Anlisis de Variacin gnica mediante el mtodo HRM (High Resolution Melting)

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HRM
Estudio realizado por:

FRANCISCA GALLEGOa Y ROSA ARJONAb a)Tcnico superior especialista en RT-QPCR; b)Tcnico de Laboratorio Unitat Cientificotcnica de Suport Vall dHebron Institut de Recerca (VHIR) Hospital Universitari Vall dHebron

28 de septiembre de 2012

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Introduccin
El mtodo denominado de curvas de disociacin de alta resolucin (High Resolution Melting, HRM) es un mtodo simple, rpido y de bajo coste que se usa para la identificacin de variaciones en secuencias de cidos nucleicos (por ej. SNP, mutaciones, metilacin). El mtodo se basa en la caracterizacin de los productos de la PCR de acuerdo al comportamiento de disociacin de hebras, o dicho de otra manera, se basa en las caractersticas de desnaturalizacin trmica de los amplicones y suministra informacin con un rendimiento nunca antes alcanzado por el anlisis de la curva de disociacin clsica de ADN. Las variaciones en las secuencias son detectadas tanto por un cambio en la Tm como por un cambio en la forma de la curva de disociacin. Esto es posible gracias a la introduccin de fluorocromos de unin a doble cadena de DNA de tercera generacin y a la incorporacin de instrumentos de PCR a tiempo real con un sistema de control de temperatura preciso y una capacidad de captura de datos avanzada. Los datos son analizados y manipulados con programas diseados especficamente para el anlisis de HRM. Los aspectos ms importantes a considerar en un anlisis de HRM son: 1.- Qumica- El anlisis de HRM utiliza fluorocromos de tercera generacin. Son fluorocromos que presentan una baja toxicidad en las reacciones de amplificacin y por tanto pueden ser usados a mayores concentraciones que los convencionales para conseguir una mayor saturacin de las muestras de ADN de doble cadena. No interfieren con la reaccin de la PCR. 2.- Instrumentos- El anlisis de HRM requiere instrumentos que recolecten datos de fluorescencia a una resolucin de temperatura muy fina. 3.- Software- El anlisis de HRM requiere un programa ms sofisticado que use nuevos algoritmos. En el presente trabajo presentamos los resultados de un estudio de genotipado realizado en la UCTS con la plataforma de PCR a Tiempo Real LightCycler480 de ROCHE utilizando el reactivo LightCycler480 High Resolution Melting Master para la deteccin de cuatro clases de SNPs humanos.

Objetivo
El objetivo principal del presente estudio es poner a disposicin de los investigadores el bagaje experimental adquirido por personal tcnico de la UCTS durante la realizacin de un estudio de genotipado mediante la tcnica de HRM (High Resolution Melting) realizada con la plataforma LightCycler480 de ROCHE. Pretendemos que con esta informacin los investigadores puedan extraer un cdigo de buenas prcticas para la realizacin de experimentos HRM.

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Diseo Experimental
Para la realizacin del presente estudio se ha seguido el flujo de trabajo descrito por ROCHE en la nota tcnica N.1: High Resolution Melting Optimization Strategies: 1.- Eleccin de SNPs. 2.- Diseo de Cebadores. 3.- Eleccin de la fuente de DNA. 4.- Comprobacin de la especificidad y optimizacin de la Tm de las diferentes parejas de cebadores mediante PCR convencional y Bioanalyzer. 5.- Optimizacin de la mezcla de reaccin PCR-HRM. 6.- Optimizacin del programa de PCR y disociacin. 7.- Anlisis de los datos experimentales utilizando un software apropiado y Validacin de la tcnica.

1.- Eleccin de SNPs. El objetivo de este ensayo es reproducir la deteccin de 4 tipos de SNPs conocidos mediante HRM con el uso de herramientas de la UCTS que estn a disposicin de los investigadores. Con el fin de simplificar la puesta a punto de un ensayo de genotipado mediante HRM se hizo una bsqueda bibliogrfica para la seleccin de cuatro SNPs que ejemplifican cada uno de los 4 tipos existentes descritos en la literatura (Tabla 1)

Tabla 1 Clasificacin y frecuencia de SNPs. Un ejemplo de cada tipo. Tipo SNP 1 2 3 4 Cambio de base C>T, T>C, G>A, A>G C>A, A>C, G>T, T>G C>G, G>C A>T, T>A Frecuencia 64% 20% 9% 7% Ejemplo SNP Rs12913832 Rs12896399 Rs35731153 RS641805 de Mutacin A/G G/T C/G A/T

