................... 7 1.5. A Introduo de um projeto ........................................................................................ 7 1.6. A justificativa de um projeto ....................................................................................... 8 1.7. Objetivo do projeto ...................................................................................................... 8 1.8. Metodologia do projeto cientifico ............................................................................... 8 1.9. Cronograma................................................................................................................. 9 1.10. Resultados e Discusso ........................................................................................... 9 1.11. Referencia bibliogrfica .......................................................................................... 10 Captulo 2. EPIDEMIOLOGIA DAS LEISHMANIOSES .................................................... 11 2.1. Introduo .................................................................................................................. 11 2.2. Breve histrico das Leishmanioses ......................................................................... 11 2.3. Ciclo biolgico da Leishmania ................................................................................. 12 2.4. Os agentes etiolgicos na transmisso das Leishmanioses ................................ 12 2.5. Os vetores do ciclo de transmisso da Leishmaniose .......................................... 13 2.6. O papel dos reservatrios na transmisso da Leishmaniose ............................... 14 2.7. Epidemiologia da Leishmaniose .............................................................................. 15 2.8. Medidas preventivas e de controle da leishmaniose ............................................. 19 2.9. Tcnicas de Biologia Molecular empregada para diagnostico de leishmanioses nos estudos epidemiolgicos .......................................................................................... 19 Capitulo 3 - CAPTURA E TAXONOMIA DE FLEBOTOMNEOS .................................... 21 3.1. Introduo .................................................................................................................. 21 3.2. Morfologia e taxonomia dos flebotomneos ............................................................ 23 3.3. Captura dos flebotomneos ...................................................................................... 30 3.4. Montagem e Identificao dos flebotomneos ........................................................ 33 3.4.1. Preparao dos insetos para montagem ......................................................... 33 Captulo 4. EXPEDIO DE COLETA DE PEQUENOS MAMFEROS/ BIOSSEGURANA NO CAMPO ........................................................................................ 35

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

4.1. Introduo .................................................................................................................. 35 4.2. Planejamento ............................................................................................................ 36 4.2.1. Licenciamento de coleta.................................................................................... 37 Fig. 4.1 Modele de Licena Permanente de Coleta para coleta de material zoolgico. ...................................................................................................................... 38 4.2.2. Lista de materiais ............................................................................................... 39 4.3. Georreferencioamento e marcao de pontos/ Armadilhamento e preparao de iscas................................................................................................................................... 39 4.4. CADERNO DE CAMPO ........................................................................................... 41 4.5. IDENTIFICAO NO CAMPO ................................................................................ 41 4.6. BIOSSEGURANA NO CAMPO............................................................................. 41 4.7. Equipamentos de Proteo Coletiva ....................................................................... 42 4.8. Coleta de amostras................................................................................................... 43 4.8.1 Caritipo............................................................................................................... 43 4.9. Coleta para leishamanioses..................................................................................... 43 4.9.1. Coleta de Sangue .............................................................................................. 44 4.9.2. Coleta para Leishmaniose Tegumentar Americana ....................................... 44 4.9.3. Tcnica da coleta ............................................................................................... 44 4.10. Taxidermia e/ou conservao em meio lquido.................................................... 45 4.11. Etiquetagem ............................................................................................................ 45 4.12. Entrega das amostras ............................................................................................ 45 4.13. Consideraes Finais ............................................................................................. 45 4.14. Agradecimentos ...................................................................................................... 46 Captulo 5. LEISHMANIOSES CANINAS .......................................................................... 47 5.1. Introduo leishmaniose tegumentar canina....................................................... 47 5.1.2. A doena nos ces ............................................................................................ 47 5.2. Introduo leishmaniose visceral canina (LVC) .................................................. 48 5.2.1. A doena nos ces ............................................................................................ 49 5.3. Diagnstico das leishmanioses ............................................................................... 51 5.4. Tratamento ................................................................................................................ 54 5.5. Vacinas ...................................................................................................................... 55 5.6. Eutansia ................................................................................................................... 55 5.7. Medidas de controle dirigidas populao canina ................................................ 55 5.7.1. Controle da populao canina errante ............................................................. 55 5.7.2. Doao de animais: ces .................................................................................. 55

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

5.7.3. Uso de telas em canis individuais ou coletivos ............................................... 56 5.7.4. Coleiras Impregnadas com Deltametrina a 4%............................................... 56 Captulo 6. LEISHMANIA: CONSIDERAES SOBRE O PARASITO E A INTERAO COM OS HOSPEDEIROS ........................................................................... 57 6.1. Introduo .................................................................................................................. 57 6.2. Taxonomia ................................................................................................................. 58 6.3. Ultraestrutura............................................................................................................. 61 6.4. Interao de Leishmania com o hospedeiro invertebrado .................................... 63 6.5. Metaciclognese ....................................................................................................... 66 6.6. Interao de Leishmania com o hospedeiro vertebrado ....................................... 66 6.7. Leishmaniose ............................................................................................................ 68 6.8. Leishmaniose Tegumentar (LT)............................................................................... 69 6.9. Leishmaniose Visceral (LV) ..................................................................................... 70 REFERNCIAS .................................................................................................................... 72 Captulo 1 .......................................................................................................................... 72 Captulo 2 .......................................................................................................................... 72 Captulo 3 .......................................................................................................................... 77 Captulo 4 .......................................................................................................................... 78 Captulo 5 .......................................................................................................................... 78 Captulo 6 .......................................................................................................................... 83

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Captulo 1. OS PRIMEIROS PASSOS PARA SE DESENVOLVER UM PROJETO DE PESQUISA Cristian Ferreira de Souza 1.1. Introduo
Um projeto de pesquisa o esqueleto que sustenta um estudo a ser desenvolvido, o processo de elaborao, execuo e apresentao da pesquisa. Para que o estudo tenha consistncia, o projeto deve abordar questes como: o que, por que, como e quando pesquisar? O projeto de pesquisa tem por objetivo esclarecer essas questes, auxiliando seu autor, a saber, de onde est partindo e onde pretende chegar. Desenvolver um projeto no to simples como fazer um bolo, no se tem uma receita para que se possa seguir, porm existem etapas e questionamento os quais devemos estar sempre atentos para no esquecer. O primeiro passo ao desenvolver um projeto conhecer o assunto o qual ser trabalhado, para tanto o habito da leitura essencial. A leitura importante para a construo da fundamentao terica, que da sustentao a pesquisa a ser realizada, para isso a leitura de artigos cientficos so de valiosa importncia para se iniciar o conhecimento do assunto a ser abordado, essas leituras devem ser realizadas sempre buscando uma anlise critica dos textos. atravs dos que podemos nos informar dos estudos que j formam realizados e que atualmente vem sendo desenvolvidos, e por meio da leitura que acusamos nossa curiosidade em buscas de questes at o momento ainda no resolvidas. Aps se conhecer mais sobre o assunto hora de iniciar a escrita propriamente dita do projeto. No entanto, um projeto sempre precedido por uma pergunta que pretendemos responder, e para respond-la precisamos fragment-la em elementos que podem variar dependendo das orientaes da instituio a qual a pesquisa est vinculada. Esses elementos nos permitem apresentar a ideia do trabalho a ser desenvolvida e como ser desenvolvida e a quais resultados esperamos chegar. Basicamente os elementos so: capa, folha de rosto, sumario, resumo, abstract, introduo, reviso literria, justificativa, objetivo, cronograma, resultados a serem alcanados, referencia bibliogrfica.

1.2. Pesquisa de artigos cientficos


Atualmente inmeros so os sites de pesquisa de artigos cientficos porem uma grande dificuldade o acesso gratuito, nem todos os sites disponibilizam 5

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

trabalhos de forma gratuita e sem custos ao leitor. Hoje uma grande ferramenta de acesso ao conhecimento cientifico, e que se encontra a nossa disposio, o Portal de Peridicos Capes, criado em 2000 pela Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES), uma biblioteca virtual que rene e disponibiliza a instituies de ensino e pesquisa no Brasil um acervo de mais de 33 mil ttulos com texto completo, 130 bases referenciais, dez bases dedicadas exclusivamente a patentes, alm de livros, enciclopdias e obras de referncia, normas tcnicas, estatsticas e contedo audiovisual. O Portal se constitui hoje em um dos maiores acervos mundiais no apoio a aquisio de peridicos eletrnicos, o que vem garantindo o apoios aos grande avano da cincia brasileira. O acesso ao Portal CAPES se da pelo endereo: http://www.periodicos.capes.gov.br/. (Figura 1.1)

Figura 1.1. Imagem da pagina principal de acesso ao Portal Capes (Fonte: http://www.periodicos.capes.gov.br/). Alm do portal capes podemos encontrar publicaes cientificas disponveis em diversos outros endereos eletrnicos, aqui citamos alguns: www.scielo.br; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed; http://www.webofknowledge.com. scholar.google.com.br/; www.scopus.com;

1.3. Titulo do projeto


Deve ser conciso e falar o que se pretende fazer no estudo.

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

1.4. Resumo do projeto


Quando preparamos um resumo buscamos sintetizar de forma clara o objetivo do estudo ou investigao. Para alcanar este objetivo, necessrio resumir a metodologia bsica (identificando a rea de estudo, demonstrando as populaes, animais ou amostras a serem selecionadas e os mtodos de observao e anlise utilizados) e os resultados alcanados, elucidando as perspectivas do trabalho. Uma dica que se deixe o resumo como ultimo item a ser escrito no projeto, pois assim o pesquisador ter um aporte maior de informaes para a elaborao do mesmo.

Ainda junto ao resumo, porm em uma linha parte devemos identificar trs palavras-chaves que possam auxiliar na busca do projeto.

1.5. A Introduo de um projeto


A introduo o momento que se busca a fundamentao do estudo ou da observao a que se propem o projeto, e a parte onde se faz uma breve apresentao do tema proposto. O pesquisador neste momento explicar como chegou a um questionamento e o motivo pelo qual h uma inquietao a respeito do tema que se prope pesquisar. E importante que na introduo tenha, de forma sintetizada, um histrico sobre o tema a ser abordado, assim como as motivaes que levaram a prop-lo. claro que tudo que for escrito com base em outros autores dever ser devidamente referenciado. Ao se ler a introduo, o leitor dever ter uma viso clara e exata do que a pesquisa trata, o assunto que ela abordar, sua importncia. A clareza do texto de grande valor, pois ela deve permitir que mesmo um leigo no assunto possa entender os aspectos essenciais do tpico que est sendo investigado. de grande relevncia que o pesquisador no utilize um tema muito amplo, como por exemplo: a epidemiologia das leishmanioses, as leishmanioses, As vacinas, entre outros, esses temas possuem uma grande quantidade de contedos e o que provavelmente no ser alcanado em nico estudo. Portanto, interessante que o tema seja limitado, de forma a ser pensado no local a ser estudado, com a especificidade da rea escolhida para a pesquisa. Outra preocupao que o pesquisador deve ter em relao ao tema a afinidade com a rea da qual ele o tema faz parte. E de suma importncia que o pesquisador procure escolher um assunto que seja de uma rea de conhecimento, dentro da sua formao, com a qual ele se identifique.

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

1.6. A justificativa de um projeto


A justificativa talvez seja o principal momento do projeto, aqui que o pesquisador devera enumerar as razes que o levaram a escolher o tema e o local para o estudo. O pesquisador deve demostrar a relevncia do estudo para o meio cientifico e social. Deve demostrar tambm, quais os benefcios os resultados alcanados pela pesquisa trar tanto para a comunidade quanto para a Cincia. Existem projetos que no possuem o tpico justificativa, quando isso acontece o pesquisador ir incluir o contedo da justificativa junto a introduo como parte final da introduo.

1.7. Objetivo do projeto


Um bom projeto de pesquisa deve ter definido claramente o objetivo que se espera alcanar. Tem que ter coerncia com o tema proposto e estar ligado diretamente a metodologia proposta no projeto. O objetivo de forma resumida a finalidade do projeto. Normalmente os objetivos so divididos em Geral e especficos, onde o objetivo geral define explicitamente a inteno do estudo. J os objetivos especficos so o detalhamento do objetivo geral, o que nem sempre obrigatrio. O objetivo deve ser escrito de forma direta e geralmente os verbos usados na escrita aparecem no infinitivo, tais como: apontar, citar, conhecer, definir, relatar, diferenciar, desenvolver, organizar, traar, comparar, diferenciar, construir, avaliar, etc.

1.8. Metodologia do projeto cientifico


Ao redigir a metodologia, o pesquisador deve estar ciente que este o momento de fazer uma sntese de como se pretende realizar a pesquisa. Neste tpico sero informados detalhes do local onde se pretende realizar o estudo, os instrumentos que sero utilizados, os mtodos que sero empregados, os materiais, procedimentos e as etapas da pesquisa. Neste momento o autor ir responder a seguinte pergunta: como se pretende fazer a pesquisa? Aqui mostramos alguns tpicos interessantes a serem includos na metodologia, caso seja contemplado no estudo pretendido: Identificao da populao a qual ser coletada as amostras; Critrios adotados para a seleo de material usado como amostragem; Forma de operacionalizao da coleta de dados; Forma de interpretao do material coletado - analise laboratorial e estatsticas das amostras; Princpios ticos da pesquisa - informar as autorizaes dos comits responsveis pela pesquisa. 8

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

1.9. Cronograma
O projeto de pesquisa deve ter uma previso para inicio e termino de todas as atividades envolvidas no estudo. O cronograma um elemento do projeto que utilizado justamente para demostrar essa previso, ele procura expressar se possvel conciliar as atividades propostas com o tempo previsto para a execuo do projeto. Ele permite ao pesquisador avaliar continuamente o andamento do projeto e administrar, de forma mais adequada, o tempo de que ainda dispe para a execuo das demais etapas planejadas. O cronograma tambm possibilita que os coordenadores das instituies de pesquisa acompanhem o andamento do trabalho desenvolvido. Normalmente o cronograma redigido em forma de tabela como demonstrado na Figura 1.2.
BIMESTRES ATIVIDADES 1 Escrita do projeto Reviso bibliogrfica Definio dos locais de coletas Coleta de amostras Analise laboratoriais Elaborao do banco de dados Analise e esttica dos dados Redao do artigo, dissertao, tese ou da monografia. 2 ANO I 3 4 5 6 1 2 ANO II 3 4 5 6

Fig. 1.2. Exemplo de um cronograma de atividades de um projeto cientifico. A Figura 1.2. apenas um exemplo, os quadros devero ser preenchidos de acordo com a realidade de cada projeto, as datas, os perodos, as descries das atividades, tudo isso ser preenchido de acordo com o que se pretende realizar na execuo do projeto.

1.10. Resultados e Discusso


Durante essa etapa o autor dever descrever onde pretende chegar com os resultados de seu estudo. Como esses resultados sero utilizados tanto pelo meio cientficos quanto para a comunidade? As aes de disseminao dos resultados devem ser pensadas. A proposta de divulgao poder ser planejada em nvel local, regional, regional, mundial incluindo: a divulgao por meio de publicao podero ser por meio de livros, artigos para revistas/jornais, vdeos, seminrios, congressos; a divulgao atividades que 9

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

podem ser atravs de palestras, reunies; e o pblico que se pretende atingir se a comunidade envolvida no estudo, os setores acadmicos, Organizaes no governamentais, rgos Pblicos, entre outros; O autor deve mostrar que seu projeto slido e trar retorno diretamente para a sociedade.

1.11. Referencia bibliogrfica


Nesse momento o autor dever especificar todas as citaes que fora feitas ao longo do projeto. Apenas devem ser citados trabalhos consultados que realmente foram utilizados durante a elaborao do projeto. Esse trabalho de citao bibliogrfica um dos pressupostos ticos da pesquisa cientfica. As referncias permitem ao leitor verificar as fontes de informao usadas na elaborao do projeto, possibilitando o mesmo de recuperar e confrontar dados mencionados nos projetos. Para a elaborao das referencias bibliogrficas so estabelecidas normas tcnicas que devem ser seguidas. No Brasil as normas mais aceitas so estabelecidas pela Associao Brasileira de Normas Tcnicas (ABNT).

10

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Captulo 2. EPIDEMIOLOGIA DAS LEISHMANIOSES Cristian Ferreira de Souza 2.1. Introduo


As leishmanioses constituem um complexo grupo de doenas causadas por protozorios do gnero Leishmania. A princpio, so consideradas como uma zoonose podendo acometer o homem, quando o mesmo entra em contato com o ciclo de transmisso do parasito, transformando-se em uma antropozoonose que considerada um grande problema de sade pblica. Sua transmisso natural ocorre pela picada de fmeas de flebotomneos. As leishmanioses foram separadas em dois grupos, a leishmaniose visceral (LV), tambm conhecida como calazar, e a leishmaniose tegumentar ou cutnea (LT), que recebe este nome por afetar principalmente a estrutura da pele e das mucosas. Essa separao se deve de acordo com as diferenas e peculiaridades das caractersticas clnica e epidemiolgica de cada grupo. Segundo a Organizao Mundial da Sade (OMS) estima que 350 milhes de pessoas estejam expostas ao risco de contrair a doena, com registro aproximado de dois milhes de novos casos das diferentes formas clnicas a cada ano.

2.2. Breve histrico das Leishmanioses


A descoberta dos agentes etiolgicos das leishmanioses ocorreu no final do sculo XIX, quando Cunningham (1885), na ndia, descreveu formas amatigotas em casos de calazar. Posteriormente, em 1898, o pesquisador russo Borovisky demonstrou ser um protozorio. (FIOCRUZ, 2012) Os primeiros relatos e descrio na literatura de LT surgiram no sculo I d.C., na sia Central, ao norte do Afeganisto, onde era conhecida como lcera de Balkh (Laveran, 1917). Nas Amricas, os primeiros registros foram em cermicas incas, entre os anos de 400 e 900 do sculo I d.C., onde se encontraram imagens humanas com mutilaes de lbios e nariz, sintomas caractersticos da leishmaniose mucocutnea (Lainson; Shaw, 1988). No Brasil, a primeira confirmao de um caso de Leishmaniose com leses cutneas e nasofarngeas se deu na cidade de Bauru, interior do estado de So Paulo em 1909, por Lindenberg, que encontrou formas de Leishmania, idnticas Leishmania (Leishmania) tropica (Wright, 1903), um dos agentes da leishmaniose tegumentar do Velho Mundo, em indivduos que trabalhavam nas matas do interior do estado (Pessa; Martins, 1982). Gaspar Vianna, em 1911, (Silveira et al., 1997) em suas observaes, considerou o parasito diferente da L. tropica, e deu o nome de Leishmania (Viannia) braziliensis (Vianna, 1911), ficando 11

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

assim denominado o agente etiolgico da "lcera de Bauru", "ferida brava" ou "nariz de tapir". J os primeiros casos relatados de LV no Brasil ocorreram em 1913 e foram descritos no Paraguai por Migone, ao analisar de material de necropsia de paciente oriundo de Boa Esperana, Mato Grosso (Alencar; Dietze, 1991). Posteriormente, foram encontrados 41 casos positivos para Leishmania, em indivduos das regies Norte e Nordeste do pas, durante o desenvolvimento de um estudo para diagnstico e distribuio da febre amarela no Brasil (Penna, 1934). A partir dessas pocas tanto LV quanto LT vieram sendo descritas em vrios municpios localizados nas mais diversas regies do pas, com uma menor prevalncia na regio sul. A doena vem nos ltimos anos mudando seu padro de transmisso, o que inicialmente era uma doena apenas de rea silvestre, com caractersticas de ambientes rurais, vem se desconfigurando e se reestruturando com um padro de transmisso em reas com caractersticas de grandes centros urbanos e periurbanos, distribudos por todo o Brasil.

2.3. Ciclo biolgico da Leishmania


A transmisso de Leishmania ao ser humano e outros mamferos normalmente se d quando a fmea de flebotomneo infectada pica o hospedeiro vertebrado, durante o repasto sanguneo, ingerindo macrfagos infectados pelas formas amastigotas. O ciclo de vida de Leishmania intracelular: o parasito se desenvolve e se multiplica dentro dos macrfagos, clulas do sistema mononuclear fagocitrio. As amastigotas, ao serem ingeridas pelos flebotomneos, se multiplicam e se transformam em formas extracelulares, flageladas, alongadas e mveis, no intestino do inseto, denominadas de promastigotas. (Pimenta et al., 2003; Desjeux, 2004). Os flebotomneos infectados, ao realizarem um novo repasto sanguneo, transmitem para o hospedeiro vertebrado as promastigotas que tendem a ser fagocitadas pelos macrfagos, onde se transformam em amastigotas. A multiplicao dos protozorios no interior das clulas ocupa todo o citoplasma, deslocando o ncleo at o rompimento da membrana celular, ocasionando a liberao das amastigotas no tecido, sendo essas novamente fagocitadas, dando continuidade ao ciclo biolgico (Nieves; Pimenta, 2000; Rey, 2001; Pimenta et al., 2003).

