GUIN DE PRCTICAS DE LA ASIGNATURA ELEMENTOS DE BIOLOGA.

MSTER EN BIOFSICA

PROGRAMA DE PRCTICAS
1.- DISOLUCIONES. SOLUCIONES TAMPN .............................................. 3

2.- (I) PRECIPITACIN FRACCIONADA DE PROTENAS .................................. 6

3.- (II) CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO ................................... 7

4.- DETERMINACIN CUANTITATIVA DE PROTENAS: LOWRY .......................11

5.- ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA-SDS ...........................13

6.- CRECIMIENTO DE BACTERIAS TRANSFORMADAS GENTICAMENTE. ............18

7.- AISLAMIENTO DE CIDOS NUCLEICOS ..............................................19

8.- DIGESTIN DE DNA PLASMDICO POR ENZIMAS DE RESTRICCIN.............20

9.- SEPARACIN DE DNA POR ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA. .........22 10.-IDENTIFICACIN DE AMINOCIDOS EN LA CASENA MEDIANTE CROMATOGRAFA EN CAPA FINA (TLC). ................................................23

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ESQUEMA DE PRCTICAS DE ELEMENTOS DE BIOLOGA

DA MARTES PRCTICA 1 (nmero) DISOLUCIONES Y TAMPONES (1) MIRCOLES PRECIPITACIN CON SULFATO AMNICO (2) JUEVES CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO (3) VIERNES CUANTIFICACIN DE PROTENAS: LOWRY (4) LUNES PREPARACIN DE GELES DE ACRILAMIDA (5) MARTES DESARROLLO DE LA ELECTROFORESIS DE PROTENAS(5)-TINCIN MIRCOLES PURIFICACIN DE CIDOS NUCLEICOS (7) JUEVES CROMATOGRAFA EN CAPA FINA (10, I) VIERNES CROMATOGRAFA EN CAPA FINA (10, II)
NORMAS DE TRABAJO.

PRCTICA 2

Calcular y hacer las diluciones de cada fraccin obtenida segn tabla de la prctica 4.

Plaquear bacterias transformadas para aislar colonias. Preparar y hervir muestras de protenas segn tabla prctica 5. Crecimiento de bacterias transformadas genticamente (6). Destincin de geles de acrilamida Digestin de un DNA plasmdico (8) Preparacin de geles de agarosa (9) Electroforesis y visualizacin de DNA en geles de agarosa (9)

Todo el trabajo se llevar a cabo en los Laboratorios del Departamento de Biologa Molecular, en el 1er stano del edifico de Biolgicas. Generales: Est prohibido pipetear con la boca, comer, beber o fumar en los laboratorios. Es obligatorio el uso de bata. El material desechable de vidrio se tirar a basuras especiales para residuos cortantes: os pedimos colaboracin para no llenar estas basuras con guantes y otros desechos que no sean de cristal. Marcar siempre cualquier tubo o recipiente que contenga algo til de la forma ms segura posible, por ejemplo tanto en la tapa como en el tubo.

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En algunas prcticas se utilizarn reactivos que requieren ser manipulados con mayores medidas de seguridad y que los profesores identificarn como txicos (p.ej., fenol, bromuro de etidio, sales de cobre, etc). Os pedimos una atencin especial a las instrucciones que los profesores os darn a para utilizarlos y para desechar adecuadamente los residuos que se generen. Seguridad biolgica Es obligatorio lavarse las manos despus del trabajo de laboratorio, para evitar contaminacin del usuario con material biolgico, y la potencial dispersin de ste. Todo el material biolgico, p. ej. bacterias o material que haya estado en contacto con stas (tanto slido como lquido), ha de ser inactivado dejndolo en contacto con hipoclorito (leja) durante al menos 30 min. antes de desecharlo. El material lquido se puede entonces desechar por la pila dejando correr algo de agua, y el slido se eliminar tirndolo a las basuras correspondientes. Cualquier material biolgico derramado ha de ser descontaminado inmediatamente con hipoclorito, antes de proceder a secar y lavar con jabn la superficie manchada. 1.- DISOLUCIONES. SOLUCIONES TAMPN En esta primera prctica se llevar a cabo la preparacin de los reactivos y disoluciones que se van a emplear en el resto de las prcticas. Es muy importante el manejo con soltura de las unidades de medida y concentracin, as como la mxima precisin a la hora de medir los pesos y volmenes para preparar las disoluciones. A continuacin se recuerdan las definiciones bsicas referentes a concentracin y se plantean dos problemas tericos sencillos que deben resolverse antes de empezar a preparar las disoluciones. Finalmente se enumeran unas cuantas disoluciones que se emplearn en las prcticas y que debern prepararse. DEFINICIONES DE UNIDADES DE CONCENTRACIN La concentracin de una sustancia es una medida de la cantidad en que dicha sustancia (el soluto) est presente en una disolucin. La concentracin del soluto viene expresada normalmente en unidades de masa, (gramos, miligramos, etc), o ms frecuentemente, de cantidad de sustancia (moles o equivalentes), mientras

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que la cantidad de disolucin suele venir dada en unidades de volumen (litros o sus submltiplos). El concepto de equivalente cambia segn el tipo de reaccin en la que vaya a intervenir el compuesto, sea sta cido-base o redox. As, en una reaccin cidobase, se define como equivalente la cantidad de sustancia capaz de ceder o aceptar un mol de protones, mientras que en un equilibrio redox, un equivalente corresponde a la cantidad de sustancia capaz de ceder o aceptar un mol de electrones. En la prctica, el nmero de equivalentes es el nmero de moles multiplicado por un coeficiente que indica el nmero de protones o electrones que intercambia en la reaccin cido-base o en la reaccin redox. Las formas ms comunes de expresar la concentracin son las siguientes: Molaridad. Expresa el nmero de moles de soluto por litro de disolucin. Se abrevia, M. Normalidad. Expresa el nmero de equivalentes de soluto por litro de disolucin. Se abrevia, N. Tanto por ciento peso / volumen (p/v). Expresa la masa en gramos de soluto en 100 ml de disolucin. Tanto por ciento peso / peso (p/p). Expresa la masa en gramos de soluto en 100 g. de disolucin. Tanto por ciento volumen / volumen (v/v). Expresa el volumen en mililitros de soluto en 100 ml de disolucin.