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2.- Diseo de Cebadores. Las secuencias de los cebadores para la deteccin de los cuatro SNPs seleccionados fueron diseadas utilizando el programa Primer Express de Life Technologies (Applied Biosystems). De acuerdo con los prerrequisitos de la PCR a tiempo real, los cebadores fueron diseados para tener una temperatura de anillamiento de alrededor de 60C, un porcentaje en el contenido de C-G de entre 30%-80% (excepto uno de los cebadores que contiene 28.1% C-G) y amplificar amplicones menores de 150 bp. Adems, y siguiendo las recomendaciones de expertos en HRM (soporte tcnico de Roche), con el fin de aumentar la probabilidad de identificar una pareja vlida y robusta para el genotipado, se disearon dos parejas de cebadores para los tipos de SNPs I (cebadores 1/2 y 3/4), II (cebadores 9/10 y 11/12) III (cebadores 5/6 y 7/8) y IV (cebadores 15/16 y 17/18). Se test, adems, una pareja extra de cebadores de secuencias conocidas y publicadas para el SNP tipo IV (cebadores 13/14). Los cebadores fueron resuspendidos en el volumen de agua calculada con la hoja de clculo de IDT technology, con el fin de obtener una concentracin de 50 M. La concentracin de trabajo fue de 5 M y la concentracin final de los cebadores en la mezcla de PCR fue 0.3 M. En contra de lo recomendado por Roche y con el fin de minimizar costes se usaron cebadores no purificados mediante HPLC. Los detalles de la secuencia de cada pareja de cebadores y el tamao del amplicn resultante en cada caso se recogen en la Tabla 2. Tabla 2 Secuencias de cebadores para el genotipado mediante HRM de cuatro tipos de SNPs.
SNP Tipo SNP Mutacin Secuencia de Cebadores 1-Rv= 5TCGGCCCCTGATGATGATAG 3 2-FW= 5ATGGCTCTCTGTGTCTGATCCAA 3 3-Rv= 5CTCGGCCCCTGATGATGATA 3 4-FW= 5 TTCATGGCTCTCTGTGTCTGATC 3 9-Rv= 5 TACTTAGCCCTGGGTCTTGATGTT 3 10-FW=5CAATTCTTTGTTCTTTAGGTCAGTATATTTTG 3 11-Rv= 5 GTATTGATGAGGAAGGTTAATCTGCTGTG 3 12-FW= 5AGCTAAAAGTTGTTATTTATCTGAAAATTCAA 3 5-Rv= 5GTGACGGCAGGGAAGT 3 6-FW= 5GCATCTTCATCAGGACCTACT 3 7-Rv= 5GCTAGCATTGCAGATGGT 3 8-FW= 5ATCTTCATCAGGACCTACTTGAG 3 15-Rv= 5 ACTACCAGAAATGTTAGTGAAAGTTTGC 3 16-FW= 5 GTCTAAACAAATAGACTGGCGCATTAC 3 RS641805 4 A/T 17-Rv= 5 TGTTTCTTTCTGTCTTGAGCAATACCT 3 18-FW= 5 GCGCATTACTTTTGGCTTTTCT 3 13-Rv= 5ACATTCATCCTTACATGGCACCA 3 14-FW= 5AACTTGGCTTTAATGGACCTCCA 3 Tamao Amplicn (bp) 90 94 97 139 89 99 101 121 101

Rs12913832

A/G

Rs12896399

G/T

Rs35731153

C/G

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3.- Eleccin de la fuente de DNA. Se utiliz un DNA genmico humano comercial (ROCHE) para el testado de la especificidad y optimizacin de la temperatura de anillamiento (Tm) de cada una de las dos parejas de cebadores diseadas para cada tipo de SNP. Este DNA se utiliz tambin para la optimizacin de la mezcla de reaccin (ver detalles en el punto 5). Para el anlisis completo de HRM con una pareja vlida de cebadores para cada SNP se utilizaron muestras de DNA genmico pertenecientes al panel comercial HRC-5 del banco de clulas Europeo ECACC, que representa una poblacin control de 96 donadores de sangre Caucasianos de origen UK. Se utilizaron 30 ng de cada muestra de DNA como molde en la PCR.

