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ESTUDO DE ASSOCIAO DE UMA VARIANTE DO GENE CD40L E O PNFIGO FOLICEO

Carolina Maciel CamargoI, Danielle MalheirosII, Maria Luiza Petzl-ErlerIII

Graduanda do curso de Cincias Biolgicas na Universidade Positivo, Curitiba, PR, Brasil. Doutora em Gentica, professora titular na Universidade Positivo, Curitiba, PR, Brasil. Doutora em Gentica Humana, coordenadora do Laboratrio de Gentica Molecular

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III

Humana, Departamento de Gentica, Universidade Federal do Paran.

Correspondncia: Dra. Danielle Malheiros, Universidade Positivo, Rua Professor Pedro Viriato Parigot de Souza, 5300 - Cidade Industrial, Curitiba, PR, Brasil. E-mail: dani.malheiros@up.com.br.

Palavras-chave: fogo selvagem, CD40L, rs3092945, doena autoimune, estudo de associao caso-controle.

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RESUMO

O pnfigo foliceo (PF) uma doena autoimune endmica no Brasil, de etiologia complexa e pouco conhecida. O gene CD40L, localizado no cromossomo X, codifica a molcula CD40L, expressa principalmente em clulas T CD4+ ativadas e de papel fundamental na resposta imune celular e humoral. Em razo de suas funes, variabilidade e associaes com diversas doenas autoimunes, esse gene candidato a conferir susceptibilidade ao PF. O polimorfismo rs3092345 (-726T>C) est localizado na regio promotora do referido gene e sua associao com o PF j foi encontrada em estudo anterior. O objetivo do presente trabalho foi analisar uma amostra independente de pacientes e controles e subsequentemente reunir esta amostra j genotipada para ampliar o tamanho da amostra. Para tanto, a genotipagem dos pacientes e controles foi feita atravs da tcnica PCR-RFLP. Foram analisados 155 pacientes e 95 controles. Foi observado apenas um aumento no nmero de portadores do alelo T em pacientes (OR = 2,50; P = 0,045). Contudo, quando esta amostra foi reunida amostra j analisada anteriormente, a associao previamente encontrada, de maneira geral, permaneceu. Foi observada uma frequncia maior de alelos T (OR = 1,69; P = 0,030), uma diminuio de C (OR = 0,58), e uma frequncia maior de portadores do alelo T (OR = 4,80; P = 10-3) em pacientes da amostra conjunta de homens e mulheres. A frequncia do alelo T foi maior em homens pacientes do que em controles (OR = 3,34, P = 0,017), e tendncias de associaes foram observadas em mulheres. Diferenas estatisticamente significativas tambm foram encontradas em afrobrasileiros e eurobrasileiros. Os resultados no reproduzem totalmente aqueles do estudo anterior, no entanto, a associao foi confirmada na amostra conjunta. Fica assim demonstrada a importncia do tamanho da amostra para os estudos de associao. Os resultados desse estudo levam-nos a concluir que o polimorfismo analisado tem influncia na patognese do PF.

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INTRODUO

O pnfigo um grupo de dermatoses bolhosas autoimunes, raras e rgo-especficas, cuja manifestao cutnea consiste em vesculas e bolhas na pele (Cunha e Barraviera, 2009). A formao de bolhas ocorre atravs da acantlise (perda de adeso entre os queratincitos), mediada por autoanticorpos patognicos que se acumulam nas superfcies dos queratincitos e so direcionados contra protenas desmossmicas, as desmoglenas (Dsg) (Martel e Joly, 2001; Gonalves et al., 2011). No pnfigo foliceo, o antgeno reconhecido a Dsg1. A doena ocorre no mundo todo, mas sua forma endmica o pnfigo foliceo endmico (PF) ou fogo selvagem ocorre no Brasil, alm de outros pases, porm aqui apresenta sua maior incidncia (Campbell et al., 2001; Qian et al., 2012). A etiologia do PF ainda obscura, mas a agregao temporal e geogrfica da doena sugere que a exposio recorrente a determinados fatores ambientais crucial para o seu desenvolvimento (Diaz et al., 2008). A exposio a picadas de insetos hematfagos parece estar envolvida com a etiologia do PF: Lutzomyia longipalpis (mosquito palha), reduvideos (barbeiros) e simuldeos (borrachudos) (Qian et al., 2012). A etiologia do PF (fig. 1) parece ocorrer em duas fases. Foi proposto que, em um primeiro estgio, um antgeno ambiental que possui uma sequncia semelhante ao domnio EC5 da Dsg1 desencadeia uma resposta no patognica Dsg1. Nessa fase, o indivduo no apresenta leses cutneas. A seguir, em certos indivduos que apresentam susceptibilidade gentica, ocorre o fenmeno de espalhamento intramolecular de eptopos, atravs do qual algum dano tecidual acaba por expor eptopos ou ainda antgenos diferentes daqueles que geraram a resposta no patognica inicial, e que antes no eram detectados pelo sistema imune, levando produo de autoanticorpos anti-Dsg1 direcionados contra aos domnios EC1 e EC2 e induzindo a acantlise (Culton et al., 2008).

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Para aqueles que acabam por desenvolver a doena, o perodo entre as duas fases pode durar at 10 anos (Qaqish et al., 2009). O PF uma das poucas doenas autoimunes nas quais apenas a interao entre o autoanticorpo com o antgeno capaz de originar todos os sintomas (Hans-Filho et al., 1999). Pacientes com pnfigo apresentam depsitos intercelulares de imunoglobulinas,

predominantemente IgG4, mas tambm IgG1, IgG2, IgE e IgM, nas membranas dos queratincitos (Aoki et al., 2005; Calvanico et al., 1991; Qian et al., 2011), juntamente com depsitos de complemento, especialmente C3 (Martel e Joly, 2001). A resposta celular tambm essencial na patogenia do PF j que as clulas B, no estgio da produo de autoanticorpos, requerem a interao com clulas T auxiliares CD4+, especialmente do tipo Th2 (Culton et al., 2008; Lin et al.,2000). Esse fato foi confirmado por Lin et al. (2000), que demonstraram que linfcitos T CD4+, os responsveis por regular a produo de anticorpos, proliferam e apresentam uma resposta antgeno-especfica restrita ao HLA-DR e direcionada ao Dsg1 em pacientes com PF. Aproximadamente 18% dos casos de pacientes com PF so familiares, e a agregao familial evidencia a importncia de fatores genticos no desenvolvimento da doena (Castro e Proena, 1983). Alelos de genes do complexo MHC esto diretamente associados com o PF e doenas autoimunes em geral. Os produtos dos alelos associados a maior susceptibilidade poderiam facilmente interagir e apresentar autoantgenos, iniciando assim uma resposta de clulas T autorreativas. Alternativamente, poderiam falhar na induo de tolerncia central ou perifrica. Molculas HLA classe II, por exemplo, possuem pockets que interagem com aminocidos de peptdeos ligantes. Polimorfismos das molculas HLA II, portanto, podem alterar esses stios de ligao e, assim, os produtos de diferentes alelos ligam conjuntos diferentes de antgenos exgenos e de autoantgenos (Tron et al., 2005). H comprovada