A la hora de preparar disoluciones, es imprescindible conocer una serie de propiedades del soluto, como son el peso molecular, la riqueza (con la posible presencia de molculas de agua de hidratacin). Muchas sales incorporan un nmero fijo de molculas de agua en su composicin, denominadas de hidratacin. Se incluyen estas molculas de agua en la frmula y en el peso molecular del compuesto. Hay sales que pueden presentar varios grados de hidratacin distintos segn la preparacin comercial. El valor de la riqueza comercial hace referencia a que muchos compuestos no son, en su presentacin comercial, completamente puros. Este valor suele expresarse en tanto por ciento en peso. En estos casos, para medir un volumen, habr que conocer tambin la densidad de la disolucin.

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Algunas de las disoluciones que se emplearn son disoluciones reguladoras o disoluciones tampn, que tienen la propiedad de ser capaces de neutralizar pequeas adiciones de iones H3O+ u OH- dejando prcticamente inalterado el pH. Para la correcta preparacin de tales disoluciones hemos de emplear el pHmetro ya que, como veremos en la prctica nmero 2, esta propiedad de tamponamiento slo se mantiene en un rango determinado de pH. PROBLEMAS TERICOS PROBLEMA N 1 Calcular la cantidad de NaOH necesaria para preparar 200 ml de una solucin al 20% (p/v). A partir de ella describir cmo preparar 100 ml de NaOH 200 mM y expresar dicha concentracin en porcentaje p/v. PROBLEMA N 2 El cido clorhdrico concentrado tiene una riqueza del 37,5% (p/p) de HCl y su densidad es de 1,19; el cido sulfrico tiene una riqueza del 96% y una densidad de 1,84. Calcular la Molaridad y la Normalidad de dichos cidos concentrados. Describir la preparacin de 100 ml de HCl 10 mM y 50 ml de H2SO4 0.2M a partir de las disoluciones anteriores. LISTA DE DISOLUCIONES QUE PREPARAR: 1-Tris-HCl 1M pH8.5 (50 ml) 2-Tris-HCl 0,1M pH7.5 (50 ml) 3-NaCl 3 M (50 ml) 4-Etanol 70% (7ml)

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PURIFICACIN DE INMUNOGLOBULINAS DE SUERO

Los anticuerpos pertenecen a un grupo de protenas llamadas "inmunoglobulinas", que estn compuestas por dos cadenas pesadas (de unos 50KDa) y dos cadenas ligeras (de 25KDa) unidas entre s por puentes disulfuro, y son muy abundantes en la circulacin sangunea. Un cierto nmero de tcnicas ampliamente utilizadas en los laboratorios de Bioqumica requieren la utilizacin de inmunoglobulinas purificadas. Hay muchos mtodos de purificacin de inmunoglobulinas, pero en esta prctica vamos a seguir el mtodo ms convencional que incluye un fraccionamiento de las protenas del suero con sulfato amnico y una cromatografa de intercambio inico. El anlisis del resultado de ambos mtodos se realizar mediante electroforesis en geles de protenas en presencia de SDS. Se pretende con ello que el investigador se familiarice con tres tcnicas de separacin de protenas que se basan en diferentes principios de separacin.

2.- (I) PRECIPITACIN FRACCIONADA DE PROTENAS

Cuando una sal se aade a una disolucin de protenas, se produce un incremento de la solubilidad de las mismas (solubilizacin por salado o "salting in"). Este aumento inicial en la solubilidad se debe a la estabilizacin en solucin de la protena por la disminucin de los coeficientes de actividad de los grupos ionizables. A medida que la fuerza inica se eleva, por aumento en la concentracin en la sal, se alcanza un mximo de solubilidad seguido de una disminucin hasta que las protenas precipitan (precipitacin salina o "salting out"). Durante la precipitacin probablemente existe una competencia por las molculas de agua de solvatacin entre la protena y la sal, por lo que las interacciones protena-protena aumentan, producindose su precipitacin. El sulfato amnico, (NH4)2SO4, tiene una gran solubilidad (por encima de 700 g/l) y es la sal ms utilizada para el fraccionamiento de protenas. Material y reactivos - Suero de ternera (ST). - Disolucin saturada de (NH4)2SO4 (100% de saturacin). - PBS (137 mM NaCl; 2.6 mM KCl; 8 mM Na2HPO4; 1.8 mM KH2PO4 pH 7.2). Mtodo

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1.- Tomar 6 ml de una dilucin 1/6 del ST en H2O destilada preparada por los profesores en un tubo de 10 ml (tapn rojo). La adicin de (NH4)2SO4 se va a realizar aadiendo el volumen suficiente (lentamente, y a 4C) de disolucin saturada hasta alcanzar la concentracin que se desea. Para ello se utilizar la siguiente ecuacin: (1) V= V(S2-S1) / 1 - S2 siendo, V = Volumen que hay que echar de la disolucin saturada. V= Volumen de muestra que se tiene. S2 = Tanto por uno de la concentracin de saturacin a la que se quiere llevar la muestra. S1 = Tanto por uno de la concentracin inicial de la muestra. 2.- 5 ml de esta dilucin se llevan hasta un 30% de saturacin. Se mezcla lentamente en fro, se incuba 10 minutos en hielo y se centrifuga a 4000 rpm durante 10 minutos a 4C. Guardar a 4C el otro ml de ST diluido rotulado con el nombre del investigador. 3.- Se pasa el sobrenadante a un tubo graduado y se mide el volumen. El precipitado se disuelve en 6 ml de PBS (con ayuda del vrtex) y se mide el volumen final (fraccin 1). 4.- El sobrenadante obtenido en el paso anterior se lleva a un 40% de saturacin. Se incuba 10 minutos en hielo y se centrifuga a 4000 rpm durante 10 minutos a 4C. 5.- Se pasa el sobrenadante a un tubo graduado y se mide su volumen. El precipitado se disuelve en 6 ml de PBS y se mide el volumen final (fraccin 2). 6.- El sobrenadante obtenido se lleva a un 60% de saturacin. Se procesa del mismo modo que en los pasos anteriores. El precipitado se disuelve en 6 ml de PBS y se mide su volumen final (fraccin 3). Todas las fracciones se conservarn a 4C hasta su utilizacin en el siguiente ensayo.