4.- Comprobacin de la especificidad y optimizacin de la Tm de las diferentes parejas de cebadores mediante PCR convencional y Bioanalyzer. La temperatura de anillamiento es el parmetro con mayor influencia sobre la eficiencia y especificidad de la reaccin de PCR. Reacciones eficientes y robustas generan datos reproducibles. La determinacin de la temperatura de anillamiento se realiz mediante PCR convencional y la especificad de cada pareja de cebadores se comprob con el Bioanalyzer utilizando chips de DNA 1000. La Tabla 3 muestra el programa universal de temperaturas de PCR utilizado. Tabla 3 Programa Universal de temperaturas de PCR T Pre-Incubation Amplification (X40) 95C 95C 60C Time 10 min 15 seg 1 min

5.- Optimizacin de la mezcla de reaccin PCR-HRM. La mezcla de reaccin HRM se optimiz utilizando el reactivo LightCycler480 High Resolution Melting Master, una mezcla de reaccin especficamente desarrollada para producir resultados ptimos de HRM con la plataforma de PCR a tiempo real LightCycler480. Todas las variantes se amplificaron en un formato de placas blancas de 384 pocillos (Roche) con las mismas condiciones de mezcla de PCR siguiendo las

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instrucciones recomendadas por el producto. Para ms detalles sobre la mezcla de reaccin ver Tabla 4.

Las sales afectan al comportamiento de disociacin, de manera que es importante que la concentracin de buffer, Mg2+ y otras sales en la mezcla de reaccin sean tan uniformes como sea posible en todas las muestras. Para asegurar la especificidad y robustez de la PCR llevamos a cabo una titulacin para determinar la concentracin ptima de MgCl2 en la reaccin. Para ello se utiliz un rango de concentraciones finales de MgCl2 entre 1.5 y 3.5 mM, partiendo de una solucin stock de concentracin 25 mM suministrada individualmente con el kit de master mix. Tabla 4 Mezcla de reaccin PCR_HRM Componentes Master Mix Resolight Melting Master (2X) MgCl2 (25mM) Primer Fw (5 M) Primer Rv (5 M) DNA (10 ng/l) H2O Volumen Final Volumen 10 l 1,2 l 1,2 l 3 l 3 l 20 l Concentracin Final 1X 1.5-3.5 mM 0,3 M 0,3 M 30 ng -

6.- Optimizacin del programa de PCR y de disociacin. En la Tabla 5 se muestra el programa de temperatura PCR-HRM recomendado para la realizacin de un ensayo de genotipado en el instrumento LightCycler480 utilizando la LightCycler480 High Resolution Melting Master Mix.

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Tabla 5 Programa de Temperatura Adquisition Mode Ramp rate (C/s) 4,8 4,8 2,5 4,8 2,5 1 0 2,5 Adquisition (per C)

T Pre-Incubation Amplification (X40) High Resolution Melting 95C 95C 60C 95C 40C 65C 95C 40C

Time

10 min none 15 seg 1 min 1 min 1 min 1 seg 10 seg none Single none none none Continous none

25

Cooling

7.- Anlisis de Datos y Validacin con la tecnologa Sanger. El anlisis de los datos de amplificacin y la especificidad del producto se realiz con el programa LightCycler 480 especfico de la plataforma que lleva el mismo nombre y el anlisis de curva de disociacin de alta resolucin mediante el mdulo Gene Scanning versin 1.2 que ofrece el mismo programa. Previo al anlisis de HRM hay que revisar siempre los datos de la amplificacin. Para conseguir un anlisis ptimo de HRM: a) todas las curvas de amplificacin deben producir un valor de Cp < 30 b) todas las curvas deben alcanzar una fase plat similar, c) entre las muestras, el valor de Cp no debe variar ms de 5 unidades de Cp (correspondientes a aproximadamente una dilucin 1:100). A continuacin, la aplicacin Gene Scanning analiza las curvas de disociacin de la siguiente manera (Figura 1): 1) Normalizacin de los datos crudos de curvas de disociacin, estableciendo valores uniformes de fluorescencias inicial (pre-melt) y final (post-melt) de todas las muestras; 2) Temperature shift: mueve las curvas normalizadas a lo largo del eje de temperaturas, para equiparar el punto en el cual el dsDNA en cada muestra est totalmente desnaturalizado; 3) Difference Plot: Sustrae a partir de una curva de referencia para mostrar de forma ms clara las diferencias en la forma de las curvas de disociacin entre las muestras y las traza.

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En el grfico de diferencias resultante, las muestras forman grupos en funcin de las formas de sus curvas de disociacin.