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associao entre o PF e alelos de HLA-DRB1. Foi proposto que os produtos dos alelos associados susceptibilidade aumentada compartilham um eptopo representado pela sequncia de aminocidos LLEQRRAA nas posies 67-74 no terceiro domnio hipervarivel da molcula, o que sugere que a herana dessa sequncia esteja envolvida com o desenvolvimento da doena (Moraes et al., 1997). Entretanto, essa hiptese no foi corroborada em outro estudo (Pavoni et al., 2003). Com relao a outros genes, j foram encontradas associaes de variantes genticas de interleucina 6 (IL6), interleucina 4 (IL4) (Pereira et al., 2004), morte celular programada 1 (PDCD1) (Braun-Prado e Petzl-Erler, 2007), CD40, CD40L e BLYS (Malheiros e Petzl-Erler, 2009), CD86, CTLA4 e CD28 (Dalla-Costa et al., 2010) com o PF. Associaes no foram encontradas com fator de necrose tumoral (TNF), linfotoxina alfa (LTA) (Roxo et al., 2003), antgeno 4 de linfcito T citotxico (CTLA4) (Pavoni et al., 2006), BAX e TP53 (Kohler e Petzl-Erler, 2006) e desmoglena 1 (DSG1) (Petzl-Erler e Malheiros, 2005). O gene que codifica CD40L, o ligante de CD40 (tambm chamado CD40L, CD154, TRAP, TNFSF5 ou CD40LG), um candidato a susceptibilidade para doenas autoimunes, devido ao papel essencial que apresenta nas respostas imunes. Em humanos, ele est localizado no cromossomo X, posio Xq26-Xq27, composto de 12-13 kb, e contm em 5 xons e 4 ntrons (van Kooten e Banchereau, 2000). A molcula CD40L um potente mediador da resposta inflamatria. Pertence superfamlia TNF, e pode ocorrer como protena transmembrana ou na forma solvel, o que evidencia as suas funes de citocina (Vaitaitis e Wagner, 2010). A molcula expressa principalmente em clulas T auxiliares CD4+ ativadas, e em menor escala em CD8+. Pode tambm ser encontrada em plaquetas, macrfagos, basfilos, eosinfilos, clulas natural killers e moncitos, entre outros (Vaitaitis e Wagner, 2010). A molcula CD40 expressa em linfcitos B, clulas dendrticas, macrfagos, e em clulas no hematopoiticas, tais como

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queratincitos e fibroblastos (Malheiros e Petzl-Erler, 2009). Enquanto a expresso de CD40 constitutiva, CD40L expressa somente aps a interao do MHC de classe II com o receptor da clula T e a ativao da clula T. A expresso de CD40L tambm autorregulada pela prpria ligao do ligante com seu receptor (Thusberg e Vihinen, 2007). A interao entre clulas T e B, mediada pela ligao de CD40 e CD40L, desencadeia o sinal coestimulatrio que induz a proliferao e diferenciao das clulas B, mudanas de classe das imunoglobulinas, secreo de anticorpos, preveno da apoptose das clulas B do centro germinativo, maturao de afinidade, gerao de clulas B de memria e produo de IL-2 pelos dendrcitos (Lobo et al., 2000; Malheiros e Petzl-Erler, 2009). A molcula CD40L est relacionada a vrias doenas autoimunes, tais como lpus, diabetes tipo 1, artrite reumatoide e pnfigo (Goules et al., 2006; Caproni et al., 2007). Associaes entre variantes de CD40L com a susceptibilidade ao PF foram observadas por Malheiros e Petzl-Erler (2009). Anlises do SNP -726T>C (rs3092945) demonstraram que este polimorfismo est associado fortemente com susceptibilidade ao PF. O objetivo desse trabalho foi analisar uma amostra independente, ampliar a amostra inicialmente analisada e refazer a anlise de associao caso-controle do polimorfismo com o PF.

MATERIAIS E MTODOS

Amostra Uma amostra constituda de 186 pacientes com PF e 105 indivduos controle foi genotipada para esse estudo. Entretanto, por razes de pareamento de estratos populacionais que sero abordadas posteriormente, para as anlises foram utilizados 155 pacientes e 95 controles - amostra esta que foi somada quela anteriormente analisada por Malheiros e PetzlErler (2009), composta por 150 pacientes e 167 controles. Indivduos consanguneos, que

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apresentavam outras doenas autoimunes e/ou aqueles com informaes faltantes ou incompletas sobre etnia ou sexo foram excludos da amostra. A coleta de sangue dos pacientes foi realizada principalmente no Hospital Adventista do Pnfigo de Campo Grande, MS. Os indivduos controle analisados so residentes nas proximidades das regies endmicas do PF. A coleta de sangue desses indivduos foi realizada, em grande parte, no Hospital Adventista do Pnfigo (Campo Grande, MS). As coletas de sangue foram acompanhadas de uma extensa averiguao clnica e pessoal de pacientes e controles, realizada atravs de entrevistas. Todos os indivduos assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, aps terem recebido informaes sobre os objetivos da pesquisa. Os pacientes includos no estudo foram diagnosticados com pnfigo foliceo atravs de critrios clnicos e histolgicos. A amostra bastante diversificada em relao aos grupos tnicos que a compem. Portanto, os indivduos foram classificados segundo a sua origem: eurobrasileiros (EU, de ascendncia predominantemente europeia), amostra composta por 83 pacientes e 57 controles; afrobrasileiros (AF), sendo 29 pacientes e pacientes e 13 controles; e mulatos claros (MC), amostra composta de 43 pacientes e 25 controles. Hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh Extrao de DNA O DNA dos indivduos j havia sido obtido atravs da tcnica de extrao que utiliza fenol-clorofrmio-lcool isoamlico (FCI) (Sambrook et al., 1989), e as amostras encontramse armazenadas sob condies adequadas no Laboratrio de Gentica Molecular Humana (LGMH) da Universidade Federal do Paran. A concentrao de uso de todas as amostras foi ajustada para 20 g/ml.