3.- (II) CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO

La cromatografa de intercambio inico de protenas tiene su fundamento en las propiedades cido-base de stas. Las protenas tienen una carga neta determinada por su composicin amino-acdica y por el pH del medio en el que se encuentran. El carcter y magnitud de esta carga neta les permite interaccionar o no con un grupo cargado determinado. El comportamiento de una protena en una cromatografa de intercambio inico puede predecirse a partir de su punto isoelctrico (pI). Una protena con un pI de 5.8, tendr una 7

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carga neta positiva a pHs inferiores a su pI, y negativa a pHs superiores. Atendiendo al pI de la protena y a los valores de pH con los que deseemos trabajar, deberemos elegir un intercambiador aninico o catinico. El intercambiador est constituido por una matriz insoluble y, a ser posible, inerte a la que est unida un grupo COLUMNA funcional con una carga positiva (cuando se trate de un intercambiador aninico) o negativa (en el caso de un intercambiador catinico). RESINA La cromatografa por intercambio inico consta de cuatro fases: a) Equilibrado, o ajuste de la resina y de la muestra a las condiciones salinas y de pH iniciales requeridas para el experimento; b) Fijacin de la EPPENDORFF muestra, por incubacin de la mezcla, en este caso de protenas, que 1 ml deseamos resolver, uniendo todas o parte de ellas para luego eluirlas (despegarlas) de forma diferencial; c) lavado de las protenas que hayan quedado retenidas inespecficamente; y d) Elucin de la muestra, utilizando concentraciones variables de sales y/o tampones con diferente pH. La prctica que se realiza a continuacin tiene como objetivo la purificacin de inmunoglobulinas de suero de ternera a partir de un extracto parcialmente enriquecido en esta protena por precipitacin con CH -CH3 2 sulfato amnico. Para ello emplearemos un intercambiador CELULOSA -CH2-CH2-N+H aninico, el DEAE-sephacel, CH2-CH3 constituido por una matriz a la que est unido como grupo funcional un radical dietil-amino-etilo. El procedimiento empleado ser una cromatografa en columna, empleando una solucin tampn Tris/HCl a pH 8.5, que nos asegure que la carga neta de la inmunoglobulina sea negativa y, por consiguiente, que la protena se una de forma efectiva al intercambiador.
FILTRO

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Material y reactivos Extracto correspondiente al corte del 40% de la prctica de precipitacin con (NH4)2SO4 [F2] Tampn de equilibrado : Tris 10 mM, pH 8.5 Resina DEAE-Sephacel. Columna, soporte y pinza de cierre Soluciones stock para preparar tampones de elucin de la columna (del 1 al 4, ver tabla ms abajo)

Mtodo 1- Equilibrado de resina y muestra Procederemos al equilibrado y empaquetamiento de la resina aadiendo suavemente sobre la resina 10 ml de Tris 10mM pH 8.5 y dejndolo caer libremente. De esta forma nos aseguramos que la resina se halla al pH y condiciones inicas que deseamos (se suele pasar un volumen de 10 veces el de la resina de tampn de equilibrado). Para ir preparando la muestra que pasaremos a continuacin, tomar 1 ml (aprox. 5 mg de protena) de la fraccin del precipitado del 40% del tratamiento con (NH4)2SO4 (Fraccin 2) y diluirlos en 5 volmenes de Tris 10mM pH 8.5. con el fin de disminuir en lo posible la concentracin de sales (y que la protena no tiene que competir con los iones de las sales para quedarse pegada al intercambiador) y cambiar las condiciones de pH de la F2 al adecuado para la unin de las inmunoglobulinas a la resina. 2- Unin de la muestra a la resina Cuando acabe de pasar el tampn de equilibrado, se aade la muestra diluida (6 ml) en movimientos rotatorios intentando no distorsionar la resina con ayuda de una pipeta Pasteur. Descartaremos lo que caiga (pass through). Deberemos ir calculando y preparando en tubos de 5ml los tampones de elucin (del 1 al 4) partiendo de soluciones concentradas siguiendo la siguiente tabla: N COMPOSICIN (preparar 4 ml ) 1 2 3 4 Tris 10 Tris 10 Tris 10 Tris 10 mM, mM, mM, mM, pH 8.5; pH 8.5; pH 8.5; pH 8.5; NaCl NaCl NaCl NaCl 50 mM 150 mM 300 mM 500 mM 9 Vol de NaCl 3M Vol Tris 1M pH 8,5 H2O (hasta 4 ml)

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3- Lavado de la columna Cuando termine de salir el pass through, aadir 4 volmenes (4ml) de Tris 10mM pH 8.5. para arrastrar (lavar) las protenas que no se hayan retenido electrostticamente a la resina. Descartaremos lo que caiga. 4- Elucin de la muestra Para separar las imunoglobulinas de la muestra del resto de las protenas se llevarn a cabo varias eluciones de la columna con concentraciones crecientes de NaCl en tampn Tris/HCl 10mM a pH 8.5. Cada uno de los pasos se llevar a cabo con 4 ml del correspondiente tampn (ver tabla), y se recogern fracciones de 1 ml que, posteriormente, se analizarn por electroforesis en gel de poliacrilamida. TAMPON 1 2 3 4 COMPOSICION Tris 10 Tris 10 Tris 10 Tris 10 mM, mM, mM, mM, pH 8.5; pH 8.5; pH 8.5; pH 8.5; NaCl NaCl NaCl NaCl 50 mM 150 mM 300 mM 500 mM muestras 1.3 y 1.4 2.3 y 2.4 3.3 y 3.4 4.3 y 4.4

