358010a Microbiologia Practicas 2013

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD
Escuela de Ciencias Agrcolas, Pecuarias y del Medio Ambiente

Protocolo de prcticas de la Escuela versin 2011
ESCUELA DE CIENCIAS AGRCOLAS, PECUARAS Y AMBIENTALES-ECAPMA

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA-UNAD
Tecnologa en Saneamiento Ambiental e Ingeniera Ambiental
CURSO DE:
358010 A MICROBIOLOGIA AMBIENTAL
Directora de curso: Diana Garca Vargas.
GUA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGA AMBIENTAL

Adaptado de la autora Echeverry, L.C.
AO 2013

I ACTIVIDADES PARA EL ESTUDIANTE

PRACTICAS DE LABORATORIO
1. IDENTIFICACION DE LA PRCTICA
Nombre de curso
Microbiologa Ambiental
358010 A
Cdigo de curso
Valor de esta actividad Se asignar un valor de 100 puntos. Ver rbrica. La asignacin de puntos a los
cuestionarios y al informe de laboratorio depende de la asistencia obligatoria al
prctica
100% de las prcticas.
Nombre del director de
Diana Garca Vargas.
curso
Sede Nacional Jos Celestino Mutis
CEAD al que pertenece
Contacto del director de

Diana.garcia@unad.edu.co Tel.: 3164657609 Skype:dianagarciavargas
curso
Espacio donde se debe
desarrollar la prctica
Laboratorio 409, Sede Nacional JCM Bogot.

CEADs donde se matricul el estudiante.
Aprender los conceptos bsicos de microbiologa y sus tcnicas de laboratorio

para seres unicelulares procariotas (bacterias); seres unicelulares eucariotas
(algas, hongos, protozoos) y organismos pluricelulares eucariotas (algas y
hongos).
Objetivos de la prctica
Profundizar en microbiologa ambiental de acuerdo a la infraestructura de

laboratorio de cada CEAD y el trabajo del tutor prctico.
Justificacin
prctica
de
Competencias
desarrollar
Duracin de la prctica.
la
Los laboratorios se constituyen en el componente prctico obligatorio, que

buscan, mediante procesos heursticos, afianzar, clarificar y profundizar en los
aspectos conceptuales, procedimentales y metodolgicos del curso.
El estudiante comprende los elementos conceptuales, procedimentales y

a metodolgicos que estn involucrados en la coloracin, tincin, medios de
cultivo, siembras, identificacin microscpica, macroscpica y bioqumica de
microorganismos presentes en el agua, aire, suelo, flora.
ECAPMA: Acuerdo 15 del 2011. 24 horas de acompaamiento tutorial en la
prctica incluye programacin, organizacin, ejecucin, calificacin y
retroalimentacin.
Segn rbrica adjunta al final del presente protocolo (la misma que est en el
Mecanismo mediante el aula virtual).
cual se evaluar la
La asistencia presencial es obligatoria al desarrollo de los protocolos de los
prctica:
laboratorios programados por cada tutor prctico de cada CEAD.

CONTENIDO
Pg.
PRCTICA 00. BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO
CUESTIONARIO PRACTICA 00.

RECONOCIMIENTO DEL LABORATORIO Y MATERIALES DE MICROBIOLOGIA 8
PRACTICA 01. METODOS DE SIEMBRA
10
18
PRACTICA 02. TCNICAS DE TINCIN.
19
PRACTICA 03. OBSERVACIN MICROSCPICA DE HONGOS
25
28
PRACTICA 04. MEDIOS DE CULTIVO DIFERENCIALES Y SELECTIVOS
30
PRACTICA 05. REACCIONES BIOQUIMICAS
32
37
PRACTICA O6. CONTROL DEL CRECIMIENTO BACTERIANO
39
PRACTICA 07. OBSERVACIN MICROSCPICA DE CIANOBACTERIAS
41
45
PRACTICA 08. RECUENTO DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS
46
48
PRACTICA 09. PRUEBAS DE ANTAGONISMO
50