Normalizacin

Temperature Shift

Difference Plot

Figura 1 El mdulo Gene Scanning del programa LighCycler480 permite analizar curvas de disociacin de alta resolucin o HRM.

Si bien la aplicacin Gene Scanning puede detectar cualquier variacin de secuencia entre diferentes muestras, no determina en cambio cul es exactamente la base que est presente en los respectivos alelos. Por tanto, a veces se requiere de la secuenciacin de un amplicn de cada grupo establecido por HRM para definir las variaciones. En el presente trabajo se ha utilizado la secuenciacin Sanger para la validacin del genotipado por HRM. Para analizar la relacin existente entre las dos tecnologas se han empleado tablas de contingencia.

Resultados y Discusin
1. Comprobacin de la especificidad de producto y optimizacin de la Tm. Para la determinacin de la Tm ptima se test primero la temperatura de 60C para amplificar mediante PCR convencional 30 ng de DNA genmico humano (Roche) con cada una de las parejas de cebadores diseadas para la deteccin de los diferentes tipos de SNP. La calidad del producto de PCR resultante se determin mediante gel de agarosa al 4% (Figura 2 A) y mediante Bioanalyzer utilizando chips de DNA 1000 (Figura 2 B). En el gel de agarosa se aprecia una banda del tamao esperado (Tabla 2) resultante de la amplificacin con los cebadores 1/2, 3/4, 7/8, 9/10, 11/12, 15/16 y 17/18; mltiples bandas resultantes de la amplificacin con los cebadores 5/6 y ninguna banda resultante de la amplificacin con los cebadores 13/14. La verificacin de este resultado mediante un chip DNA-1000 revel la presencia de dos picos resultantes de la amplificacin con los

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cebadores 5/6, 7/8 y 9/10. Este dato es indicativo de que el Bioanalyzer es ms sensible que el gel de agarosa, de acuerdo con las especificaciones tcnicas de este equipo. Con el fin de corroborar este resultado se repiti la amplificacin en las mismas condiciones con los cebadores 5/6, 7/8, 9/10 y 13/14, de la que se obtuvo una nica banda con los cebadores 5/6 y 9/10. Por ello consideramos que los picos extra que se observaron anteriormente con estos cebadores son posiblemente producto de un artefacto. Los cebadores 7/8 y 13/14 tampoco generaron un amplicn nico al variar la temperatura de anillamiento a 59 y 58C (no se muestran datos). La Figura 3 muestra el anlisis por Bioanalyzer (chips DNA-1000) de los amplicones obtenidos con los cebadores 1/2, 9/10, 5/6 y 15/16, seleccionados para el anlisis completo de HRM Figura 2 Verificacin de la calidad de amplicones mediante A) Gel de agarosa y B) gel de un Bioanalyzer con Chips de DNA 1000, C) Electroferogramas resultantes del Chip de DNA 1000 A)
10bp Ladder 10bp Ladder NTC1/2 NTC3/4 NTC5/6 NTC7/8 NTC9/10 NTC11/12 NTC13/14 NTC15/16 NTC17/18 0.5ug 2ug 1/2 15/16 17/18 7/8 9/10 11/12 13/14 3/4 5/6

B)
bp
1/2 3/4 5/6 7/8 9/10 13/14 17/18 15/16 11/12

4% Gel agarosa TM=60C

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C)

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Figura 3 Anlisis por Bioanalyzer (chips DNA-1000) de los amplicones obtenidos con los cebadores seleccionados para el anlisis completo de HRM.

bp

1/2

9/10 5/6 15/16

Una vez hecha la comprobacin mediante PCR convencional de la especificidad y optimizacin de la Tm con cada uno de los cebadores diseados, escogimos para la realizacin del anlisis completo de HRM las parejas de cebadores 1/2, 9/10, 5/6 y 15/16 que constituyen un ejemplo de cada uno de los tipos de SNPs I, II, III y IV, respectivamente. En la Tabla 6 se muestra las secuencias de los cebadores seleccionados para el anlisis completo de HRM y la Tm de trabajo.