Recoger las fracciones correspondientes a la salida de los mililitros 3 y 4 de cada tampn de elucin . Para ello usar tubos eppendorff rotulados como se explica en la tabla de arriba recogiendo las gotas que eluyan de la columna hasta que se alcance aproximadamente la marca correspondiente a 1ml en cada tubo. El primer y ltimo ml de cada paso se descartarn ya que el primer ml de cada lavado equivale aproximadamente al volumen muerto de la columna (el volumen que ha de recorrer el tampn desde el comienzo de la columna hasta su salida). Las fracciones 3 y 4 son las que van a contener la mayora de la protena eluda, Guardar estas fracciones rotuladas con el nmero del investigador a 4C hasta su utilizacin.
o

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4.- DETERMINACIN CUANTITATIVA DE PROTENAS: MTODO DE LOWRY

El objetivo de la prctica es calcular la cantidad total de protenas contenida en una disolucin. El mtodo de Lowry se basa en la reaccin de las protenas con el reactivo de Folin dando un complejo coloreado. Su descripcin es el artculo ms citado de la historia en nuestro rea (JBC de 1951). Este reactivo es una disolucin de tungstato sdico y molibdato sdico en cido fosfrico y cido clorhdrico. El mecanismo del proceso es el siguiente: el Cu2+, en medio alcalino, forma un complejo con los enlaces peptdicos de las protenas reducindose a Cu+. Este in, as como los grupos R de los residuos de tirosina y triptfano de las protenas reaccionan con el reactivo de Folin, produciendo inicialmente un producto inestable, que se reduce para formar un compuesto coloreado. La intensidad del color depender de la cantidad presente en las protenas de estos aminocidos aromticos y ser proporcional a la concentracin de protenas en la disolucin. La concentracin de una disolucin problema puede calcularse interpolando el valor obtenido de absorbancia en una recta de calibrado trazada con valores conocidos de concentracin de una protena y sus respectivas absorbancias. Material y reactivos - Albmina de suero bovino (BSA) 1 mg/ml en PBS. - NaOH 1 M - Reactivo 1: 10 volmenes de Na2CO3 al 2% en NaOH 0.1 M. 0.1 volmenes de tartrato sdico potsico al 2% (C4H4O6KNa). 0.1 volmenes de CuSO4 al 1%. - Reactivo 2: 1 volumen de reactivo de Folin. 1 volumen de H20 destilada. Mtodo A partir de una disolucin de albmina bovina (BSA) de 1 mg/ml, preparar 8 diluciones, con agua, de concentraciones: 0, 20, 40, 80, 160, 240, 320 y 400 !g/ml. A 0.25 ml de cada una de estas diluciones, aadir NaOH 1 M hasta una concentracin final de 0.1 M (25 l). Aadir a cada tubo 2 ml del reactivo 1, mezclarlo bien e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Aadir ahora 225 !l del reactivo 2 con la p1000, mezclarlo bien e 11

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incubarlo durante 20 minutos a temperatura ambiente. Leer la absorbancia a 750 nm, ajustando previamente el 0 del espectrofotmetro con el ensayo en blanco (tubo n 1). Con las diferentes fracciones obtenidas en el ensayo de precipitacin con (NH4)2SO4, se realizarn, con H2O, las siguientes diluciones: ST (diluido): Fraccin 1: Fraccin 2: Fraccin 3: 1/150; 1/300 1/4; 1/8 1/30; 1/60 1/30; 1/60

Procesar 0.25 ml de cada una de estas diluciones igual que las diferentes diluciones de BSA (es conveniente, para ahorrar tiempo, procesar estas fracciones a la vez que las de BSA).

1 N tubo

2 PROTEINA BSA

6 (10
min)

7 (20
min)

10

1 BSA 1mg/ml 2 BSA 1mg/ml 3 BSA 1mg/ml 4 BSA 1mg/ml 5 BSA 1mg/ml 6 BSA 1mg/ml 7 BSA 1mg/ml 8 BSA 1mg/ml MUESTRA 9 ST(dil)1/150 10 ST (dil)1/300 11 F1 1/4 12 F1 1/8 13 F2 1/30 14 F2 1/60 15 F3 1/30 16 F3 1/60

!l H2O NaOH Reac BSA !l 1M tivo 1 0 250 27!l 2 ml 5 245 27!l 2 ml 10 240 27!l 2 ml 20 230 27!l 2 ml 40 210 27!l 2 ml 60 190 27!l 2 ml 80 170 27!l 2 ml 100 150 27!l 2 ml
!l

Reac DO tivo 750 2 nm 225!l 225!l 225!l 225!l 225!l 225!l 225!l 225!l 225!l 225!l 225!l 225!l 225!l 225!l 225!l 225!l

Conc Conc !g/ml final x f-1 0 20 40 80 160 240 320 400 Conc?

250 250 250 250 250 250 250 250

27!l 27!l 27!l 27!l 27!l 27!l 27!l 27!l

2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml

Representar grficamente las concentraciones patrn frente a la absorbancia y hallar, interpolando, las concentraciones de protena de las diferentes fracciones teniendo en cuenta las diluciones realizadas y los volmenes totales de cada fraccin. 12

