Escuela Agrcola Panamericana, Zamorano.

Carrera de Agroindustria Alimentaria

Microbiologa de Alimentos

Reportes de Laboratorio
(Curva de Crecimiento y Curva de Muerte Trmica)

Presenta Prez Duarte Olga Gabriela 14029 Prez Romero Marco Antonio 14154
Grupo C3

Catedrtica Mayra Mrquez Gonzlez PhD.

San A. de Oriente, Francisco Morazn, Hn 22 de marzo de 2013.

Resumen En este informe se presenta el desarrollo de dos prcticas una sobre la curva de crecimiento y la curva de muerte trmica de E. coli, las cuales fueron realizadas por estudiantes en el laboratorio de Microbiologa de los Alimentos de Zamorano (LMAZ). Durante la prctica de Curva de crecimiento se aprendi a evaluar el procedimiento para determinar el tiempo de generacin de un cultivo bacteriano mediante la preparacin de muestras utilizando el mtodo de vaciado en placa. En la prctica de Curva de muerte trmica se determin el valor D y el valor Z de E. coli a travs de la preparacin de muestras utilizando la tcnica de siembra por superficie. Obteniendo un tiempo de generacin para E. coli de 34.28 minutos y un valor Z de 243.9C. Palabras claves: E. coli, Curva de crecimiento, Curva de muerte trmica, vaciado en placa, siembra por superficie. Introduccin El control microbiano se basa en eliminar o inhibir los microorganismos cuyas actividades son nocivas para el hombre. Es importante el estudio del comportamiento que exhibe una poblacin microbiana en sus niveles de crecimiento y al ser expuesta a un agente destructivo, el cual es independiente del tipo de microrganismo y del agente aplicado (Garca, 2004). Para asegurar la calidad e inocuidad de los productos en la industria alimentaria, es importante conocer la curva de crecimiento y la curva de muerte trmica de los microorganismos patgenos, ya que todo producto alimenticio que sea tratado por encima de la curva de muerte trmica podr considerarse en condiciones de esterilidad comercial y la curva de crecimiento nos ayudar a prevenir la generacin de microorganismos dentro del producto (Todar, 2009). En este informe se describe el anlisis de la curva de crecimiento y la curva de muerte trmica en los microorganismos, utilizando como unidad experimental el cultivo de E. coli. El objetivo de dicho anlisis fue adquirir el conocimiento necesario sobre el procedimiento para determinar el tiempo de generacin, el valor D y el valor Z en E. coli (Brock, 2009). Realizar una curva de crecimiento es importante para determinar el tiempo de generacin de un cultivo bacteriano, ya que es un grfico que presenta el logaritmo del nmero de bacterias por mililitro contra el tiempo. Por otro lado, la curva de muerte trmica muestra la tasa de muerte de las poblaciones de microorganismos expuestos a un agente letal, la cual es constante y exponencial o logartmica. Esto significa que el nmero de microorganismos que son destruidos por unidad de tiempo es siempre un porcentaje constante del nmero de microorganismos sobrevivientes al inicio de cada nuevo lapso (Brock, 2009). Con los valores de D y Z queda definido trmicamente un microrganismo. Los valores de D y z de los microorganismos son diferentes a los de los nutrientes y cualidades nutritivas y organolpticas lo que hace posible el uso de los tratamientos trmicos en alimentos para la destruccin de microorganismos (Birollo, 2003).

