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Determinacin de Adulteracin de Leche Pasteurizada con Suero de Quesera en la Ciudad de Aguascalientes I.B.Q. Jorge Reyes Medina, M en C. Fernando Bon Rosas, M en C. Jos Luis Moreno Hernndez Duque, T.L.Q. Carmen Rubio Franchini. Universidad Autnoma de Aguascalientes, Av. Universidad No. 940, Aguascalientes, Ags. e-mail: www.uaa.mx, j_reyes_m3@hotmail.com . Resumen El objetivo de este trabajo fue determinar la adulteracin de leche pasteurizada que se comercializa en la ciudad de Aguascalientes con suero de quesera mediante las tcnicas de electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), espectrofotometra de luz visible y Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin (HPLC). Para esto se analizaron las 8 principales marcas de leche durante todo el ao 2005. Se validaron y estandarizaron las tcnicas, establecindose la incidencia y el porcentaje de adulteracin por marca de leche, por mes y por estacin del ao. El promedio de positivos fue del 36.46 % del total y el promedio de suero aadido en leche fue de 6.46 % presentando una alta dispersin durante el ao y entre marcas. Palabras claves: glucomacropptido, anlisis, HPLC, electroforesis, espectrofotometra Abstract The objective of this work was to determine the adulteration of milk whit pasteurized milk marketed in Aguascalientes city; using poliacrilamide gel electrophoresis techniques (SDSPAGE), visible light spectrophotometry, and high performance liquid chromatography (HPLC). The main 8 brands of techniques were validated and standarized, setting the incidence and the adulteration percentage by brand of milk, month and season. The positives average was 36.46 % from the total and the average of serum added in milk was 6.46 %; this represents a high dispersion during the year and among the brands. Key words: glucomacropeptide, analysis, HPLC, electrophoresis, spectrophotometry. Introduccin Un producto se considera adulterado cuando su naturaleza o composicin no correspondan con lo que se etiqueta, anuncia, expenda, suministra o cuando no corresponda a las especificaciones de su autorizacin, o haya sufrido tratamiento que disimule su alteracin se encubran defectos en su proceso o en la calidad sanitaria de las materias primas utilizadas (Ley General de Salud, 1998).

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La adulteracin pretende obtener mayores rendimientos en el producto final, con la consecuente ganancia econmica; actualmente el litro de suero se comercializa aproximadamente en $ 0.30, mientras que el litro de leche entera cruda tiene un costo de $3.80 Con base en lo anterior, los productos alimenticios son susceptibles de sufrir adulteraciones y la leche no es una excepcin. Existen diversas maneras en las que la leche puede ser adulterada, destacndose la adicin de agua, la presencia de agentes neutralizantes y la incorporacin de suero de quesera (Pinto, 1991). Para la mayora de estas adulteraciones existen diversos mtodos analticos que permiten conocer la calidad del producto: para conocer la adicin de agua existen principalmente tres mtodos: a) refractomtrico, b) crioscpico y c) osmomtrico. En el caso de agentes neutralizantes las ms sencillas son las pruebas colorimtricas que usan indicadores de pH como el cido roslico o rojo de fenol. Pero especficamente en la adulteracin de leche con suero no existe una tcnica oficial que pueda detectarlo (Pinto, 1991). Cmo encontrar un mtodo de anlisis que nos permita identificar una adulteracin de la leche con un componente de la propia leche? Las propiedades fsico-qumicas de las protenas, as como el fenmeno de coagulacin durante la fabricacin de quesos, son la base para el desarrollo de los mtodos de anlisis Durante la produccin de queso por medio de enzimas del cuajo se lleva a cabo una ruptura entre los aminocidos 105 y 106 de la -casena. Esta hidrlisis tiene como resultado la separacin de la fraccin hidrofilica soluble: glucomacropptido (GMP) que contiene los residuos cidos, el grupo fosfato y las unidades de carbohidratos y de la fraccin hidrofbica e insoluble o para -casena (Noa, 2005). La gran solubilidad del GMP se deriva del considerable nmero de grupos hidroxilos de los glcidos y de los hidroxiaminocidos presentes (Alais, 1997). El GMP esta formado por 64 aminocidos y su peso molecular es de 6800 Dalton cuando esta libre de carbohidratos (Noa, 2005). Es posible utilizar al GMP como un ndice de suero de queseras adicionado en leche. Este GMP puede detectarse de manera cualitativa por medio de la tcnica de electroforesis (Pinto, 1991), y de manera cuantitativa por mtodos (Fukuda, 2004 y Nakano, 1999) y HPLC (Noa, 2005). En la ciudad de Aguascalientes se distribuyen principalmente 8 marcas de leche pasteurizada y es de suma importancia que se realice un estudio de control de calidad de las espectrofotomtricos