2.4. Os agentes etiolgicos na transmisso das Leishmanioses


Como mencionado anteriormente, as leishmanioses so compostas por um grupo de doenas que possuem formas clnicas e epidemiolgicas diferentes. A LT, 12

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

por exemplo, pode se apresentar das seguintes formas: cutnea, com leses discretas de pele que se curam dentro de alguns meses, deixando cicatrizes; cutnea difusa disseminada, que produz leses crnicas de pele de difcil tratamento; e mucocutnea, que apresenta leses que podem destruir total ou parcialmente as mucosas do nariz, boca e garganta, alm das cavidades e tecidos circundantes (Brasil, 2007). J a LV, tambm conhecida como kala-azar, caracterizada por febre alta, perda de peso substancial, inchao do bao e do fgado e anemia. Se deixada sem tratamento, a doena pode ter uma taxa de mortalidade to elevada quanto 100% em dois anos (WHO, 2012). O gnero Leishmania constitui um grupo de espcies morfologicamente muito similares. Um exemplo que at a dcada de 70, todos os casos de LT, no Brasil, eram associados L. braziliensis. Com o aprimoramento das tcnicas de anlise e a intensificao dos estudos ecolgicos e epidemiolgicos, outras espcies foram descritas. Atualmente, nas Amricas, so conhecidas 11 espcies dermotrpicas de Leishmania causadoras de doena humana. No Brasil, j foram identicadas sete espcies, sendo 6 do subgnero Viannia e uma do subgnero Leishmania (Lainson; Shaw, 1987; Brasil, 2009). As espcies L. (Vianna) guyanensis (Floch, 1954), L. (Vianna) braziliensis e L. (Leishmania) amazonenses (Lainson & Shaw, 1972), so os principais agentes responsveis pela maioria dos casos de LT no Brasil. J na LV do novo mundo a espcie frequentemente isolada a L. (Leishmania) chagasi [sinnimo L. (L.) infantum] (Cunha, Chagas, 1937).

2.5. Os vetores do ciclo de transmisso da Leishmaniose


Os vetores da LT so insetos denominados flebotomneos, pertencentes Ordem Dptera, Famlia Psychodidae, Subfamlia Phlebotominae, que se infectam no momento em que as fmeas picam para se alimentar de sangue do vertebrado infectado (Ashford, 2000). As primeiras espcies de flebotomneos registradas nas Amricas foram descritas no ano de 1907 e at 1940 se limitavam a 33 espcies. Com a incriminao de algumas espcies de flebotomneos como transmissores de leishmanioses o interesse de estudar estes insetos aumentou e o quadro das espcies conhecidas mudou, passando atualmente para aproximadamente 500 espcies e subespcies descritas nas Amricas. O Brasil possui uma grande variedade de espcies de flebotomneos, sendo o pas com maior nmero de espcies e subespcies, em torno de 229, em todo mundo (Aguiar; Medeiros, 2003). As principais espcies envolvidas na transmisso da LT, no Brasil, so: Bichromomyia flaviscutellata (Mangabeira, 1942), Nyssomyia whitmani, Nyssomyia 13

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

umbratilis (Ward & Fraiha, 1977), Nyssomyia intermedia, Psychodopygus wellcomei (Fraiha, Shaw & Lainson, 1971) e Migonemyia migonei (Frana, 1920). No municpio de Timteo, j foram relatadas as presenas de Ny. intermedia, Ny. whitmani, Br. flaviscutellata e Mg. migonei, sendo essas as principais espcies encontradas no estado de Minas Gerais e envolvidas na transmisso de LT (Aguiar; Medeiros, 2003; Souza et al, 2009; Brasil, 2007). J na transmisso da LV, no Brasil, apenas duas espcies, esto relacionadas com a transmisso da doena, sendo elas: Lutzomyia longipalpis considerada a principal espcie transmissora da L. (L.) chagasi no Brasil; e Lutzomyia cruzi tambm incriminada como espcie vetora (Brasil, 2006). Os flebotomneos so insetos holometablicos, suas formas imaturas tm o habitat terrestre, desenvolvendo-se em locais ricos em matria orgnica em decomposio, especialmente de natureza vegetal (Aguiar; Medeiros, 2003). Os abrigos utilizados pelos flebotomneos adultos variam de acordo com o micro-habitat, estao do ano, umidade relativa do ar e de acordo com a espcie. Os ventos e chuvas podem influenciar no nvel de atuao dos flebotomneos, sendo os fenmenos mais importantes na inibio da atividade desses insetos, embora quando moderados no impeam sua atividade. O ciclo lunar tambm interfere

consideravelmente na distribuio dos flebotomneos, principalmente em noites mais claras, proporcionadas pela lua cheia. Assim, a densidade populacional dos flebotomneos pode ser afetada por fatores climticos, alteraes do micro -habitat, disponibilidade de sangue para o repasto das fmeas, competio entre espcies e fatores ligados a alteraes antrpicas do ambiente (Aguiar et al., 1987; Ferro et al., 1997).

2.6. O papel dos reservatrios na transmisso da Leishmaniose


Segundo o Ministrio da Sade, considerado como reservatrio, a espcie ou o conjunto de espcies que garantem a circulao de um determinado parasito na natureza, dentro de um recorte de tempo e espao. A disperso da leishmaniose est diretamente ligada aos movimentos de seus reservatrios, e identific-los de fundamental importncia para o controle efetivo da transmisso (Brasil, 2007). Segundo Lainson e Shaw (1988), os reservatrios de leishmaniose podem ser classificados em dois tipos: reservatrio primrio, que se refere aos reservatrios infectados que albergam o parasito e so responsveis pela manuteno do ciclo do parasito na natureza; e reservatrio secundrio, que se refere situao onde o animal est infectado, mas incapaz de manter o ciclo do parasito. A infeco dos reservatrios por Leishmania j foi descrita em espcies de animais silvestres, sinantrpicos e domsticos.

14

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Os reservatrios silvestres naturais de Leishmanioses tm sido alvo de vrios estudos desde as primeiras dcadas do sculo XX e muitos relatos tm sido documentados, como a presena de Leishmania em roedores, marsupiais, edentados e candeos silvestres, a participao de roedores na epidemiologia das leishmanioses j vem sendo descrita no Brasil (Nry Guimares et al., 1968; Brasil, 2007). Alm dos estudos envolvendo animais silvestres, alguns autores j relataram a infeco por Leishmania em animais domsticos, tais como: sunos (Brasil et al., 1987), felinos (Pennisi et al., 2004; Souza, 2005) e equinos (Aguilar et al., 1986), porm seu papel na manuteno do parasito no meio ambiente ainda no foi esclarecido. Em reas urbanas, endmicas de LV, o co apontado como a principal fonte de infeco e tambm j h relato na literatura com ces encontrados infectados por L. (V.) braziliensis em reas endmicas de LT (Gintijo et al., 2002, Madeira et al.,2003), porem ainda no se pode afirmar que sejam um reservatrio na transmisso de LT, pois no h evidncias cientcas que comprovem o seu papel como reservatrio, sendo considerados reservatrios acidentais da doena (Brasil, 2007). O ministrio da Sade no recomenda aes de controle de animais silvestres e sinantrpicos em reas endmicas de leishmaniose e nos casos de animais domsticos apenas com LV recomendado a eutansia, j em reas com LT s permitida a eutansia quando as leses mucosas e infeces secundrias causem sofrimento ao animal. Desta forma, conhecer a biologia dos reservatrios importante para oferecer alternativas mais eficazes para o controle dos vetores (Lainson; Shaw, 1988; Brasil, 2007).

2.7. Epidemiologia da Leishmaniose


Segundo dados da Organizao Mundial de Sade (OMS), as leishmanioses encontram-se atualmente distribuda em 96 pais e trs territrios, com estimativa de registro de aproximadamente 0,2 a 0,4 milhes de casos de LV e 0,7 a 1,2 milhes de casos de LT ocorrendo a cada ano. No estudo desenvolvido por Alvar et al. (2012), foram apresentados informaes de registros de casos de LV e LT em 96 pases, dados informados pelo OMS, verificou-se que entre os pases com maior numero de casos por ano de LV esto concentrados em apenas seis pases, somando aproximadamente 90% dos casos relatados, sendo eles: ndia, Bangladesh, Sudo, Sul do Sudo, Brasil e Etipia. Ainda no estudo de Alvar et al. (2012) foi verificado que os casos de LT so mais amplamente distribudos, onde os dez pases com maior numero de casos por anos so: Arbia Saudita, Lbia, Peru, Tunsia, Paquisto, Colmbia, Afeganisto, Sria, Brasil e Arglia que juntos representam 15

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

aproximadamente 76% dos casos registrados (Alvar et al, 2012) (Figura 2.1). A Organizao Mundial de Sade considera a Leishmaniose como uma das seis mais importantes doenas infecciosas. Pelo seu alto coeficiente de deteco e capacidade de produzir deformidades, classificada como uma doena negligenciada, devido aos limites dos recursos investidos em diagnstico, tratamento, controle e sua grande associao populao de baixa renda (WHO, 2012; Brasil, 2007; CDC, 2012). A epidemiologia das leishmanioses nas Amricas complexa, com variao nos ciclos de transmisso, reservatrios, vetores, manifestaes clnicas e resposta terapia, alm das espcies de Leishmania que circulam na mesma rea geogrfica. A leishmaniose era, predominantemente, uma doena profissional, relacionada com atividades como extrao de borracha, operaes militares, construo de estradas e de desenvolvimento agrcola. A exposio ocupacional continua a ser importante, mas o desmatamento generalizado levou a um rpido aumento no nmero de casos, mudando os aspectos epidemiolgicos da doena. No Brasil, de acordo com do Ministrio da Sade (Brasil, 2012), foram notificados durante o perodo de 1991 a 2011 um total de 563.209 casos de LT e 66.745 casos de LV (Tabela 2.1). Verificando a evoluo dos casos de LT no Brasil, observa-se uma expanso geogrfica, sendo que, no incio da dcada de 80, foram registrados casos autctones em 19 unidades federadas e, no ano de 2003, foi confirmada autoctonia em todas as unidades federadas do pas. Sendo que 36,65% e 34,29% dos casos registrados entre 1991 e 2011 de LT se concentram nas regies norte e nordeste respectivamente. A Figura 2.1 descreve o crescimento dos casos notificados de LV, principalmente nos ltimos anos 10 anos, sendo que a regio onde se concentra o maior nmero de casos de LV a regio nordeste com 68,86%. O aumento dos casos de leishmaniose ao longo dos anos devido s aes humanas sobre o meio ambiente. Aes que atuam diretamente na mudana de comportamento e habitat, tanto dos vetores quanto dos reservatrios, possibilitando a seleo de espcies e adaptao ao ambiente antrpico, explicando, em parte, a persistncia das leishmanioses em rea domiciliar e peridomiciliar. Alm disso, as habitaes humanas de m qualidade ou em locais inadequados, a construo desordenada de abrigos de animais domsticos no ambiente peridomiciliar e a carncia de condies mnimas de saneamento bsico so condies comuns em reas rurais e perifricas de centros urbanos (Teodoro, 1996; Teodoro et al., 2001; Lima et al., 2002). Nessas reas, os mamferos reservatrios de Leishmania spp. tm sobrevivido e os flebotomneos tm sido capturados em grande nmero (Teodoro, 1996; Carvalho et al., 2010) favorecendo a infeco humana e de animais domsticos.

16

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Alm da incidncia da doena aumentar substancialmente, os sub-registros de casos nos impede de conhecer a magnitude do problema. O controle das leishmanioses uma das prioridades da OMS. Medidas como eliminao de vetores com inseticidas no domiclio e peridomiclio, colares impregnados para prevenir a infeco canina, alm do sacrifcio de ces com LV, no causaram o impacto esperado. Uma vacina eficaz seria uma alternativa, porm o que se tem at o momento so pesquisas clnicas (Desjeux, 2004; FUNASA, 1999; Brasil, 2007). Tabela 2.1. Distribuio anual dos casos humanos notificados, populao e coeficiente de deteco para LV e LT, no Brasil, no perodo de 1991 a 2011
ANOS 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 TOTAL CASOS HUMANOS LV 1.510 1.870 2.570 3.426 3.885 3.246 2.570 1.977 3.624 4.858 2.549 2.450 2.971 3.580 3.597 3.651 3.446 3.852 3.693 3.526 3.894 66.745 LT 28.450 24.668 27.454 35.103 35.748 30.030 31.303 21.801 30.367 33.720 26.636 28.361 30.814 28.737 26.685 22.397 21.407 19.992 21.824 21.981 15.731 563.209 POPULAO
(1)

146.825.475 149.236.984 151.571.727 153.725.670 155.822.440 157.070.163 159.636.413 161.790.311 163.947.554 166.112.518 172.385.826 174.632.960 176.871.437 181.581.024 184.184.264 186.770.562 183.989.711 189.612.814 191.480.630 190.747.855 192.379.287 -

COEFICIENTE DE DETECO (x100.000 hab.) LV LT 1,03 19,38 1,25 16,53 1,70 18,11 2,23 22,83 2,49 22,94 2,07 19,12 1,61 19,61 1,22 13,47 2,21 18,52 2,92 20,30 1,48 15,45 1,40 16,24 1,68 17,42 1,97 15,83 1,95 14,49 1,95 11,99 1,87 11,63 2,03 10,54 1,93 11,40 1,85 11,52 2,02 8,18 -

Nota: (1) Dados referentes estimativa da populao para o municpio de Timteo, segundo IBGE1.

http://www.ibge.gov.br

17

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

6.000

3,50

5.000

3,00

2,50

Nmero de casos

4.000 2,00 3.000 1,50 2.000 1,00

1.000

0,50

0 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011

0,00

Ano
Casos de LV Coeficiente

Fig. 2.1. Distribuio anual dos casos humanos notificados e dos coeficientes de deteco para LV, no Brasil, de 1991 a 2011. (Dados obtidos no portal do Ministrio da Sade: http://portal.saude.gov.br/portal/saude )
T

Coeficiente de deteco (x100.000 hab.) 18

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

2.8. Medidas preventivas e de controle da leishmaniose


Segundo o Ministrio da Sade h como diminuir os riscos de transmisso das leishmanioses, para isso necessrio algumas medidas tais como: uso de repelentes, em ambientes onde possam ser encontrados vetores de leishmaniose; uso de mosquiteiros de malha fina; telagem de portas e janelas; limpeza de quintais e terrenos, dificultando o estabelecimento de criadouros para formas imaturas do vetor; poda de rvores a fim de diminuir o sombreamento do solo e evitar as condies favorveis para o desenvolvimento de larvas de flebotomneos; destino adequado do lixo orgnico impedindo a permanncia de roedores, possveis hospedeiros de Leishmania e limpeza peridica dos abrigos de animais domsticos (Brasil, 2012). Em virtude das caractersticas epidemiolgicas da LTA, as estratgias de controle devem ser flexveis, distintas e adequadas a cada regio ou foco em particular. A diversidade de agentes, de reservatrios, de vetores e a situao epidemiolgica da LTA, aliada ao conhecimento ainda insuficiente sobre vrios aspectos, evidenciam a complexidade do controle desta endemia (Brasil, 2012).

2.9. Tcnicas de Biologia Molecular empregada para diagnostico de leishmanioses nos estudos epidemiolgicos
Diagnosticar e identificar Leishmania sempre foi um grande desafio. Ross, em 1903, tentou classificar os parasitos do gnero Leishmania apenas considerando aspectos clnicos e epidemiolgicos da doena, pois a distino de espcies atravs da morfologia do parasito nunca foi um mtodo fcil, devido a similaridade entre as espcies e sua diferenas morfolgicas minsculas. Da dcada de 80 em diante, tcnicas de biologia molecular vm sendo desenvolvidas para a deteco e identificao precisa desses parasitos, sem a necessidade de isolamento em cultura, auxiliando na caracterizao taxonmica das espcies de Leishmania (Quaresma et al, 2009; Margonari et al, 2010; Quaresma et al, 2011, Saraiva et al, 2010). Entre as tcnicas de biologia molecular, a que vem sendo mais empregada a tcnica de PCR (Reao em cadeia da polimerase), mtodo esse baseado na amplificao de fragmentos de DNA (cido desoxirribonuclico) e que tm sido desenvolvido para a deteco de material gentico de Leishmania (Schallig; Oskan, 2002). A PCR tem sido utilizada para vrias finalidades, desde o diagnstico at monitoramento do tratamento e estudos epidemiolgicos. Esta tcnica tem sido descrita como um mtodo sensvel para a deteco do parasito, independente da imunocompetncia ou da histria clnica do paciente (Weiss, 1995). Apesar de ser um mtodo sensvel para a deteco de Leishmania em uma variedade de amostras 19

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

biolgicas de humanos e ces, a PCR tem sido mais utilizada em estudos epidemiolgicos do que no diagnstico de rotina (Solano-Gallego et al, 2001). A PCR um mtodo que vem inovando a pesquisa com vetores e reservatrios de Leishmania spp. um mtodo que possui alta sensibilidade e especificidade, com resultados rpidos e seguros. Esse mtodo se baseia na sntese de milhares de cpias de DNA in vitro catalisada pela Taq DNA polimerase. A tcnica requer o conhecimento do DNA alvo de um determinado organismo, para o desenvolvimento de oligonucleotdeos iniciadores ( primers) que iro hibridizar-se especificamente sequncia alvo (Yang; Rothman, 2004; Roselino, 2008; Soares et al., 2005). A PCR tambm tem sido muito utilizada para diagnstico etiolgico da leishmaniose por se tratar de uma tcnica mais sensvel que as convencionais (Garcia et al., 2005). Em um estudo realizado no estado de So Paulo, foram comparadas as tcnicas de identificao do parasito por PCR e deteco histopatolgica. Os autores relataram que a tcnica de PCR demonstrou ser superior deteco histopatolgica de Leishmania para o diagnstico da LTA (Medeiros et al., 2002). Para se identificar as diferentes espcies de Leishmania, tanto em flebotomneos quanto nos diagnsticos etiolgicos, tem sido descrita na literatura, a utilizao de uma grande quantidade de enzimas de restrio, por se tratar de um mtodo mais barato e mais rpido (Garcia et al., 2005; Rotureal et al., 2006). Alm do bom desempenho no diagnstico etiolgico, a PCR tem sido muito utilizada nos estudos epidemiolgicos que buscam identificar animais silvestres ou domsticos como possveis hospedeiros reservatrios de diferentes espcies de Leishmania (Solano-Gallego et al. 2001, Brando Filho et al. 2003; Oliveira et al, 2005, Quaresma et al, 2009). Apesar do grande avano tecnolgico, os mtodos de biologia molecular apresentam limitaes que incluem falsos-positivos devido contaminao, falsosnegativos devido baixa carga parasitria em alguns tecidos e tambm limitaes intrnsecas da PCR como a presena de inibidores da reao (Yang; Rothman, 2004).

20

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Capitulo 3 - CAPTURA E TAXONOMIA DE FLEBOTOMNEOS Andressa Alencastre Fuzari Rodrigues 3.1. Introduo
Os insetos pertencem ao grande filo dos animais de patas articuladas Arthropoda. No estgio adulto so caracterizados pelo corpo dividido em trs regies: cabea, trax e abdmen e pela presena de pares de pernas inseridas no trax. As regies do corpo e nmero de pernas permitem que esses animais sejam agrupados em diferentes classes. A classe Insecta, por exemplo, distingue-se primariamente por apresentar trax tri-segmentado, suportando em cada segmento um par de pernas. Dessa forma, essa classe tambm foi denominada de Hexapoda por possurem o total de seis pernas. Os insetos adultos tpicos possuem o corpo dividido em cabea (regio anterior) onde se situam os olhos, antena e trs pares de peas bucais. A regio seguinte o trax, composto de trs segmentos, cada um com um par de pernas e em muitos grupos, o segundo e o terceiro segmentos com um par de asas. A regio posterior do corpo o abdmen, composto de 9 a 11 segmentos e no possuem pernas. Do oitavo ao dcimo segmentos, geralmente possuem apndices modificados que servem cpula ou oviposio. Em alguns grupos esses apndices tambm so importantes para a taxonomia. O exoesqueleto dos insetos, como em outros Arthropoda, prov a proteo dos rgos vitais e manuteno da forma do corpo. As principais partes dos rgos vitais consistem: trato digestivo; traquias tubulares (respirao); vaso dorsal (sistema circulatrio); um par de rgos reprodutores; msculos (sistema muscular) e sistema nervoso composto de crebro e pares de gnglios segmentares. Os insetos so geralmente ovparos, exceto algumas espcies que so vivparas. O inseto jovem de tempos em tempos sofre mudanas de exoesqueleto (ecdise/muda) para poder atingir o estado adulto. Esse desenvolvimento pode ser classificado em: Hemimetbolo (metamorfose gradual ou incompleta) quando

todos os estgios imaturos, da ecloso ao adulto, so chamados de ninfas, ou quando aquticos, niades. Holometbolo (metamorfose completa) que consiste de estgios distintos. Ovo larvas pupa adulto.

21

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Os insetos imaturos no possuem asas. Somente com uma exceo encontrada na Ordem Ephemeroptera em que os ltimos estgios imaturos apresentam asas funcionais. Atualmente, os insetos so classificados em 26 ordens, destas, somente nove possuem desenvolvimento holometablico, mas essas nove representam cerca de 80% das espcies. Na Ordem Diptera os insetos possuem duas asas membranosas funcionais (um par) correspondentes ao par anterior ou mesotorcico, enquanto que o posterior ou metatorcico apresenta-se modificado em halteres ou balancins. As partes bucais formam, em geral, uma probscide que se destina suco e frequentemente puno. Possuem metamorfose completa e essa ordem est dividida em duas subordens: Nematocera e Brachycera. Os flebotomneos (Figura 3.1), insetos de interesse neste captulo, possuem seguinte classificao: Reino: Animal Filo: Arthopoda Classe: Insecta Ordem: Diptera SubOrdem: Nematocera Famlia: Psychodidae Subfamlia: Phlebotominae

Fig 3.1. Flebotomneos. (foto CDC Frank Collins e James Gathany) Fonte: http://diogobiotech.blogspot.com/2011_07_05_archive.html

22

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

3.2. Morfologia e taxonomia dos flebotomneos


Os insetos da subordem Nematocera, possuem larvas com cabea distinta e as pupas so geralmente livres. Os adultos apresentam antenas com mais de 10 segmentos e palpos filiformes com quatro ou cinco segmentos (Figura 3.2). Compreende as seguintes famlias de interesse mdico ou veterinrio: Culicidae, Simulidae, Psychodidae e Ceratopogonidae.