El valor D es el tiempo de reduccin decimal, es decir, el tiempo necesario para destruir el 90% de los microorganismos a temperatura constante y mide la rapidez con la que un microrganismo muere. El valor de z proporciona informacin sobre la resistencia relativa a la destruccin de un microorganismo a diferentes temperaturas. Los valores de z son especficos para cada alimento. A mayor valor z el microorganismo es ms resistente a la temperatura. Como se ve los microorganismos son mucho ms sensibles a cambios de temperatura que la mayora de los compuestos orgnicos (Birollo, 2003). Procedimiento Experimental Para la curva de crecimiento se realiz lo siguiente: Las muestras se hicieron en un cultivo de E. coli en caldo estndar, puesto que la muestra no est diluida, se design con el factor de dilucin 100 en tubos inoculndolos a 35C a tiempos de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, y 12 horas. Para crear la dilucin correspondiente de la muestra deseada se utiliz un dilucin 1:9 (muestra: diluyente) de agua peptonada o buffer fosfatos usando una pipeta por dilucin y agitando en el Vortex por 7 segundos para tener una dilucin homognea (Ver Tabla 1). En la preparacin de las diluciones es recomendable tener el medio de cultivo en agua con hielo, para evitar que las bacterias se sigan desarrollando y se afecten los resultados finales. Tabla 1. Diluciones a sembrar mediante vaciado en placa, segn edad del cultivo. Tiempo de incubacin 0hrs, 1hrs 2hrs, 3hrs, 4hrs 5hrs, 6hrs 7 hrs, 8hrs, 9hrs 10hrs, 11hrs 12hrs, 15hrs, 18hrs 21hrs, 24hrs Diluciones Vaciado en placa 10-2, 10-3 10-3, 10-4 10-4, 10-5 10-5, 10-6 10-6, 10-7 10-7, 10-8 10-6, 10-7

Una vez terminada la dilucin se prosigui a sembrar segn la edad del cultivo mediante el mtodo vaciado en placa, que consiste en tomar 1ml de la dilucin preparada vaciando aproximadamente 15 ml del inculo ACE (agar cuenta estndar) previamente fundido a 45 1C en bao mara. En el vaciado en placa es importante tener un mechero encendido y flamear la boca del envase donde se encuentra el ACE en cada llenado de las cajas Petri, con esto aseguramos que no se contamine el medio o la caja Petri y se genera un rea asptica. Para tener una mezcla homognea de la muestra con el agar es necesario agitar suavemente en forma circular la caja Petri. Un buen mtodo para solidificar el medio es dejarlo a temperatura ambiente aproximadamente 5 minutos, una vez solidificado se meti en una incubadora a 35C por 24hrs.

 Para la curva de muerte trmica se realiz lo siguiente: La preparacin de la muestra fue realizada de E. coli en un caldo estndar utilizando 2ml de cultivo en fase estacionaria, la muestra fue denominada como factor de dilucin 10 0. Se realiz una aplicacin trmica a tres temperaturas diferentes (65C, 75C y 85C) en un bao mara a tiempos diferentes de exposicin trmica. Tabla 2. Diluciones a sembrar segn tiempo de inactivacin trmica del cultivo. Tratamiento trmico Ninguno Tiempo de exposicin (minutos) 0 3 6 9 12 15 3 6 9 12 15 2 4 6 8 10 Diluciones a sembrar 10-5, 10-6, 10-7 10-4, 10-5, 10-6 10-2, 10-3, 10-4 10-2, 10-3, 10-4 100, 10-1 100, 10-1 10-3, 10-4, 10-5 10-1, 10-2, 10-3 100, 10-1, 10-2 100, 10-1 100, 10-1 10-2, 10-3, 10-4 10-1, 10-2, 10-3 100, 10-1 100 100

65C

75C

85C

Pasado el tiempo de exposicin se hicieron las diluciones con buffer fosfato (Ver Tabla 2) para sembrar por el mtodo de Siembra por superficie est consiste en colocar 0.1 ml de la dilucin en una caja Petri con ACE. Es necesario que se agregue la cantidad requerida (0.1ml) en la caja y esparcir con la esptula de vidrio para que seque bien evitando que las colonias queden acumuladas, ya que seco la siembra se meti a la incubadora a 35C por 24hrs. El clculo del valor D es por la siguiente frmula: Est se aplic en cada curva de tratamiento trmico. El clculo del valor Z es por la siguiente frmula: Aplicada al final y significa cuanto es el aumento de temperatura necesario para disminuir 1 logaritmo del valor D. Resultados y Discusiones