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Genotipagem O polimorfismo investigado est localizado na regio promotora do gene CD40L, mais especificamente na posio -726T>C. Toda a parte prtica do estudo foi realizada no Laboratrio de Gentica Molecular Humana da Universidade Federal do Paran. A genotipagem do SNP (Single Nucleotide Polymorphism) -726T>C (rs3092945) foi realizada atravs da tcnica PCR-RFLP (PCR - polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrio). Atravs dessa tcnica, o fragmento que contm a posio varivel amplificado por PCR e, em seguida, o mesmo submetido a uma digesto com enzima de restrio LweI, cujo stio de clivagem (5'GCATC3') abrange a posio polimrfica -726T>C. Os tamanhos esperados do produto de PCR, bem como aqueles dos fragmentos resultantes aps a digesto, so mostrados na figura 2. Os oligonucleotdeos iniciadores utilizados nas amplificaes foram a montante 5 ATCTTCACAGCAACCTAC 3, e a juzante 5 CACTAAACTCAATGAAAGCC 3 (Malheiros e Petzl-Erler, 2009). A reao de PCR compunha-se de 0,04 g de DNA; 0,6 M de cada oligonucleotdeo iniciador; tampo 1X (comercial, provido com a Taq polimerase Fermentas); 2 mM de MgCl2; 0,2 mM de cada dNTP; 0,5 U de Taq Polimerase; e gua ultrapura q.s.p. para 10 l. As amplificaes foram realizadas segundo a seguinte ciclagem: desnaturao inicial por 3 minutos temperatura de 95C, seguida de 35 ciclos de desnaturao por 15 segundos a 95C, anelamento por 30 segundos a 56C, extenso a 72C por 40 segundos e, por fim, uma etapa de alongamento por 5 minutos a 72C e 5 minutos a 10C para o resfriamento. A qualidade das amplificaes foi verificada atravs de eletroforese em gel de agarose 1%, a 100 V durante 40 minutos. Posteriormente, os amplicons foram submetidos digesto, segundo a seguinte reao: 2 l de produto de PCR; 0,3 U de enzima de restrio LweI; tampo 1X (comercial, provido

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com a enzima de restrio) e gua ultrapura q.s.p. para completar 6,0 l. Para que a clivagem dos amplicons ocorresse, a mistura foi submetida a uma temperatura de 37C por 2 horas. O produto da digesto foi ento misturado ao corante (tampo de carregamento e GelRed) e submetido a uma corrida eletrofortica em gel de agarose 3%, a uma voltagem de 95 V durante 1 hora e 30 minutos. O padro de bandas obtido segundo a metodologia descrita acima pode ser observado na figura 3.

Anlise estatstica As frequncias genotpicas, allicas e de indivduos portadores foram determinadas atravs de contagem direta, e foram comparadas entre pacientes e controles atravs do teste exato de Fisher em tabelas de contingncia 2X2. Todas as anlises foram realizadas para homens e mulheres separadamente. Anlises comparativas entre os diferentes estratos e amostras populacionais foram realizadas da mesma forma. Foram considerados

estatisticamente significantes os valores de P inferiores a 0,05, indicando associao da variante com a doena ou diferena significativa entre amostras populacionais. As anlises estatsticas foram realizadas atravs do programa computacional GraphPad Prism 6. O equilbrio de Hardy-Weinberg para a distribuio de gentipos foi estimado com o programa Hardy-Weinberg Calculator (Court, 2005-2008). Para cada alelo foi estimada uma razo de chances (OR), obtida pelo mtodo de Woolf (Woolf, 1955) e utilizando-se o programa computacional GraphPad Prism 6. Os valores da OR refletem o risco relativo (RR) quando se estudam caractersticas raras, como o caso desse estudo. Portanto, os valores da OR representam a chance que um portador de um determinado polimorfismo gentico tem de desenvolver certa patologia em relao mesma chance de um indivduo que no possui aquela variante. Uma OR de valor 1 indica que as

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223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247

chances de um portador de desenvolver a patologia so as mesmas de um no portador. ORs maiores de 1 significam que as chance de desenvolver a doena so maiores para os portadores do alelo e valores abaixo de 1 indicam uma menor chance.

RESULTADOS

O gene CD40L est localizado no cromossomo X e, portanto, todas as frequncias e anlises de interesse foram calculadas para homens e mulheres separadamente. Todas as amostras foram inicialmente subdivididas em eurobrasileiros (EU), mulatos claros (MC) e afrobrasileiros (negros e mulatos mdios e escuros, AF). Na amostra genotipada para esse estudo, os estratos MC e AF foram unidos em um nico subgrupo denominado AFRO, sem prvios testes de homogeneidade, considerando-se que o tamanho da subamostra AF era muito pequeno (apenas 29 pacientes e 13 controles). Os estratos populacionais AFRO e EU foram comparados atravs de um teste de homogeneidade para avaliar se estas etnias poderiam ser analisadas em conjunto. No houve diferena significativa entre esses estratos em pacientes (P = 0,074) ou em controles (P = 1,000) e, portanto, as amostras foram agrupadas em uma amostra total. Ajustes foram realizados em homens e mulheres da amostra total e dentro do subgrupo AFRO para que as quantidades de indivduos pertencentes s diferentes ancestralidades fossem proporcionais nas amostras de pacientes e controles. Pacientes e controles da amostra total e de ambos os subgrupos (AFRO e EU) encontram-se em equilbrio de Hardy-Weinberg (HW). Foram comparadas, entre pacientes e controles da amostra total (tabela 1), as frequncias allicas, genotpicas e de indivduos portadores das variantes allicas. H uma maior quantidade de portadores do alelo T em pacientes (OR = 2,50; P = 0,045). No foram