PRACTICA No.00 BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO

Los laboratorios de microbiologa estn regidos por normas de seguridad e higiene que deben
cumplirse a cabalidad para garantizar la proteccin contra infecciones de los estudiantes u otro
personal que labora en estas instalaciones, as como garantizar la calidad de las tcnicas y la
confiabilidad de los resultados.
1.1. Las siguientes medidas son de obligado cumplimiento en cualquier rea del
laboratorio:
1.1.1. El acceso al laboratorio estar limitado al personal autorizado.
1.1.2. El personal del laboratorio debe implicarse en el cumplimiento de las normas de
seguridad.
1.1.3. Todas las reas estarn debidamente marcadas con la seal de riesgo biolgico y su nivel
de contencin.
1.1.4. Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas para mantener la adecuada contencin
biolgica.
1.1.5. Todas las superficies de trabajo se limpiarn y desinfectarn diariamente y siempre que
se produzca un derrame.
1.1.6. Los residuos y muestras peligrosas que van a ser incinerados fuera del laboratorio deben
ser transportados en contenedores cerrados, resistentes e impermeables siguiendo las normas
especficas para cada tipo de residuo.
1.1.7. El laboratorio debe permanecer limpio y ordenado y no es aconsejable utilizar los
pasillos como almacn. Siempre debe quedar un espacio libre no inferior a 120 cm para poder
evacuar el laboratorio en caso de emergencia.
1.1.8. El transporte de las muestras dentro o entre laboratorios se realizar de tal manera que, en
caso de cada, no se produzcan salpicaduras. Lo recomendable es hacerlo en cajas hermticas o
neveras transportables. Estas cajas o neveras debern ser rgidas y resistentes a los golpes,
contar con materiales absorbentes en su interior y de fcil desinfeccin. Se etiquetarn o
identificarn de forma oportuna y no podrn ser utilizadas para otros fines. Bajo ningn
concepto se deben transportar las muestras a mano.
1.1.9. La ropa protectora, fcilmente ajustable y confortable, as como guantes, gafas, etc.; debe
estar disponible en todo momento. La ropa protectora de las reas con nivel de contencin 3
(batas) nunca debe ser usada fuera del rea de trabajo y si se quita debe de ser desechada
automticamente en una bolsa de material contaminado. Jams debe volver a ser usada.
1.1.10. Todo el personal debe poner especial cuidado en evitar el contacto de la piel con
materiales potencialmente infecciosos. Con este fin deben usarse guantes cuando se manipulen
muestras o cultivos que contengan posibles patgenos. Los guantes siempre sern desechados
antes de salir del rea de trabajo. Jams se saldr de la misma con los guantes puestos, ni con
ellos se coger el telfono, se tocarn las hojas de examen, maniguetas de las puertas, etc.
1.1.11. Tras quitarse los guantes, se realizar un lavado de manos.
1.1.12. Se usarn gafas protectoras y mascarillas faciales si existe riesgo de salpicaduras y/o
aerosoles.
1.1.13. Se pondr extremo cuidado en minimizar el riesgo de auto-inoculacin y de generacin
de aerosoles.
1.1.14. Los derrames y accidentes deben ser informados inmediatamente al Supervisor y al Jefe
del Laboratorio y hacerse constar por escrito.

1.1.15. Est rigurosamente prohibido pipetear con la boca. Se realizar pipeteo automtico con
material adecuado y cada trabajador ser instruido para manejarlo debidamente.
1.1.16. En la zona de trabajo no debe colocarse material de escritorio ni libros ya que el papel
contaminado es de muy difcil esterilizacin.
1.1.17. No debern usarse lentes de contacto.
1.1.18. El personal con el cabello largo debe llevarlo recogido.
1.1.19. Comer, beber, fumar y aplicarse cosmticos esta formalmente prohibido en el rea de
trabajo del laboratorio, as como el almacenamiento de comida o bebida.
1.1.20. El personal debe lavarse las manos frecuentemente durante las actividades rutinarias,
tras acabar la jornada laboral y siempre antes de abandonar el laboratorio (almorzar). Se usar
un jabn antisptico y el secado se realizar con papel.
1.1.21. Las heridas y cortes en las manos, si se han producido en el Laboratorio, sern
comunicados al responsable de la Seccin correspondiente, as como al Supervisor de
Bioseguridad que lo registrar haciendo constar todas las circunstancias. Las heridas y cortes
deben ser convenientemente vendados y despus es imprescindible ponerse guantes.
1.2. Clasificacin de los microorganismos infecciosos por grupo de riesgo
1.2.1. Grupo de riesgo 1 (riego individual o poblacional escaso o nulo)
1.2.2. Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser
humano o los animales
1.2.3. Grupo de riesgo 2 (riego individual moderado, riesgo poblacional bajo)
1.2.4. Agentes patgenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que
tienen pocas probabilidades de entraar un riesgo grave para el personal de laboratorio, la
poblacin, el ganado o el medio ambiente. La exposicin en el laboratorio puede provocar una
infeccin grave, pero existen medidas preventivas y teraputicas eficaces y el riesgo de
propagacin es limitado.
1.2.5. Grupo de riesgo 3 (riego individual elevado, riesgo poblacional bajo)
1.2.6. Agentes patgenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales graves, pero
que de ordinario no se propagan de un individuo a otro. Existen medidas preventivas y
teraputicas eficaces.
1.2.7. Grupo de riesgo 4 (riesgo individual y poblacional elevado)
Agentes patgenos que suele provocar enfermedades graves en el ser humano o los animales y
que se transmiten fcilmente de un individuo a otro, dicta o indirectamente. Normalmente no
existen medidas preventivas y teraputicas eficaces.
Tipos de laboratorios:
Nivel de bioseguridad 1
Laboratorio bsico
Laboratorio bsico
Laboratorio de contencin
Laboratorio
de
contencin
mxima