Para la curva de crecimiento los resultados fueron reportados en UFC/ml y multiplicados por el factor de la dilucin, por ejemplo: Para el tiempo de 21 horas, la dilucin fue 10 -6 el conteo dio 168 UFC X1000 000 = 168 000 000 UFC/ml debido que se tiene que redondear dos cifras el dato a reportar ser 170 000 00 UFC/ml. Para considerar el conteo de la caja se toma un rango de 25 a 250 UFC por dilucin, aquella lectura que este por debajo del rango se elimina, en este experimento solo se tomaron 11 tiempos para poder ajustar la curva. Se sabe que la curva de crecimiento presenta 4 fases a partir del tiempo 0 al 2 E. coli se encuentra en fase de adaptacin, del tiempo 2 al 10 est en fase logartmica (crecimiento), del 10 al 15 en fase estacionaria y del 21 al 24 en fase de declinacin (Ver Fig. 1). La fase de declinacin en E. coli se debe a que ha llegado en un momento donde hay ms metabolitos presentes en el medio que le provocan toxicidad a E. coli. Lo recomendable en este caso para mantener a E. coli es agregar Caldo pre-enriquecimiento al medio donde se encuentra proviniendo de ms nutrientes al microorganismo.

Fig. 1. Curva de crecimiento de E. coli en Log UFC/ml Para el nmero de generacin de E. coli se realiz con la siguiente frmula Ocupando Cf = 8.6 del 10 y Co = 4.4 del 2

El nmero de generacin para E. coli fue de N= 14 Para el Tiempo de generacin la frmula es

El tiempo de generacin de E. coli fue de 0.57 hrs, transformado en 34.28 minutos es el tiempo que tardaron en dividirse todas las clulas presentes en el medio, en la fase logartmica. Los resultados fueron los esperados en el crecimiento de E. coli, debido a que sigui el patrn de la curva de crecimiento presentando las fases en todos los tiempos. Para la curva de muerte trmica los datos reportados son: Los resultados varan conforme al tratamiento trmico y al tiempo que fue expuesto el cultivo, la tasa de muerte de las poblaciones de microorganismos expuestos a un agente letal es constante o logaritmica, es el inverso del patron de crecimiento en fase Log. Esto significa que el nmero de microorganismos de E. coli que son destruidos por unidad de tiempo es siempre un porcentaje constante del nmero de bacterias sobrevievientes al inicio de cada tratamiento. En la curva de muerte trmica a 60C las UFC/ml del cultivo fueron disminuyendo conforme el paso del tiempo, llegando a quedar 3,200 UFC/ml de E. coli despus de 15 minutos transcurridos. Esta curva se obtuvo un valor D de 2.8910 minutos (Ver Fig. 2). La frmula de la pendiente es y = -0.3459x + 8.2224

Fig. 2. Curva muerte trmica de E. coli a una temperatura de 60C a travs del tiempo. En la curva de muerte trmica a 65C las UFC/ml del cultivo fueron disminuyendo conforme el paso del tiempo, llegando a quedar 2,700 UFC/ml de E. coli la curva presento un valor D de 2.099 minutos (Fig.3). La frmula de la pendiente es y = -0.4762x + 9.1942

Fig. 3. Curva de muerte trmica de E. coli a una temperatura de 65C a travs del tiempo. En la curva de muerte trmica a 75C las UFC/ml fueron disminuyendo hasta tener 600 UFC/ml de E. coli en un tiempo de exposicion de 15 minutos, presentando un valor D de 2.685 minutos (Ver Fig. 4). La frmula de la pendiente es y = -0.3725x + 7.6105

Fig. 4. Curva de muerte trmica de E. coli a una temperatura de 75C a travs del tiempo. La similitud en el comportamiento de la curva fue similar a la que fue tratada con la temperatura de 85C, la diferencia fue que a los 10 minutos de tratamiento la cantidad de UFC/ml fue de 1,300 UFC/ml (Ver Fig. 5). La frmula de la pendiente es y = -0.5049x + 7.4428 Presento un valor D de 1.980 siendo el valor ms bajo de los 4 tratamientos, indicando que necesita menos tiempo en el tratamiento para destruir el 90% de E. coli.