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mismas, especficamente la adulteracin con suero, ya que esta prctica fraudulenta es la ms reciente de las conocidas, por tal motivo las tcnicas de deteccin son novedosas e implican conocimientos y equipos actualizados. En la actualidad no existe un estudio que reporte la incidencia de adulteracin as como el porcentaje con que se adultera la leche pasteurizada con suero. Objetivo del trabajo. Determinar la adulteracin de leche pasteurizada con suero de quesera que se comercializa en la ciudad de Aguascalientes mediante las tcnicas: SDS-PAGE, HPLC y Espectrofotometra de luz visible. Materiales y Mtodos Se validaron las tcnicas SDS-PAGE, Espectrofotometra de luz visible y HPLC para la determinacin de GMP, adulterando leche con diferentes concentraciones de suero 100 % puro proveniente de la fabricacin de queso. Estandarizacin de la tcnica electrofortica para la determinacin del Glucomacropptido El procedimiento que se sigui para estandarizar la tcnica electrofortica fue el siguiente: Se tomaron 25 mL de cada una de las muestras de suero, se precipitaron las protenas por adicin de 15 mL de cido tricloroactico (TCA) al 24 %, se agitaron durante 2 minutos y se dejaron reposar durante un mnimo 2 horas a temperatura ambiente, la mezcla se filtr a travs de papel filtro Whatman No. 5. Del filtrado que contena el glucomacropptido se tomaron 15mL y se agregaron 6 mL de TCA al 50% y se refrigeraron a 4C durante 24 horas para precipitar el glucomacropptido, el cual se recuper por centrifugacin a 9000 x g durante 10 minutos, se decantaron y se dejaron secar los tubos. Las pastillas se lavaron con 10 mL de etanol-ter (1:1), se reposaron por 30 minutos a 4C, se centrifugaron a 9000 x g durante 10 minutos. Se decantaron y se secaron los tubos a temperatura ambiente (25 C), se resuspendieron en 200 L de tris acetato etilendiaminotetracetico (TAE) a una concentracin: 50 x solucin stock a Ph 8.5, 242 g Tris base, 57.1 mL cido actico glacial, 37.25 g Na2 EDTA.2H2O, H2O a 1L y se agregaron 100 L de buffer de azul de Bromofenol 0.002% en sacarosa al 50%. Estas muestras se corrieron en electroforesis con geles continuos de poliacrilamida al 11 % de un tamao de 10 x 10 cm, a 100 volts y a un tiempo de corrida de 50 minutos. Los geles se tieron con azul de coomassie durante 24 horas y se destieron con metanol: cido actico: agua 40:10:50 durante 4 horas para visualizar la banda correspondiente al glucomacropptido, de acuerdo al mtodo de Pinto, (1991) modificado. Estandarizacin de la tcnica de espectrofotometra para determinacin del Glucomacropptido.
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Se tomaron 10 mL de cada una de las muestras, se les aadi 10 mL de TCA al 24 % en constante agitacin. Se reposaron las muestras por 30 min. Se filtraron con papel Whatman No. 5. Se recolectaron 10 mL del filtrado y se les aadi 1 mL de cido fosfotungstico. Se centrifugaron a 3150 x g por 10 minutos. Se decantaron los sobrenadantes y las pastillas se lavaron con 6 mL de alcohol. Se centrifugaron a 3150 x g por 10 minutos. Se decantaron los sobrenadantes y se aadieron 2 mL de cido actico y 1 mL de ninhidrina. Se sometieron las muestras a bao maria (95 C) por 10 minutos, con lo cual desarrollaron un color que varia de amarillo a caf amarillento. Se enfriaron rpidamente hasta temperatura ambiente (25 C). Se leyeron a 470 nm en un espectrofotmetro UV-VIS de doble haz, marca GBC, modelo Cintra 10e . (Fukuda, 2004). Se elabor una curva patrn aplicando regresin lineal a los datos obtenidos de la lectura de la absorbancia con la tcnica de Espectrofotometra de luz visible en diferentes concentraciones conocidas de suero adicionado a las muestras de leche a analizar. Estandarizacin de la tcnica de HPLC para determinacin del Glucomacropptido. Se tomaron 25 mL de cada una de las muestras, se les aadi 5 mL de TCA al 24 % en constante agitacin. Se reposaron las muestras por 60 min. Se filtraron con papel Whatman No. 5. Se recolectaron 15 mL del filtrado y se sometieron a lectura utilizando un equipo Pekn Elmer series 200 con detector de arreglo de diodos, con inyeccin de 20 L, con una columna de exclusin en gel de un dimetro interno