Fig. 3.2. Caractersticas das antenas dos insetos da Ordem Diptera, subordem Nematocera (adaptado de Ahid, 2009).

A subfamlia Phlebotominae composta de pequenos insetos (2-3 mm) com o corpo e as asas cobertos de cerdas, antena composta por 16 segmentos, possuem o corpo delgado e pernas longas e delgadas (Figura 3.3). So de grande importncia em Sade Pblica, pois so insetos hematfagos os quais podem veicular diversas doenas, entre elas as leishmanioses.

23

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Fig.3.3. Flebotomneos do gnero Lutzomyia. Fmeas (A) e machos (B) de Lutzomyia migonei. Adaptado de Dantas-Torres Parasites & Vectors 2009 2 (Suppl 1):S1 Os adultos de ambos os sexos necessitam de carboidratos como fonte de energia, retirando-os do nctar de flores e frutos e/ou de seiva de plantas. O hbito hematofgico restringe-se s fmeas, necessrio maturao de seus ovos. Os flebotomneos praticam a hematofagia em diversas espcies de animais, inclusive o homem. Os animais silvestres mais comumente atacados so: gamb, tatu, preguia, tamandu, paca e outros roedores silvestres. Tambm se alimentam em anfbios, rpteis e aves. E como consequncia da invaso e devastao da mata pelo homem, animais domsticos como o co e o cavalo tambm podem ser infectados e servir como fonte de infeco para os flebotomneos. Os flebotomneos apresentam ampla distribuio geogrfica, sendo vistos sob as mais diversas condies climticas e de altitude e em diversos ambientes, tanto silvestres, rurais e at urbano. No Brasil, so conhecidos popularmente, dependendo da regio, como asa branca, asa dura, birigui, cangalhinha, mosquito-palha, tatuquira, frebti, entre outros. Seus vos so curtos e baixos, conferindo um comportamento saltitante e uma disperso mxima de 200m. So insetos holometbolos e suas formas imaturas desenvolvem-se em criadouros constitudos por solos midos, ricos em matria orgnica, entre razes expostas, embaixo de folhas cadas, pedras e ambientes antrpicos, bem como chiqueiros, galinheiros e estbulos, sempre que existam 24

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

condies adequadas. Dependendo do grau de umidade, a fmea pe de 40-70 ovos que eclodem em 6-17 dias, dando origem s larvas. Possuem hbitos crepusculares ou noturnos e costumam permanecer em seus abrigos durante as horas de alta luminosidade do dia, abandonando-os na busca de alimento. O ciclo-de-vida completo tem em mdia 30-90 dias, conforme as condies ambientais. Formas imaturas: Ovos so alongados, elpticos, ligeiramente recurvados e esbranquiados (Figura 3.4 A). Larvas exceo dos outros Psychodidae, cujas larvas so aquticas ou semi-aquticas, as larvas dos flebotomneos so terrestres e um aspecto vermiforme. Possui quatro estdios larvais (Figura 3.4 B), apresentando uma cabea bem definida, escura, o corpo com trs segmentos torcicos e nove abdominais, os quais apresentam pseudpodos que permitem a locomoo das larvas no substrato. Pupas so mais ou menos cilndricas (Figura 3.4 C), medindo cerca de 2mm. Consistem em um cefalotrax sem segmentao ntida e um abdome com nove segmentos. A extremidade posterior do abdome envolvida pela exvia do quarto estdio larvar.

Fig.3.4. Estgios do ciclo de vida do flebotomneo. Ovo (A), larva (B) pupa (C) adulto (D). 25

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Os adultos, assim como outros insetos, possui o corpo divido em cabea, trax e abdmen (Figura 3.4 D). Cabea os olhos tm tamanhos e aparncia semelhantes em ambos

os sexos. As antenas so longas (16 segmentos), assentando-se entre os olhos (Figura 3.5 A e B). As peas bucais so do tipo sugador pungitivo, contitudas de labro, um par de mandbulas, hipogaringe, um par de maxila e lbio. Os machos tm mandbulas rudimentares, no sendo capazes de penetrar na pele dos vertebrados e nem de alimentar-se de sangue. Certas estruturas da cabea so de considervel valor taxonmico, como: o cibrio que a continuao da hipofaringe, apresenta dentes posteriores na fmea; os machos, s vezes, tm dentes vestigiais; a armadura cibarial das fmeas apresenta caracteres especficos; a faringe e a armadura faringeal tm aspectos, ausncia, presena ou disposio de espinhos importantes na identificao especfica (Figura 1.5 A).

Fig.3.5. Aspectos morfolgicos de flebotomneos (Lutzomyia longipalpis). Cabea de macho (A) cabea de fmea (B) e asa (C). Trax a colorao do trax, a presena ou ausncia de cerdas no

trax e a presena ou ausncia de espinhos no fmur posterior auxiliam muito na identificao. Enquanto que as nervuras (venao) das asas tm pouca utilidade para identificao das espcies (Figura 3.6). So importantes no reconhecimento da famlia e dos gneros.

26

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Fig.3.6. A ilustrao mostra um flebotomneo macho ( esquerda) e uma fmea ( direita). http://www.fiocruz.br/ccs/cgi/cgilua.exe/sys/start.htm?infoid=2284&sid=9 Abdomen formado por 10 segmentos. Nas fmeas, os segmentos

abdominais 8-10 acham-se telescopados para dentro do stimo segmento (Figura 3.7). Internamente encontra-se um par de espermatecas (Figura 3.8), cujo aspecto tem considervel importncia taxonmica. A genitlia masculina externa deriva do nono segmento abdominal (Figura 3.9). O brao dorsal composto pelo dististilo e pelo basistilo, e o elemento ventral constitudo por um par de parmeros (Figura 3.9). Internamente formada por uma bomba genital e um par de filamentos genitais (cujo comprimento coincide com os ductos das espermatecas das fmeas). As partes ventrais da terminlia masculina compem-se de um par de lobos laterais e um par de cercos, que no fazem parte da genitlia e, sim, protegem o nus do inseto. Todos os detalhes da terminlia masculina so importantes para a identificao das espcies.

Fig.3.7. Lutzomyia intermedia (fmea e macho) http://mundoeducacao.uol.com.br 27

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Fig.3.8. Aspectos morfolgicos de fmeas de flebotomneos. A - Bomba salivar (cibrio e faringe); B espermatecas, ductos espermatecais, forquilha genital

Fig.3.9. Aspectos morfolgicos de machos de flebotomneos. Genitlia do macho.

28

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Os criadouros naturais desses insetos so dificilmente encontrados, e para o Novo Mundo, somente Hanson (1961) encontrou resultados concretos, utilizando o mtodo de flotao combinado a uma soluo saturada de acar tendo obtido 2258 larvas do solo da floresta no Panam, em quatro anos de estudo. Menos de 30% dessas larvas chegou fase adulta, a qual a maioria foi identificada como Lutzomyia longipalpis. Em reviso sobre este assunto, Feliciangeli (2004) incluiu informaes sobre criadouros de algumas espcies envolvidas na transmisso de leishmanioses nas Amricas. Nos insetos hematfagos a saliva cumpre papel essencial na inibio dos mecanismos de homeostasia do hospedeiro, induzindo a vaso dilatao e a inibio de coagulao sangunea, aes que facilitam o repasto. Torna-se necessrio para isso que o inseto, no momento da alimentao, apresente glndulas salivares desenvolvidas e com a reserva de secreo suficiente para o repasto. Na saliva dos flebotomneos foi observada a presena de anticoagulantes e de um peptdeo, denominado maxadilan, um potente vasodilatador, que auxilia na formao de poas de sangue que surgem dos pequenos vasos dilacerados pela probscida do inseto, que no longa o suficiente para atingir vasos sanguneos de maior calibre, como fazem os culicdeos e triatomneos. Nos flebotomneos, o repasto sanguneo das fmeas pode ocorrer 24 horas aps a emergncia do adulto. Entretanto, observaes em laboratrio, de L. longipalpis, demonstraram que um nmero maior de fmeas inicia essa atividade aps 48 horas, o que pode estar associado ao amadurecimento das glndulas salivares e ao endurecimento das peas bucais. A importncia dos flebotomneos para o homem e para os animais deve-se, sobretudo, a seu papel como vetores de doenas, porm s vezes, tornam-se importantes porque afetam diretamente as pessoas, com suas picadas dolorosas e causadoras de reaes alrgicas. Os flebotomneos so os vetores naturais de alguns agentes etiolgicos de doenas humanas e de animais, como protozorios do gnero Leishmania e outros tripanossomatdeos, bactrias do gnero Bartonella e vrias espcies de arborvrus. Sua classificao morfolgica, baseada nos adultos, machos e fmeas. De acordo com Young & Ducan (1994) a subfamlia Phlebotominae agrupa seis gneros: Phebotomus, Sergentomyia e Chinius no Velho Mundo, Lutzomyia, Brumptomyia e Warileya no Novo Mundo. Destes trs ltimos gneros, Lutzomyia considerado o mais importante por conter representantes vetores de leishmanioses na regio neotropical.

29

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Em 1995, Galati props uma nova classificao, utilizando uma abordagem filogentica, onde a diviso em duas tribos apresentada por Artemiev (1991) foi mantida, e oito subtribos, diversos novos gneros, subgneros foram criados, e alguns subgneros foram elevados categoria de gnero. De acordo com a autora, esto descritas 490 espcies nas Amricas, sendo que a maioria delas tem registros no Brasil. Embora essa classificao tenha lanado nova luz sobre a evoluo e a biogeografia dos flebotomneos, refletindo um sistema de classificao mais natural do que o atualmente utilizado, j que contm informaes sobre um grande nmero de caracteres, ela ainda pouco aceita no Brasil.

3.3. Captura dos flebotomneos


Para a coleta de flebotomneos no campo, alguns mtodos podem ser empregados, seja utilizando aspiradores de suco ou mecnicos ou ainda fazendo utilizando diferentes tipos de armadilhas. Para tanto fundamental estabelecer previamente o objetivo da realizao da pesquisa, alm do grau de conhecimento sobre a fauna local e da rea a ser investigada. Algumas caractersticas da biologia dos flebotomneos devem ser

consideradas para a realizao do trabalho de campo. Uma delas, os criadouros naturais, as fmeas ao realizarem a oviposio, colocam seus ovos isoladamente no sustrato, e as formas imaturas se desenvolvem em microambientes terrestres, ricos em material em decomposio, com pouca luminosidade e elevada umidade. Em vista do pequeno tamanho e ao tipo de locomoo das larvas no substrato, extremamente difcil encontrar larvas e pupas em natureza. As metodologias utilizadas para esse fim podem ser: Exames de amostras de substrato oriundas do campo ao microscpio

estereoscpio; Peneiramento e anlise de amostras de substrato, por intemdio de

flutuao em soluo de acar para a pequisa de larvas e pupas; Avaliao diria, por perodos prolongados, desse tipo de amostras

colocadas em recipientes esmatados recobertos com funis de vidro para a observao da ecloso de adultos.

Os estudos nesse sentido so extremamente escassos, o mais bem sucedido foi desenvolvido no Panam, onde 2.258 larvas foram coletadas em diversos hbitats naturais, por meio de tcnica de peneiramento e flutuao em soluo aucarada, alm da simples procura nesses microambientes. 30

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Outra caracterstica so os abrigos naturais, alguns ambientes podem constituir locais de preferncia para os flebotomneos, como: ocos de rvores, razes tabulares, fendas em rochas, espaos em troncos de rvores, escavaes no solo ou em tocas de animais e folhas cadas no solo da floresta (serrapilheira). Para a coleta de flebotomneos nesses tipos de ambientes so utilizadas as seguintes metodologias: busca ativa por meio do capturador de Castro (Figura 3.10) ou a associao ou no deste aparato com as armadilhas de pano, de luz e por de isca animal. Dentre as armadilhas mais utilizadas temos: as de pano Armadilha de Damasceno (Figura 3.11 A) e Armadilha de Shannon (Figura 3.11 B); as luminosas Armadilha do tipo CDC e suas variaes (Figura 3.12), e a Armadilha Falco (Figura 3.13); as com atrativo de isca animal Armadilha Disney (Figura 3.14 A) e Armadilha de Shannon com isca animal como atrativo (Figura 3.14 B).

Fig.3.10. Tubo de suco para coletar flebotomneos Capturador de Castro

a
Fig.3.11. Armadilha de Damasceno (A) e Armadilha de Shannon (B).

31

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Fig.3.12. Armadilha tipo CDC e suas variaes.

Fig.3.13. Armadilha de Falco

Fig.3.14. Armadilha Disney (A) e armadilha de Shannom utilizando isca animal (B).

32

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

3.4. Montagem e Identificao dos flebotomneos


Aps as coletas, os potes com os insetos so encaminhados para o laboratrio, onde passam por uma triagem. Cada armadilha examinada, sendo retirado todo e qualquer material capturado. Deste, so selecionados somente os flebotomneos, espcie de interesse do estudo.

3.4.1. Preparao dos insetos para montagem Aps triagem, os insetos so colocado no hidrxido de potssio (KOH) a 10%, em mdia 16 horas para clarificao. Para neutralizar o processo de clarificao esses so transferidos para cido actico a 10% por 15 a 20 minutos. Logo aps, passaram por uma desidratao seriada: lcool 70% - 10 minutos, lcool 90% - 10 minutos, lcool 95% - 10 minutos e lcool 100% - 10 minutos. Em seguida, so colocados no Eugenol (leo de cravo) por no mnimo 24 horas, para a diafanizao das estruturas. Aps finalizao do processo acima descrito, os insetos so montados entre lmina e lamnula. Cada inseto colocado na lmina sob uma gota de blsamo do Canad. Nas fmeas, com o auxlio de dois estiletes de pontas finas, separa-se a cabea, o trax e o abdmen (Figura 3.15), a fim de visualizar os caracteres taxonmicos, como por exemplo, o cibrio e a espermateca. Os exemplares machos so montados inteiros. Em seguida, uma lamnula colocada sobre o exemplar. As lminas depois de prontas so levadas estufa (37C) para secagem e aps 72 horas, coloca-se esmalte incolor em volta da lamnula para sua impermeabilizao. Para a identificao em nvel de gnero, subgnero e espcie, as lminas so examinadas no microscpio ptico (Figura 1.16) e so utilizadas descries disponveis na literatura e chaves taxonmicas (Young; Ducan, 1994; Galati, 2003; Shimabukuro, 2007).
1 C T A 2

Espcie Autor da Espcie Sexo

Local de coleta, Municpio, Estado, Pas. Data Coletor Sexo

Fig.3.15. Esquema de montagem em lmina. 1: Etiqueta de identificao deve conter nome da espcie, autor e sexo do exemplar; 2: Etiqueta de procedncia dados do local da coleta, municpio, estado, pas, data da coleta e o nome do coletor. Posio de montagem da fmea: C cabea; T - trax; A abdmen.

33

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

C E

F
Fig.3.16. Fotos de lminas com flebotomneos visualizados ao microscpio ptico. A Lutzomyia intermedia macho (4x); B Genitlia de L. intermedia (10x); C Espermateca L. choti (40x); D - Espermatemateca L. intermedia (40x); E L. longipalpis macho (4x); F Genitlia masculina de L. longipalpis (10x).

34

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Captulo 4. EXPEDIO DE COLETA DE PEQUENOS MAMFEROS/ BIOSSEGURANA NO CAMPO Jonathan Gonalves de Oliveira 4.1. Introduo
Para os profissionais que trabalham com sade silvestre, ecologia de pequenos mamferos e/ou os seus patgenos, sabem da importncia do sucesso da coletas das respectivas amostras. Nos dias atuais, a logstica desse trabalho mais sofisticada pois determina que o trabalho cientfico seja o mais eficiente possvel e que cada vez mais os acidentes de percurso se minimizem. Com isso, foi estabelecidos padres de coleta, que se diferenciam de acordo com o ramo de pesquisa de determinado laboratrio. Os profissionais de taxonomia buscam novas espcies, os parasitologistas novos hospedeiros que participem do ciclo do parasito, as secretarias de sade dos municpios buscam encontrar meios de minimizar as causas de uma epidemia, e em cada trabalho como esse necessrio que se faa uma coleta de campo. Esse trabalho exige que os profissionais envolvidos se preparem com antecedncia, porque mesmo que a justificativa de coleta seja imediata, quando estamos no campo no podemos ser surpreendidos por algum imprevisto, seja ele qual for : burocrtico, falta de materias, perda de dados etc. Tudo isso prejudica os resultados esperados, principalmente quando buscamos solucionar uma questo cientfica. A coleta de pequenos mamferos tambm exige um cuidado especial com relao a segurana do profissional engajado nessa funo. Trabalharemos esse assunto a posteriori, mas necessrios ressaltar que estes animais

independentemente se so coletados para fins de estudos parasitolgicos ou no, so reservatrios de inmeros patgenos que podem ser bactrias, vrus ou protozorios. Por isso atualmente vem sendo recomendado o uso dos equipamentos de proteo individual e coletivos que mantero os profissionais livres de contaminao por esses patgenos. Os pequenos mamferos ( marsupiais americanos e roedores em geral) possuem vantagens evolutivas. Estas vantagens so: alta taxa reprodutiva que consiste em vrias gestaes por ano com vrios filhotes e alimentao variada que os favorecem em meios degradados e/ou sinantrpicos. Por no serem muito exigentes com relao ao habitat e conviver com os humanos no lhes causam transtornos, as populaes crescem rapidamente e com isso a transmisso de algum patgeno bem sucedida. A diversidade de espcies de pequenos mamferos no 35

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

ainda completamente conhecida e a sistemtica apresenta-se, para muitos grupos, bastante confusa. Neste caso, faz-se necessrio utilizao de tcnicas citogenticas (cariotipagem) e moleculares, pois a identificao especfica quase nunca possvel, considerando-se somente os caracteres morfolgicos e/ou morfomtricos externos . Neste captulo ser especificado o antes, durante e depois da expedio de coleta. Os cuidados necessrios com as amostras, a importncia da biossegurana no campo e que todos os dados sejam registrados com cautela. Isto porque, toda sada de campo demanda o deslocamentos dos profissionais do laboratrio para o campo, a hospedagem deles, a compra de materias de consumo de laboratrio etc. Para que acontea a expedio, necessrio fomento do laboratrio envolvido, das agncias patrocinadoras dos projetos, ou dos cursos de mestrado e doutorado, ou seja h um investimento para que a pesquisa seja realizada, de extrema preocupao do responsvel pela expedio que a mesma traga para o laboratrio amostras para serem analisadas e com isso gerar trabalhos, teses e artigos cientficos.

4.2. Planejamento
Numa expedio de coleta a primeira tarefa a ser feita a logstica. A primeira pergunta : Qual o objetivo de ser coletado nessa localidade? No geral, as coletas so direcionadas a partir dessa pergunta. Respondendo: O responsvel pela coleta geralmente possui um projeto de estudo, seja ele artigo, tese ou outros. Focando o assunto na Parasitologia,

principalmente em leishmanioses, o profissional busca conhecer as localidades que esto sendo afetadas pela doena, se a secretaria de sude sinalizou algum paciente diagnosticado com o patgeno, ou ele tambm pode estar interessado em explorar uma rea indita e uma possvel transmisso ainda no relatada etc. Enfim, necessrio que o objetivo da coleta bem detalhado. A localidade, pode variar de acordo com o objetivo do responsvel. Mas vlido que o mesmo busque saber se o animal reservatrio pode ser encontrado naquela regio, se existe algum registro no municpio que ali foi coletado o possivel vetor ou hospedeiro. Depois da localidade ser definida, necessrio saber o tipo de localidade que foi escolhida. A partir da, saberemos as autorizaes necessrias para explorar essa regio. Por exemplo: numa propriedade particular (fazenda, RPPNs) recomendado que o proprietrio autorize atravs de um documento assinado pelo responsvel da expedio, o chefe do laboratrio e dono da propriedade. E neste documento seja especificado a data, a durao da expedio, a equipe de profissionais e um mini relatrio do que ser feito na localidade. O propsito desse documento formalizar a 36

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

autorizao do uso da rea. Em reas de proteo permamente (APPs) ou reas de proteo ambiental (APAs) , necessrio um licenciamento especial junto aos orgos de licenciamento ambiental. Essas autorizaes so particularidades de algumas regies escolhidas para as coletas, que se referem ao local, e no a fauna em si. A fauna possui um licenciamento diferenciado. A equipe e o transporte devem ser previamente resolvidos. O recrutamento dos profissionais visando sempre que durante o campo necessrio praticidade, e que cada profissional realize uma funo para que o trabalho funcione como uma equipe, no sendo necessrio um numero exagerado de pessoas para evitar a ociosidade. Eles devem estar em dias com as vacinaes, e se fazem o uso de algum frmaco seja previamente especificado para evitar transtornos relacionados ao bem estar desses profissionais. O transporte, se for areo, as passagens devem ser compradas com antecedncia, e se for terrestre que o carro seja previamente revisado e em condies de viajar dentro e fora do estado, isso tambm impede que a expedio seja prejudicada.