Tabla 6 Secuencias de los cebadores seleccionados para el anlisis completo de HRM y la Tm de trabajo.
SNP Rs12913832 Tipo SNP I Mutacin A/G Secuencia de Cebadores 1-Rv= 5TCGGCCCCTGATGATGATAG 3 2-FW= 5ATGGCTCTCTGTGTCTGATCCAA 3 9-Rv= 5 TACTTAGCCCTGGGTCTTGATGTT 3 10-FW=5CAATTCTTTGTTCTTTAGGTCAGTATATTTTG 3 5-Rv= 5GTGACGGCAGGGAAGT 3 6-FW= 5GCATCTTCATCAGGACCTACT 3 15-Rv= 5 ACTACCAGAAATGTTAGTGAAAGTTTGC 3 16-FW= 5 GTCTAAACAAATAGACTGGCGCATTAC 3 Tm (C) 60

Rs12896399

II

G/T

60

Rs35731153 RS641805

III IV

C/G A/T

60

60

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2. Titulacin de MgCl2. Teniendo en cuenta que las sales pueden afectar al comportamiento de disociacin, el siguiente paso fue la determinacin de la concentracin ptima de MgCl2 titulando concentraciones de entre 1 mM y 4 mM en la reaccin de PCR con las parejas de cebadores 1/2, 5/6, 9/10 y 15/16. La verificacin de la calidad de los amplicones se puede llevar a cabo mediante un gel de agarosa o mediante anlisis de curva de disociacin. Debido a la posibilidad de monitorizar la cintica de la amplificacin en un instrumento de PCR a tiempo real, se utiliz preferentemente la plataforma LightCycler480 en lugar de un termociclador convencional para verificar la calidad de los amplicones mediante el anlisis de curva de disociacin. Se escogi como mejor concentracin de MgCl2 la que dio lugar a un amplicn con un valor de Cp bajo con una fase plat elevada, teniendo en cuenta que un valor de Cp menor de 30 ciclos es indicativo de que hay una cantidad apropiada de muestra y una eficiencia de amplificacin idnea. De las amplificaciones resultantes de la titulacin de MgCl2 concluimos que la concentracin que ofrece un valor de Cp por debajo de 30 con la fase plat ms elevada es de 2 mM en todas las parejas de cebadores testadas. La Figura 4 muestra el perfil de curvas de amplificacin con el correspondiente valor de Cp y las curvas de disociacin obtenidas con cada una de las parejas de cebadores.

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Figura 4 Titulacin tpica de MgCl2. La concentracin ptima para todos los casos es de 2 mM debido al valor ms bajo de Cp y la fase plat ms elevada.

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3. Anlisis de HRM y validacin mediante la tecnologa Sanger. Una vez optimizada la Tm y la mezcla de reaccin se procedi a la realizacin de la PCR a tiempo real y posterior anlisis de HRM de 96 muestras de DNA con cada una de las parejas de cebadores seleccionadas. Se aplicaron los siguientes tipos de anlisis que ofrece el programa LightCycler 480 para la validacin de los datos: 1.- Abs Quant/2nd Derivative Max Este tipo de anlisis est indicado para testar los valores de Cp y las curvas de amplificacin. De acuerdo con el grfico de la Figura 5, todas las muestras amplificadas con las parejas de cebadores 1/2, 5/6, 9/10 y 15/16 dieron valores de Cp < 30. Adems, entre las muestras, el valor de Cp no vari ms de 5 unidades.

23.70 0.054 26.05 0.047 24.35 0.039 24.03 0.077

Figura 5 Valores de Cp de 96 muestras de DNA con las parejas de cebadores 1/2, 9/10, 5/6 y 15/16.

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Hay que mencionar la presencia de producto amplificado tambin en los NTCs con las parejas de cebadores 1/2, 5/6, 9/10 y 15/16. Mientras que esta contaminacin estaba siempre presente en los NTCs con la pareja de cebadores 5/6, slo apareca a veces en los NTCs con el resto de cebadores. Un ejemplo de ello lo muestran los grficos de la Figura 6. Es conocido que la aparicin de producto amplificado en las muestras NTCs es indicativo de la contaminacin por DNA o de la formacin de dmeros de cebadores en las reacciones de PCR. Para obtener ms detalle acerca del tipo de contaminacin observada procedimos al anlisis de curvas de disociacin clsicas que ofrece el software LightCycler 480 denominado Tm calling (ver apartado 2) En cualquier caso, asumimos que la presencia de estos productos inespecficos no afecta a la valoracin final del ensayo dado que la aparicin de dicha contaminacin se produce siempre en el valor de Cp 35, ms all de nuestro Cp lmite de 30.

Figura 6 Aparicin ocasional de producto inespecfico en las muestras NTCs a un valor de Cp=35.