de 4.6 mm y una longitud de 25 cm. Se utilizo un flujo de 1 mL por minuto de la fase mvil con lo que se logro la separacin del GMP, el cual paso por el detector en una banda de luz visible con una longitud de onda de 210 nm. La fase mvil que se utilizo fue una solucin estndar de fosfatos a un pH de 6 a la que se le adicionaron 21.41 g/L de sulfato de sodio. Esta solucin fue filtrada a travs de una membrana de 0.45 m (Fukuda, 2004). Tambin se elabor una curva patrn aplicando regresin lineal a los datos obtenidos de la lectura de los milivolts (mV) de la tcnica de HPLC en diferentes concentraciones conocidas de suero adicionado a las muestras de leche a analizar. Durante un ao se realizaron mensualmente muestreos por triplicado de ocho marcas de leche pasteurizada comercializada en la ciudad de Aguascalientes. La tcnica de electroforesis proporcion la incidencia de adulteracin, mientras que las tcnicas de espectrofotometra y de HPLC la cantidad de suero aadido por marca de leche, mes y estacin del ao. Resultados
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La tcnica de SDS-PAGE proporciono que la cantidad de muestras positivas fue en promedio del 36.46 % del total de leches analizadas. Se present una alta dispersin de estos resultados al hacer la comparacin entre marcas con una desviacin estndar de 41.29 % (Grfico 1). Al realizar una comparacin del % de muestras positivas a la presencia de GMP en los meses del ao 2006, es evidente que en los meses de enero, febrero y marzo, la incidencia fue mucho mayor que la de otros meses con un promedio de 62.50 % (Grafico 2). En lo referente a la comparacin de muestras positivas por estaciones del ao, la estacin de invierno (diciembre, enero y febrero), fue la que presento una incidencia mayor equivalente al 50.00 %, comparado con las estaciones de verano y otoo que fueron iguales con un 25 % (Grafico 3). Las tcnicas de espectrofotometra y de HPLC cuantificaron al GMP presente en las diferentes marcas de leche pasteurizada. Aunque presentan algunas diferencias importantes. La Espectrofotometra tiene un grado de deteccin aproximado del 1.85 % de suero aadido, y requiere de poca inversin. La tcnica de HPLC tiene un grado de deteccin del 0.02 % de suero aadido, la inversin y costo de la prueba es mayor, adems de que necesita de una mayor capacitacin de los analistas. La deteccin de GMP por estas tcnicas permiti calcular la cantidad de suero aadido a las diferentes marcas de leche pasteurizada (Grafico 4) y (Grafico 5). Se encontr que el promedio general de suero aadido de las ocho marcas de leche pasteurizada durante el ao 2005 fue de 6.46 % presentando una alta dispersin (Grafico 6). El comportamiento del Grfico 6 muestra que hay una fluctuacin en la cantidad de suero aadido que puede observarse ms claramente si se comparan las cuatro estaciones del ao (Grafico 7). La cantidad de suero adicionado por las diferentes marcas tambin presento una alta variabilidad (Grafico 8). Discusin La leche pasteurizada que se comercializa en la ciudad de Aguascalientes present adulteracin con suero de quesera en un 36.46 %. La electroforesis permite detectar cualitativamente la presencia de suero de quesera en la leche aunque su tiempo es de 3 a 4 das y con un nivel de deteccin mayor al 5 % (Tabla 1). La tcnica de espectrofotomtrica es cuantitativa permite determinar la cantidad de suero de quesera adicionado a la leche, en aproximadamente 15 horas y no es costoso, aunque el nivel de deteccin es del 1.85 %. La tcnica de HPLC es cuantitativa y permite determinar el suero de quesera adicionado a la
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leche, es un mtodo ms rpido (aproximadamente 6 horas) con un excelente nivel de deteccin de 0.02 %, sin embargo el inconveniente es el costo. La adulteracin de leche con suero de quesera es mayor en los meses de temperaturas bajas. En invierno fue de 9.91 % mientras que en verano disminuy 3.95 % posiblemente debido al incremento en la produccin de leche. Existe una diferencia estadsticamente significativa en la adulteracin de la leche entre las marcas y las estaciones del ao. Muestras dependientes del porcentaje de suero aadido en los meses de Noviembre y Diciembre.