1.3. Cdigo de prcticas en laboratorios bsicos

1.3.1. Acceso: el smbolo y signo internacional de peligro biolgico (Figura 1) debe colocarse
en las puertas de loa locales donde se manipulen microorganismos del grupo de riesgo 2 o
superior.
1.3.2. Proteccin personal: se debe usar todo el tiempo batas o uniformes especiales para el
trabajo en el laboratorio. Usar guantes protectores apropiados con materiales potencialmente
infecciosos.
1.3.3. Procedimientos: es estrictamente prohibido pipetear con la boca. Colocarse material y/o
etiquetas en la boca. Se mantendr un registro de accidente e incidentes que ocurren en el
laboratorio. Se elaborar y seguir un procedimiento escrito para la limpieza de todos los
derrames. Los lquidos contaminados debern descontaminarse antes de ser descartados.
1.3.4. Zona de trabajo del laboratorio: se mantendr ordenado, limpio y libre de materiales
no relacionados con el trabajo. Las superficies de trabajo deben permanecer descontaminadas.
Las ventanas que puedan abrirse deben estar equipadas de rejillas para evitar el ingreso de
artrpodos.
1.3.5. Diseo e instalaciones del laboratorio: inicialmente se debe prestar especial atencin a
los problemas que puedan causar problemas en la bioseguridad, Entre ellos estn: la formacin
de aerosoles, el trabajo con grandes cantidades o altas concentraciones de microorganismos, el
exceso de personal o material, la infestacin por roedores o artrpodos, la entrada de personas
no autorizadas y el circuito de trabajo.
1.4. Normas de trabajo en el laboratorio de microbiologa
1.4.1. Desinfectar el rea de trabajo
1.4.2. Prender el mechero antes de comenzar a trabajar
1.4.3. Al utilizar el asa bacteriolgica, debe calentarse en toda su extensin el alambre a la
llama del mechero hasta que se ponga roja. Este proceso debe hacerse antes y despus del uso.
1.4.4. Durante las siembras, el tubo debe mantenerse en la mano izquierda y el tapn en la
mano derecha sostenido entre el dedo meique y la palma de la mano, cerca de la llama del
mechero, con esta misma mano debe cogerse el asa entre el dedo ndice y el pulgar. El correcto
manejo de los tubos evitara contaminaciones cruzadas en los cultivos.
1.4.5. Flamear la boca de los tubos despus de quitarles el tapn y antes de volverlo a colocar
para evitar la formacin de aerosoles o la contaminacin del contenido del tubo.
1.4.6. Destapar las cajas de petri manteniendo la base y la tapa simultneamente en la mano
izquierda, abriendo la caja parcialmente y cerca de la llama del mechero.
1.4.7. Los escobillones o baja lenguas deben quemarse en la llama del mechero, se deja enfriar
y se descarta.
1.4.8. Todo el material que se use en microbiologa de estar estril.
1.4.9. El material se debe marcar con cinta de enmascarar antes de llevarlo a la incubadora. Las
cajas de Petri se marcan en el borde de la base para evitar que tapen las superficies de los
cultivos.

FIGURA 1. Seal de advertencia de peligro biolgico para las puertas del laboratorio.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
BENSON, HAROLD J. Microbiological applications: Laboratory Manual in General
Microbiology. McGraw Hill. U.S.A. 1998.
COLLINS, C. H. and M LYNE, PATRICIA. Traduccin del ingles por Jos Mara Tarazona
Vilas. Mtodos microbiolgicos. Editorial ACRIBIA, S. A. ZARAGOZA (Espaa). 1989.
OMS Organizacin Mundial de la Salud. Manual de bioseguridad en el laboratorio.
Ginebra. 2005.

CUESTIONARIO No. 00
DE RECONOCIMIENTO DEL LABORATORIO Y MATERIALES DE
MICROBIOLOGIA
1. Qu caractersticas debe reunir el vidrio utilizado para la fabricacin del material de
cristalera para los laboratorios y por qu?
2. Explique brevemente las ventajas y desventajas del uso de materiales de vidrio y de plstico,
respectivamente, en los laboratorios de microbiologa.
3. Describa, ilustre y clasifique los siguientes materiales, indicando el uso que se les da en el
laboratorio de microbiologa (Sea breve, se le sugiere elaborar un cuadro):
a) Portaobjetos
b) Cubreobjetos
c) Cajas de Petri
d) Pipetas graduadas (terminales y no terminales)
e) Pipetas Pasteur
f) Tubos de ensayo (tipos)
g) Matraces (tipos)
h) Probetas (tipos)
i) Tubos de Durham
j) Asas de inoculacin (tipos)
k) Mecheros (tipos)
l) Estufas bacteriolgicas (tipos)
m) Bao bacteriolgico
n) Horno Pasteur
o) Autoclave
p) Jarra de anaerobiosis
q) Centrfuga
r) Nefelmetro de Mac Farland
s) Membranas Millipore
t) Cuenta colonias
4. Ilustre un Microscopio ptico de campo claro con los nombres de todas sus partes.
5. Enliste detalladamente todas las medidas que se requiere tomar en cuenta para el manejo
correcto y cuidados del microscopio compuesto.
6. Enliste detalladamente todos los pasos que se requiere seguir para enfocar imgenes en un
microscopio compuesto.
7. Defina los siguientes trminos en microscopa: Lmite de resolucin, poder de resolucin y
poder de amplificacin, indicando la frmula mediante la que se calculan cada uno.
8. Mencione los tipos de microscopio electrnico que existen actualmente y cules son las
diferencias y ventajas que usted considera ms importantes entre estos y el microscopio ptico
cuando se trabaja en un laboratorio de microbiologa.
9. Cul es la utilidad del asa recta y redonda?
10. Qu se entiende por resiembra o pase bacteriano?
8