4.2.1. Licenciamento de coleta A coleta de campo busca inventariar os espcimes presente em fauna geralmente silvestres. Para esse tipo de trabalho preciso obter licenas, como j foi descrito anteriormente. Porm o licenciamento de coleta se diferencia pois, existem os orgos competentes que mesmo que um proprietrio da terra autorize, a expedio s pode ser realizada se o responsvel for a essa localidade com a permisso desses orgos. A obteno de licena para coleta de mamferos realizada principalmente pelo SISBIO (Sistema de Autorizao e Informao em Biodiversidade), do Instituto Chico Mendes de Conservao da Biodiversidade (Figura 4.1). Este sistema um servio de atendimento a distncia que permite pesquisadores solicitarem

autorizaes ara coleta de material biolgico e para realizao de pesquisa em unidades de conservao federais e cavernas. Essa licena obtida desde que o pesquisador realize alguma atividade de ensino ou pesquisa, e seja vinculado formalmente a uma Instituio cientfica. Esse pedido realizado on line pelo site www.icmbio,gov.br/sisbio, onde nesse site haver varias modalidades de licenas de coleta, e o pesquisador responsvel precisa imprimir essa licena adquirida e lev-la na expedio. Na Fundao Oswaldo Cruz, as expedies ainda precisam passar pela Comisso de tica do Uso de Animais (CEUA) onde ser analisado a quantidade de

37

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

animais que podero ser coletados para pesquisa, se ser permitido a eutansia desses animais. E tambm a verificao se o protocolo de uso desses animais no est sendo violado.

Fig. 4.1 Modele de Licena Permanente de Coleta para coleta de material zoolgico.

38

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

4.2.2. Lista de materiais Ainda como parte no planejamento, os materiais utilizados na expedio precisam ser listados seguindo a seguinte classificao: Materiais de Uso (Tabela 4.1); Materiais de Consumo (Tabela 4.2); Materiais de Biossegurana no Campo (Tabela 4.3). Materiais de uso: so os materiais de uso contnuo (equipamentos) do laboratrio de campo. Entre os materiais de uso continuo podemos listar os seguintes:

Equipamentos: banho-maria, placa aquecedora, Air Mate Hepa, pesolas de 100g, 300g, 600g e 1000g e 2500g, rdio de comunicao, GPS, mquina fotogrfica, galo de nitrognio, recarregadores rdios, recarregadores hepa, etc. Equipamentos de Apoio: rotuladora, faco c/bainha, alicate brinco, alicate grande, alicate diagonal, luminria, galo de gua, lanterna, maleta 1 socorros, maleta de campo, maleta biologica grande, maleta biologica pequena, mascara facial 3m, pipetador 200, rgua 20cm, rgua 30cm, tenda, martelo, chave de fenda, chave philips, pina serra 12cm, tesoura ponta fina pequena, tesoura ponta romba mdia 15cm, cabo de bisturi 23, cabo de bisturi 24, tesoura de escritrio. Material da maleta de campo (transporte imediato): martelo, alicate grande, bocais de pino, rotuladoras, rgua 20cm, rgua 30cm, termmetro, pipetador 200, garfo, fita isolante, chave de fenda, chave philips e pesolas. Todos o materiais aqui listados foram com base na lista de campo de Scrates Neto do Laboratrio de Biologia e Parasitologia de Mamferos Silvestre Reservatrios (LBPMR/Fiocruz). Os materiais de consumo so materiais no voltaro da expedio como placas de petri, seringas, desinfetantes, algodo etc. Os materiais de Biossegurana so os materiais que vo garantir a segurana do profissional no campo. Alguns deles so descartados como jalecos e luvas, porm outros no como air mates, capuz e traquias.

4.3. Georreferencioamento e marcao de pontos/ Armadilhamento e preparao de iscas


So estabelecidos em geral, 10 transectos lineares com 20 estaes de captura cada, durante cinco noites, totalizando um esforo de captura total de 1000 armadilhas-noite por expedio, em cada localidade. Todos os transectos sero georeferenciados utilizando-se um GPS, obtendo-se trs coordenadas geogrficas de cada (incio, meio e fim). Nestas estaes, sero dispostas armadilhas do tipo livetrap, modelos Tomahawk (40,64cm x 12,70cm x 12,70cm) (Figura 4.2) e do tipo

39

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Sherman (7,62cm x 9,53cm x 30,48cm) (Figura 4.3), apropriadas para a captura de pequenos mamferos vivos com at 3Kg.

Fig. 4.2. Modelo da armadilha Tomahawk

Fig. 4.3. Modelo da armadilha Sherman A isca utilizada uma mistura composta de protena animal, um cereal, uma fruta e uma farinha para dar liga, frequentemente utilizamos bacon, aveia, banana e pasta de amendoim. Os transectos so percorridos diariamente pela manh para checagem das armadilhas quanto presena de animais. As armadilhas contendo os animais so transportadas, imediatamente aps sua remoo dos transectos, para uma base laboratorial de campo, aonde os animais so processados e as amostras coletadas. A eutansia dos animais realizada, preferencialmente, por exanguinao (sangria total) dos animais em anestesia profunda. No caso de impossibilidade de sua realizao, ser realizada inoculao intra-cardaca de Cloridrato de Ketamina, numa

40

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

super-dosagem acima de 50 mg/Kg de peso, conforme descrito em Rivera (2006) e aprovado em protocolo CEUA ( Comisso de tica do Uso de Animais.

4.4. CADERNO DE CAMPO


O caderno de campo funciona como um dirio. Cada dia de expedio preciso relatar detalhadamente tudo que aconteceu na ida as trilhas, os animais coletados, a identificao que foi feita no campo, as coordenadas do GPS, as fisionomias vegetais. Este caderno ser guardado no laboratrio como registro principal de que houve expedio para aquela localidade. A justificativa de sua utilizao , caso exista outra expedio anos depois, possvel ter uma idia de como era as antigas fisionomias vegetais, alguma mudana ecolgica drstica causada por motivos biticos ou abiticos, se as espcies coletadas ainda continuam l etc.

4.5. IDENTIFICAO NO CAMPO


A identificao no campo basicamente feita por caracteres morfolgicos ou chaves de identificao. preciso que nas fichas de campo seja descrita a localidade, a trilha e o ponto exato que foi coletado o espcime, o tipo de amostras coletadas, e como o trabalho com pequenos mamferos (roedores e marsupiais) separamos as principais caractersticas dessas famlias para serem descritas. Mas no geral, atividade reprodutiva e a presena de embries (roedores) ou filhotes no marspio (marsupiais), peso, tamanho da cauda e do corpo, dentio (marsupiais), e observaes que so as situaes que no se enquadram nos padres de identificao que precisamos especificar.

4.6. BIOSSEGURANA NO CAMPO


Segundo Teixeira & Valle (1996), a biossegurana o conjunto de aes voltadas para a preveno, minimizao ou eliminao de riscos inerentes s atividades de pesquisa, produo, ensino, desenvolvimento tecnolgico e prestao de servios, visando sade do homem, dos animais, a preservao do meio ambiente e a qualidade dos resultados. Seguindo este conceito o trabalho de campo o carro chefe das pesquisas com mamferos silvestres. O descomprometimento de amostras ou dos profissionais envolvidos transforma o trabalho de campo numa total perda de tempo e investimento cientfico. Por isso o uso dos materiais de biossegurana preveem o resguardo das duas partes envolvidas : o profissional e o material. 41

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Para marcao de pontos e para percorrer as trilhas, os materiais so: Cala comprida; Sapato fechado; Blusa de manga longa; Luvas de borracha; Chapu; Colete esses utenslios servem para proteger evitando que pele fique expostas a qualquer tipo de picadura de animais; Perneira ou galocha de cano alto: evita riscos de piscadas de cobras e outros animais; Repelente: proteger o rosto, a nuca e as partes expostas de picadas de insetos; Mochila: levar outros utenslios que sero usados em caso de captura; Bolsa para reposio de armadilhas caso seja capturado algum animal, a armadilha trazida para o laboratrio de campo, no deve ser recolocada na trilha; Leva-se armadilhas do tipo Sherman e Tomahawk para reposio. Quando percorremos as trilhas, preciso levarmos armadilhas mais, dos dois tipo pois em caso de captura do espcime temos que retirar a armadilha do ponto e colocar outra armadilha iscada. Para que esse procedimento funcione, dentro da mochila preciso levar os materiais de biossegurana que vo ser utilizados para pegar a armadilha com o animal capturado. Dentro da mochila deve ter: Sacos pretos: estes sacos sero utilizados para colocar as armadilhas com os animais capturados; Mscara c/ filtro : este mscara precisa ser colocada pela pessoa que manipular a armadilha; Caneta-piloto e fita crepe: utilizada para identificar o ponto exato e a trilha onde o espcime foi capturado ( ex: Trilha A, ponto 6 : A6); Desinfetante: depois de o saco ser vedado, para desinfectar a mscara e as luvas usado o Lysol diludo. Com o animal j no laboratrio de campo, precisamos nos aparamentar. Primeiro delimitamos a rea de acesso com uma fita sinalizadora, depois disso colocamos o jaleco, o respirador motorizado (air mate) e as luvas. Uma ateno

especial deve existir quando colocamos as luvas., pois colocamos uma luva de base, vedada junto ao jaleco por uma fita adesiva e uma luva de descarte colocada por cima, pois caso a luva superior rasgue ou danifique, no afeta diretamente a pele do profissional. Durante todo o processamento do animal preciso prestar bastante ateno se todos os equipamentos de proteo individual esto funcionando corretamente.

4.7. Equipamentos de Proteo Coletiva


Alm de haver a proteo individual, preciso estabelecer alguns cuidados coletivos. Como o uso separados de lixo biolgico e lixo comum, preciso ainda vedar a mesa com papel absorvente descartvel, que ser recolocados quando houver processamento de amostras, todo material cirrgicos deve ser separado, para cada espcime ser utilizado um, para no existir uma contaminao cruzada. necessrio 42

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

o uso do desinfetante quando entrarmos no laboratrio de campo e na sada do laboratrio tambm. Todas as armadilhas precisam ser lavadas com desinfetante e postas para secar para serem guardadas ou reutilizadas. A ultima pessoa a deixar o laboratrio de campo precisa fechar o lixo biolgico de medo que no haja ar no interior e bem vedado, verificando se no h furos no saco plstico. O material cirrgico tambm precisa ser lavado e posto pra secar e todo o local ao trmino do processamento precisa ser desinfetado utilizando o borrifador.

4.8. Coleta de amostras

4.8.1 Caritipo A tcnica de cariotipagem visa determinar o nmero cromossmico

diplide e fundamental, com o objetivo de descrever e associar cada complemento cromossmico espcie confirmando a identificao morfolgica. Essa anlise visa tambm detectar possveis polimorfismos cromossmicos e analis-los levando em considerao a distribuio geogrfica dos exemplares analisados. As clulas em suspenso so obtidas por cultura de medula ssea extrada do osso femural do animal ainda em campo aps mantida no seguinte meio de cultura contendo RPMI 1640 suplementado com 20% de soro bovino fetal, colchicina (106M) e brometo de etdio (5og/ml) por duas horas. Aps centrifugao, o material celular ser ressuspendido em soluo de KCl (0,075 M) durante 30 minutos a fim de promover choque hipotnico. O material ser posteriormente fixado em Carnoy (trs partes metanol para uma de cido actico). Em seguida, para preparao das lminas sero utilizadas 40 ml de soluo tampo-fosfato a 0,1M e 2 ml do corante Giensa (4%). Aps a preparao das lminas as imagens das metfases sero obtidas via microscpio ptico acoplado com cmera digital. Os caritipos sero montados seguindo uma ordem decrescente de tamanho dos autossomos, sendo que os cromossomos sexuais so colocados a parte.(Bonvicino, 2011)

4.9. Coleta para leishamanioses

43

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

4.9.1. Coleta de Sangue Existem duas tcnicas para puno venosa. Uma tcnica usando seringa e agulha e uma outra tcnica utilizando um mecanismo de coleta vcuo. A coleta feita em tubos estreis, geralmente fabricados por empresas especializadas. Alguns tubos de coleta contm substncias especficas para

determinados exames, como anticoagulantes, etc. Coleta-se em mdia 5 ml por tubo. A quantidade de tubos depende da variedade dos exames e suas

recomendaes centrifugado.

especficas.

O sangue dever retrair

(coagular) para ser

A entrega da amostra de sangue ao laboratrio sem demora, para que no ocorram alteraes artefatuais. O transporte deve ser realizado por pessoal treinado, de acordo com as normas de biossegurana. A amostra deve ser

centrifugada de preferncia imediatamente e at no mximo duas horas aps a coleta.

4.9.2. Coleta para Leishmaniose Tegumentar Americana

Diagnstico parasitolgico por mtodo direto. Material: distenso de esfregao de borda de leso ou impresso por oposio de material de bipsia (Imprint) em lminas microscpica. Armazenagem: lmina fixada e corada.

4.9.3. Tcnica da coleta

Esfregao realizado por escarificao de borda e superfcie da leso utilizando-se lminas de bisturi estril. Os materiais obtidos so distendidos em lminas de microscopia previamente limpas e desengorduradas. Imprint deve ser realizado imediatamente aps a bipsia.Com auxlio de uma pina so feitos movimentos de oposio de uma das faces da bipsia sobre uma lmina de vidro previamente limpa e desengordurada, visando deixar uma impresso do material. Empregar lminas de borda fosca para melhorar identificao do material. feito a partir da bipsia de leso cutnea / mucosa. A bipsia coletada segundo procedimento mdico e imediatamente mergulhada em soluo de salina estril contendo antibitico e antifngico (1000u de penicilina e 50mg fluorocytocina por cada ml de salina).Esse material encaminhado imediatamente ao laboratrio nessa condio de preferncia protegido do calor excessivo. 44

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

4.10. Taxidermia e/ou conservao em meio lquido


Aps a retirada de amostras necessrias retiramos a pele do animal e realizamos a taxidermia. Esta tcnica utilizada para manter as caractersticas morfolgicas externas do animal. Primeiro passamos sabo arsenical no interior da pele para impedir o crescimento de fungos e a deteriorizao da pele. Preenchemos com algodo cru e arames galvanizados e costuramos a inciso feita na pele. Com isso, esse pele pode ser armazenada na coleo de peles do laboratrio e depois encaminhada ao Museu de Mastozoologia. Quando a muitos animais, ou as caractersticas externas de identificao so visivelmente fceis sem o uso da tcnica de taxidermia, guardamos os animais em meio lquido, pois preciso que leve o material testemunho das coletas realizadas.

4.11. Etiquetagem
Todos os animais coletados precisam ser etiquetados. Na etiqueta deve vir as informaes bsica para estes espcimes. Esse dados so: quem coletou; Quando; Gnero; Sexo; Medidas corporais e peso; e Localidade.

4.12. Entrega das amostras


Na volta ao laboratrio, preciso ser entregue todas amostras a gesto de qualidade para que enumerem no sistema de dados do laboratrio o que foi coletado, quantas amostras vo estar alocadas no laboratrio. Assim, o acesso a essas informaes vo constar no registro geral para assim estabelecer um padro vigente de dados.

4.13. Consideraes Finais


O sucesso da expedio s acontece quando os profissionais trabalham em equipe, e buscam exercer sua funo com o compromisso de favorecer o meio cientfico com mais dados, mais trabalhos publicados etc. compromisso do executor de uma expedio trabalhar de modo que sua logstica no falhe, que a seguranas dos participantes no seja comprometida e que as amostras sejam recebidas no laboratrio integras, de acordo com os protocolos de manipulao e assim todo o investimento cientfico nessa tarefa resulte em retorno a comunidade cientficas.

45

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

4.14. Agradecimentos
Este captulo foi elaborado a partir de modelos das expedies do Laboratrio de Biologia e Parasitologia de Mamferos Silvestre Reservatrios, onde o aluno de mestrado Jonathan Gonalves de Oliveira est alocado. O treinamento de biossegurana foi ministrado pelo Msc. Socrates Neto tambm alocado a esse Laboratrio. Agradeo tambm ao apoio do Curso de Ps-Graduao Biodiversidade e Sade onde estudo e ao meu orientador Dr. Paulo Srgio Dandrea.

46

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Captulo 5. LEISHMANIOSES CANINAS Tuanne Rotti Abrantes 5.1. Introduo leishmaniose tegumentar canina
A leishmaniose tegumentar americana (LTA) uma doena infecciosa, no contagiosa, causada por protozorio do gnero Leishmania, de transmisso vetorial, que acomete pele e mucosas. primariamente uma infeco zoontica que afeta outros animais que no o homem, o qual pode ser envolvido secundariamente (Brasil, 2012). A leishmaniose tegumentar canina uma doena generalizada que afeta ces, causadas por diferentes espcies de parasitas do gnero Leishmania. Na Amrica do Sul, Leishmania braziliensis o agente causador mais difundido (DantasTorres, 2009). No Brasil, existem relatos de infeco natural em ces por L. (V.) braziliensis (Vasconcelos et al., 1994 ; Coutinho et al., 1985 ; Falgueto et al., 1986 ; Lonardoni et al., 2006 ; Madeira et al., 2006 ; Madeira et al., 2006b) raramente, por L. (L.) amazonensis (Tolezano et al., 2007). O envolvimento desses animais em ciclos que se mantm no domiclio ou peridomiclio est associado principalmente aos ambientes alterados, favorecendo a adaptao de espcies vetoras (Marzochi; Marzochi, 2004). Em reas endmicas, os ces so freqentemente expostos s picadas de flebotomneos como Lutzomyia (Nyssomyia) intermedia e Lutzomyia (Nyssomyia) whitmani, os quais muitas vezes se encontram estabelecidos no ambiente domstico ou peridomstico (Rangel et al., 2009). So numerosos os registros de infeco em animais domsticos. Entretanto, no h evidncias cientficas que comprovem o papel desses animais como reservatrios das espcies de Leishmania sp., sendo considerados hospedeiros acidentais da doena. A distribuio sistmica dos parasitos em ces infectados com Leishmania chagasi contrasta com a aparente restrio da L. braziliensis em leses cutneas (Marzochi et al., 1985). No entanto, ces infecta dos por L. braziliensis podem servir como sentinelas, isto , so os indicadores de risco para a infeco em seres humanos (Pirmez et al., 1988). e, mais

5.1.2. A doena nos ces


A LTA nesses nos ces pode apresentar-se como uma doena crnica, com manifestaes semelhantes as da doena humana, ou seja, o parasitismo ocorre preferencialmente em mucosas das vias aerodigestivas superiores (Brasil, 2012).

47

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

A lcera cutnea sugestiva costuma ser nica, eventualmente mltipla, localizada nas orelhas (Figura 5.1), focinho ou bolsa escrotal. No entanto, deve-se estar atento a outras doenas que causem lceras, tais como neoplasias, piodermites e micoses. Estas devem ser includas no diagnostico diferencial. Entre as micoses, especialmente a esporotricose deve ser considerada, por se tratar de uma zoonose e apresentar-se com leses muito semelhantes as da LTA, ocorrendo atualmente de forma epidmica em cidades, como, por exemplo, no Rio de Janeiro (Santos et al., 2007 ; Brasil, 2007). Os achados clnicos e hematolgicos observadas em ces infectados pela L. braziliensis pode ser sugestivo, mas so inespecficos.

Fig. 5.1. Co apresentando leso ulcerada em pavilho auricular. (Figura cedida pelo Lapclin-Dermzoo/ Fiocruz).

5.2. Introduo leishmaniose visceral canina (LVC)


A leishmaniose visceral uma zoonose que afeta seres humanos quando estes entram em contato com o ciclo de transmisso do parasito (Brasil, 2006). Embora os seres humanos tambm podem atuar como reservatrios do agente e desempenhar um papel no ciclo de transmisso, o co considerado um dos mais importantes elos da cadeia epidemiolgica de leishmaniose (Ribeiro, 2006). A leishmaniose visceral canina (LVC) transmitida atravs da picada de insetos conhecidos como flebotomneos, principalmente a espcie Lutzomyia longipalpis e L. cruzi, que transmitem as promastigotas infectantes. O principal agente da leishmaniose visceral no Brasil a Leishmania (Leishmania) chagasi [sinnimo L. (L.) infantum] (Brasil, 2006 ; Carmago-Neves, 2006). Acredita-se que a introduo da L. chagasi no pas, tenha sido durante a colonizao europeia, por meio de ces infectados e tenha se adaptado aqui a novos

48

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

hospedeiro e vetores (Shaw, 2002). Em meados dos anos 80, observou-se uma mudana drstica na distribuio da LVA no Brasil. Antes, restrita s reas rurais do nordeste brasileiro, avanou para outras regies indenes, alcanando a periferia de grandes centros urbanos. A partir dos anos 90, os estados do Par e Tocantins (regio Norte), Mato Grosso do Sul (regio Centro-oeste), Minas Gerais e So Paulo (regio Sudeste) passaram a influenciar de maneira significativa nas estatsticas da LVA no Brasil (Brasil, 2006). Devido a esse processo de expanso em vrias regies brasileiras, tem se observado casos humanos e caninos tanto em reas rurais como em reas urbanizadas (Bevilacqua et al., 2001; Gontijo; Melo, 2004; Brasil, 2006).

Recentemente, foram relatados casos caninos autctones na cidade de So Borja (RS), regio sul do pas, onde no havia registro da doena, demonstrando a expanso da doena (Souza et al., 2009). No municpio do Rio de Janeiro, embora atualmente no sejam descritos, casos humanos de LVA, casos caninos so frequentemente diagnosticados, sendo que nos ltimos anos, tem-se observado um aumento nos ndices de soroprevalncia canina em algumas regies endmicas, alm da descrio novos casos em outras cidades do estado onde no existiam casos autctones (De Paula et al., 2009). Em 2010, foi relatado um caso autctone no bairro de Laranjeiras, zona sul do municpio do Rio de Janeiro (Figueiredo et al., 2010a). Durante os anos de 2011 e 2012 chegaram ao conhecimento da Vigilncia Epidemiolgica Estadual a ocorrncia de casos de LVC nos municpios de Mangaratiba, Niteri, Rio de Janeiro e Volta Redonda, alm da ocorrncia de trs casos humanos, um autctone em Volta Redonda, outro indeterminado no Rio de Janeiro e o terceiro autctone em Barra Mansa, que veio a bito (Rio De Janeiro, 2012).