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encontradas outras diferenas estatisticamente significantes entre pacientes e controles dessa amostra. Todas as subamostras encontram-se em equilbrio de Hardy-Weinberg (HW). Anlises realizadas nas subamostras EU e AFRO tambm no mostraram diferenas significativas entre pacientes e controles. No estudo realizado por Malheiros e Petzl-Erler (2009), 150 pacientes e 167 controles haviam sido genotipados. Para assegurar a qualidade das genotipagens, foi realizada uma tipagem confirmatria de 45 dos 54 indivduos que apresentavam gentipo T/C, C/C ou C. Nesta retipagem, o gentipo de 27 indivduos foi confirmado. Dos restantes, 14 tinham sido genotipados anteriormente como T/C, mas foram alterados para T/T; 3 eram C/C mas foram retipados como T/C e 1 homem teve seu gentipo alterado de C para T. Deste modo, as frequncias allicas e de portadores dos alelos foram calculadas novamente para todos os estratos populacionais. O subgrupo AF foi unido ao MC em um subgrupo AFRO, j que o primeiro era muito pequeno (29 pacientes e 24 controles) para que testes de homogeneidade fossem realizados. Os subgrupos no se mostraram homogneos para que as amostras pudessem ser reunidas em uma nica amostra total. Contudo, como possivelmente a diferena entre frica e Europa significativa (com base nos resultados dos estudos populacionais citados adiante, na Discusso), justifica-se a unio dos estratos em uma amostra total, mesmo sem a realizao de testes de homogeneidade, desde que sejam feitos ajustes das propores dos diferentes estratos. As propores tambm foram ajustadas no subgrupo AFRO. Todas as amostras encontram-se em equilbrio de HW. Os resultados das anlises da amostra total so mostrados na tabela 2. Foram encontradas diferenas estatisticamente significativas entre pacientes e controles. Na amostra conjunta de homens e mulheres pacientes, h um aumento da frequncia de alelos T (OR = 2,66; P = 0,005), e diminuio de C (OR = 0,37). Este efeito provavelmente causado pela

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273 274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 284 285 286 287 288 289 290 291 292 293 294 295 296

frequncia aumentada de homens hemizigotos T (OR = 10,71; P = 0,009) em pacientes, e diminuio da frequncia de homens C tambm em pacientes (OR = 0,09). Pelo mesmo motivo, h um aumento significativo de portadores de T em pacientes da amostra conjunta de homens e mulheres (OR = 2,81; P = 0,001), e uma tendncia de diminuio do nmero de portadores de C em pacientes (OR = 0,49; P = 0,061). Em eurobrasileiros (tabela 3) da amostra de Malheiros e Petzl-Erler (2009), h um aumento significativo na freqncia de alelos T (OR = 3,02; P = 0,021), assim como uma diminuio na freqncia de alelos C (OR = 0,33) em pacientes. Os portadores do alelo T so mais frequentes em pacientes (OR = 16,88; P = 0,004). Essas associaes na amostra conjunta de homens e mulheres refletem as associaes encontradas em homens, nos quais h um aumento de alelos T (OR = 10,87; P = 0,040) e uma diminuio de alelos C (OR = 0,09) em pacientes, sendo que nenhuma associao foi encontrada em mulheres. As frequncias allicas, genotpicas e de indivduos portadores dos diferentes alelos da amostra AFRO de Malheiros e Petzl-Erler esto descritas na tabela 4. H um aumento estatisticamente significativo do nmero de portadores do alelo T (OR = 3,03; P = 0,017) em pacientes. No foram diferenas significativas nas outras comparaes. Testes de homogeneidade foram feitos entre todos os estratos da amostra genotipada para este estudo com os estratos da amostra analisada anteriormente. Os subgrupos EU foram homogneos em pacientes e controles, ao contrrio de AFRO em controles (P = 0,04). Entretanto, como todos os indivduos so teoricamente pertencentes a uma mesma amostra, esses estratos tambm foram analisados conjuntamente. Apesar de os estratos totais EU e AFRO no apresentarem homogeneidade, esses subgrupos foram unidos em uma nica amostra, o que se justifica devido s diferenas significativas entre africanos e europeus (ver acima na linha 265). Ajustes foram realizados em homens e mulheres para que a quantidade

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de indivduos de diferentes ancestralidades fosse proporcional em pacientes e controles das amostras total e AFRO. As frequncias allicas, genotpicas e de indivduos portadores dos diferentes alelos da amostra total esto descritas na tabela 5. Pacientes e controles encontram-se em equilbrio de HW. Diferenas significativas foram encontradas nas frequncias allicas, genotpicas e de portadores da amostra conjunta de homens e mulheres e nos homens. A frequncia do alelo T maior em homens pacientes (OR = 3,34, P = 0,017), e a frequncia do alelo C, por sua vez, menor em pacientes (OR = 0,29). Tambm foi observada uma maior frequncia de alelos T (OR = 1,69; P = 0,030) e um decrscimo de alelos C (OR = 0,58) em pacientes da amostra conjunta de homens e mulheres. Devido a esses resultados, a quantidade de portadores de T significativamente maior em pacientes do que em controles (OR = 4,80, P10-3). Apesar de no terem sido encontradas diferenas estatisticamente significantes para mulheres, existem tendncias de um aumento do nmero de portadoras do alelo T em pacientes (OR = 6,76; P = 0,070). As anlises dos subgrupos AFRO das duas amostras podem ser observadas na tabela 6. H um aumento do nmero de portadores do alelo T em pacientes (OR = 3,84; P = 0,021) da amostra conjunta de homens e mulheres. Isso efeito do aumento de homens hemizigotos para o alelo T em pacientes (OR = 4,53; P = 0,038), acompanhado de uma diminuio de homens de gentipo C em pacientes (OR = 0,22). No houve diferenas significativas entre as mulheres. Pacientes e controles encontram-se em equilbrio de HW. Diferenas estatisticamente significativas tambm foram encontradas nos

eurobrasileiros da amostra conjunta (tabela 7). H um aumento significativo na freqncia do alelo T (OR = 2,28; P = 0,015) e uma diminuio da freqncia de alelos C (OR = 0,44). Tambm h um aumento do nmero de portadores do alelo T em pacientes (OR = 5,97; P = 0,010). No foi encontrada qualquer associao do polimorfismo em homens, mas h uma

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tendncia de associao negativa do gentipo C/C com a doena em mulheres (OR = 0,10; P = 0,074). H tambm tendncias de aumento da freqncia do alelo T (OR = 2,17; P = 0,057) e de diminuio da freqncia de alelos C em pacientes mulheres (OR = 46). A amostra de mulheres controles est fora do equilbrio de HW (HW = 0,038), porm o valor est prximo ao limiar.