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5.- ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA-SDS La electroforesis se basa en el movimiento que experimenta una partcula cargada en un determinado medio cuando se ve sometida a la accin de un campo elctrico. Esta tcnica se utiliza frecuentemente en el laboratorio para la separacin de protenas y de cidos nucleicos. La tcnica electrofortica ms comn en la separacin de protenas es la que se realiza en geles de poliacrilamida en presencia del detergente dodecilsulfato sdico (SDS). El gel se obtiene mediante la polimerizacin de acrilamida y el entrecruzamiento de las cadenas con bis-acrilamida. De esta manera el gel forma una red o malla a travs de cuyos poros circulan las protenas a separar. El tamao de los poros depende de la concentracin absoluta y de la proporcin acrilamida/bis-acrilamida del gel. La polimerizacin es promovida por el persulfato amnico y estabilizada por el TEMED. Los pesos moleculares de las protenas se pueden determinar midiendo su movilidad en geles de poliacrilamida en presencia de SDS. Esto es debido a que la cantidad de SDS (cargado negativamente) que se une a una protena es proporcional al peso molecular del polipptido y es independiente de su secuencia. A saturacin, se une aproximadamente 1.4 g de detergente por gramo de protena. De esta manera, cuando una mezcla de protenas de peso molecular conocido se somete a electroforesis en un gel de poliacrilamida en presencia de SDS, la representacin grfica de la distancia recorrida por cada protena en funcin del logaritmo de su peso molecular dar una lnea recta (ver anexo al fin al del guin). Material y reactivos Disolucin de acrilamida-bisacrilamida al 30%/0.8% en agua destilada. Tris-HCl 0.5 M pH 6.8 Tris-HCl 3 M pH 8.8 SDS 10% Persulfato amnico al 10% Tampn de electroforesis (Tris 25 mM pH 8.3; Glicina 192 mM; SDS 0.1%) Tampn de ruptura (Tris 313 mM pH 6.8; SDS 10%; Glicerol 25%; mercaptoetanol 25%; azul de bromofenol 0.02%) - Cubetas de electroforesis, cristales, fuentes de alimentacin, separadores, pinzas. - Marcadores de peso molecular de protenas - Solucin de fijacin (cido actico 10%; etanol 20%) - Solucin de tincin (azul de Coomassie 0.1%; etanol 40%; cido actico 10%) - Solucin de revelado (cido actico 10%) -

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Mtodo 1.- Preparacin del gel En esta prctica se va a preparar un gel discontinuo constituido por el gel de separacin o resolucin y el gel de concentracin o empaquetamiento. Las cantidades de cada reactivo se muestran en la tabla. Limpiar perfectamente los cristales (uno cuadrado y otro con dos rebordes), peines y espaciadores con agua y jabn, aclararlos con abundante agua y escurrirlos en posicin vertical y en un sitio a resguardo de posibles roturas. Montar el gel con los separadores en la carcasa correspondiente siguiendo las instrucciones de los encargados de prcticas. Meter el peine para hacer una marca con rotulador 1-2 cm por debajo del nivel que ser ocupado por el peine formador de los pocillos. Rellenar la carcasa con agua para comprobar que no hay prdidas. Preparar la solucin del gel de separacin (30 ml por gel) teniendo en cuenta que el persulfato amnico y el TEMED se aaden al final. Verterlo rpida y cuidadosamente entre los cristales hasta la marca de rotulador. Colocar un poco de agua destilada cuidadosamente sobre el gel (gota a gota con una pipeta Pasteur) y dejarlo polimerizar a temperatura ambiente. Dejar polimerizar en el tubo Falcon el resto de la mezcla del gel como control de polimerizacin y descartarlo despus. Una vez polimerizado (unos 30 minutos), retirar el agua y preparar la solucin del gel de concentracin. Verter esta solucin sobre el gel de separacin hasta llenar el espacio entre cristales y colocar un peine previamente lavado con agua y etanol, evitando que queden burbujas entre el peine y el gel. Dejarlo polimerizar a temperatura ambiente durante 20-30 minutos (proceder del mismo modo que antes desechando el resto de mezcla polimerizada una vez slida). Gel de separacin (10%) 10 ml 15,6 ml 3,8 ml 300 !l 300 !l 30 !l -----Gel de concentracin 1,25 ml 6,1 ml -----100 !l 100 !l 10 !l 2,5 ml

AcrilamidaBisacrilamida Agua Tris HCl 3 M pH 8.8 SDS 10% Persulfato amnico 10% TEMED Tris HCl 0.5 M pH 6.8

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2.- Preparacin de las muestras En esta prctica se van a analizar mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS las muestras provenientes de las dos prcticas anteriores. Por un lado, las muestras resultantes de la precipitacin con sulfato amnico del suero de ternera y, por otro lado, las muestras eluidas de la columna de DEAE. Se incluir tambin un carril con marcadores de peso molecular, que consta de una mezcla de protenas de peso molecular conocido que nos servirn de referencia. Las muestras a analizar son las siguientes: N tubo 1 2 3 4 muestra SUERO Ternera (1/6 o original) F1 (precip. del 30% de (NH4)2SO4) F2 (precip. del 40% de (NH4)2SO4) !l para 100!gr !l de agua (hasta 80) !l de Tampn 5x 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20

F3 (precip. del 60% de (NH4)2SO4) 5 1.3 (eluida con NaCl 50 mM) 80!l 0 6 1.4 (eluida con NaCl 50 mM) 80!l 0 7 2.3 (eluida con NaCl 150 mM) 80!l 0 8 2.4 (eluida con NaCl 150 mM) 80!l 0 9 3.3 (eluida con NaCl 300 mM) 80!l 0 10 3.4 (eluida con NaCl 300 mM) 80!l 0 11 4.3 (eluida con NaCl 500 mM) 80!l 0 12 4.4 (eluida con NaCl 500 mM) 80!l 0 Para preparar las muestras (100!l de cada una), proceder como sigue:

1) En base a los valores de concentracin de protenas obtenidos en el ensayo de Lowry, calcular el volumen que debemos tomar de cada fraccin para tener en cada muestra 100!g de protena total. Tener el cuenta que si el volumen resultante es mayor de 80!l, hay que tomar solamente 80!l aunque no se lleguen a completar los 100!gr (no cabe ms en los pocillos). 2) Calcular el volumen de agua a aadir para llegar a 80 !l totales. 3) Preparar esas mezclas en eppendorff numerados. 4) Aadir por ltimo el tampn de ruptura 5x (20!l/eppendorff) CON GUANTES y cerrar rpidamente los tubos despus de pipetearlo. 5) Calentar las muestras en un termoblock a 90C durante 3-5 minutos para desnaturalizar las protenas y permitir su unin al SDS. OJO: calentar con los tubos eppendorff perfectamente cerrados y con un agujero en la tapa hecho con una aguja fina. 6) Se cargarn 40!l (40!gr de protena) por pocillo.