5.2.1. A doena nos ces


Classicamente, a leishmaniose visceral canina (LVC) pode apresentar um espectro de manifestaes clnicas bem variadas, condicionadas a imunocompetncia individual do animal. Entre os sinais clnicos mais comuns na LVC esto alteraes cutneas, principalmente descamao, em particular no espelho nasal (Figura 5.2) e orelha, pequenas lceras rasas, localizadas mais frequentemente nas orelhas (Figura 5.2), focinho, cauda e articulaes. Nas fases mais adiantadas da doena, observa-se, com grande frequncia, onicogrifose (Figura 5.3), esplenomegalia, linfadenopatia, alopecia, dermatites, hiperqueratose, edema de membros, lceras de pele, ceratoconjuntivite, apatia, diarria, hemorragia intestinal e vmito. Pode ocorrer 49

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

tambm paresia dos membros posteriores, caquexia, inanio, que geralmente levam morte. Entretanto, ces infectados podem permanecer sem sinais clnicos por um longo perodo de tempo (Deane; Deane, 1955a; b; Marzochi et al., 1994; Almeida et al., 2005), podendo estes representar cerca de 40 a 60% da populao soropositiva (Marzochi; Marzochi, 1997).prazos pra ultrapassar

Fig. 5.2. Animal com LVC apresentando descamao e leso ulcerada no pavilho auricular. (Figura cedida pelo Lapclin-Dermzoo/ Fiocruz)

Fig 5.3. Animal com LVC apresentando onicogrifose. (Figura cedida pelo LapclinDermzoo/ Fiocruz) Os parmetros hematolgicos e bioqumicos, embora sejam limitados no diagnstico da LVC, so muito teis para a avaliao do estado clnico do animal e a extenso das leses, e pode dar indicaes sobre o prognstico (Ikeda et al., 2003 ; Reis et al., 2006). Os animais com a forma clnica da doena, apresentam alteraes condizentes com anemia, uremia, hiperproteinemia e hiperglobulinemia, as quais se 50

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

apresentam como marcadores clnicos da leishmaniose visceral, associados aos sinais previamente relatados (Jos-Claudio et al., 2012).

5.3. Diagnstico das leishmanioses


O diagnstico das leishmanioses deve considerar a associao entre dados clnicos, laboratoriais e epidemiolgicos. Os testes laboratoriais contam com ferramentas de diferentes complexidades, cuja aplicabilidade pode variar de acordo com a forma da doena (LTA ou LVA) ou da infraestrutura local. Os mtodos parasitolgicos incluem: identificao microscpica direta e isolamento do parasita em meio de cultura a partir de diferentes espcimes clnicos. Em reas endmicas de LVA, os testes sorolgicos so usados como ferramenta nos inquritos

epidemiolgicos para diagnstico e posterior recolhimento dos ces considerados positivos (Brasil, 2006). Os espcimes clnicos coletados para o diagnstico parasitolgico podem ser obtidos a partir de aspirado de medula ssea, bao, fgado, linfonodos (LVC) e em alguns casos de bipsias de pele ntegra, leso (LTA) ou vsceras. No exame parasitolgico direto, realizada a pesquisa de formas amastigotas em lminas de impresso por aposio do material coletado, corado pela tcnica de Giemsa ou Leishman. O exame parasitolgico indireto visa o isolamento do agente infeccioso em meios de cultivo apropriados, sendo comumente utilizado o meio de cultura bifsico Novy, MacNeal, Nicole (NNN) e meio Schneider acrescido de 10% de soro fetal bovino (Brasil, 2006), para o crescimento e posterior identificao da espcie. O teste padro de referncia para o diagnstico das leishmanioses a cultura parasitolgica positiva (Chouihi et al., 2009), porm no realizada na rotina, principalmente devido ao grande volume de trabalho e estrutura laboratorial especializada. A anlise histopatolgica (Figura 5.4) dos fragmentos coletados atravs da bipsia tambm de fundamental importncia no diagnstico da LVA, assim como LTA, pois pode identificar as formas parasitrias e ao mesmo tempo contribuir para o diagnstico diferencial, porm tem uma baixa sensibilidade e muitas vezes pode ser inconclusiva (Tafuri et al., 2004), e tambm no permite a identificao da espcie envolvida, apenas do gnero. A imunohistoqumica (IHQ) vem sendo utilizada para deteco de formas amastigotas de Leishmania sp. em amostras de diversos tecidos, como pele ntegra, linfonodo, fgado e bao, apresentando um desempenho diagnstico superior ao exame histopatolgico corado pela hematoxilina eosina (HE), alm proporcionar uma leitura mais rpida, pois permite fcil visualizao dos parasitos marcados (figura 5)

51

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

(TAFURI et al., 2004), mas ambas as tcnicas possuem preciso limitada e no permitem a identificao de espcies (Quintela et al., 2009).

Fig. 5.4. Corte histolgico de pele ntegra, corado com hematoxilina eosina, apresentando formas amastigotas compatveis com Leishmania sp. (Figura cedida pelo Lapclin-Dermzoo/ Fiocruz)

Fig. 5.5. Corte histolgico de pele ntegra, processado pela tcnica de imunohistoqumica, apresentando formas amastigotas compatveis com Leishmania sp. (Figura cedida pelo Lapclin-Dermzoo/ Fiocruz).

Na LVC, a distribuio do parasita pode ser extensiva, alcanando rgos como bao, fgado, linfonodos, pele, medula ssea, etc. (Alvar et al., 2004), oposto do que ocorre no ser humano, onde o parasita normalmente limitado medula ssea, bao e fgado (Swenson et al., 1988). A presena do parasita nos mais diferentes tecidos e rgos provocam reaes caractersticas da LVC, entre as quais a ativao policlonal de linfcitos, produzindo elevados nveis sricos de imunoglobulinas, que, se por um lado no possui significado de proteo, por outro, facilita o diagnstico 52

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

laboratorial atravs de testes sorolgicos, diferente do que ocorre na LTA, onde a distribuio do parasita est restrita leso, produzindo baixos ttulos de anticorpos. A imunofluorescncia indireta (IFI), um dos mtodos mais empregados na rotina do diagnstico da LVC, apresenta uma elevada especificidade e relativa sensibilidade, no entanto, algumas desvantagens, tais como, no automatizao e avaliao subjetiva, tm sido apontadas como fatores limitadores para utilizao em larga escala. Por outro lado, os ensaios imunoenzimaticos (EIE), tais como enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) que so automatizados, possuem vantagens nesse aspecto (Rosati et al., 2003). Nos ltimos anos importantes avanos tm acontecido na elaborao de exames sorolgicos para diagnstico da Leishmania, incluindo testes de aglutinao direta (TAD) e ELISA, construdos a partir de antgenos puros ou recombinantes (El Harith et al., 1996; Brasil, 2006). De acordo com o manual de controle da LVA, devem ser realizados inquritos sorolgicos (amostrais ou censitrios) na populao canina para avaliao da soroprevalncia, empregando para isto a tcnica de ELISA para triagem e a IFI para confirmao dos casos (Brasil, 2006). De um modo geral, os testes sorolgicos so considerados muito sensveis e especficos, entretanto, possuem limitaes para deteco de baixos nveis de anticorpos e apresentam reatividade cruzada leishmaniose tegumentar canina (LTC), observada em reas endmicas de sobreposio (Ferrer et al., 1995). A sensibilidade e a especificidade dos testes sorolgicos esto condicionadas a inmeros aspectos e podem variar consideravelmente (Massunari et al., 2009). Porm estudos vm demonstrando alguns problemas encontrados na IFI quando comparada ao EIE, como baixa sensibilidade e especificidade,

consequentemente gerando resultados falso positivos e falso negativos (Figueiredo et al., 2010b; Silva et al., 2011; Grimaldi et al., 2012). A partir de 2012, nos inquritos epidemiolgicos, o ELISA passou a ser utilizado como teste confirmatrio e o teste imunocromatogrfico rpido Dual-Path Platform technology (DPP) (figura 6), j validado pelo Ministrio da Sade (Rio De Janeiro, 2012), como teste de triagem, pois apresenta alta sensibilidade e especificidade. Possui um dispositivo impregnado com antgeno recombinante rK28 (quimera combinando K9, K26 e K39) de L. (L.) chagasi e permite a utilizao de amostras de sangue ou de soro, fornecendo uma avaliao qualitativa do diagnstico, utilizando uma quantidade mnima de sangue, alm dos resultados serem demonstrados em apenas 15 minutos (Grimaldi et al., 2012; Silva et al., 2012).

53

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Fig 5: O teste imunocromatogrfico rpido Dual-Path Platform technology (DPP), com amostra de soro de animal com LVC, apresentando diagnstico positivo. (Figura cedida pelo Lapclin-Dermzoo/ Fiocruz)

5.4. Tratamento
Tentativas de controlar a leishmaniose tegumentar por meio do tratamento (Sessa et al., 1994) ou do sacrifcio (Costa et al., 2004) de ces infectados foram propostas no passado, mas existe pouca ou nenhuma evidncia cientfica que demonstre a efetividade dessas medidas na teoria ou na prtica. As injeces intralesionais de antimoniato N-metilglucamina tm a reputao de ser eficaz (Barbosa Santos et al., 1998), porm o tratamento da leishmaniose cutnea canino no rotineiramente realizado no Brasil (Dantas-Torres, 2009). O tratamento de ces com leishmaniose visceral no uma medida recomendada, pois no diminui a importncia do co como reservatrio do parasito. As tentativas de tratamento da leishmaniose visceral canina, por meio de drogas tradicionalmente empregadas (antimoniato de meglumina, anfotericina B, isotionato de pentamidina, alopurinol, cetoconazol, fluconazol, miconazol, itraconazol), tem tido baixa eficcia. O uso rotineiro de drogas em ces induz remisso temporria dos sinais clnicos, no previne a ocorrncia de recidivas, tem efeito limitado na infectividade de flebotomneos e levam ao risco de selecionar parasitos resistentes s drogas utilizadas para o tratamento humano (Brasil, 2006). Tanto para a leishmaniose visceral canina, quanto para a tegumentar canina proibido o tratamento dos animais com produtos de uso humano, de acordo com a Portaria Interministerial nmero 1.426 de 11 de julho de 2008 (Rio de Janeiro, 2012).

54

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

5.5. Vacinas
At 2006, existia uma vacina contra a leishmaniose visceral canina, registrada no Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento (Brasil, 2006). Hoje existem duas vacinas produzidas no Brasil (Leishmune e Leish tec), porm ambas sem constatao de seu custo benefcio e efetividade para o controle de reservatrio da leishmaniose visceral canina em programas de sade pblica.

5.6. Eutansia
De fato, no existem evidncias que suportem a eutansia de animais domsticos poderia contribuir para o controle da leishmaniose tegumentar. O nico estudo sobre o controle da leishmaniose tegumentar por meio da eutansia de ces foi realizado no municpio de Paraty, Estado do Rio de Janeiro, e os resultados foram inconsistentes (Costa et al., 2004). Portanto, a eutansia de ces ou de quaisquer outros animais domsticos infectados por L. (V.) braziliensis deve ser evitada por razes ticas e prticas (Sinval Pinto, et al., 2011). A prtica da eutansia canina, na LVC, recomendada pelo Ministrio da Sade a todos os animais sororreagentes e/ou parasitolgico positivo, como uma medida de controle do reservatrio canino. Para a realizao da eutansia, deve-se ter como base a Resoluo n. 714, de 20 de junho de 2002, do Conselho Federal de Medicina Veterinria, que dispe sobre os procedimentos e mtodos de eutansia em animais e d outras providncias (Brasil, 2006). Porm, trata-se de uma prtica que gera bastante conflito e questionamentos quanto sua eficcia no controle da LVC.

5.7. Medidas de controle dirigidas populao canina

5.7.1. Controle da populao canina errante


A rotina de captura de ces errantes essencial, especialmente em reas urbanas, por ser fonte disseminadora de diversas doenas de importncia mdico sanitria, entre elas a LV. Esta dever ser realizada pelo municpio rotineiramente de acordo com as normas estabelecidas no cdigo sanitrio.

5.7.2. Doao de animais: ces


Em reas com transmisso de LV humana ou canina, recomendado que seja realizado previamente o exame sorolgico canino antes de proceder a doao de

55

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

ces. Caso o resultado seja sororreagente, devero ser adotadas as medidas de vigilncia e controle recomendadas pelo Programa.

5.7.3. Uso de telas em canis individuais ou coletivos


Os canis de residncias e, principalmente, os canis de pet shop, clnicas veterinrias, abrigo de animais, hospitais veterinrios e os que esto sob a administrao pblica devem obrigatoriamente utilizar telas do tipo malha fina, com objetivo de evitar a entrada de flebotomneos e consequentemente a reduo do contato com os ces.

5.7.4. Coleiras Impregnadas com Deltametrina a 4%


Em condies experimentais, diversos trabalhos demonstraram a eficcia na utilizao de coleiras impregnadas com deltametrina 4% como medida de proteo individual para os ces contra picadas de flebotomneos. Entretanto, para a sua adoo em programas de sade publica, a fim de interromper o ciclo de transmisso domstico, necessria a implementao de estudos longitudinais que demonstrem sua efetividade como medida de controle.

56

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Captulo 6. LEISHMANIA: CONSIDERAES SOBRE O PARASITO E A INTERAO COM OS HOSPEDEIROS Camila Mesquita-Rodrigues 6.1. Introduo
Os protozorios do gnero Leishmania so classificados como heteroxenos, desenvolvendo-se entre insetos flebotomneos e diversas espcies de mamferos. No trato digestrio do hospedeiro invertebrado, o protozorio apresenta formas flageladas denominadas promastigotas. No hospedeiro vertebrado, por sua vez, encontram-se os amastigotas, formas arredondadas e sem flagelo livre. Quando uma fmea de flebotomneo realiza seu repasto sanguneo em um mamfero infectado, ingere macrfagos contendo formas amastigotas de Leishmania. Os macrfagos se rompem no intestino do vetor liberando as formas amastigotas que se diferenciam em promastigotas procclicos (Bates, 2007). Depois de se multiplicarem, os promastigotas procclicos sofrem metaciclognese, transformando-se em promastigotas metacclicos, que so altamente infectivos para os mamferos. Cerca de uma semana aps a infeco, os promastigotas metacclicos so regurgitados sobre a derme do hospedeiro vertebrado (Rogers et al., 2002; Bates, 2007). Estas formas, resistentes lise pelo complemento, penetram nos macrfagos do vertebrado atravs de fagocitose mediada por receptores. No interior dos fagolisossomos, o pH cido e a temperatura de 37 C, dentre outros fatores, induzem a diferenciao dos parasitos para a forma amastigota, que capaz de se multiplicar e infectar novos macrfagos (Besteiro et al., 2007; McConville e Handman, 2007). O ciclo se completa quando outra fmea de flebotomneo realiza o repasto sanguneo no mamfero infectado.

57

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

6.2. Taxonomia
Atualmente, os parasitos do gnero Leishmania esto classificados da seguinte forma:

Domnio Eukaryota Reino Protozoa (Goldfuss, 1818; Owen, 1858) Filo Euglenozoa (Cavalier Smith, 1981) Classe Kinetoplastea (Cavalier Smith, 1981) OBS: Equivalente Ordem Kinetoplastida (Honigberg, 1963) Ordem Trypanosomatida (Kent, 1880; Hollande, 1952) Famlia Trypanosomatidae (Doflein, 1901; Woodcock, 1906) Gnero Leishmania (Ross, 1903)

Nesta classificao, o filo Euglenozoa rene todos os protozorios flagelados enquanto a classe Kinetoplastea e a ordem Trypanosomatida agrupam aqueles que so dotados de cinetoplasto e flagelo nico respectivamente. Com exceo de pequenas diferenas no tamanho dos parasitos, as espcies do gnero Leishmania apresentam morfologias bastante similares (Chance, 1979). Por esta razo, as primeiras classificaes foram baseadas nas diferenas geogrficas, epidemiolgicas e clnicas das populaes de parasitos (Lainson e Shaw, 1972; Lainson e Shaw, 1987). O padro de desenvolvimento das distintas populaes de Leishmania no intestino do inseto vetor levou separao das espcies em dois subgneros: o subgnero Viannia reuniu os parasitos que se desenvolvem na regio pilrica do intestino posterior do inseto enquanto o subgnero Leishmania agrupou aqueles que se desenvolvem nos intestinos mdio e anterior do vetor (Lainson e Shaw, 1987). A classificao das espcies de Leishmania em dois subgneros (Leishmania e Viannia) vlida at os dias atuais e tem sido corroborada por distintos marcadores moleculares (Cupolillo et al., 1994; Cupolillo et al., 2000; Momen e Cupolillo, 2000). A eletroforese de isoenzimas (Multilocus enzyme electrophoresis - MLEE) considerada a tcnica de padro ouro para a identificao de espcies de Leishmania (Rioux et al., 1990; Cupolillo et al., 1994; 2000). A reatividade com anticorpos monoclonais especficos tambm um mtodo empregado para identificar e classificar estes protozorios (Grimaldi, et al, 1991; Kreutzer et al.,1991). Contudo, tcnicas baseadas na anlise de sequncias de DNA tm sido as mais utilizadas para o estudo da diversidade gentica de Leishmania. A anlise do polimorfismo dos fragmentos de restrio do DNA (Restriction Fragment Length Polymorphisms RFLP) uma tcnica

58

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

que utiliza enzimas de restrio para clivar DNA em fragmentos de tamanhos especficos que so posteriormente separados por eletroforese e detectados por hibridizao usando o mtodo do Southern blot (Botstein et al., 1980). No que diz respeito taxonomia de Leishmania, a anlise do polimorfismo dos fragmentos de restrio do gene da hsp70 (heat shock protein 70) tem sido bastante til para a identificao de espcies, confirmando resultados previamente obtidos por

eletroforese de isoenzimas (da Silva et al., 2010; Montavo et al., 2010). No entanto, por envolver muitos passos, o RFLP considerado um procedimento lento e trabalhoso e algumas alternativas, tais como a tipagem de sequncias multilocus (Multilocus sequence typing - MLST), tm sido utilizadas para a caracterizao de isolados de Leishmania. O MLST tem como objetivo analisar os polimorfismos dos nucleotdeos na sequncia do DNA de genes constitutivos formados por um mnimo de sete fragmentos internos contendo de 400 a 500 pares de bases (Maiden et al., 1998). Como envolve apenas duas etapas (amplificao e sequenciamento do DNA) o MLST tem sido considerado um mtodo inequvoco e mais preciso quando comparado eletroforese de isoenzimas e ao RFLP (Maiden et al., 1998). Outra vantagem deste mtodo sobre os procedimentos que envolvem comparaes de perfis eletroforticos a possibilidade da criao de um banco de dados na Internet visando o rastreamento epidemiolgico e a determinao de clones de maior virulncia (Maiden et al., 1998; Chan et al., 2001). At o presente momento dez marcadores foram descritos para o complexo L. donovani e quatro foram sugeridos para o subgnero Viannia (Mauricio et al., 2001, 2006; Zemanova et al., 2007; Tsukayama et al., 2009). No entanto, o nmero de espcies e cepas de Leishmania tipadas por MLST ainda pequeno, o que talvez ainda no tenha motivado a criao de um banco de dados online. Tal como o MLST, a anlise de sequncias multilocus (Multilocus sequence analysis - MLSA) tambm tem sido utilizada para a caracterizao de cepas em estudos evolutivos. Atravs desta tcnica possvel concatenar as sequncias de mltiplos genes constitutivos para analisar os padres de agrupamento de cepas pertencentes a espcies muito prximas entre si segundo outros mtodos taxonmicos (Hanage et al., 2006). Em outras palavras, o MLSA usado para observar se cepas de populaes similares podem ser separadas em grupos bem resolvidos ou se existe entre elas uma continuidade gentica que impede a separao em grupos (Hanage et al., 2006; Bishop et al., 2009). Recentemente, a anlise da sequncia de quatro genes constitutivos de diversas espcies do subgnero Viannia confirmou o carter monofiltico do grupo, corroborando dados previamente obtidos por eletroforese isoenzimtica (Cupolillo et al., 1994; Boit et al., 2012). A classificao aceita atualmente est esquematizada na Figura 6.1. 59

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Famlia

TRYPANOSOMATIDAE

Gnero

Crithidia

Leptomonas

Herpetomonas

Blastocrithidia

Leishmania

Sauroleishmania

Trypanosoma Phytomonas

Endotrypanum

Subgneros

Viannia

Leishmania

Espcies

L. braziliensis L. guyanensis L. peruviana L. panamensis L. shawi*

L. lainsoni L. naiffi

L. donovani L. infantum

L. tropica L. killick*

L. major

L. aethiopica L. mexicana L. amazonensis L. garnhami* L. pifanoi* L. venezuelensis

Fig. 6.1. Classificao taxonmica dos protozorios do gnero Leishmania que infectam o homem. (Adaptado de WHO, 2010)