1. Qu se entiende por resiembra o pase bacteriano?
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____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
________________________________________
2. Cul es la utilidad del asa recta y del asa curva?
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
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_______________________________
3. Cmo se esteriliza un medio de cultivo en microbiologa?
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
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____________________________________________________________________________
_______________________________
4. Cules son las condiciones de esterilizacin en seco, que equipo se usa y para que
materiales est destinada?
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____________________________________________________________________________
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5. Cmo se esterilizan elementos con filo como cuchillas, tijeras, entre otros?
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
_______________________________
6. Qu utilidad tiene la esterilizacin en fro?
_____________________________________________________________________________
_________________________________________________________
7. Qu es la tindalizacin?
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________
9

PRACTICA 01. METODOS DE SIEMBRA Parte A

La inoculacin de medios de cultivo para la recuperacin, mantenimiento y/o aislamiento de
microorganismos, es un procedimiento fundamental e importante. Debe tenerse cuidado con las
tcnicas de siembra microbiana para evitar en lo posible la contaminacin por otros
microorganismos diferentes al deseado.
MATERIALES
1. Muestra contaminada con microorganismos
2. Agua peptonada al 0,1% estril
3. Agar nutritivo en caja de Petri
4. Asa redonda
5. Gradilla
6. Mechero
7. Incubadora
8. Vinipel
9. Marcador de vidrio
PROCEDIMIENTO
1. Desinfectar el rea de trabajo, prender el mechero y preparar el material de trabajo.
2. Coger parte de la muestra y colocarla en el tubo de ensayo que contiene el agua peptonada.
Homogenizar.
3. Dejar 20 30 minutos en incubacin los tubos.
4. Realizar un diagrama de aislamiento de colonias, en un circulo de papel (8 cm) para ponerlo
debajo de la caja de Petri (Figura 1)
5. Finalizado el tiempo de incubacin tomar el asa redonda y esterilizarla por calor hasta que
est est roja, dejar enfriar cerca al mechero.
6. Abrir el tubo con la muestra y tomar una asada.
7. Cerrar el tubo y colocarlo en la gradilla. Teniendo cuidado de que el asa no toque nada y de
no pasarla por encima del mechero, pero siempre estar cerca de este
8. Abrir la caja de Petri y seguir el esquema para el aislamiento.
9. Terminado la siembra, marcar las cajas en el borde de la base de la caja y envolverla en papel
vinipel.
10. Colocar el tubo y la caja a incubar a 37C. La caja debe estar boca abajo siempre.
11. Desinfectar el rea de trabajo, apagar el mechero y entregar el material
10

Figura 1. Tcnica de aislamiento de colonias
Este procedimiento se denomina aislamiento de bacterias, debido a que las bacterias

presentes en una muestra se distribuyen sobre la superficie de un agar, y cada clula se
reproduce independientemente hasta formar un conglomerado de bacterias observables a
simple vista (colonia bacteriana). De esta manera es posible observar sobre la superficie del
medio, colonias de diferentes caractersticas en cuanto a forma, superficie, borde, forma,
color, aspecto y elevacin, lo que indica microscpicamente presencia de diferentes tipos
microbianos en la muestra. As se puede estudiar e identificar independientemente cada
especie.
11

RESULTADOS PARTE A
Fecha: __________________________
12

PRACTICA 01. METODOS DE SIEMBRA Parte B

Figura 2. Tcnica de aislamiento de colonias por el mtodo de rejilla.
Figura 3. Tcnica de aislamiento de colonias por el mtodo francs.
13

Figura 4. Morfologa colonial
Figura 5. Siembra en medio lquido
14

Figura 6. Siembra en medio semislido con superficie plana
Figura 7. Siembra en medio slido con superficie inclinada
Similar a la obtencin de unidades formadoras de colonias (UFC) en una caja de Petri se puede
evaluar el crecimiento en un medio lquido o en un medio slido.
Figura 8. Crecimiento en medio lquido
15

Figura 9. Patrn de crecimiento en medio slido
REFERENCIAS
ESCOBAR de RICO, M. Fundamentos de microbiologa. Editorial CEJA. 1999.
CARMONA P, G. L. Manual de laboratorio microbiologa general. Corporacin universitaria
LaSallista. 2001.
16

RESULTADOS PARTE B
Fecha: __________________________
17


1. Qu se entiende por maduracin de un colorante?
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
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2. En qu momento se deben filtrar los colorantes y por qu?
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
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3. Por qu razn los colorantes deben guardarse en frascos de color ambar?
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
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4. Cules son los colorantes ms utilizados en microbiologa y por qu?
____________________________________________________________________________
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5. Describa una coloracin para teir el ncleo bacteriano?
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____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
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_______________________________
6. Qu utilidad tiene la tincin con sudan III?
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_______________________________________________
7. Mencione 5 razones de la selectividad de las bacterias por los colorantes de Gram?

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_____________________________________________________________________________
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_____________________________________________________________________________
18

PRACTICA 02. TCNICAS DE TINCIN.