DISCUSSO

Consideraes sobre a composio da amostra O tamanho das amostras de pacientes e de indivduos controle um importante indicador de qualidade de um estudo de associao. Tendo conscincia desse fato, os indivduos genotipados nesse trabalho foram analisados independentemente e conjuntamente com a amostra previamente analisada por Malheiros e Petzl-Erler (2009). Ainda assim, o tamanho amostral no o ideal para estudos de associao com gentipos ou alelos pouco frequentes na populao. Contudo, deve-se levar em conta que o PF uma doena rara e, deste modo, o tamanho das amostras do nosso estudo considervel. Alm disso, estudos iniciais, mesmo com falta de significncia estatstica, podem indicar possveis tendncias que podem ser reproduzidas em estudos posteriores. A escolha de quais populaes sero amostradas tambm um fator importante, pois uma das principais fontes de resultados esprios em anlises de associao a estratificao populacional (Balding, 2006), que ocorre quando casos e controles apresentam frequncias allicas distintas devido a diferentes ancestralidades (Cardon e Palmer, 2003). Para que uma falsa associao seja encontrada em razo da estratificao populacional, duas condies devem ser atendidas: 1) a frequncia do alelo de interesse deve variar substancialmente entre os estratos, e 2) a prevalncia da doena deve tambm variar nas diferentes etnias (Marchini

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347 348 349 350 351 352 353 354 355 356 357 358 359 360 361 362 363 364 365 366 367 368 369 370 371

et al., 2004). Para evitar falsos resultados e com o objetivo de efetuar as anlises de associao nos diferentes estratos, a amostra foi inicialmente subdividida em trs subgrupos: um com indivduos de origem predominantemente europeia (EU), outro com indivduos mestios de origem predominantemente africana (AF) e um terceiro composto por indivduos tambm mestios, mas com predominncia de ancestralidade europeia (MC).

Consideraes sobre a qualidade das genotipagens A tcnica utilizada para genotipagem foi PCR-RFLP, e possveis erros inerentes a essa tcnica so: digesto parcial do amplicon pela enzima de restrio e erros de leitura ou de interpretao. Para mitigar tais erros, as seguintes medidas foram tomadas. (1) Em todas as digestes, foram includos no mnimo trs indivduos de gentipos j conhecidos (um homozigoto para o alelo T, um homozigoto para o alelo C e um heterozigoto). (2) Foi feita a tipagem cega de 20 indivduos, cujos gentipos eram desconhecidos no momento da digesto, e depois comparados por outro pesquisador no banco de dados do laboratrio; todos os 20 gentipos (T/T) foram confirmados para o SNP em questo. (3) Para evitar erros de genotipagem devido digesto parcial, todos os indivduos heterozigotos T/C e homo e hemizigotos C/C e C foram genotipados no mnimo trs vezes.

Consideraes sobre a anlise da posio -726 T>C Polimorfismos de CD40L vm sendo associados a diversas doenas que envolvem o sistema imunitrio. At o ano de 1999, eram conhecidas pouco mais de 74 mutaes desse gene, muito heterogneas entre si e com diferentes resultados na funcionalidade e estrutura da molcula (Garber et al., 1999). Alelos deletrios que causam a falha na expresso de protenas CD40L funcionais so a causa da sndrome do hiper-IgM ligada ao X, uma imunodeficincia causada pela no

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372 373 374 375 376 377 378 379 380 381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 392 393 394 395 396

produo de IgG, IgA e IgE (Thusberg e Vihinen, 2007). A superexpresso de CD40L est relacionada com diversas doenas autoimunes, tais como lpus, diabetes tipo 1 e artrite reumatoide (Goules et al., 2006; Caproni et al., 2007). Lleo et al.(2012) demonstraram que pacientes com cirrose primria biliar tm menores nveis de DNA metilado no promotor do gene CD40L em clulas T CD4+, o que resulta em superexpresso da molcula transcrita. Um SNP localizado no ntron 4 do gene CD40L foi analisado em populaes asiticas e est associado positivamente com a ocorrncia da doena de Kawasaki, uma vasculite imunolgica que atinge jovens e crianas (Onouchi et al., 2004). A superexpresso de CD40L observada nesses pacientes pode levar superestimulao de CD40, assim estabelecendo e perpetuando o desenvolvimento da doena (Vaitaitis e Wagner, 2010). Existem tambm evidncias de participao do sistema CD40-CD40L na patognese do pnfigo. Caproni et al. (2007) demonstraram que o nmero de clulas CD40+ e CD40L+ infiltrantes na derme, de cpias de RNAm de CD40L e de quantidade de CD40L solvel em pacientes com pnfigo vulgar (PV) e PF maior do que nos controles. Segundo Aoki-Ota et al. (2006), administrao de anticorpos anti-CD40L no inicio do desenvolvimento de PV em camundongos foi o bastante para inibir a produo de autoanticorpos anti-Dsg3. Estes estudos (Caproni et al., 2007; Aoki-Ota et al., 2006; Malheiros e Petzl-Erler, 2009) sugerem que a interao CD40-CD40L seja crucial nos processos imunolgicos que precedem sntese de autoanticorpos no pnfigo. A interao das clulas T CD40L+ com dendrcitos CD40+ necessria para iniciar a funo da clula T e subsequente ativao da resposta imune humoral dependente de clulas T, levando proliferao e diferenciao das clulas B. Alm disso, a ativao de queratincitos e clulas endoteliais pelo CD40L pode levar superexpresso de molculas de adeso e produo de mediadores parcrinos, como quimiocinas e citocinas, assim aumentando a resposta inflamatria. Queratincitos e clulas endoteliais, quando ativadas, podem secretar IL-1, IL-6, TNF- e xido ntrico, mediadores