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3.- Desarrollo de la electroforesis Una vez polimerizado el gel de concentracin, retirar el peine con cuidado de no romper los pocillos para las muestras. Montar el gel en la cubeta de electroforesis siguiendo las instrucciones de los encargados de prcticas. Retirar restos de acrilamida con ayuda de una aguja de 0,7 mm. Eliminar las burbujas de aire de la parte inferior del gel (zona de contacto con el tampn de electroforesis) con ayuda de una jeringuilla. Aadir tampn de electroforesis y marcar los pocillos con un rotulador o aadiendo 2-5 !l de tampn de ruptura azul. Cargar las muestras en el orden adecuado apoyando la punta sobre el cristal cuadrado y dejando que resbale con suavidad la mezcla hacia el fondo del pocillo. Una vez cargadas las muestras, se conectan los cables correctamente (el polo positivo, rojo, abajo y el negativo, negro, arriba) y se corre la electroforesis a 150-200 volt (unos 50 mA/gel) hasta que el frente azul est cerca de la parte inferior del gel (unos 90 min). Cuando el frente est cerca de la parte inferior del gel, se desconecta la corriente, se separan con mucho cuidado los dos cristales con ayuda de un espaciador de tefln y, con los guantes mojados en agua, se retira el gel y se coloca en un recipiente donde se aade la solucin de tincin durante 30-40 minutos con agitacin. Se retira esta solucin y se aade la solucin de revelado, donde se deja hasta que el gel est completamente desteido (hasta el da siguiente) encima de la mesa.

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6.- CRECIMIENTO GENTICAMENTE.

DE

BACTERIAS

TRANSFORMADAS

La transformacin es un proceso a travs del cual un DNA exgeno se puede introducir dentro de un microorganismo. En algunas bacterias ste es un fenmeno que se da de manera natural, pero puede ser inducido en el laboratorio mediante tratamientos qumicos o fsicos que modifican las propiedades de la pared celular bacteriana. En esta prctica vamos a utilizar una cepa de Escherichia Coli (llamada DH5!) a la que se le ha introducido un DNA circular llamado plsmido que se caracteriza por contener las secuencias necesarias para garantizar su auto-replicacin. Adems suele contener un gen que confiere a aquellas clulas que lo expresen resistencia frente a la accin de un antibitico determinado. Nuestro plsmido codifica para un enzima que hidroliza el anillo "lactmico de la ampicilina, permitiendo el crecimiento bacteriano incluso en presencia de este antibitico. Por ello vamos a partir de placas Petri en las que se ha introducido un medio slido rico en nutrientes (LB) junto con concentraciones del antibitico ampicilina (50!gr/ml) restrictivas para el crecimiento de bacterias. En estas condiciones, las bacterias que hayan adquirido el DNA plasmdico van a poder crecer en forma de colonias observables a simple vista. Estas colonias son aglomeraciones de bacterias derivadas de una nica clula original, es decir, clones. Para poder trabajar con el material biolgico procedente de estas colonias bacterianas (en nuestro caso el DNA), necesitamos una cantidad grande de clulas de partida, para lo cual procederemos a cultivar estas bacterias inoculando una colonia en un medio lquido de LB-ampicilina en el que las bacterias se replicarn de manera muy eficiente durante toda la noche generando millones de clulas hija. Materiales -tubos de 10 ml de tapn rojo estriles -puntas autoclavadas -medio LB-ampicilina (50!gr/ml) Mtodo 1.- Preparar en condiciones de esterilidad (cerca de la llama y con puntas de 1 ml esterilizadas en el autoclave) un tubo de 10 ml estril que contenga 2 ml de medio LB con ampicilina 50!gr/ml. 2.- Limpiar con etanol la parte blanca y el disparador de metal de una pipeta Gilson (p200).

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3.-Tomar con ayuda de una punta estril y cerca de la llama una pequea porcin de una colonia procedente de la placa Petri que proporcionar el profesor. 4.- Inocular el medio introduciendo la punta dentro del tubo con 2 ml de LBampicilina y pipeteando arriba y abajo dos veces (teniendo cuidado de no tocar las paredes del tubo y de que el medio no llegue a mojar la punta blanda de la pipeta). 2.- Dejar creciendo el cultivo en un bao de agitacin a 37C durante toda la noche.

7.- AISLAMIENTO DE CIDOS NUCLEICOS.

La purificacin de cidos nucleicos se basa en la diferente solubilidad de las macromolculas biolgicas en funcin de la polaridad del disolvente. Vamos a realizar una extraccin de cidos nucleicos de DNA plasmdico de bacterias. El DNA resultante se someter una digestin con enzimas especficos y despus a electroforesis en un gel de agarosa con bromuro de etidio. Los cidos nucleicos se visualizan con luz ultravioleta debido a la fluorescencia del bromuro de etidio que se intercala entre las bases de los cidos nucleicos. Los plsmidos son molculas de DNA de doble cadena, cerradas covalentemente, con un tamao variable de 1-20 kilobases. Se encuentran en una gran variedad de especies bacterianas, funcionando como elementos genticos que se replican, y heredan, de manera independiente del cromosoma bacteriano y que, frecuentemente, contienen genes que confieren a la bacteria resistencia a antibiticos. En esta prctica vamos a purificar DNA plasmdico de una estirpe de la bacteria Escherichia coli. Tras crecer las bacterias toda la noche, el mtodo de purificacin comienza con la destruccin de la pared celular. Seguidamente las clulas son expuestas a la accin de un detergente (dodecil sulfato sdico) y lisadas por tratamiento con sosa. Como consecuencia se produce la desnaturalizacin del DNA cromosmico y de las protenas formndose una matriz insoluble. El DNA circular cerrado del DNA plasmdico no se desnaturaliza a no ser que el tratamiento con sosa sea prolongado. La mezcla se neutraliza con acetato potsico y se centrifuga. El DNA del plsmido queda soluble en el sobrenadante y es precipitado con etanol. Tras centrifugar y eliminar el etanol, el DNA precipitado se resuspende en tampn TE.