MATERIALES
1. Lminas
2. Laminillas
3. Agua destilada estril
4. Asas bacteriolgicas redonda y asa recta
5. Mechero
6. Azul de metileno
7. Cristal violeta
8. Lugol
9. Alcohol cetona
10. Fucsina bsica o safranina
11. Tinta china
12. Microscopio ptico
13. Colonias aisladas de bacterias para observacin de bacterias
14. Guantes de ltex
PROCEDIMIENTO
1. Coloracin simple
a. En una lmina portaobjetos limpia, colocar una gota del agua destilada estril (trabajo con
muestra slida) o una gota del cultivo bacteriano (trabajo con muestra liquida) sobre la misma y
con ayuda del asa redonda estril extender la gota de suspensin a un rea no superior a dos
centmetros cuadrados.
b. Dejar que la preparacin se seque al aire. Fijar con calor, pasando tres veces seguidas a
travs de la llama del mechero.
c. Dejar enfriar la lmina. Lo anterior se conoce como la realizacin de un frotis y se hace para
coloraciones donde la muestra debe ser fijada y luego si iniciar las coloraciones respectivas.
d. Colocar la preparacin sobre una rejilla encima del vertedero.
e. Cubrir la suspensin con algn colorante dado por el profesor, as:
i. Cristal violeta: 1 minuto
ii. Azul de metileno: 5 minutos
iii. Fucsina: 1 minuto
f. Terminado el tiempo de coloracin segn el colorante empleado, eliminar el colorante
lavando con agua suavemente.
g. Dejar secar y colocar la preparacin en la platina del microscopio y observar con el objetivo
de menor aumento inicialmente hasta llegar al objetivo de 100X (ver figura 1).
19

Figura 1. Observacin de imgenes en el microscopio ptico.
20

2. Coloracin compuesta
a. Realizar un frotis de la muestra seleccionada
b. Colocar en la rejilla para coloracin y cubrir el frotis con cristal violeta esperando que
transcurra 1 minuto. Lavar con agua el colorante.
c. El segundo colorante es el lugol, el cual se deja por 1 minuto sobre el frotis
d. Realizar la decoloracin con la mezcla alcohol-acetona, por 25 segundos. Lavar
inmediatamente con agua.
e. Finalmente adicionar el colorante de contraste, fucsina o safranina, por 30 segundos. Lavar
con agua.
f. Escurrir el exceso de agua, dejar secar y montar al microscopio para hacer las observaciones
respectivas.
Figura 2. Tincin de Gram
21

Figura 3. Morfologa bacteriana.
22

3. Coloraciones especiales.
a. Coloracin de Glicoclix con Rojo Congo
Emulsionar la muestra con una (1) gota de rojo congo y dejar secar la lmina a temperatura
ambiente. Al estar seca la lmina sumergirla en HCl 1N con ayuda de una pinza y teniendo
cuidado de no tocar o salpicar el cido sobre la piel. Luego lavar con agua teniendo cuidado de
no hacerlo sobre la tincin. Poner azul de metileno sobre la tincin inicial por tres (3) minutos y
terminado este tiempo lavar la lmina con agua. Montar al microscopio la lmina cuando este
seca y hacer las observaciones respectivas.
b. Coloracin de Glicoclix con Tinta China
En el centro de un portaobjetos se coloca una gota de agua, otra de tinta china y un poco del
cultivo bacteriano a estudiar. Todo se debe mesclar suavemente y sin extender. Seguidamente
colocar un cubreobjetos sobre la suspensin y presionar suavemente evitando la formacin de
burbujas. Observar inmediatamente al microscopio y desechar el material en un recipiente
con antisptico.
23

RESULTADOS
Fecha: __________________________
24

PRACTICA 03. OBSERVACIN MICROSCPICA DE HONGOS

La clula fngica es similar a cualquier organismo eucarionte, aunque existen diferencias
subcelulares entre la clula de un hongo inferior a la de uno superior. Cuando se estudian los
hongos se pueden observan dos grandes grupos: los algodonosos, que se conocen con el
nombre de mohos y otros que forman colonias hmedas y se conocen como levaduras.
MATERIALES
1. Cultivo de hongos
2. Lminas portaobjetos
3. Laminillas
4. Azul de lactofenol
5. Microscpio
PROCEDIMIENTO
Colocar en el centro de la lmina portaobjeto una gota de azul de lactofenol, luego tomar con el
asa micolgica previamente esteril parte del hongo y resuspenderlo en la gota del colorante.
Colocar luego una laminilla encima de esta preparacin y esperar 3 minutos. Finalizado este
tiempo montar al microscpio y observar en 10X y 40X.
CONSOLIDACIN DE CONCEPTOS
1. Dibuje:
Hifa septada
Hifa cenoctica
Artroconidios
Conidios
25

Esporangiosforo
Blastoconidia
Cuerpo fructfero de un Aspergillus y nombre sus partes
Cuerpo fructfero de un Penicillium y nombre sus partes
Cuerpo fructfero y macroconidias de un Fusarium y nombre sus partes
Cuerpo fructfero y nacroconidias de una Alternaria y nombre sus partes
Cuerpo fructfero de un Rhizopus y de un Mucor y nombre sus partes
26

OBSERVACIONES HECHAS EN EL LABORATORIO
27


1. Cul es la diferencia entre adaptacin evolutiva y adaptacin fisiolgica de los
microorganismos, con respecto a la ubicuidad?
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____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
_________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
__________________________________________________________________
Escriba que significan los siguientes trminos.
Aptacin:____________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
______________________________________________________________________
Abaptacin:__________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
______________________________________________________________________
Exaptacin:__________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
______________________________________________________________________
2. Cmo se realiza el control de calidad a los medios de cultivo, a parte del mtodo
ecomtrico?
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________
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3. Cul es la utilidad microbiolgica de los medios: simples, enriquecidos, diferencial, de

prueba, para recuento, bioqumico y de mantenimiento?
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
_______________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
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_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_______________________________________
29