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397 398 399 400 401 402 403 404 405 406 407 408 409 410 411 412 413 414 415 416 417 418 419 420 421

qumicos que podem contribuir com a acantlise (Caproni et al., 2007). No pnfigo, ocorre tambm uma superexpresso de CD40L solvel em pacientes. O CD40L solvel produzido por clulas T ativadas, e pode mediar a produo de anticorpos ao se ligar ao receptor CD40 em clulas B em linfonodos e outros tecidos, e atuar como citocina em clulas epiteliais, aumentando a apresentao de antgenos no epitlio (Goules et al., 2006). A expresso da molcula CD40L em clulas T regulada de acordo com o estgio de desenvolvimento das clulas o ligante expresso em clulas T maduras ativadas, simples positivas, e quase que exclusivamente em clulas T CD4+ (Lobo et al., 2000). Essa regulao da expresso de CD40L sugere que polimorfismos nas regies regulatrias 5 e 3 podem ser importantes na resposta imune (Malheiros e Petzl-Erler, 2009). O conhecimento das regies regulatrias do promotor do gene CD40L de grande importncia para a compreenso da sequncia de eventos que levam produo de citocinas em estgios inflamatrios iniciais. Esses fatores motivaram o estudo do polimorfismo -726T>C. Alteraes em nucleotdeos em uma regio promotora podem mudar a prpria conformao do promotor, incluindo seus elementos regulatrios, afetar a ligao de fatores de transcrio, e regular a expresso gnica (Crow e Yixin, 2001). Steiper et al. (2008) evidenciou a importncia da regio promotora do CD40L ao comparar a sua sequncia entre vrias espcies de mamferos, e descobriu que diversas regies no promotor do gene CD40L so altamente conservadas. A regulao do transcrito do gene CD40L pode ocorrer atravs do reconhecimento de sequncias na regio promotora do gene por intermdio de vrios elementos NF-AT, EGR, AP-1, NF-kB, AKNA, e TFE3/TFEB (Steiper et al., 2008). O fator de transcrio NF-AT tem um papel essencial na transcrio de citocinas e fatores de transcrio expressos em clulas T logo aps sua estimulao. Na regio 5 do gene CD40L, existem trs stios de ligao de fatores de transcrio NF-AT, localizados em -62 a -69, -258 a -265 e -761 a -756 a montante

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422 423 424 425 426 427 428 429 430 431 432 433 434 435 436 437 438 439 440 441 442 443 444 445 446

do stio de incio de transcrio. O mais distal tem o maior efeito entre os trs na regulao da transcrio de CD40L (Lobo et al., 2000). Steiper et al.(2008) demonstrou que esse stio de ligao de 6 pb conservado em todos os primatas, o que evidencia ainda mais a importncia dessa regio. Essa a nica regio regulatria conhecida que fica perto da regio da variante 726T>C (Cron, 2003). Porm, no existem evidncias de que esse polimorfismo mude a afinidade com esses fatores de transcrio. No existem muitas informaes sobre a frequncia da variante CD40L -726T>C em populaes mundiais. A frequncia allica de -726C em controles eurobrasileiros observada nesse estudo (10,5%) mais alta do que aquela descrita pelo projeto HapMap em duas amostras de eurodescendentes (5% e 2,8%). Contudo, ambas as amostra descritas pelo HapMap esto fora do equilbrio de Hardy-Weinberg, e a amostra de eurodescendentes analisada neste estudo no composta por europeus, mas por indivduos miscigenados com origem predominantemente europeia. A frequncia do alelo C observada no presente estudo (18%) prxima quela encontrada na amostra de controles afrobrasileiros (N = 4101) analisada por Ndila (2009) (C = 22,6%), da amostra de afrodescendentes disponvel no HapMap, na qual a frequncia do alelo C de 31%. De modo geral, observando as frequncias allicas de -726C descritas em amostras europeias pelo projeto HapMap e em amostras africanas descritas pelo HapMap e por Ndila (2009), h uma tendncia no aumento da frequncia do alelo C em africanos em comparao com europeus. Essa diferena foi corroborada pelo presente estudo. Estudos sobre associaes do polimorfismo deste gene com doenas tambm so escassos. Sabeti et al. (2002) encontraram uma pequena e significante reduo no risco para a malria (OR=0,52; P=0,002) em homens hemizigotos para o alelo -726C, e uma tendncia associao foi encontrada para as mulheres. Ndila (2009) encontrou tambm forte evidncia de proteo contra a malria exercida pelo alelo C do polimorfismo rs3092945 (OR=0,65,

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447 448 449 450 451 452 453 454 455 456 457 458 459 460 461 462 463 464 465 466 467 468 469 470 471

P=3,4x10-8). Manjurano et al. (2012) encontrou um aumento significativo do gentipo T/T em relao a T/C e C/C em pacientes de malria do sexo feminino (OR = 5,27; P = 0,01), mas no encontrou a associao em homens. At o momento, outras anlises desse SNP e associao com doenas so inexistentes. No PF, a frequncia do alelo T est aumentada em pacientes, enquanto que o oposto ocorre com o alelo C e, portanto, o risco de PF diminui pela presena do alelo C. Malheiros e Petzl-Erler (2009) descreveram associao do polimorfismo com o PF em mulheres e homens da amostra total. A frequncia do alelo T estava aumentada (OR = 3,65), acompanhada de um decrscimo do alelo C (OR = 0,27; P = 10-6) em pacientes. Aps a tipagem confirmatria e alterao dos gentipos de alguns indivduos, as anlises foram refeitas na amostra total, de eurobrasileiros e de afrobrasileiros. A associao permaneceu nas amostras conjuntas de homens e mulheres e em homens da amostra total e de eurobrasileiros, mas desapareceu em mulheres em ambos os casos, apesar de existirem tendncias de associao em mulheres eurobrasileiras. Na amostra conjunta de homens e mulheres da amostra total, a frequncia do alelo T est aumentada (OR = 2,66) e a de C diminuda (OR = 0,37; P = 0,005) em pacientes. Na amostra de indivduos genotipados para esse estudo, foram encontradas diferenas estatisticamente significantes em relao ao aumento do nmero de portadores do alelo T em pacientes. Alm disso, as frequncias allicas, genotpicas e de portadores mantiveram-se no sentido do aumento da frequncia do alelo T em pacientes quando comparados aos controles, o que pode ser observado na amostra de homens, mulheres e amostra conjunta de homens e mulheres. A no reprodutibilidade total do estudo, porm, no significa que a associao no verdadeira, especialmente se o efeito gentico da variante for fraco. Normalmente, estudos de associao com pequeno tamanho amostral no tm poder suficiente para detectar pequenos efeitos (Hirschhorn et al., 2002), o que pode ser o caso deste estudo. Portanto, provavelmente o limitado tamanho da amostra do presente estudo influenciou a no