60

6.3. Ultraestrutura
Ao contrrio dos organismos pluricelulares, que apresentam um grande nmero de mitocndrias por clula, os tripanossomatdeos possuem uma nica mitocndria tubular que se estende por todo o corpo celular do parasito (Simpson, 1972). Esta mitocndria apresenta grande plasticidade podendo fragmentar-se e fundir-se alterando seu formato e sua distribuio de forma dinmica pela clula (Bernard e Rossignol, 2008). A mitocndria possui tambm uma regio especializada que abriga um componente caracterstico da Classe Kinetoplastea, o cinetoplasto. Como revelado por microscopia eletrnica, o cinetoplasto constitudo por filamentos densos de DNA dispostos em alas paralelas arrumadas em um ou dois planos (revisado por Schneider, 2001). O DNA do cinetoplasto (kDNA) constitui cerca de 30% do DNA total da clula sendo composto por 20 a 50 cadeias fechadas em maxicrculos e 5 a 20 mil cadeias fechadas em minicrculos (revisado por Schneider, 2001). Os maxicrculos possuem estrutura e funo semelhantes ao DNA mitocondrial de eucariotos superiores, codificando um pequeno nmero de RNAr, RNAt e RNAm necessrios para a sntese de protenas que constituem os complexos respiratrios. Por outro lado, os minicrculos codificam pequenas molculas de RNA guia que adicionam ou deletam resduos de uridina dos transcritos dos maxicrculos em um processo conhecido como edio de RNA (Stuart e Panigrahi, 2002). Em tripanossomatdeos, a duplicao de estruturas de cpia nica (tais como mitocndria, cinetoplasto e flagelo) ou mesmo a mudana no posicionamento das mesmas no interior da clula envolve processos de diferenciao ou diviso celular (Gull, 1999). Por esta razo, estes organismos possuem um citoesqueleto bastante organizado formado por uma rede de microtbulos subpeliculares cujos filamentos conectam-se entre si e com a membrana celular do parasito, formando uma espcie de gaiola que envolve todo o citosol (Gull, 1999). Na extremidade anterior do parasito, uma invaginao da membrana celular forma a bolsa flagelar, que estabelece um contato direto com a membrana do flagelo (De Souza, 2002; McConville et al., 2002). A bolsa flagelar a nica regio do parasito que no apresenta microtbulos subpeliculares associados membrana, sendo uma estrutura altamente especializada em endocitose e exocitose de molculas (De Souza, 2002; McConville et al., 2002). A endocitose de hemoglobina por Leishmania ocorre atravs de um receptor localizado na bolsa flagelar (Sengputa et al., 1999). A secreo de cisteno-peptidases, proteofosfoglicanas e fosfatases cidas pelo parasito tambm ocorre nesta regio (Stiehof et al., 1994; McConville et al., 2002). Nas formas amastigotas das espcies que compem o complexo mexicana, organelas semelhantes aos lisossomos, denominadas megassomos, armazenam cisteno-peptidases e fosfatases cidas que

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

so posteriormente secretadas atravs bolsa flagelar (Pupkins et al., 1986; Antoine et al., 1988; Duboise et al., 1994;). O tamanho e o nmero de megassomos no citoplasma podem variar de acordo com a espcie de Leishmania e o tipo de amastigota em questo. Os amastigotas axnicos, por exemplo, apresentam menor nmero de megassomos do que amastigotas derivados de leses (Ueda-Nakamura et al., 2007). Os acidocalcissomos so organelas encontradas em diversos organismos tais como bactrias, protozorios e diversas espcies de vertebrados, incluindo o homem (Docampo e Moreno, 2011). Em Leishmania, os acidocalcissomos foram inicialmente identificados como compartimentos de pH cido que importavam Ca +2 devido presena da enzima Ca +2 ATPase na membrana das organelas (Lu et al., 1997). Atualmente, sabe-se que alm de Ca+2 os acidocalcissomos tambm armazenam fosfato, ctions (tais como Na, K, Mg, Zn e Fe) e pequenos aminocidos (Docampo e Moreno, 2011). Estas organelas apresentam um contedo eltron-denso que pode ser visualizado de diferentes modos de acordo com o mtodo de preparao da amostra antes da anlise por microscopia eletrnica (De Souza, 2002). Nos procedimentos de rotina, parte do material eltron-denso pode ser removida, restando apenas uma pequena esfera adjacente membrana (De Souza, 2002). Os glicossomos so organelas citoplasmticas esfricas e delimitadas por membrana sendo anlogas aos peroxissomos dos eucariotos superiores. Todos os protozorios da Ordem Trypanosomatida possuem glicossomos, no entanto, a atividade da enzima catalase, responsvel pela degradao do perxido de hidrognio, s pode ser detectada com facilidade nos tripanossomatdeos monoxnicos tais como Crithidia e Leptomonas (Muse e Roberts, 1973; Souto-Padron e De Souza, 1982). Embora a atividade da catalase no seja significativa em tripanossomatdeos heteroxenos como Trypanosoma cruzi e Leishmania, os glicossomos destes parasitos abrigam as primeiras sete do total de dez enzimas que compem a via glicoltica (Michels et al., 2006). Alm disso, outros processos metablicos tais como a via pentose-fosfato, a -oxidao dos cidos graxos, a sntese de purina e as vias biossintticas de pirimidinas, esqualenos e ter-lipdios tambm ocorrem nos glicossomos destes protozorios (Michels et al., 2006). Os peroxissomos dos mamferos tambm abrigam vrias enzimas que participam das vias metablicas citadas acima, confirmando a relao destas organelas com os glicossomos dos tripanossomatdeos (De Souza, 2002). As localizaes das organelas descritas acima bem como as diferenas morfolgicas entre promastigotas e amastigotas podem ser visualizadas na Figura 6.2.

62

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Fig. 6.2. Representao esquemtica das principais organelas encontradas nas formas promastigotas e amastigotas de Leishmania. Fonte: Besteiro et al., 2007.

6.4. Interao de Leishmania com o hospedeiro invertebrado


O desenvolvimento de Leishmania no inseto vetor se inicia depois que as fmeas de flebotomneos ingerem sangue contendo as formas amastigotas do parasito. Como o aparelho bucal dos flebotomneos curto e rgido, estes insetos no conseguem se alimentar de sangue diretamente nos vasos sanguneos (Bates, 2007). Por isso, as fmeas dilaceram a pele do hospedeiro e formam uma poa subcutnea contendo sangue e restos de tecido. O dano tecidual gerado libera macrfagos ou amastigotas da derme para a poa de sangue, que ingerida pelo inseto dando incio ao ciclo (Bates, 2007). O desenvolvimento das formas promastigotas de Leishmania no inseto vetor depende do subgnero ao qual o parasito pertence. Os promastigotas do subgnero Viannia se multiplicam no intestino posterior do inseto e, em seguida, migram para o intestino mdio e anterior. Por outro lado, os promastigotas do subgnero Leishmania se multiplicam diretamente no intestino mdio e anterior (Lainson e Shaw, 1987; Bates, 2007). Grande parte do que se sabe sobre a interao entre o parasito e o vetor se deve ao estudo de parasitos do subgnero Leishmania.

63

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Por esta razo, o relato abaixo baseado no desenvolvimento das leishmanias deste subgnero. Em um primeiro momento, o contato com o pH bsico e com uma temperatura de aproximadamente 25 C no intestino do vetor induz a diferenciao dos amastigotas em promastigotas procclicos (Bates, 2007). Estes promastigotas possuem um flagelo curto e movimentam-se pouco, multiplicando-se em meio ao sangue ingerido que envolto por uma estrutura denominada matriz peritrfica. A matriz peritrfica formada por protenas, glicoprotenas e microfibrilas de quitina e tem como principais funes proteger o flebotomneo da ao de microorganismos invasores e das peptidases secretadas para digerir o sangue. As peptidases digestivas so secretadas entre 18 e 48h aps o repasto sanguneo tornando o ambiente da matriz peritrfica hostil para as leishmanias. Nesta etapa da infeco, a sobrevivncia dos promastigotas procclicos depende da secreo de fosfoglicanas que conferem resistncia ou modulam a atividade das enzimas digestivas (Sacks et al., 2000; Secundino et al., 2010). Os movimentos peristlticos do intestino do inseto movimentam a matriz peritrfica contendo o sangue que no foi digerido, auxiliando na excreo deste material (Kamhawi, 2006). Para garantir o sucesso da infeco, os promastigotas procclicos diminuem sua taxa de proliferao e comeam a se diferenciar em promastigotas nectomonas, formas alongadas e muito mveis que migram para a extremidade anterior da matriz peritrfica a fim de perfur-la (Kamhawi, 2006; Bates, 2007). A perfurao da matriz peritrfica ocorre pela ao de quitinases secretadas pelo inseto e pelos nectomonas (Schlein et al., 1991; Shakarian e Dwyer, 2000; Ramalho-Ortigo et al., 2005). O pico de atividade da quitinase dos flebotomneos ocorre 48 horas aps a ingesto de sangue, coincidindo com o momento em que os nectomonas comeam a escapar da matriz peritrfica (Ramalho-Ortigo et al., 2005). Depois de escaparem da matriz, alguns nectomonas se ligam s microvilosidades do epitlio do intestino e traam uma trajetria at a vlvula do estomodeu, interseo entre os intestinos mdio e anterior (Bates, 2007). A LPG, principal lipofosfoglicana de superfcie nos promastigotas a molcula responsvel pela ligao dos nectomonas ao epitlio do intestino do vetor. (Kamhawi, 2006) Esta molcula tambm apresenta polimorfismos bem definidos entre as diversas espcies de Leishmania, sendo considerada a maior determinante de competncia vetorial dos flebotomneos (Pimenta et al., 1992). Em outras palavras, a composio da LPG capaz de selecionar as espcies de Leishmania que conseguiro se ligar ao intestino de determinada espcie de flebotomneo, caracterizando a competncia vetorial como espcie-especfica (Pimenta et al., 1992). 64

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Quatro dias aps a ingesto de sangue, os nectomonas chegam vlvula do estomodeu onde podem se diferenciar em promastigotas do tipo leptomonas ou haptomonas (Kamhawi, 2006). Os leptomonas se multiplicam vrias vezes, causando uma grande infeco no intestino anterior do flebotomneo. Depois, se diferenciam em formas promastigotas metacclicas que no se multiplicam, mas que so altamente infectivas para o hospedeiro vertebrado (Kamhawi, 2006; Bates, 2007). Os leptomonas tambm produzem e secretam um gel de constituio glicoprotica que envolve os promastigotas leptomonas e metacclicos. Este gel obstrui parte do intestino mdio e o intestino anterior do inseto, chegando regio da faringe (Rogers et al., 2002). A obstruo do tubo digestrio gera uma presso que leva a fmea do flebotomneo a regurgitar o gel secretrio na derme do hospedeiro vertebrado antes de se alimentar de sangue, dando continuidade ao ciclo (Rogers et al., 2004). Ainda no se sabe sobre a funo exata dos promastigotas haptomonas no ciclo de transmisso de Leishmania (Kamhawi, 2006). No entanto, tem sido visto que estes parasitos se agrupam em anis concntricos e permanecem ligados vlvula do estomodeu bloqueando a passagem dos promastigotas metacclicos para o intestino anterior. Por este motivo, especula-se que os haptomonas auxiliem na regurgitao do gel secretrio contendo leptomonas e metacclicos (Kamhawi, 2006).

Fig. 6.3. Desenho esquemtico do trato digestrio de um flebotomneo ilustrando os distintos morfotipos de promastigotas que habitam o vetor.

65

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

6.5. Metaciclognese
A metaciclognese confere resistncia lise pelo complemento e contribui para a sobrevivncia do parasito no ambiente intracelular (Franke et al.,1985; Rogers et al., 2004). Nas fmeas de flebotomneos, este processo de diferenciao ocorre em meio ao gel secretado pelos leptomonas, nas proximidades da vlvula do estomodeu (Rogers et al., 2002; Bates, 2007). Nos promastigotas cultivados in vitro, a metaciclognese ocorre durante a fase estacionria de crescimento, quando a escassez de nutrientes no meio de cultura inibe a multiplicao celular e a sntese de protenas (Sacks e Perkins, 1984). A diferenciao de promastigotas procclicos em metacclicos caracterizada por uma mudana na forma e no tamanho da clula (Williams et al., 2006). Diversos estudos tm demonstrado que a autofagia responsvel pelas alteraes que ocorrem durante a metaciclognese, sendo essencial para a aquisio de virulncia pelo parasito (Williams et al., 2006; Besteiro et al., 2007). A autofagia um processo catablico que envolve o sequestro de materiais citoslicos para o interior de organelas de dupla membrana denominadas autofagossomos (Seglen e Bohley, 1994; Levine e Klionsky, 2004). A degradao dos materiais citoslicos ocorre aps a fuso dos autofagossomos com endossomos ou lisossomos (Figura 2) (Levine e Klionsky, 2004). Em Leishmania, os autofagossomos tambm se fundem com lisossomos tubulares multivesiculares, organelas que apresentam pouca atividade ltica em promastigotas procclicos, adquirindo as propriedades de um lisossomo maduro durante a metaciclognese (Figura 2) (Besteiro et al., 2007). Tanto os lisossomos isolados quanto os lisossomos tubulares multivesiculares de promastigotas metacclicos contm serino e cisteno peptidases em seu interior, indicando que estas enzimas so necessrias para o processamento do material autofgico (Williams et al., 2006). De fato, parasitos que no expressam as cisteno peptidases A e B, no sofrem qualquer alterao morfolgica, sendo susceptveis lise pelas enzimas do sistema complemento dos hospedeiros vertebrados (Williams et al., 2006).

6.6. Interao de Leishmania com o hospedeiro vertebrado


Durante o repasto sanguneo, o inseto vetor deposita promastigotas metacclicos na derme do hospedeiro vertebrado. Os promastigotas podem ser fagocitados por diversos tipos celulares tais como neutrfilos, clulas dendrticas e fibroblastos, mas a doena se propaga primariamente no interior dos macrfagos. Antes de serem fagocitados, os promastigotas devem ultrapassar uma srie de obstculos, incluindo a matriz extracelular constituda principalmente por colgeno, 66

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

fibronectina, laminina, hialuronas e proteoglicanas (Pedersen e Swartz, 2005). A migrao de Leishmania atravs da matriz extracelular aumentada durante a expresso ativa de metalopeptidases de superfcie tais como a gp63, que capaz de degradar colgeno e fibronectina (McGwire et al., 2003). Outras funes da gp63 envolvem a clivagem do componente C3b do sistema complemento, a interao com receptores de fibronectina na superfcie dos macrfagos e a inibio da proliferao das clulas natural killers (NK) (Brittingham et al., 1995; Lieke et al., 2008). A principal lipofosfoglicana de superfcie (LPG) tambm tem sido associada com as etapas iniciais da infeco por Leishmania, principalmente com a resistncia dos promastigotas metacclicos s espcies reativas de oxignio ( Reactive Oxygen Species ROS) liberadas durante a invaso (Spth et al., 2003). Curiosamente, os parasitos do complexo mexicana possuem uma resistncia intrnseca ao estresse oxidativo, no necessitando da LPG para estabelecer a infeco (LLg, 2000). Outras funes tambm foram propostas para a LPG tais como ligao aos receptores dos macrfagos e inibio da maturao dos fagolisossomos (Mosser et al., 1985, 1987; Desjardins e Descoteaux, 1997). Estudos pioneiros demonstraram que a LPG atua em conjunto com a gp63 sendo capaz de ativar o sistema complemento e gerar opsoninas (Mosser et al., 1985, 1987). Estas opsoninas facilitam a fagocitose de Leishmania atravs da ligao com os receptores para complemento presentes na superfcie dos macrfagos (Mosser et al., 1985, 1987). A fagocitose do parasito atravs destes receptores no estimula eventos pr-inflamatrios tais como a queima oxidativa ou a liberao de IL-12, sendo comumente chamada de entrada silenciosa (Mosser et al., 1985, 1987). Embora o papel da LPG na invaso dos macrfagos seja reconhecido, camundongos deficientes em receptores para o sistema complemento tambm desenvolvem a infeco sugerindo que a LPG pode ser redundante ou pouco importante para este evento (Carter et al., 2009). A diferenciao de promastigotas metacclicos em amastigotas se completa no interior dos fagolisossomos dos macrfagos e est associada com a diminuio da expresso da LPG e da gp63 na superfcie do parasito (revisado por Alexander et al., 1999). Quando isto ocorre, a superfcie dos amastigotas passa a ser recoberta principalmente por lipdios de glicosil-fosfatidil-inositol (glycosyl phosphatidyl inositol lipids GIPLs) parasito (revisado por Alexander et al., 1999). A contribuio dos GILPs para a virulncia de Leishmania controversa. Alguns estudos consideram sua importncia para a inibio da xido ntrico sintase e da protena kinase C (Proudfoot et al., 1995; Zufferey et al., 2003). Contudo, outros reportes apontam que os GILPs dos amastigotas so substitudos por glicolipdios dos hospedeiros que protegem os parasitos da ao das hidrolases dos lisossomos (Zhang e Berveley, 2009). 67

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Durante a permanncia no interior dos fagolisossomos, a aquisio de nutrientes constitui um dos principais desafios das formas amastigotas. Os carboidratos, principal fonte de nutrientes dos promastigotas, so muito escassos no ambiente intracelular. Para sobreviver no hospedeiro vertebrado, os amastigotas diminuem a expresso de protenas da via glicoltica, responsvel pela quebra de glicose, e aumentam a expresso de enzimas envolvidas na -oxidao dos cidos graxos e na gliconeognese (Bente et al., 2003, Nugent et al., 2004; Rosenzweig et al., 2008). Em outras palavras, os amastigotas passam a utilizar aminocidos e cidos graxos como principal fonte de energia. Enquanto os aminocidos so internalizados atravs de permeases presentes na membrana celular, protenas e lipdios so endocitados atravs do bolso flagelar e degradados nos megassomos, organelas de natureza lisossomal (revisado por Besteiro et al., 2007). No interior dos fagolisossomos, os amastigotas tambm permanecem expostos s espcies reativas de oxignio e nitrognio liberadas pelos macrfagos. Em Leishmania, a via da sntese de poliaminas, que culmina na produo da enzima tripanotiona redutase, a principal frente de defesa dos parasitos contra o estresse oxidativo (Dumas et al., 1997). A tripanotiona redutase uma enzima exclusiva dos tripanossomatdeos responsvel por controlar o balano redox, a detoxificao de perxido de hidrognio e a detoxificao de metais e drogas (Dumas et al., 1997). Esta enzima um dos alvos dos antimoniais pentavalentes, drogas de primeira escolha no tratamento da Leishmaniose (Wyllie et al., 2004).

6.7. Leishmaniose
A leishmaniose possui um amplo espectro de manifestaes clnicas, abrangendo formas tegumentares e viscerais que encontram-se resumidas na tabela 6.1. O estabelecimento da infeco e o desenvolvimento dos sintomas da doena dependem da espcie de Leishmania envolvida, da resposta imunolgica do hospedeiro e da biologia do vetor (Murray et al., 2005; Reithinger et al., 2007). O controle da leishmaniose dificultado pelas limitaes intrnsecas dos medicamentos usados no tratamento e pelo alto custo financeiro, bem como pelo crescente nmero de casos de coinfeco com o HIV e pela ausncia de uma vacina eficaz (Murray et al., 2005; Reithinger et al., 2007). As distintas manifestaes clnicas da Leishmaniose esto descritas com mais detalhes abaixo.

68

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Tabela 6.1. Principais formas clnicas da infeco por Leishmania spp. Forma Clnica Sintomas Cutnea Leso nica ou leses mltiplas que podem ser ppulos, ndulos, ndulos ulcerados ou leses ulceradas. Mucosa Disseminao dos parasitos da leso cutnea para a mucosa oro - nasal e farngea por via linftica ou sangunea. Cutnea Mltiplas leses ulceradas Disseminada acneiformes, papulares e nodulares em reas no contguas do corpo podendo ou no haver comprometimento das mucosas. Cutnea Mltiplas leses no Difusa ulceradas podendo ocorrer sob a forma de ppulos, ndulos ou placas. Visceral Comprometimento de bao, fgado, mucosa intestinal, medula ssea e linfonodos. Febre, anemia, diarria e perda de peso. Ps Kala-azar Leses papulares ou (PKL) nodulares e despigmentao da pele. Principais Espcies Associadas L. (V.) braziliensis, L. (V.) panamensis, L. (V.) guyanensis, L. (V.) peruviana, L. (L.) mexicana, L. (L.) amazonensis, L. (L.) infantum, L. (L.) tropica, L. (L.) major, L. (L.) aethiopica, L. (L.) donovani. L. (V.) braziliensis, L. (V.) panamensis, L.(L.) aethiopica, L. (L.) amazonensis, L. (L.) infantum, L. (L.) major, L.(L.) tropica .