PRACTICA 04. MEDIOS DE CULTIVO DIFERENCIALES Y SELECTIVOS
Los medios de cultivo permiten estudiar los microorganismos en un ambiente artificial el cual
debe ser semejante a su medio natural, que incluya nutrientes (protenas, pptidos y
aminocidos), energa (carbohidratos), metales y minerales esenciales (Ca, Mg, Fe, trazas de
metales: PO3, SO4), agentes tampn (fosfatos, acetatos), indicadores de pH (rojo de fenol,
prpura de bromocresol, rojo neutro), agentes selectivos (productos qumicos, antibacterianos)
y agentes gelificantes (normalmente agar pero algunas veces se usa gelatina, carragenatos,
alginatos, silica gel).
De acuerdo a la composicin y a la combinacin de los anteriores ingredientes mencionados los

medios de cultivo se pueden clasificar en: lquidos, semislidos, slidos, simples enriquecidos,
selectivos, diferenciales, bioqumicos y de mantenimiento.
MATERIALES
1. Agar EMB (selectivo para enterobacterias patgenas)

2. Agar Baird Parker (selectivo para estafilococos)
3. Agar Salmonella Shigella
4. Agar selectivo de Bacillus cereus
5. Muestra de lixiviados de basura
PROCEDIMIENTO
Sembrar la muestra en cada caja de Petri por medio del mtodo ecomtrico y determinar el
ndice de crecimiento absoluto (ICA).
30

RESULTADOS
Fecha: __________________________
31

PRACTICA 05. REACCIONES BIOQUIMICAS

Las pruebas bioqumicas consisten en distintos test qumicos aplicados a medios biolgicos, los
cuales, conocida su reaccin, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes. Su
sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una va
metablica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al
crecer incorpora o no. Para realizar las pruebas bioqumicas se dispone de mltiples medios, los
cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio.
FECHA: _____________________
PRUEBA DEL CITRATO
ANTES
DESPUS
PRUEB
PRUEBA DEL TRIPLE AZUCAR HIERRO

ANTES
DESPUS
32

PRUEBA DE SULFUROS-INDOL-MOTILIDAD
ANTES
DESPUS
PRUEBA DE OXIDACION
ANTES
DESPUES
33

PRUEBA DE FERMENTACIN
ANTES
DESPUS
PRUEBA DE UREA
ANTES
DESPUS
34

PRUEBA DE ROJO DE METILO

ANTES
DESPUS
PRUEBA DE VOGUES PROSKAWER

ANTES
DESPUS
35

COLORACION DE GRAM
V.B. PROFESOR: ______________
IDENTIFICACION CON TABLA

Posible microorganismos identificado:
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
______________________________________________
ANEXO
Tabla de identificacin bioqumica
36


1. Defina:
Neutrfilo:_____________________________________________________________
_________________________________________________________________
Acidfilos:_____________________________________________________________
_________________________________________________________________
Alcalinfilo:____________________________________________________________
_________________________________________________________________
Sacarfilos:_____________________________________________________________
________________________________________________________________
halfilos
osmosis:_______________________________________________________________
________________________________________________________________
presin
osmtica:______________________________________________________________
______________________________________________________________________
_____________________________________________________________
plasmlisis:_____________________________________________________________
________________________________________________________________
lisis:__________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________
2. Todos los microorganismos osmfilos son halfilos?
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
_______________________________
37

3. Los microorganismos xerfilos pueden ser simultneamente sacarolticos?

____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
_______________________________
4. Cmo acta la luz ultra violeta sobre las bacterias para inhibir o eliminar su desarrollo,
explique desde el punto molecular y metablico?
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
_______________________________
____________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
5. Qu tiene de especial H. salinarium?

_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_______
38

PRACTICA O6. CONTROL DEL CRECIMIENTO BACTERIANO

Los factores fsicos y qumicos tienen un efecto notable sobre la vida de los microorganismos
en su medio ambiente natural. Algunos estimulan su desarrollo en tanto que otros lo retardan o
lo impiden. El conocimiento del efecto de esos parmetros medio ambientales no solo permiti
estudiar los microorganismos bajo condiciones controladas de laboratorio para favorecer su
crecimiento sino que posibilit aprender la forma de controlarlos.
MATERIALES
Cultivo de un microorganismo Gram - positivo
Cultivo de un microorganismo Gram - negativo.
Medio de cultivo nutritivo en cajas de Petri con diferentes pHs.
Medio de cultivo nutritivo en cajas de Petri con diferentes concentraciones de NaCl.
Medio de cultivo nutritivo en cajas de Petri
Caldo nutritivo
Pipetas estriles de 1 y 2 mL
Estufa
Vaso de precipitado de 500 mL
Incubadora
PROCEDIMIENTO
1. ACCIN DE LA TEMPERATURA
Suspender una colonia del microorganismo seleccionado en el caldo nutritivo y dejarlo por
media hora para un desarrollo de los microorganismos en el medio de cultivo. Luego tomar
0.1 mL del medio y sembrarlo sobre el medio slido del agar nutritivo. Llevar el caldo nutritivo
donde se inoculo el microorganismo a la estufa y ponerlo a ebullicin por el tiempo dado por
el profesor y sembrar como al inicio. Llevar las dos cajas de Petri e incubarlas a 37oC.
2. ACCION DEL pH
Dividir la base de las cajas en dos cuadrantes con el marcador de vidrio y con el asa redonda
sembrar por estras en un cuadrante el microorganismo Gram-negativo y en el otro el Grampositivo. Realizar este procedimiento con todas los medios de diferentes pH.
3. ACCIN DE LA PRESIN OSMTICA
sembrar por estras en un cuadrante el microorganismo Gram-negativo y en el otro el Grampositivo.
39