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472 473 474 475 476 477 478 479 480 481 482 483 484 485 486 487 488 489 490 491 492 493 494 495 496

observncia de diferenas estatisticamente significativas entre pacientes e controles (exceto pelo nmero de portadores do alelo T que foi significativamente maior em pacientes). Desta maneira, fica evidenciada a importncia deste trabalho no que concerne ao aumento do nmero amostral analisado para esta variante. A associao encontrada por Malheiros e Petzl-Erler (2009) foi confirmada com a anlise conjunta das amostras do estudo anterior e deste estudo. Foram observadas diferenas estatisticamente significativas em homens afrobrasileiros e da amostra total, e nas amostras conjuntas de homens e mulheres da amostra total e das subamostras de eurobrasileiros e afrobrasileiros. Foram encontradas tendncias de associao em mulheres de origem predominantemente europia e da amostra total. Os resultados so similares queles de Sabeti et al. (2002), que encontrou significante reduo no risco para a malria em homens C+, e tendncias de associao em mulheres. Em suma, os resultados levam-nos a concluir que o polimorfismo analisado influencia a susceptibilidade/resistncia ao PF. possvel que isso seja efeito do aumento de afinidade que o polimorfismo rs3092945 exerce entre os fatores de transcrio e seus stios de ligao que se localizam na regio promotora do gene CD40L, aumentando a expresso dessa molcula e propiciando um aumento da resposta inflamatria e da resposta imune humoral na patogenia do PF. O polimorfismo rs3092945 poderia tambm estar em desequilbrio de ligao (LD) com o marcador gentico que realmente apresenta associao com a susceptibilidade ao pnfigo. Possivelmente, como sugerido para a malria, as associaes seguem um modelo de herana cujo poder de deteco mais limitado em mulheres, ou poderia haver diferena real entre homens e mulheres no efeito biolgico do alelo (Sabeti et al.,2002), o que explicaria os resultados distintos observados em homens e mulheres.

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497 498 499 500 501 502 503 504 505 506 507 508 509 510 511 512 513 514 515 516 517 518 519 520

AGRADECIMENTOS

Universidade Federal do Paran, ao LGMH, e Universidade Positivo pelo apoio financeiro.

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28

669 670 671 672 673 674 675 676 677 678 679 680 681 682 683 684 685 686 687 688 689 690 691 692 693

Vaitaitis GM e Wagner Jr DH (2010) CD40 glycoforms and TNF-receptors 1 and 2 in the formation of CD40 receptor(s) in autoimmunity. Mol Immunol 47:2303-2313.

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29

694

Figura 1. Etiopatogenia do FS (AOKI et al., 2008).

695 696 697 698 699 700 701

Figura 2. Localizao da posio varivel 726C>T no fragmento amplificado por PCR, mostrando que o alelo T clivado pela enzima de restrio, originando dois fragmentos. O perfil eletrofortico esperado para os trs gentipos : 447 bp (pares de bases) para o gentipo C/C; 196 e 251 bp para o gentipo T/T e 196, 251 e 447 bp para o gentipo T/C. *Stio de restrio.

702 703 704 705 706

30

707 708 709

Figura 3. Padro de bandas em gel de agarose dos fragmentos de restrio. Gentipos possveis: T/T, T/C, C/C.

447 pb 251 pb 196 pb

Sentido da corrida

710 711 712 713

Tabela 1. Frequncias allicas, genotpicas e de portadores de CD40L -726 (T,C) na amostra total de indivduos analisados no presente estudo.
Pacientes 150 214 19 145 18 83 69 13 1 151 15 82 14 0,666 67 63 4 Controles 86 118 13 81 12 45 37 7 1 81 9 44 8 0,362 41 37 4 OR % 90,1 9,9 94,2 14,0 82,2 15,6 2,2 90,0 10,0 97,8 17,8 1,24 0,80 2,50 0,90 95% IC 0,59-2,60 0,38-1,69 1,06-5,89 0,41-1,98 P 0,700 0,045 0,842

T C T+ C+ Mulheres T/T T/C C/C T C T+ C+ HW Homens T C

% 91,8 8,2 96,7 12,0 83,1 15,7 1,2 91,0 9,0 98,8 169

94,0 6,0

T C T+ C+ Mulheres T/T T/C C/C T C T+ C+ HW Homens T C

0,99 0,53 1,12 0,89 1,86 0,94

0,36-2,71 0,03-8,82 0,46-2,67 0,37-2,13 0,11-30,52 0,36-2,44

1,000 1,000 0,824 1,000 1,000

90,2 9,8

1,70 0,58

0,40-7,21 0,14-2,48

0,707

714 715 716

OR = Odds ratio; HW = Hardy-Weinberg; IC = intervalo de confiana.

31

717 718

Tabela 2. Frequncias allicas, genotpicas e de portadores de CD40L -726T>C na amostra total de Malheiros e Petzl-Erler (2009), aps retipagem e correo de alguns gentipos.
Pacientes 135 204 13 134 13 82 70 12 0 152 12 82 12 0,475 53 52 1 Controles 141 171 29 125 27 59 46 11 2 103 15 57 13 0,219 82 68 14 OR % 85,5 14,5 88,7 19,1 78,0 18,6 3,4 87,3 12,7 96,6 22,0 2,66 0,37 2,81 0,49 95% IC 1,34-5,27 0,18-0,74 1,50-5,25 0,24-0,99 P 0,005 0,001 0,061

% 94,0 6,0 99,3 9,6 85,4 14,6 0 92,7 7,3 100,0 14,6 T C T+ C+ Mulheres T/T T/C C/C T C T+ C+ HW Homens T C

T C T+ C+ Mulheres T/T T/C C/C T C T+ C+ HW Homens T C

0,72 0,13 1,84 0,52 7,17 0,60

0,29-1,76 0,00-2,81 0,82-4,10 0,24-1,20 0,33-152,24 0,25-1,44

0,493 0,163 0,152 0,173 0,272

94,1 5,9

82,9 17,1

10,71 0,09

1,36-84,05 0,01-0,73

0,009

719 720 721 722

OR = Odds ratio; HW = Hardy-Weinberg; IC = intervalo de confiana.

Tabela 3. Frequncias allicas, genotpicas e de portadores de CD40L -726T>C em eurobrasileiros (EU) da amostra de Malheiros e Petzl-Erler (2009).
Pacientes 95 145 6 95 6 56 50 6 0 106 6 56 6 0,672 39 39 0 Controles 116 152 19 107 17 55 45 8 2 98 12 53 10 0,062 61 54 7 OR % 88,9 11,1 92,2 14,7 81,8 14,5 3,6 89,1 10,9 96,4 18,2 3,02 0,33 16,88 0,39 95% IC 1,17-7,77 0,13-0,85 0,97-293,90 0,14-1,03 P 0,021 0,004 0,074

T C T+ C+ Mulheres T/T T/C C/C T C T+ C+ HW Homens T C

% 96,0 4,0 100,0 6,3 89,3 10,7 0 94,6 5,4 100,0 10,7

100,0 0

T C T+ C+ Mulheres T/T T/C C/C T C T+ C+ HW Homens T C

0,67 0,18 2,16 0,46 5,28 0,54

0,21-2,09 0,00-3,85 0,78-5,98 0,16-1,28 0,24-112,54 0,18-1,60

0,574 0,232 0,147 0,243 0,292

88,5 11,5

10,87 0,090

0,60-195,98 0,00-1,65

0,040

723

OR = Odds ratio; HW = Hardy-Weinberg; IC = intervalo de confiana.