Grfica 1: Comparacin del % de suero aadido entre los meses de Noviembre y Diciembre utilizando un diagrama de cajas. Existe una diferencia de 3.1025 entre las medias de los % de suero aadido de los meses de Noviembre y Diciembre, lo que representa un incremento casi del 100% de adulteracin en Diciembre, con una diferencia en la desviacin estndar de 5.6126 La tcnica de HPLC es mucho ms exacta de la tcnica de Espectrofotometra, por lo que es posible obtener datos ms reales, de tal forma que de las ocho muestras de leche las nicas que presentaron adulteracin con suero fueron las marcas 5 y 8. El comportamiento en cantidad de suero aadido es muy clara, con un mayor % de suero aadido en el mes de Diciembre que en el mes de Noviembre. Existe diferencia significativa en la adulteracin de leche de la marca cinco entre el mes de Noviembre y Diciembre, siendo mayor en el mes de Diciembre con -14.5933 de diferencia y una desviacin estndar muy pequea y semejante de 1.3439 y 1.2200 respectivamente.

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Muestras dependientes del porcentaje de suero aadido en los meses de Noviembre y Diciembre de la marca 5.

Grfica 2: Comparacin del % de suero aadido entre los meses de Noviembre y Diciembre de la marca 5 utilizando un diagrama de cajas. Muestras dependientes del porcentaje de suero aadido en los meses de Noviembre y Diciembre de la marca 8.

Grfica 3: Comparacin del % de suero aadido entre los meses de Noviembre y Diciembre de la marca 8 utilizando un diagrama de cajas. Existe diferencia significativa en la adulteracin de leche de la marca ocho entre el mes de Noviembre y Diciembre, con una diferencia de -10.22% de suero aadido, siendo el mes de Diciembre el mes que presenta mayor adulteracin con 28.2366% y una desviacin estndar relativamente pequea y semejante de 1.9460 y 1.6874 respectivamente. La diferencia de las medias entre marcas es de -3.10250, mientras que en la marca 5 la diferencia es de -14.5933 siendo superior a la resultante de la muestra 8 con -10.2267. Conclusiones

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El 36.46 % de la leche pasteurizada preferente comercializada en la ciudad de Aguascalientes presenta un problema de adulteracin con suero de quesera. El porcentaje de adulteracin de la leche pasteurizada preferente comercializada en la ciudad de Aguascalientes con suero de quesera es del 6.46. La electroforesis es una tcnica cualitativa que permite detectar presencia de suero de quesera en la leche aunque tiene el inconveniente de requerir bastante tiempo para obtener resultados (3-4 das) y con un nivel de deteccin mayor al 5 %. La espectrofotometra es una tcnica cuantitativa que permite determinar la cantidad de suero de quesera adicionado a la leche, es un mtodo rpido (15 horas) y no costoso, cuyo manejo es muy sencillo, aunque el nivel de deteccin es del 1.85 %. La HPLC es tambin una tcnica cuantitativa que permite determinar la cantidad de suero de quesera adicionado a la leche, es un mtodo muy rpido (6 horas) con un excelente nivel de deteccin de 0.02 %, sin embargo el inconveniente es el costo, la capacitacin especializada para manejar el equipo y el mantenimiento como los reactivos son muy costosos. La adulteracin de leche con suero de quesera es mayor en los meses de temperaturas bajas. Existe una diferencia estadsticamente significativa en la adulteracin de la leche entre las marcas y entre las estaciones del ao. Existe una variacin muy elevada entere marcas con una desviacin estndar del 41.29 %. De la misma forma la variacin entre meses y entre estaciones es muy alta pues en Verano es de 25 % contra 62.5 % en Invierno, siendo el mes de Enero el que presenta mayor adulteracin con 75 % y los meses de Junio a Diciembre la menor adulteracin con 25 %. Bibliografa Alais, C. Ciencia de la leche. 1 edicin, Mxico: CECSA. pp. 16,17,40,41,53,54,87-150. 1997 Fukuda, P.S., Roig, M.S., Prata, L. Correlation between acidic ninhidrin and HPLC methods to evaluate fraudulent addition of whey in milk. INRA, EDP Sciences. 2004 Nakano, T., Ozimek, L. Determination of sialic acid by the thiobarbituric acid reaction in sweet whey and its fractions. J. Agric. Food Chem., Jul., v. 47(7): 2613-2616. 1999. Noa, M., Prez N., Daz G., Vega S. Anlisis de Glicomacropeptido (GMP) de suero de quesera en leche por HPLC. Cromatografa de Gases y de Lquidos de Alta Resolucin: Aplicacin en el anlisis de alimentos. Editados por Universidad Autnoma Metropolitana. Serie Acadmicos CBS No 57. pp. 305-310. ISBN 970-331-0297-2. 2005

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Pinto, C.M., Casadini, V.S., Brito, C.C., Molina, C.H., e Israel, A.L. Deteccin de slidos totales de suero de quesera en leche pasteurizada y leche en polvo por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Alimentos 16:23-31. 1991. Grficos

100% 80% 60% 40% 20% 0%

1 2 3

Muestras positivas (%)

Marcas Comerciales de Leche

Grfica 4. Porcentaje de muestras positivas a la presencia de GMP en el total de las 8 marcas analizadas durante el ao 2006.

80% 60% 40% 20% 0%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Grfica 5. Porcentaje de muestras positivas a la presencia de GMP en los 12 meses del ao 2006.
25 20 15 10 5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Marcas Comerciales de Leches

M eses del Ao 2006

Grfica 6. Porcentaje promedio de suero adicionado a las diferentes marcas de leche pasteurizada durante el ao 2006.

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