4. ACCIN DE LA LUZ ULTRAVIOLETA
sembrar por estras en un cuadrante el microorganismo Gram-negativo y en el otro el Grampositivo. Seguidamente tapar la mitad de la caja con papel de aluminio y colocar sobre la otra
parte de la caja la luz ultravioleta por 5 y/o 10 minutos, tapar la caja y llevar a incubar.
RESULTADOS
Fecha: __________________________
40

PRACTICA 07. OBSERVACIN MICROSCPICA DE CIANOBACTERIAS

Cyanobacteria (del griego ciano = azul) es el nombre de un filo del reino Bacteria (nico del
dominio del mismo nombre) que comprende a las cianobacterias y, en algn sentido, a sus
descendientes por endosimbiosis, los plastos. Las cianobacterias se caracterizan por ser los
nicos procariotas que llevan a cabo fotosntesis oxignica, por ello tambin se les denomina
oxyphotobacteria.
MATERIALES
1. Agua con cianobacterias
2. Lminas portaobjetos
3. Laminillas
4. Microscopio
PROCEDIMIENTO
Colocar en el centro de la lmina portaobjeto una gota del agua que trajo como muestra y
colocar luego una laminilla encima de esta preparacin y esperar 2 minutos. Finalizado este
tiempo montar al microscpio y observar en 10X, 40X y 100X.
CONSOLIDACIN DE CONCEPTOS
1. Explique qu funcin tiene el carboxisoma en las cianobacterias
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
______________________________________________
2. Explique qu funcin tiene las vesculas gasferas en las cianobacterias
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_________________________________________________________________
41

3. Qu son los tilacoides?, Cul es su funcin y donde se ubican en las cianobacterias?

____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
________________
4. Dibuje:
Cianobacteria formadora de filamentos simples
Heterocisto
42

Anabaena sp
Nostoc sp
Volvox sp
43

OBSERVACIONES HECHAS EN EL LABORATORIO
44


1. Defina el grupo denominado aerobios mesfilos
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
________________________________________
2. Cul es la diferencia entre un microorganismo emergente y uno reemergente?
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
________________________________________
3. Mencione mnimo cuatro grupos de microorganismos utilizados como bioindicadores en
suelos
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
________________________________________
4. Explique otro mtodo que le permita determinar el nmero de microorganismos presentes en
una muestra de suelos
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
______________
45

PRACTICA 08. RECUENTO DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS

Microorganismo aerobio mesfilo son todas las bacterias, levaduras y hongos capaces de
desarrollarse en condiciones de aerobiosis a 30C. Es un parmetro que sirve para estimar la
flora total, pero sin especificar tipos de microorganismos. Es uno de los indicadores ms tiles
del estado microbiolgico de un alimento, agua, suelo entre otros. Tiene un valor limitado
como indicador de la presencia de patgenos o sus toxinas. Altos recuentos microbianos se
consideran poco aconsejables para la mayor parte de los alimentos.
MATERIALES
1. 2 cajas de Petri estriles
2. 4 tubos de ensayo con agua peptonada al 0.1% estriles
3. 4 Pipetas de 1 mL o una pipeta automtica (100 1000 L)
4. 1 frasco de dilucin con 90 mL de agua peptonada al 0.1%
5. 50 mL de agar nutritivo previamente preparado y atemperado a 45 - 48C
6. Marcador de vidrio
7. Incubadora a 35C
8. Contador de colonias
9. Balanza
PROCEDIMIENTO
1. Hacer diluciones del alimento de acuerdo al tipo de producto.
Si es un alimento crudo deben realizarse diluciones altas
En alimentos procesados se hacen diluciones bajas
2. Sembrar en profundidad por duplicado 1 mL de cada una de las diluciones seleccionadas
3. Adicionar de 15 20 mL del agar nutritivo a la temperatura adecuada
4. Mezclar inmediatamente el inculo con el medio, con movimientos circulares de la placa a
favor y en contra de las manecillas del reloj, como en ngulo recto. Debe evitarse que el
medio impregne la tapa.
5. Dejar solidificar, adicionar una capa sellante de 5 mL sobre la caja y dejar solidificar
nuevamente.
6. Una vez solidificado el agar, se vierten las placas e introducen en la incubadora (35C
durante 72 horas) .7. Sacar de la incubadora y realizar el recuento
8. Lectura: se deben contar las cajas cuyo nmero de colonias est comprendido entre 300 y
300. Es conveniente ir marcando las colonias para evitar volver a contarlas. Hallar la media. El
nmero contado se multiplica por el factor de dilucin y los resultados se expresarn en
unidades formadoras de colonia (UFC) por mL o g, dependiendo del tipo de alimento de
partida.
9. Siempre se informan dos nmeros enteros y el resto en exponente
46