L. (V.) braziliensis, L. (V.) panamensis, L. (V.) guyanensis, L. (L.) amazonensis.

L. (L.) amazonensis, L. (L.) mexicana, L. (L.) aethiopica.

L. (L.) infantum, L. (L.) donovani.

L. (L.) donovani.

6.8. Leishmaniose Tegumentar (LT)


A LT abrange as manifestaes clnicas cutnea, mucocutnea, disseminada e difusa da doena (Tabela 6.1). Geralmente, o primeiro sinal de infeco por leishmaniose cutnea o surgimento de um pequeno eritema no local da picada do flebotomneo. O eritema se desenvolve formando uma ppula que pode progredir para ndulo eritematoso, placa endurecida, placa escamosa ou lcera. As leses podem ser secas, crostosas ou acompanhadas de exudatos (Murray et al., 2005; Reithinger et al., 2007; David e Craft, 2009). As lceras tendem cura espontnea, mas a metstase, mesmo aps a cura clnica, um fenmeno descrito com frequencia na forma cutnea da leishmaniose (Murray et al., 2005; Reithinger et al., 2007; David e Craft, 2009). As leses mucosas se apresentam geralmente meses ou anos aps o primeiro episdio cutneo (Marsden, 1986). O tipo de leso varia desde a perfurao do septo nasal at a destruio do tecido facial, sendo seu tratamento difcil e no raramente, ineficiente (Marsden et al., 1998; Lessa et al., 2007;). Acredita-se que a 69

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

leishmaniose mucosa se deva metstase dos parasitos para a mucosa oro-nasal e farngea, via disseminao sangunea ou linftica, a partir da leso cutnea primria (revisado por Silveira et al., 2004). L. (V.) braziliensis a principal espcie associada leishmaniose mucocutnea. A leishmaniose disseminada menos comum,

abrangendo 2% dos casos diagnosticados de leishmaniose cutnea (Turetz et al, 2002), sendo caracterizada por mltiplas leses cutneas em mais de duas reas no contguas do corpo. As leses apresentam-se acneformes e papulares ulceradas (Turetz et al, 2002). As principais espcies associadas a esta forma da doena so L. (V.) braziliensis e L. (L.) amazonensis (Turetz et al, 2002; Silveira et al., 2004). Por ltimo, a leishmaniose difusa ocorre em pacientes com anergia e deficincia especfica na resposta imune celular a antgenos de Leishmania. caracterizada pela presena de macrfagos com muitos amastigotas nas leses. Contudo, apresenta reatividade negativa no teste de Montenegro (revisado por Silveira et al., 2004). Inicia-se como uma leso nica com baixa resposta ao tratamento, evolui de forma lenta com formao ndulos, ppulas e placas infiltradas que raramente so ulcerativas. L. (L.) amazonensis o principal agente etiolgico da leishmaniose difusa (revisado por Silveira et al., 2004).

6.9. Leishmaniose Visceral (LV)


Os principais agentes etiolgicos da LV so L. (L.) donovani e L. (L.) infantum (Tabela 6.1). O desenvolvimento das manifestaes clnicas da LV depende em grande parte da resposta imunolgica do hospedeiro. Deste modo, uma infeco recentemente adquirida pode permanecer subclnica, ou evoluir para as formas oligossintomtica e clssica (WHO, 2010; Murray et al., 2005). A LV ativa tambm pode apresentar recorrncia depois de um perodo de 6 a 12 meses de tratamento aparentemente bem sucedido. Alm disso, a doena pode sofrer recrudescncia, ou seja, uma reativao mais tardia tanto em pacientes previamente subclnicos quanto naqueles que receberam tratamento (Murray et al., 2005). A recrudescncia pode ser espontnea, mas costuma ocorrer com mais frequncia em indivduos

imunologicamente deprimidos. Os portadores da LV clssica expressam sintomas clnicos bastante caractersticos que incluem febre, palidez, fraqueza muscular, hepatomegalia e esplenomegalia (WHO, 2010). Sintomas como diarria e retardo no crescimento tambm so comuns em crianas. A despigmentao da pele observada na Leishmaniose drmica ps-kalazar (WHO, 2010). Nesta forma da LV, causada por L. (L.) donovani, o paciente pode apresentar eritemas, mculas, ppulas ou ndulos faciais (WHO, 2010). Se a LV no for tratada, pode tornar-se 70

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

multisistmica em qualquer faixa etria produzindo caquexia profunda, sangramento associado trombocitopenia, susceptibilidade a infeces secundrias e morte (Murray et al., 2005).

71

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

REFERNCIAS Captulo 1
Brasil. Portal Peridicos Capes. Disponvel em: http://www.periodicos.capes.gov.br/. Acessado em: 03 de dez. de 2012. Gil, AC (2008). Mtodos e tcnicas de pesquisa social. 6. ed. So Paulo: Atlas. Severino, AJ. Metodologia do trabalho cientfico . 23.ed. rev. atual. So Paulo: Cortez, 2007. 304 p.

Captulo 2
Aguiar GM, medeiros WM (2003). Distribuio regional e habitats das espcies de flebotomneos do Brasil. In: RANGEL, E.F.; LAINSON, R. ( Org.). Flebotomneos do Brasil. Rio de Janeiro: Editora Fiocruz, p.207-256. Aguiar GM, Vilela ML, Lima RB (1987). Ecology of the sandflies of Itagua, an area of cutaneous leishmaniasis in the State of Rio de Janeiro. Food preferences (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae). Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 82(4): 583584. Aguilar CM, Rangel EF, Deane LM (1986). Cutaneous leishmaniasis in frequent in equines from an endemic area in Rio de Janeiro, Brazil. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 81(4): 471-472. Alencar JE, Dietze R (1991). Leishmaniose visceral (Calazar). In: VERONESI, R. Doenas infecciosas e parasitrias. 8. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p. 706-17. Ashford R.W (2000). The Leishmaniases as emerging and reemerging zoonoses. International Journal for Parasitology , 30(12/13): 1269-1281. Avair J, Vliz ID, Caryn B, et al (2012). Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. 7(5): 1-12. Brando-Filho SP, Brito ME, Carvalho FG, et al (2003). Wild and synanthropic hosts of Leishmania (Viannia) braziliensis in the endemic cutaneous Leishmaniasis locality of Amaraji, Pernambuco State, Brazil. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene , 97(3) 291-296.

72

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Brasil (2006). Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia em Sade. Departamento de Vigilncia Epidemiolgica. Manual de Vigilncia e Controle da Leishmaniose Visceral, 1 ed. Braslia-DF, 120p. Brasil (2007). Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia em Sade. Departamento de Vigilncia Epidemiolgica. Manual de Vigilncia da Leishmaniose Tegumentar Americana, 2. ed. Braslia, 182p. Brasil (2009). Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia em Sade. Departamento de Vigilncia Epidemiolgica. Guia de vigilncia epidemiolgica , 7ed. Braslia. 2009. 816p. Brasil (2012). Ministrio da Sade. Leishmaniose. Disponvel

<http://portal.saude.gov.br/portal/saude> Acesso em: 29 dez. de 2012. Brazil RP, Nascimento MDSB, Macau RP (1987). Infeco natural do porco (Sus scrofa) por Leishmania em foco recente de leishmaniose tegumentar na Ilha de So Lus, Maranho. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 82(1): 145. Carvalho GML, Gontijo CMF, Falco AL, et al (2010). Study of Phlebotomine Sand Flies (Diptera: Psychodidae) Collected in a Leishmania-Endemic rea of the Metropolitan Region of Belo Horizonte, Brazil. Journal of Medical Entomology, 47(6) 972-976. CDC (2012). Center for Disease Control and Prevention. Parasites Leishmaniasis. Disponvel em: <http://www.cdc.gov/parasites/Leishmaniasis/index.html>. Acesso em 12 de dez. 2012. Desjeux P (2004). Leishmaniasis: current situation and new perspectives. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, 27(5) 305-318. Ferro C, Prado R, Torres ME, et al (1997). Larval microhabitats of Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae) in an endemic focus of visceral Leishmaniasis in Colombia. Journal of Medical Entomology, 34(6) 719-728. FIOCRUZ (2012). Fundao Oswaldo Cruz. As leishmanioses. Disponvel em: <http://www.dbbm.fiocruz.br/tropical/leishman/leishext/index.htm>. Acesso em 21 de dez 2012. FUNASA (1999). Fundao Nacional de Sade. Evoluo temporal das doenas de notificao compulsria no Brasil de 1980 a 1998 . Boletim Epidemiolgico; Ed. Especial. Garcia FCB, Santos SSR, Chociay MF, et al (2005). Mtodos subsidirios para o diagnstico da leishmaniose tegumentar americana (LTA): comparao dos 73

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

resultados do sequenciamento de DNA e da PCR-RFLP para determinao da espcie de Leishmania em amostras cutneo-mucosas. Anais Brasileiros de Dermatologia, 80(3) 340-345. Gontijo CMF, Silva ES, Fuccio MB, et al (2002). Epidemiological studies of an outbreak of cutaneous Leishmaniases in the Rio Jequitinhonha Valley, Minas Gerais, Brazil. Acta Tropica, 81(2) 143-150. IBGE (2012). Instituto Brasileiro de Geografia e Estatstica. Estimativa Populacional. Disponvel em: <http://www.ibge.gov.br/home/>. Acesso em 29 de dez 2012. Lainson R, Shaw JJ (1987). Evolution. classification and geographical distribution.In: PETERS, W.; KILLICK-KENDRICK, R (Eds). The Leishmaniases in biology and medicine. Academic Press. London, 1: 1-120. Lainson R, Shaw JJ (1988). New world Leishmaniasis - The Neotropical Leishmania species. In: TOPLEY; WILSON. Microbiology and Microbial Infections, (9 a ed). London: Ed. Feg Cox; 9 ed. Laveran A (1917). Leishmanioses. Kala-Azar, Bouton dorient, Leishmaniose Amricaine. Masson et Cie., (ed), Paris, 521p. Lima AP, Minelli L, Comunello E, et al (2002). Distribuio da leishmaniose tegumentar por imagens de sensoriamento remoto orbital, no Estado do Paran, Sul do Brasil. Anais Brasileiros de Dermatologia, 77(6): 681-692. Madeira MF, Uchoa CMA, Leal CA, et al (2003). Leishmania (viannia) braziliensis em ces naturalmente infectados. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical; 36(5): 551-555. Margonari C, Soares RP, Andrade-Filho JD, et al (2010). Phlebotomine Sand Flies (Diptera: Psychodidae) and Leishmania Infection in Gafanhoto Park, Divinpolis. Brazil. Journal of Medical Entomology, 47(6): 1212-1219. Medeiros ACR, Rodrigues SS, Roselino AMF (2002). Comparison of the specificity of PCR and the histopathological detection of Leishmania for the diagnosis of American cutaneous Leishmaniasis. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 35, n. 4, p. 421-424. Nery-Guimares F, Damasceno R, Azevedo M (1968). Leishmaniose tegumentar zoonose de roedores silvestres na Amaznia. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz; 66(2): 151-168.

74

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Nieves E, Pimenta PFP (2000). Development of Leishmania (Viannia) braziliensis and Leishmania (Leishmania)amazonensisin the sand fly Lutzomyia

migonei(Diptera:Psychodidae). Journal of Medical Entomology, 37(1): 134-140. Oliveira FS, Pirmez C, Pires MQ, et al (2005). PCR-based diagnosis for detection of Leishmania in skin and blood of rodents from an endemic area of cutaneous and visceral leishmaniasis in Brazil. Veterinary Parasitology, 129(3/4): 219227. Penna HA (1934). Leishmaniose visceral no Brasil. Brasil-Mdico, v. 48, p. 949-950. Pennisi MG (2004). Case report of Leishmaniasis in four cats. Veterinary Research Communications, 28(1): 363-366. Pessa SB, Martins AV (1982). Parasitologia Mdica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan; 872p. Pimenta PFP, Secundino NFC, Blanco EEN (2003). Interao Leishmania hospedeiro invertebrado. In: rangel EF. Lainson R (Org) Flebotomneos do Brasil. Rio de Janeiro: Editora Fiocruz, p.257-274. Quaresma PF, Murta SM, Ferreira EC, et al (2009). Molecular diagnosis of canine visceral Leishmaniasis: Identification of Leishmania species by PCR-RFLP and quantification of parasite DNA by real-time PCR. Acta Trop, 111(3): 289-294. Quaresma PF, Murta SM, Ferreira EC, et al (2011). Wild, synanthropic and domestic hosts of Leishmania in an endemic area of cutaneous leishmaniasis in Minas Gerais State, Brazil. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 105: 579 585. Rey L (2001). Parasitologia. 3 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 2001. 856 p. Roselino, A.M (2008). Biologia molecular aplicada s dermatoses tropicais. Anais Brasileiros de Dermatologia, 83(3): 187-203. Rotureau B, Ravel C, Couppi P, et al (2006). Use of PCR-Restriction fragment length polymorphism analysis to identify the main new world Leishmania species and analyze their taxonomic properties and polymorphism by application of the assay to clinical samples. Journal of Clinical Microbiology, 44(2): 459-467. Saraiva L, Andrade-Filho JD, Silva SO, et al (2010). The molecular detection of different Leishmania species within sand flies from a cutaneous and visceral leishmaniasis sympatric area in Southeastern Brazil. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 105(8): 1033-1039.

75

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Schalling HDFH, Oskan L (2002). Molecular biological applications in the diagnosis and control of Leishmaniasis as parasite identification. International Health, 7(8): 641-651. Silveira FT, Lainson R, Brito AC, et al (1997). Leishmaniose Tegumentar Americana. In: LEO, R.N.Q. Doenas Infecciosas e Parasitrias: Enfoque Amaznico . Belm: Editora CEJUP; 885p. Soares MJV, Moraes JRE, Roselino AMF (2005). Polymerase chain reaction in detecting Leishmania sp in symptomatic and asymptomatic seropositive dogs. Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases , 11(4): 532539. Solano-Gallego L, Morell P, Arboix M, et al (2001). Prevalence of Leishmania infantum infection in dogs living in an area of canine Leishmaniasis endemicity using PCR on several tissues and serology. Spain. Journal of Clinical Microbiology, 39(2): 560-563. Souza AI (2005). Feline Leishmaniasis due to Leishmania (Leishmania) amazonensis in Mato Grosso do Sul State, Brazil. Veterinary Parasitology, 128(1-2): 41-45. Souza CF, Borges MAZ, Andrade AJ (2009). Contribution to the Knowledge of the Phlebotomine Sand Flies Fauna (Diptera: Psychodidae) of Timteo Municipality, Minas Gerais. Brazil. Neotropical Entomology, 38(2): 267-27. Teodoro U (1996). Caractersticas ecolgicas de Flebotomneos (Diptera Psychodidae) em habitats antrpicos. municpio de Jussara, Paran, Brasil. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 29:625-626. Teodoro U, Khl JB, Abbas M, et al (2001). Luz e aves como atrativos de flebotomneos (Diptera. Psychodidae). no sul do Brasil. Revista Brasileira de Entomologia, 45(3): 167-172. Weiss JB (1995). DNA probes and PCR for diagnosis of parasitic infections. Clinical Microbiology Reviews, 8(1): 113-30. WHO (2012). World Helth Organization. Leishmaniasis. Disponvel em: Tropical Medicine &

<http://www.who.int/>. Acesso em: 15 de nov. 2012. Yang S, Rothman R (2004). PCR-based diagnostics for infectious diseases: uses, limitations and future applications in acute-care settings. The Lancet Infectious Diseases, 4(6): 337-348.

76

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Captulo 3
Ahid SMM (2009). Apostila Didtica em Entomologia Veterinria . Mossor: Universidade Federal Rural do Semi-rido; 80 f. Brazil RP, Brazil BG (2003). Bionomia. In: Rangel EF, Lainson R. Flebotmos do Brasil. Rio de Janeiro: Editora Fiocruz; p. 257-274. FAPESP (2012). Chaves de identificao ilustrada e interativa para os flebotomneos do Brasil (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae): Disponvel em:

<http://www.bv.fapesp.br/pt/bolsas/114807/chaves-identificacao-ilustradainterativa-flebotomineos/>. Acesso em: 15 de nov. 2012. BIOTIC (2012). Chaves de identificao ilustrada e interativa para os flebotomneos do Brasil (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae). Disponvel em:

<http://biotic.bot.uc.pt/index.php?menu=13&language=pt&tabela=geral referencia>. Acesso em: 15 de nov. 2012. Forattini OP (1973). Entomologia Mdica: Psychodidae. Leishmaniose. Bartonelose. Vol IV. So Paulo: Edgard Blucher; 658p. Fuzari AA (2011). Estudo da Fauna Flebotomnica (Diptera: Psychodidae:

Phlebotominae) no Parque Estadual da Serra da Tiririca, Rio de Janeiro, Brasil . [Dissertao]. Instituto Oswaldo Cruz: Fundao Oswaldo Cruz; 65p. Mestrado Galati EAB (2003). Morfologia e Taxonomia. In: Rangel EF & Lainson R. Flebotmos do Brasil. Rio de Janeiro: Editora Fiocruz; p. 23-206. Klowden, MJ. Physiological systems in insects. University of Idaho, Moscow, Idaho 2 ed Neves DP (2000). Parasitologia Humana. 10 Ed. So Paulo: Editora Atheneu. Rangel EF, Lainson R (2003). Flebotmos do Brasil. Rio de Janeiro: Editora Fiocruz; 2003. Ruppert EE, Barnes RD (1996). Zoologia dos Invertebrados. 6 Ed So Paulo: Roca. Shimabukuro PHF (2007). Chave de identificao ilustrada dos Phlebotominae (Diptera, Psychodidae) do Estado de So Paulo. [Tese]. Secretaria de Estado da Sade de So Paulo: Programa de Ps-Graduao em Cincias da

Coordenadoria de Controle de Doenas; 107p. Doutorado. Young DG, Ducan MA (1994). Guide to the identification and geographic distribution of Lutzomyia sand flies in Mexico, the West Indies, Central and South America (Diptera: Psycodidae). Memoirs of the American Entomological Institute. 881p. 77

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Captulo 4
Bonvicino CR (2011). Diversidade Cariotpica em roedores Akodontini do Brasil . Boletim da sociedade Brasileira de Mastozoologia, n.62, p.7-13. Rivera EAB (2006). Eutansia. In: Andrade A, Pinto SC, Oliveira RS (orgs.). Animais de laboratrio: criao e experimentao . Editora Fiocruz, Rio de Janeiro Teixeira P, Valle S (1996). Biossegurana: uma abordagem multidisciplinar. Rio de Janeiro: Ed. Fiocruz. WHO (2011) World Healh Organization. Health topics - Zoonoses. Disponvel em: <http://www.who.int/zoonoses/en/>. Acesso em: 15 de dez. 2012

Captulo 5
Almeida MA, Jesus EE, Sousa-Atta ML, et al. (2005). Clinical and serological aspects of visceral leishmaniasis in northeast Brazilian dogs naturally infected with Leishmania chagasi. Veterinary Parasitology, 127(3-4):227-32. Alvar J, Canavate C, Molina R, et al. (2004). Canine leishmaniasis. Adv Parasitol, 57:188. Barbosa santos EG, Marzochi MC, Conceio NF, et al. (1998) N-methylglucamine antimonate (SbV+): intralesional canine tegumentary leishmaniasis therapy. Parasite, 5(2): 175-180. Bevilacqua PD, Paixo HH, Modena CM, et al. (2001). Urbanizao da leishmaniose visceral em Belo Horizonte. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinria e Zootecnia. 53(1). Brando Filho SP, Dantas-Torres F, Tolezano JE, et al. (2011). Captulo 7: Hospedeiros reservatrios de Leishmania spp. associados leishmaniose tegumentar americana, com especial nfase no Brasil. Leishmanias e a leishmaniose tegumentar nas Amricas. Brasil. 65-74. Brasil (2006). Ministrio da Sade. Manual de Vigilncia e Controle da Leishmaniose Visceral. Braslia-DF. Ministrio da Sade - MS (ed), Braslia. Brasil (2007). Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia em Sade. Manual de Vigilncia da Leishmaniose Tegumentar Americana / Ministrio da Sade, Secretaria de Vigilncia em Sade . 2. ed. atual. Braslia : Editora do Ministrio da Sade, 180 p. Brasil (2010). Ministrio da Sade. Nota tcnica conjunta da Secretaria de Vigilncia em Sade do Ministrio da Sade e da Secretaria de Estado do Rio Grande do

78

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Sul sobre a situao da Leishmaniose Visceral na fronteira do Estado do Rio Grande do Sul com a Argentina . Disponvel em:

<http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/nota_tec_front_br_argentina_lv_final _ses_rs.pdf.>. Acesso em 15 de dez. 2010. Brasil (2012). Ministrio da sade. Leishmaniose Disponvel em:

<http://portal.saude.gov.br/portal/saude/profissional/visualizar_texto.cfm?idtxt=319 15>. Acesso em 15 e 17 de dez. 2012. Camargo-Neves VLF, Glasser CM, Cruz LL, et al (2006). Manual de Vigilncia e Controle da Leishmaniose Visceral Americana do Estado de So Paulo . 1a ed. So Paulo: Secretaria de Estado da Sade. Chouihi E, Amri F, Bouslimi N, et al. (2009). Cultures on NNN medium for the diagnosis of leishmaniasis. Pathol Biol (Paris), 57(3):219-24. Costa CM, Moutinho FFB, bruno SF (2004). A experincia do municpio de Paraty (Rio de Janeiro, Brasil) na preveno e controle da leishmaniose tegumentar americana. Parasitol Latinoam, 59 (3/4):110-4. Coutinho SG, Nunes MP, Marzochi MC, et al. (1985). A survey for American cutaneous and visceral leishmaniasis among 1,342 dogs from areas in Rio de Janeiro (Brazil) where the human diseases occur. Mem Inst Oswaldo Cruz, 80(1):17-22. Dantas-Torres F (2009). Canine leishmaniosis in South America. Parasit Vectors; 2(S1): 1-8. PMid:19426440 PMCid:2679393. http:// dx.doi.org/10.1186/1756-33052-S1-S1 . De paula CC, Figueiredo FB, Menezes RC, et al. (2009). Canine visceral leishmaniasis in Marica, State of Rio de Janeiro: first report of an autochthonous case. Rev Soc Bras Med Trop, 42(1):77-8. Deane LM, Deane MP (1955). Leishmaniose visceral urbana (no co e no homem) em Sobral, Cear. O Hospital, 47(1):75-87. El harith A, Chowdhury S, Masum AL, et al. (1996). Reactivity of various leishmanial antigens in a direct agglutination test and their value in differentiating post-kala azar dermal leishmaniasis from leprosy and other skin conditions. J Med Microbiol;44:142-146. Falqueto A, Coura JR, Barros GC, et al. (1986). Participation of the dog in the cycle of transmission of cutaneous leishmaniasis in the municipality of Viana, State of Espirito Santo, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz, 81(2):155-63.