Fig. 5. Curva de muerte trmica de E. coli a una temperatura de 85C a travs del tiempo. Valor D y Valor Z

El valor D vari para cada temperatura en la manera que a mayores temperaturas el valor D es menor, este valor difiere por microorganismo siendo afectado por distintos ambientes y diferentes condiciones fisiolgicas (Ver Tabla 3).

Tabla 3. Datos del valor D en E. coli

Temperatura Pendiente Valor D Log Valor D (C) 60 0.3459 2.891009 0.46104944 65 0.4762 2.099958 0.32221061 75 0.3725 2.6845638 0.42887372 85 0.5049 1.9805902 0.29679463

Una vez calculado los valores D de cada tratamiento se prosigui a graficar y obtener la pendiente para calcular el valor Z (Ver Fig. 6). La frmula de la pendiente es y = -0.0041x + 0.6693

Fig. 6. Curva del valor D en E. coli Calculo valor D en E. coli. Los resultados de los tratamientos trmicos aplicados al cultivo de E. coli fueron los esperados, en este experimento se pudo comprobar la teora respecto al control microbiano y a la determinacin de los valores Z y D. . Esta prctica de laboratorio fue provechosa e interesante porque proporcion de manera aplicada conocimientos bsicos para evitar la generacin de microorganismos patgenos en productos valor Z = 243.9C necesitamos para disminuir un 90% el logaritmo de

industriales mediante la aplicacin de tratamientos trmicos adecuados. Dicha experimentacin tambin nos permiti llegar a los objetivos planteados, ya que se logr el completo entendimiento de la determinacin del valor D, valor Z y se identific el tiempo de generacin del cultivo E. coli.

Conclusiones y Recomendaciones El crecimiento de E. coli en un tiempo de 8 horas es exponencial o logartmico, presentando un tiempo de generacin de 34.28 minutos con un nmero de generacin de 14 divisiones en el tiempo de fase logartmica. El valor D vari para cada temperatura en la manera que a mayores temperaturas el valor D es menor, por lo que en el tratamiento trmico de 85 C el valor D fue de 1.98 y a 60 C el valor D fue de 2.89, siendo estos los valores ms bajo y ms alto de los resultados de dicho experimento. El valor Z indica que debe existir un incremento de 243.9 C para que el valor D se reduzca un 10% de la parte inicial, este valor es algo raro pero recordemos que en la toma de datos de todas las secciones, hubieron errores, lo que significa que puede haber una alteracin de los datos reflejada en el valor Z. Se recomienda a las industrias alimentarias elaborar sus productos por encima de las curvas de muerte trmica anteriormente presentadas para asegurar que su producto est libre de contaminacin por E. coli y as pueda considerarse en condiciones de esterilidad comercial. Es importante agregar la dosis requerida de cultivo o dilucin en la caja al momento de hacer la siembra por superficie, ya que la lectura de las colonias pueden ser malas debido a que quedan acumuladas en un solo punto esto se debe a que no seco bien la muestra. Recomendamos al laboratorio la pronta adquisicin de ms materiales como gabachas de tallas grandes de preferencia L, debido a que hay pocas en existencia y no alcanzan por lo que trabajar con una gabacha y de talla pequea es incmodo.

Bibliografa

Birollo, Gustavo. 2003. Foro Electrnico: Novedades Tecnolgicas en la Industria Lctea. Nuevas Tecnologas en Procesos Industriales: Operaciones en el Proceso continuo de esterilizacin de Productos lcteos. Tetra Pak Disponible en: http://es.scribd.com/doc/38975627/Muerte-Termica Vera, Garca Corts. Edicin 2004. Introduccin a la Microbiologa (2da. Ed.). Pgina 195200.

Todar, Kenneth. Ed. 2009. Lectures in Microbiology by Kenneth. University of WisconsinMadison: Department of Bacteriology.

Madigan M, Martinko J & Parker J. Brock. 2009. Biologa de los Microorganismos. (8va. Ed.) Captulo No.11

Rubrica de Evaluacin Partes del Reporte Organizacin Introduccin Procedimiento Experimental Resultados Discusin Conclusin Referencias Bitcora Calidad de la escritura Total Puntos obtenidos Observaciones