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Material y reactivos - 1,5 ml de cultivo bacteriano crecido durante una noche. Todos los reactivos deben esterilizarse por autoclavado o filtracin y se deben manejar posteriormente en condiciones estriles. solucin I: Glucosa 50 mM, EDTA 10 mM, Tris-HCl 25 mM pH 8 solucin II: NaOH 0.2M, SDS al 1% solucin III: (5M de in potasio, 3M de in acetato, pH 4.8) Fenol saturado con tampn Tris-HCl pH 8 Cloroformo. Alcohol isoamlico. Etanol absoluto. Etanol al 70% Tampn TE: EDTA 1mM, pH 8; Tris-HCl 10mM, pH8 Ribonucleasa 10 mg/ml (conservada a -20C). Columnas de microcentrfuga para la purificacin de plsmidos. Tampones de lavado y elucin de las columnas (comerciales)

Mtodo Transferir 1.5 ml de cultivo de bacteria crecido durante toda la noche a un tubo eppendorf y centrifugar en la microfuga durante 1 min. Decantar el sobrenadante y resuspender bien las clulas, con ayuda del vrtex, en 100 !l de solucin I. Aadir 200 !l de solucin II. Mezclar con cuidado, invirtiendo el tubo tres veces (no se debe dejar la preparacin ms de 2-3 min en esta solucin). Aadir 150 !l de solucin III. Mezclar con cuidado e incubar en hielo 5 min. Centrifugar en la microfuga durante 10 min. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y estril. Aadir 0.5 ml de fenol/cloroformo/alcohol isoamlico (50/49/1). Agitar fuertemente, con el tubo bien cerrado, durante 1 min. y volver a centrifugar 3 min. Transferir la fase acuosa a un nuevo tubo y precipitar el DNA plasmdico aadiendo 1 ml de etanol absoluto dejando el tubo 5 min en hielo. Centrifugar 10 min. Eliminar el etanol y lavar el precipitado aadiendo 1 ml de etanol al 70%. Centrifugar de nuevo 3 min. Eliminar el etanol y secar bien el precipitado en una estufa a 37C. Resuspender el DNA en 30 !l de tampn TE con RNAsa a una concentracin de 50 !g/ml. Incubar a 37C durante 30 min. Guardar la muestra a 4C hasta el momento de realizar la electroforesis.

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8.- DIGESTIN DE DNA PLASMDICO POR ENZIMAS DE RESTRICCIN.

Las enzimas de restriccin o endonucleasas de restriccin son protenas que cortan las molculas de DNA especficamente en ciertos nucletidos determinados por la secuencia precisa en la que estos nucletidos se encuentran. Estos enzimas son producidos por muchas especies bacterianas de las que generalmente se deriva su nombre. El hecho de que el corte sea especfico de secuencia, permite la digestin de molculas de DNA en lugares determinados las cuales son utilizadas con posterioridad para introducir dichos fragmentos de DNA en diferentes tipos de vectores, por ejemplo, tras un promotor que dirija su transcripcin a RNA, o tras un gen que codifica para cierta protena generndose as una protena de fusin, etc. Muchas nucleasas de restriccin ya purificadas son hoy en da disponibles comercialmente. En estas prcticas vamos a utilizar la endonucleasa EcoRI (por E. Coli Restriction 1) para digerir el DNA plasmdico que hemos preparado en la prctica anterior con el fin de generar un fragmento de este DNA y separarlo as del resto del DNA perteneciente al vector. Para ello se llevar a cabo la reaccin enzimtica de corte mezclando la enzima (EcoRI) con el sustrato (DNA) e incubando un tiempo suficiente a una temperatura adecuada. El medio ptimo para la catlisis (condiciones de pH y concentracin de sales adecuadas) se consigue aadiendo 1/10 del volumen final de una solucin tampn especfica para cada enzima que se suministra concentrada 10 veces (10x). Material y reactivos -Enzima de restriccin Eco RI (diluida 1/2 del stock a 20 unidades/!l) -Tampn de restriccin para EcoRI (10x) Mtodo En un tubo eppendorff estril (para evitar degradaciones por DNAsas) se mezclarn por este orden: 11 !l de H20 estril 2 !l de tampn para EcoRI 10x 5 !l del DNA plasmdico 2!l de EcoRI recombinante a 10 unidades/!l*

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* Pipetear evitando introducir la punta en la solucin en la que est resuspendida el enzima (tocar slo levemente la superficie para pipetear). As se evita llevarse por fuera de la punta restos de esta suspensin que contiene glicerol el cual puede inhibir la reaccin a concentraciones altas. Por ello lo se suele establecer un mximo de volumen de enzima correspondiente a 1/10 del volumen final de la digestin. Mezclar bien los componentes con el vrtex y dar un pulso con la microfuga (para concentrarlos en el fondo del tubo). Incubar en la estufa de 37C durante al menos 60 min 8 (lo dejaremos toda la noche).

9.- SEPARACIN DE DNA POR ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA.