79

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Ferrer L, Aisa MJ, Roura X, et al. (1995). Serological diagnosis and treatment of canine leishmaniasis. Vet Rec;136(20):514-6. Figueiredo FB, Barbosa Filho CJ, Schubach EY, et al. (2010). Report on an autochthonous case of canine visceral leishmaniasis in the southern zone of the municipality of Rio de Janeiro. Rev Soc Bras Med Trop, 43(1):98-9. Figueiredo FB, Madeira MF, Menezes RC, et al. (2010). Efficacy of an indirect immunofluorescence test in the diagnosis of canine leishmaniosis. The Veterinary Journal; Aug 6 doi. Figueredo LA, Cavalcanti MP, Almeida EL, et al. (2012). Clinical and hematological findings in Leishmania braziliensis infected dogs from Pernambuco, Brazil. Rev Bras Parasitol Vet. Dec 4. doi:pii: S1984-29612012005000010. Freitas JCC, Nunes-Pinheiro DCS, Neto bel, et al (2012). Clinical and laboratory alterations in dogs naturally infected by Leishmania chagasi. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 45(1):24-29. Gontijo CMF, Melo MN (2004). Leishmaniose visceral no Brasil: quadro atual, desafios e perspectivas. Revista Brasileira de Epidemiologia ;7(3). Grimaldi G, Teva A, Ferreira AL, et al. (2012). Evaluation of a novel chromatographic immunoassay based on Dual-Path Platform technology (DPP CVL rapid test) for the serodiagnosis of canine visceral leishmaniasis. Trans R Soc Trop Med Hyg;106(1):54-9. Ikeda FA, Luvizotto MCR, Goncalves ME, et al (2003). Perfil hematologico de caes naturalmente infectados por Leishmania chagasi no municipio de Aracatuba, Sao Paulo (Brasil): um estudo retrospectivo de 191 casos. Clin Vet; 47:42-48. Lonardoni MV, Silveira TG, Alves WA et al.(2006). Leishmaniose tegumentar americana humana e canina no municpio de Mariluz, Estado do Paran, Brasil. Cad Saude Publica, 22(12):2713-6. Madeira MF, Schubach A, Schubach TM, et al (2006). Post mortem parasitological evaluation of dogs seroreactive for Leishmania from Rio de Janeiro, Brazil. Vet Parasitol, 138(3-4):366-70. Madeira MF, Schubach A, Schubach TM, et al.(2006). Mixed infection with Leishmania (Viannia) braziliensis and Leishmania (Leishmania) chagasi in a naturally infected dog from Rio de Janeiro, Brazil. Trans R Soc Trop Med Hyg, 100(5):442-5. Marzochi MC, Marzochi KB, Carvalho RW (1994). Visceral leishmaniasis in Rio de Janeiro. Parasitol Today, 10(1):37-40. 80

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Marzochi MCA, Coutinho SG, Souza WJ, et al. (1985). Canine visceral leishmaniasis in Rio de Janeiro. Brazil. Clinical, parasitological, therapeutical and epidemiological findings (1977-1983). Mem Inst Oswaldo Cruz, 80: 349-357. Marzochi MCA, Marzochi KB (1994). Tegumentary and visceral leishmaniasis in Brazil - Emerging anthropozoonosis and possibilities for their control. Cadernos de Sade Pblica, 10:359-375. Marzochi MCA, Marzochi KBF (1997). Leishmanioses em reas urbanas. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 30:162-167. Massunari GK, Voltarelli EM, Santos DR, et al. (2009). A serological and molecular investigation of American cutaneous leishmaniasis in dogs, three years after an outbreak in the Northwest of Parana State, Brazil. Cad Saude Publica; 25(1):97104. Pirmez C, Coutinho SG, Marzochi MC, et al. (1988). Canine American cutaneous leishmaniasis: a clinical and immunological study in dogs naturally infected with Leishmania braziliensis braziliensis in an endemic area of Rio de Janeiro, Brazil. Am J Trop Med Hyg, 38(1): 52-58. Quintelha LP, Cuzzi T, Madeira F, et al. (2009). Immunoperoxidase technique using an anti-Leishmania (L.) chagasi hyperimmune serum in the diagnosis of culture confirmed American Tegumentary Leishmaniasis. Revista do Instituto de Medicina Tropical de So Paulo (Impresso), 51: 83-86. Rangel EF, Lainson R (2009). Proven and putative vectors of American cutaneous leishmaniasis in Brazil: aspects of their biology and vectorial competence. Mem Inst Oswaldo Cruz., 104(7):937-54. Reis AB, Martins-Filho OA, Teixeira Calho A, et al (2006). Parasite density and impaired biochemical/hematological status are associated with severe clinical aspects of canine visceral leishmaniasis. Res Vet Sci, 81:68-75. Ribeiro VM (2007). Leishmaniose visceral canina: aspectos de tratamento e controle. Clin Vet; 71:66-76. Rio de Janeiro (2012). Nota tcnica N 5/2012- GDTVZ/DTI/CVE/SVEA/SVS-SESRJ . Assunto: Intensificao da Vigilncia para Leishmaniose Visceral no Estado do Rio de Janeiro. Rosati S, Ortoffi M, Profiti M, et al. (2003). Prokaryotic expression and antigenic characterization of three recombinant Leishmania antigens for serological diagnosis of canine leishmaniasis. Clin Diagn Lab Immunol, 10(6):1153-6. 81

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Santos IB, Schubach TM, Leme LR, et al. (2007) Sporotrichosis: the main differential diagnosis with tegumentary leishmaniosis in dogs from Rio de Janeiro, Brazil. Vet Parasitol; 143(1): 1-6. PMid:16973286. http://dx.doi.

org/10.1016/j.vetpar.2006.08.002. Sessa PA, Falqueto A, Varejo JB (1994). Tentativa de controle da leishmaniose tegumentar americana por meio do tratamento dos ces doentes. Cad Saude Publica, 10(4):457-63. Shaw JJ (2002). New World Leishmaniasis: the ecology of leishmaniasis and the diversity of leishmaniasis species in Central and South America . In Farrel (ed) World ClasAs Parasites: Leishmania, 4 Kluwer Academic Publishe Boston, Dordrecht, London, p. 11-31. Silva DA, Madeira MD, Abrantes TR, et al. (2012). Assessment of serological tests for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis. Vet J. Silva DA, Madeira MF, Teixeira AC, et al. (2011).Laboratory tests performed on Leishmania seroreactive dogs euthanized by the leishmaniasis control program. Vet Parasitol. Souza GD, Santos E, Andrade Filho JD (2009). The first report of the main vector of visceral leishmaniasis in America, Lutzomyia longipalps (Lutz & Neiva) (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae), in the state of Rio Grande do Sul, Brazil. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz; 104 (8): 1181-1182. Swenson CL, Silverman J, Stromberg PC, et al. (1988). Visceral leishmaniasis in an English foxhound from an Ohio research colony. J Am Vet Med

Assoc;193(9):1089-92. Tafuri WL, Santos RL, Arantes RM, et al. (2004). An alternative immunohistochemical method for detecting Leishmania amastigotes in paraffin-embedded canine tissues. J Immunol Methods, 292(1-2):17-23. Tolezano JE, Uliana SR, Taniguchi HH, et al. (2007). The first records of Leishmania (Leishmania) amazonensis in dogs (Canis familiaris) diagnosed clinically as having canine visceral leishmaniasis from Araatuba County, So Paulo State, Brazil. Vet Parasitol, 149(3-4): 280-4. Vasconcelos IA, Vasconcelos AW, FE Filho NM, et al. (1994). The identity of Leishmania isolated from sand flies and vertebrate hosts in a major focus of cutaneous leishmaniasis in Baturite, northeastern Brazil. Am J Trop Med Hyg. 50(2):158-64. 82

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Captulo 6
Alexander J, Satoskar AR, Russel DG (1999) Leishmania species: models of intracellular parasitism. J Cell Sci 112:2993-3002 Antoine J, Colette J, Ryter A, et al (1988). Leishmania amazonensis: acidic organelles in amastigotes. Exp Parasitol 67:287300 Bates PA (2007). Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by phlebotomine sand flies. Int J Parasitol 37:1097-1106 Benard G, Rossignol R (2008). Ultrastructure of the mitochondrion and its bearing on function and bioenergetics. Antioxid Redox Signal 10:1313-1342 Bente M, Harder S, Wiesqiql M, et al (2003). Developmentally induced changes of the proteome in the protozoan parasite Leishmania donovani. Proteomics 3:1811-1829 Besteiro S, Williams RAM, Coombs GH et al (2007). Protein turnover and differentiation in Leishmania. Int J Parasitol 37:1063-1075 Bishop C, Aanensen DM, Jordan GE et al (2009). Assigning strains to bacterial species via the internet. BMC Biol 7:3 Boit MC, Mauricio IL, Miles MA et al (2012). New insights on taxonomy, phylogeny and population genetics of Leishmania (Viannia) parasites based on multilocus sequence analysis. Plos One 6:e1888 Botstein D, White RL, Skolnick M et al (1980). Construction of a genetic linkage map in man using restriction length polymorphisms. Am J Hum Genet 32:314-331 Brittingham ACJ, Morrison WR, McMaster BS, et al (1995). Role of the Leishmania surface protease gp63 in complement fixation, cell adhesion, and resistance to complement mediated lysis. J Immunol 155:31023111 Carter CR, Whitcomb JP, Campbell JA, et al (2009). Complement receptor 3 deficiency influences lesion progression during Leishmania major infection in BALB/c Mice. Infection and Immunity 77:56685675 Chance ML (1979) The identification of Leishmania. In: Symposia of the British Society of Parasitology Volume 17. Problems in the Identification of Parasites and Their Vectors. Eds. AER Taylor e R Muller. Blackwell Scientific Publications, Oxford, pp:55-74 Cupolillo E, Grimaldi G Jr, Momen H (1994). A general classification of New World Leishmania using numerical zymotaxonomy. Am J Trop Med Hyg 50: 296-311 83

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Cupolillo E, Medina-Acosta E, Noyes H, et al (2000). A revised classification for Leishmania and Endotrypanum. Parasitol Today 16:142-144 da Silva LA, de Sousa CdS, da Graa GC, et al (2010). Sequence analysis and PCRRFLP profiling of the hsp70 gene as a valuable tool identifying Leishmania species associated with human leishmaniasis in Brazil. Infect Genet Evol 10:7783 David CV, Craft N (2009). Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis Dermatol Therapy 22:491502 De Souza (2002). Special organelles of some pathogenic protozoa. Parasitol Res 88: 1013-1025 Desjardins M, Descoteaux A (1997). Inhibition of phagolysossomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan. J Exp Med 185:2061-2068 Docampo R, Moreno SNJ (2011). Acidocalcisomes. Cell Calcium 50:113-119 Duboise SM, Vannier-Santos MA, Costa-Pinto D, et al (1994). The biosynthesis, processing, and immunolocalization of Leishmania pifanoi amastigote cysteine proteinases. Mol Biochem Parasitol 68:119132 Dumas C, Oullette M, Tovar J et al (1997). Disruption of the trypanothione reductase gene in Leishmania decreases its ability to survive oxidative stress in macrophages. EMBO J 16:2590-2598 Grimaldi G Jr, Momen H, Naiff RD, et al (1991). Characterization and classification of Leishmania parasites from humans, wild mammals, and sand flies in the Amazon region of Brazil. Am J Trop Med Hyg 44:645-661 Gull K (1999). The cytoskeleton of trypanosomatid parasites. Annu Rev Microbiol 53:629-55 Hanage WP, Fraser C, Spratt G (2006). Sequences, sequence clusters and bacterial species. Phil Trans R Soc 361:1917-1927 Kamhawi S (2006). Phlebotomine sand flies and Leishmania parasites: friends or foes? Trends Parasitol 22:439-445 Kreutzer RD, Corredor A, Grimaldi G Jr, et al (1991). Characterization of Leishmania colombiensis sp. n (Kinetoplastida: Trypanosomatidae), a new parasite infecting humans, animals, and phlebotomine sand flies in Colombia and Panama. Am J Trop Med Hyg 44:662- 675 Lainson R, Shaw J (1972). Leishmaniasis of the New World: taxonomic problems. Br Med Bull 28:44-48 84

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Lessa MM, Lessa HA, Castro TWN et al (2007). Mucosal leishmaniasis: epidemiological and clinical aspects. Rev Bras Otorrinolaringol 73:843-847 Levine B, Klionsky DJ (2004). Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Dev Cell 6:463477 Lainson R, J Shaw (1987). Evolution, classification and geografical distribution. In: The Leishmaniases Volume 1. Biology and Epidemiology. Eds. W. Peters e R. KillickKendrick. Academic Press, London, pp:2-104 Lieke T, Nyln S, Eidsmo L, et al (2008). Leishmania surface protein gp63 binds directly to human natural killer cells and inhibits proliferation. Clin Exp Immunol 153:221-230 Llg T (2000). Lipophosphoglycan is not required for infection of macrophages or mice by Leishmania mexicana. EMBO J 19:1953-1962 Lu H-G, Zhong L, Chang KP, et al (1997). Intracellular Ca2+ pool content and signaling, and expression of a calcium pump are linked to virulence in Leishmania mexicana amazonensis. J Biol Chem 272:94649473 Maiden MC, Bygraves JA, Feil E, et al (1998). Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms. Proc Natl Acad Sci USA 95:31403145 Marsden P (1986). Mucosal Leishmaniasis (Espundia Escomel, 1911). Trans R Soc Trop Med Hyg 80:859-876. Marsden P, Lessa H, Oliveira M (1998). Clinical observations of unresponsive mucosal leishmaniasis. Am J Trop Med Hyg 59:543-545 Mauricio IL, Gaunt MW, Stothard JR, et al (2001). Genetic typing and phylogeny of the Leishmania donovani complex by restriction analysis of PCR amplified gp63 intergenic regions. Parasitol 122:393403 Mauricio IL, Yeo M, Baghaei M, et al (2006). Towards multilocus sequence typing of the Leishmania donovani complex: resolving genotypes and haplotypes for five polymorphic metabolic enzymes (ASAT, GPI, NH1, NH2, PGD). Int J Parasitol 36:757769 McConville MJ, Mullin KA, Ilgoutz SC et al (2002). Secretory pathway of trypanosomatid parasites. Microbiol Mol Biol Rev 66:122-154 McConville MJ, Handman E (2007). The molecular basis of Leishmania pathogenesis. Int J Parasitol 37:1047-1051 85

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

McGwire BS, Chang KP, Engman DM (2003). Migration through the extracellular matrix by the parasitic protozoan Leishmania is enhanced by surface metalloprotease gp63. Infect Immun 71:1008-1010 Michels PA, Bringaud F, Herman M, et al (2006). Metabolic functions of glycosomes in trypanosomatids. Biochim Biophys Acta 1763:1463-1477 Momen H, Cupolillo E (2000). Speculations on the origin and evolution of the genus Leishmania. Mem Inst Oswaldo Cruz 95: 583-588 Montalvo AM, Fraga J, Monzote L, et al (2010). Heat-shock protein 70 PCR-RFLP: a universal simple tool for Leishmania species discrimination in the New and Old World. Parasitol 137:11591168 Mosser DM, Edelson PJ (1985). The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes. J Immunol 135:27852789 Mosser DM, Edelson PJ (1987). The third component of complement (C3) is responsible for the intracellular survival of Leishmania major. Nature 327:329331 Murray HW, Berman JD, Davies CR, et al (2005). Advances in leishmaniasis. The Lancet 366:1561-1577 Muse KE, Roberts JF (1973). Microbodies in Crithidia fasciculata. Protoplasma 78:343348 Nugent PG, Karsani SA, Wait R, et al (2004). Proteomic analysis of Leishmania mexicana differentiation. Mol Biochem Parasitol 136: 51-62 Pedersen JA, Swartz MA (2005). Mechanobiology in the third dimension. Ann Biomed Eng 33:1469-1490 Pimenta PF, Turco SJ, McConville MJ, et al (1992). Stage-specific adhesion of Leishmania promastigotes to the sandfly midgut. Science 256:18121815 Proudfoot L, O'Donnell CA, Liew FY (1995). Glycoinositolphospholipids of Leishmania major inhibit nitric oxide synthesis and reduce leishmanicidal activity in murine macrophages. Eur J Immunol 25:745750 Pupkins ME, Tetley L, Coombs GH (1986). Leishmania mexicana: amastigote hydrolases in unusual lysosomes. Exp Parasitol 62:2939 Ramalho-Ortigo JM, Kamhawi S, Joshi MB, et al (2005). Characterization of a blood activated chitinolytic system in the midgut of the sand fly vectors Lutzomyia longipalpis and Phlebotomus papatasi.Insect Mol Biol 14:703-712 86

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Reithinger R, Dujardin JC, Louzir H, et al (2007). Cutaneous leishmaniasis. The Lancet 7: 581-596. Rogers ME, Chance ML, Bates PA (2002). The role of promastigote secretory gel in the origin and transmission of the infective stage of Leishmania mexicana by the sandfly Lutzomyia longipalpis. Parasitol 124:495-507 Rogers ME, Ilg T, Nikolaev AV, et al (2004). Transmission of cutaneous leishmaniasis by sand flies is enhanced by regurgitation of fPPG. Nature 430:463-467 Rosenzweig D, Smith D, Opperdoes F, et al (2008). Retooling Leishmania metabolism: from sand fly gut to human macrophage. FASEB J 22:590-602 Rioux J, Lanotte G, Serres E, et al (1990). Taxonomy of Leishmania. Use of isoenzymes. Suggestions for a new classification. Ann Parasitol Hum Comp 65:111-125 Sacks DL, Modi G, Rowton E, et al (2000). The role of phosphoglycans in Leishmaniasand fly interactions. PNAS 97, 406411 Sacks DL, Perkins PV (1984). Identification of an infective stage of Leishmania promastigotes. Science 223: 1417-1419 Shakarian AM, Dwyer DM (2000). Pathogenic Leishmania secrete antigenically related chitinases which are encoded by a highly conserved gene locus. Exp Parasitol 94: 238242 Schlein Y, Jacobson RL, Shlomai J (1991). Chitinase secreted by Leishmania functions in the sandfly vector. Proc Biol Sci 245:121126 Schneider A (2001). Unique aspects of mitochondrial biogenesis in trypanosomatids. Int J Parasitol 31:1403-1415 Secundino N, Kimblin N, Peters NC, et al (2010). Proteophosphoglycan confers resistance of Leishmania major to midgut digestive enzymes induced by blood feeding in vector sand flies. Cell Microbiol 12:906-918 Seglen PO, Bohley P (1992). Autophagy and other vacuolar protein degradation mechanisms. Experientia 48:158172 Sengputa S, Tripathi J, Tandon R, et al (1999). Hemoglobin endocytosis in Leishmania is mediated through a 46 kDa protein located in the flagellar pocket. J Biol Chem 274: 2758-2765

87

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Silveira FT, Lainson R, Corbett (2004). Clinical and immunological spectrum of American Cutaneous Leishmanisis with special reference to the disease in Amazonian Brazil a review. Mem Inst Osw Cruz 99: 239-251 Simpson L (1972). The kinetoplast of hemoflagellates. Int Rev Cytol 32:139207 Souto-Padron T, De Souza W (1982). Fine structure and cytochemistry of peroxisomes (microbodies) in Leptomonas samueli. Cell Tiss Res 22:153158 Spth GF, Garraway LA, Turco SJ et al (2003). The role of lipophosphoglycan in the establishment of Leishmania major infections in mammalian hosts. PNAS 100:9536-9541 Stiehof YD, Ilg T, Russel DG, et al (1994). Characterization of polymer release from the flagellar pocket of Leishmania mexicana promastigotes. J Cell Biol 125:321331 Stuart K, Panigrahi AK (2002). RNA editing: complexity and complications. Mol Microbiol 45:591596 Tsukayama P, Lucas C, Bacon DJ (2009) Typing of four genetic loci discriminates among closely related species of New World Leishmania. Int J Parasitol 39:355 362 Turetz ML, Machado PR, Ko AI, et al (2002). Disseminated leishmaniasis: A new and emerging form of leishmaniasis observed in northeast Brazil. J Infec Dis 186: 1829-1834. Ueda-Nakamura T, Attias M, de Souza W (2007). Comparative analysis of megasomes in members of the Leishmania mexicana complex. Res Microbiol 158:456-62 Williams RA, Tetley L, Mottram JC et al (2006). Cysteine peptidases CPA and CPB are vital for autophagy and differentiation in Leishmania mexicana. Mol Microbiol 61:665-674 WHO (2010) Control of Leishmaniasis. WHO Technical Report Series 949. Geneva Wyllie S, Cunningham ML, Fairlamb AH (2004). Dual action of antimonial drugs on thiol redox metabolism in the human parasite Leishmania donovani. J Biol Chem 279:39925-39932 Zemanova E, Jirku M, Mauricio IL, et al (2007). The Leishmania donovani complex: genotypes of five metabolic enzymes (ICD, ME, MPI, G6PDH, and FH), new targets for multilocus sequence typing. Int J Parasitol 37:149160 Zhang K, Berveley SM (2009). Phospholipid and sphingolipid metabolism in Leishmania. Mol Biochem Parasitol 170:55-64 88

Estudo Eco-epidemiolgico das Leishmanioses: Do planejamento a execuo - Apostila

Zufferey

R,

Allen

S,

Barron

T,

et

al

(2003)

Ether

phospholipids

and

glycosylinositolphospholipids are not required for amastigote virulence or for inhibition of macrophage activation by Leishmania major. J Biol Chem 278:44708 44718

89