REFERENCIA
ICMSF. Microorganismos de los alimentos 1: su significado y mtodos de enumeracin.
Segunda edicin. Editorial ACRIBIA S. A. Zaragoza (Espaa). 2000.
RESULTADOS
Fecha: __________________________
47

CUESTIONARIO PRACTICA 09
1) Defina:
a) Comensalismo :
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
______________________________________________
b) Protocooperacin
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
______________________________________________
c) Simbiosis
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
______________________________________________
d) Amensalismo
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
______________________________________________
e) Predacin
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
__________________________________________
f) Parasitismo
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
______________________________________________
48

2) Para las anteriores definiciones escriba una relacin microbiana que describa lo que usted
escribi.
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
______________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
______________________________________________
49

PRACTICA 09. PRUEBAS DE ANTAGONISMO

La composicin de la microflora y de la microfauna de un ecosistema est regulada por las
interacciones de los microorganismos de una comunidad entre s y de los mismos con el medio
no bitico de lo cual surge un equilibrio dinmico. Si dos o mas especies que coexisten en un
lugar no se afectan mutuamente la relacin es neutralismo. Cuando algo de esto se modifica, las
especies comienzan a interactuar y las relaciones que se presentan pueden ser: comensalismo,
protocooperacin, simbiosis, amensalismo, predacin, parasitismo. La evaluacin de estas
relaciones in vitro permiten aislar y seleccionar microorganismos con capacidad de
biocontroladores.
MATERIALES
1) 3 Cajas con Agar Nutritivo
2) Asas bacteriolgicas y micolgicas
3) Marcador de vidrio
4) Hongos
5) Bacterias
6) Incubadora a 37oC y 25oC
PROCEDIMIENTO
1) Tcnica por enfrentamiento
Se toma la caja de Petri con el medio de cultivo nutritivo y se divide en la parte trasera por la
mitad con un marcador de vidrio y se seala la mitad de cada una de las mitades previamente
divididas. Se marca cual microorganismo va a inocular en cada lado y finalmente por puncin
sembrar los microorganismos. Incubar a 37oC si uso bacterias a 25oC si uso hongos.
Microorganismo 1
Microorganismo 2
50

Mtodo de Igarashi
Se toma una caja de petri y se divide en 4/4 y sembrar por siembra masiva con un asa redonda,
en un espacio de tres (3) centmetros un microorganismo seleccionado y finalmente siembre en
el centro por puncin otro microorganismo que usted crea tenga caractersticas de
biocontrolador.
MICROORGANISMO 1 en estras
MICROORGANISMO 2 en el centro.
51

3) Tcnica de estras
En una caja de Petri en la cual previamente usted sembr con una estra en el centro una
bacteria, sembrar a 0.5 cm, por medio de estras, cuatro bacterias a evaluar. En el revs de la
caja con marcador de vidrio seale que microorganismos sembr. Incubar a 37oC.
Microorganismos
REFERENCIAS
PEDROZA, A. M., MATIZ V, A., QUEVEDO H, B. C. & AGUIRRE R, A. C. Manual de
introduccin a la biotecnologa. Coleccin Apuntes. Editorial CEJA. 2007.
MARTINEZ, M. M. & MARTINEZ N, P. Manual de laboratorio Microbiologa Ambiental.
Coleccin apuntes. Editorial CEJA. 2001.
52

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CUESTIONARIO PRACTICA 00.

PRACTICA 01. METODOS DE SIEMBRA

CUESTIONARIO PRACTICA 02.

PRACTICA 02. TCNICAS DE TINCIN.

PRACTICA 03. OBSERVACIN MICROSCPICA DE HONGOS

CUESTIONARIO PRACTICA 04.

PRACTICA 04. MEDIOS DE CULTIVO DIFERENCIALES Y SELECTIVOS

PRACTICA 05. REACCIONES BIOQUIMICAS

CUESTIONARIO PRACTICA 06.

PRACTICA O6. CONTROL DEL CRECIMIENTO BACTERIANO

PRACTICA 07. OBSERVACIN MICROSCPICA DE CIANOBACTERIAS

CUESTIONARIO PRACTICA 08.

PRACTICA 08. RECUENTO DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS

CUESTIONARIO PRACTICA 09.

PRACTICA 09. PRUEBAS DE ANTAGONISMO

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PRACTICA No.00 BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO

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1.3. Cdigo de prcticas en laboratorios bsicos

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CUESTIONARIO PRACTICA 01.

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PRACTICA 01. METODOS DE SIEMBRA Parte A

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Figura 1. Tcnica de aislamiento de colonias

Este procedimiento se denomina aislamiento de bacterias, debido a que las bacterias

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PRACTICA 01. METODOS DE SIEMBRA Parte B

Figura 3. Tcnica de aislamiento de colonias por el mtodo francs.

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Figura 4. Morfologa colonial

Figura 5. Siembra en medio lquido

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Figura 6. Siembra en medio semislido con superficie plana

Figura 7. Siembra en medio slido con superficie inclinada

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Figura 9. Patrn de crecimiento en medio slido

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CUESTIONARIO PRACTICA 02.

7. Mencione 5 razones de la selectividad de las bacterias por los colorantes de Gram?

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PRACTICA 02. TCNICAS DE TINCIN.