La agarosa es un polmero lineal que, al fundirlo y dejarlo solidificar de nuevo, forma una matriz cuyo tamao de poro depende de la concentracin de agarosa. Al aplicar una corriente elctrica al gel de agarosa, los cidos nucleicos migran hacia el nodo y se van a separar por tamao. El tamao y la cantidad relativa de los cidos nucleicos se determina por tincin con bromuro de etidio y examen del gel con luz ultravioleta. Material y reactivos - Agarosa y Bromuro de etidio 10mg/ml - Tampn TAE (se prepara a partir de TAE 50x): EDTA 0.01M pH 8; Trisacetato 0.04M - Tampn de carga (10x): Azul de bromofenol al 0.25%; Xilencianol al 0.25%; Glicerol al 30% Mtodo ATENCION: Durante la preparacin y manejo del gel es necesario SIEMPRE el uso de guantes (el bromuro de etidio es un agente cancergeno). Se pesa la cantidad correspondiente de agarosa (utilizaremos un gel de agarosa al 0,8% (p/v)). Se aade a 100 ml de tampn TAE, se calienta la mezcla, agitndola, hasta que se funda completamente la agarosa. Se deja enfriar un poco y se aade bromuro de etidio a una concentracin final de 0,5 !g/ml. 22

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Se mezcla bien y se vierte sobre la placa que va a contener el gel donde hemos colocado el peine con los pocillos. Se deja solidificar al menos durante 30 min. Las muestras que vamos a cargar en el gel son 10 !l de la digestin con EcoRI y 5 !l de la preparacin de DNA plasmdico sin digerir (al que aadiremos 5 !l de H2O estril). Para prepararlas utilizar tubos eppendorff estriles y aadir a cada muestra 2 !l de tampn de carga 6x y mezclando bien. Se introduce la muestra en el pocillo con la pipeta automtica junto a una muestra de marcadores de peso molecular. Correr la electroforesis en tampn TAE a 100 voltios durante 30 min. Una vez terminada la electroforesis, el DNA se visualiza con luz ultravioleta y se analiza mediante un escner digital.

10.- IDENTIFICACIN DE AMINOCIDOS EN LA CASENA MEDIANTE CROMATOGRAFA EN CAPA FINA (TLC).

Las protenas se caracterizan por su composicin y su secuencia de aminocidos. La composicin de aminocidos de una protena viene definida por el porcentaje de cada uno de los que componen la cadena. Para determinar la composicin de aminocidos de una cadena ser necesario: (1) romper la cadena polipeptdica liberando los aminocidos constitutivos, (2) separar los aminocidos resultantes y (3) medir las cantidades de cada aminocido. La ruptura de los enlaces peptdicos, normalmente, se consigue hirviendo la protena en HCl 6N, esto provoca la hidrlisis del enlace y libera los aminocidos, a este proceso se le conoce como hidrlisis cida de las protenas. La separacin y posterior cuantificacin de los aminocidos resultantes puede hacerse por diferentes tcnicas cromatogrficas, siendo la ms frecuente la de intercambio inico. La cromatografa en capa fina se utiliza en el Laboratorio para la determinacin semicuantitativa de aminocidos. CROMATOGRAFA La cromatografa es una de las tcnicas ms tiles para separar los componentes de una mezcla. Se basa en la distribucin relativa de un soluto entre una fase mvil, y una fase estacionaria. La cromatografa en capa fina es un caso particular de cromatografa de reparto donde la fase estacionaria (agua) se adsorbe en el soporte slido, que constituye

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la capa fina, y que podr ser cualquier material que pueda reducirse a polvo y formar una capa uniforme, p. ej. celulosa. Generalmente, la capa tiene un espesor de 0,25-0,5 mm y se extiende sobre una placa de vidrio, plstico o aluminio. La fase mvil (disolvente orgnico saturado de agua) fluye a travs de la fase estacionaria. Los componentes de la mezcla se separarn si sus coeficientes de reparto, K, entre los dos disolventes, son suficientemente distintos. La movilidad de un compuesto respecto a la del disolvente se denomina Rf. Los valores de Rf dependern, obviamente, de la naturaleza del compuesto, del soporte, del disolvente y de la temperatura.

Material y reactivos - Cubetas cromatogrficas. - Placas de capa fina de celulosa de 20 x 10 cm. - Eluyentes cromatogrficos: n-Butanol: acetona: cido actico: agua (35:35:10:20) -Disoluciones patrn de Lys, Phe, Ala, Leu, Val, Gly, Arg, Glu y Pro a una concentracin de 1,6 mg/ml en agua destilada. - Mezcla problema de 4 aas. - Hidrolizado de casena a una concentracin de 5 mg/ml en agua destilada. - Reactivo de tincin: 200 mg de ninhidrina en 100 ml de etanol al 70% Mtodo 1.- Aplicacin de las muestras. Sobre una cromatoplaca de celulosa aplicar 2 !l. de las disoluciones patrn de aminocidos, as como del hidrolizado de caseina, haciendo uso de la plantilla de papel proporcionada. Se cargarn 9 aas: Lys, Phe, Ala, Leu, Val, Gly, Arg, Glu y Pro. Dichas muestras deben ser aplicadas a 1 cm. del borde inferior de la cromatoplaca, y distantes entre s aproximadamente 1 cm. Rotular la cromatoplaca con el nmero de cada investigador en la esquina superior derecha con un lpiz de grafito. Se deja secar la placa a temperatura ambiente antes de proceder al desarrollo cromatogrfico.

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2.- Desarrollo cromatogrfico. Se introduce la placa en el eluyente que constituye la fase mvil (nbutanol: acetona: actico: agua) y se deja correr de forma ascendente hasta que el frente llegue al borde superior de la placa (aproximadamente setenta y cinco minutos). Se deja secar la placa y se repite el proceso para una mejor separacin de los aminocidos. Para obtener Rf reproducibles es imprescindible tener la atmsfera del

tanque saturada con disolvente ya que en caso contrario, puede evaporarse disolvente de la capa fina, aumentando los valores de Rf. Terminado el desarrollo se seca la placa con aire fro hasta la eliminacin total de los disolventes. Se tie por inmersin de la placa en el lquido de tincin durante 1 minuto y se seca en una estufa a 120C hasta la aparicin de las manchas (aproximadamente 5 minutos). Resultados Una vez visualizadas las manchas se calcularn los Rf, y por comparacin con los de los patrones, se proceder a la identificacin de los aminocidos mayoritarios en la casena de la leche y de las muestras problema de las que se calcularn tambin sus Rf.

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