32

724 725

Tabela 4. Frequncias allicas, genotpicas e de portadores de CD40L -726T>C na amostra em afrobrasileiros (AFRO) da amostra de Malheiros e Petzl-Eler (2009).
Pacientes 55 71 10 46 10 26 20 6 0 46 6 26 6 0,506 29 25 4 Controles 41 44 14 32 13 17 12 4 1 28 6 16 5 0,432 24 16 8 OR % 75,9 24,1 78,0 31,7 70,6 23,5 5,9 82,4 17,6 94,1 29,4 2,25 0,44 3,03 0,70 95% IC 0,92-5,52 0,18-1,08 1,21-7,55 0,27-1,77 P 0,109 0,017 0,480

T C T+ C+ Mulheres T/T T/C C/C T C T+ C+ HW Homens T C

% 87,7 12,3 83,6 18,2 76,9 23,1 0 88,5 11,5 100,0 23,1

86,2 13,8

T C T+ C+ Mulheres T/T T/C C/C T C T+ C+ HW Homens T C

0,90 0,20 1,64 0,61 4,81 0,72

0,21-3,85 0,00-5,38 0,48-5,59 0,18-2,07 0,18-125,40 0,18-1,87

1,000 0,394 0,528 0,395 0,728

66,7 33,3

3,12 0,32

0,80-12,10 0,08-1,24

0,111

726 727 728 729

OR = Odds ratio; HW = Hardy-Weinberg; IC = intervalo de confiana.

Tabela 5. Frequncias allicas, genotpicas e de portadores de CD40L -726T>C na amostra conjunta total de Malheiros e Petzl-Eler (2009) e do presente estudo.
Pacientes 277 412 35 271 34 170 141 28 1 310 30 169 29 0,757 107 102 5 Controles 239 298 43 216 40 104 82 18 3 182 24 100 21 0,125 135 116 19 OR % 86,9 12,5 90,4 16,7 78,8 17,3 2,9 87,5 11,5 96,2 20,2 1,69 0,58 4,80 0,69 95% IC 1,06-2,71 0,36-0,94 1,92-12,02 0,42-1,14 P 0,030 10-3 0,166

T C T+ C+ Mulheres T/T T/C C/C T C T+ C+ HW Homens T C

% 92,17 7,83 97,8 12,3 82,9 16,5 0,6 91,2 8,8 99,4 17,1

95,3 4,7

T C T+ C+ Mulheres T/T T/C C/C T C T+ C+ HW Homens T C

0,90 0,19 1,36 0,73 6,76 0,80

0,47-1,74 0,01-1,89 0,77-2,40 0,41-1,29 0,74-61,33 0,43-1,49

0,867 0,148 0,302 0,070 0,520

85,9 14,1

3,34 0,29

1,20-9,27 0,11-0,83

0,017

730 731

OR = Odds ratio; HW = Hardy-Weinberg; IC = intervalo de confiana.

33

732 733

Tabela 6. Frequncias allicas, genotpicas e de portadores de CD40L -726T>C na amostra conjunta de afrobrasileiros (AFRO) de Malheiros e Petzl-Eler (2009) e do presente estudo.
Pacientes 94 124 19 90 18 49 34 14 1 82 16 48 15 0,748 45 42 3 Controles 89 109 24 76 22 44 33 9 2 75 13 42 11 0,213 45 34 11 OR % 82,0 18,0 85,4 24,7 75,0 20,5 4,5 85,2 14,8 95,5 25,0 1,43 0,69 3,84 0,72 95% IC 0,74-2,76 0,36-1,33 1,20-12,29 0,35-1,46 P 0,320 0,021 0,377

T C T+ C+ Mulheres T/T T/C C/C T C T+ C+ HW Homens T C

% 86,7 13,3 95,7 19,1 69,4 28,6 2,0 83,7 16,3 98,0 30,6

93,3 6,7

T C T+ C+ Mulheres T/T T/C C/C T C T+ C+ HW Homens T C

1,51 0,48 0,88 1,12 2,28 1,32

0,57-3,96 0,04-5,61 0,40-1,96 0,51-2,49 0,20-26,11 0,53-3,30

0,472 0,999 0,841 0,601 0,645

75,6 24,4

4,53 0,22

1,17-17,54 0,05-0,85

0,038

734 735 736 737

OR = Odds ratio; HW = Hardy-Weinberg; IC = intervalo de confiana.

Tabela 7. Frequncias allicas, genotpicas e de portadores de CD40L -726T>C na amostra conjunta de eurobrasileiros (EU) de Malheiros e Petzl-Eler (2009) e do presente estudo.
Pacientes 178 271 14 176 14 107 95 12 0 202 12 107 12 0,538 71 69 2 Controles 173 229 27 162 24 83 67 13 3 147 19 80 16 0,038 90 82 8 OR % 89,5 10,5 93,6 13,9 80,7 15,7 3,6 88,6 11,4 96,4 19,3 2,28 0,44 5,97 0,53 95% IC 1,16-1,45 0,22-0,85 1,30-27,36 0,26-1,06 P 0,015 0,010 0,085

T C T+ C+ Mulheres T/T T/C C/C T C T+ C+ HW Homens T C

% 95,1 4,9 98,9 7,9 88,8 11,2 0 94,4 5,6 100,0 11,2

97,2 2,8

T C T+ C+ Mulheres T/T T/C C/C T C T+ C+ HW Homens T C

0,65 0,10 2,17 0,46 9,34 0,53

0,27-1,51 0,00-1,98 1,02-4,62 021-0,97 0,47-183,54 0,23-1,19

0,386 0,074 0,057 0,082 0,149

91,1 8,9

3,36 0,290

0,69-16,37 0,06-1,44

0,187

738

OR = Odds ratio; HW = Hardy-Weinberg; IC = intervalo de confiana.