2.- Tm calling Este tipo de anlisis est indicado para corroborar la especificidad de los productos amplificados obtenidos as como para informar de la presencia o ausencia de posibles contaminantes. En todas las muestras problema amplificadas con las parejas de cebadores 1/2, 5/6, 9/10 y 15/16 se obtuvo un nico producto de PCR con Tm de entre 78-84C. En la figura 7 se detalla la Tm obtenida con cada pareja de cebadores. En cuanto a las muestras NTCs, la presencia de producto amplificado con las parejas de cebadores 1/2, 9/10 y 15/16 tena siempre el mismo valor de Tm que los productos amplificados en las muestras problema, lo que hace pensar en la posibilidad de que se trate de contaminacin por producto de PCR procedente de reacciones previas y no en la formacin de dmeros de cebadores. Se descart que la contaminacin fuera debida a la contaminacin por DNA de algunos de los reactivos de la mezcla de PCR, ya que se tomaron todas las precauciones posibles, inclusive la compra de novo de los cebadores. En cuanto al producto amplificado detectado en las muestras NTCs con la pareja de cebadores 5/6, el valor de Tm=76C apuntaba a que se trata de dmeros de cebador. No obstante, cabe destacar en este ltimo caso que la presencia de dmeros de cebadores en slo las muestras

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NTCs y no en las muestras problema indica que la amplificacin del DNA problema por la polimerasa se ve favorecida frente a los dmeros de cebadores, evitando as el uso de los mismos con los que interacta en ausencia de DNA de la muestra.

P1-2 Tm = 81.50 0.184

P5-6 Tm = 83.61 0.104

P15-16 Tm = 79.11 0.59

P9-10 Tm = 78.96 0.37

Figura 7 Anlisis de la especificidad de producto mediante el tipo de anlisis Tm calling del software LightCycler 480.

Las pequeas variaciones en la Tm de un mismo producto de PCR que se aprecian entre las diferentes muestras pueden ser debidas a las variaciones en la secuencia del amplicn resultante causadas por el SNP.

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3.- Gene Scanning, para el anlisis PCR-HRM. La Figura 8 muestra el anlisis de curva de disociacin de alta resolucin, mediante la aplicacin Gene Scanning, de las muestras amplificadas con las diferentes parejas de cebadores: 1/2 (para la deteccin del SNP tipo I), 9/10 (para la deteccin tipo II), 5/6 (para la deteccin del SNP tipo III), y 15/16 (para la deteccin del SNP tipo IV). Adems, se contrasta este resultado con la secuenciacin mediante Sanger del producto amplificado por HRM. La secuenciacin se realiz utilizando uno de los cebadores y slo en caso de dudas se utiliz el cebador contrario para la confirmacin de la secuencia. Adems, la secuenciacin se llev a cabo sin previa purificacin del producto amplificado, comprobando de esta manera que el fluorocromo 480 ResoLight contenido en la master mix no interfiere con el proceso de secuenciacin. Concretamente: SNP de tipo I: A/G Para la deteccin del SNP de tipo I A/G mediante HRM se procesaron 96 muestras a la vez, resultando dos grupos de muestras, el grupo 1 y el grupo 2, cada uno con una forma de curvas de disociacin caracterstica y diferente entre s (apartado A-1 de la Figura 8). De la validacin por Sanger de estas muestras con el cebador en sentido directo, un 3% (3/96) de muestras fueron homocigotos AA, un 66,6% (64/96) fueron homocigotos GG y un 30% (29/96) fueron heterocigotos A/G. Concretamente, dentro del grupo 1 detectado por HRM haba muestras pertenecientes a los tres genotipos y dentro del grupo 2 detectado por HRM haba muestras pertenecientes a los genotipos GG y AG (apartado B-1 de la Figura 8). SNP de tipo II: G/T Para la deteccin del SNP de tipo II G/T mediante HRM se procesaron las muestras en tres tandas de 30 y una de 6, resultando dos grupos de muestras en la tanda 1 y tres grupos de muestras en el resto de tandas (apartado A-2 del grfico X). La validacin por Sanger de estas muestras con el cebador en sentido directo produjo un 25% (24/96) homocigotos GG, 20% (19/96) homocigotos TT y 55% (53/96) heterocigotos GT. (apartado B-2 de la Figura 8). SNP de tipo III: C/G De la deteccin del SNP de tipo III mediante HRM en las 96 muestras a la vez se obtuvieron dos grupos, cada uno con una forma de curva de disociacin caracterstica (A-3 del grfico X). La validacin por Sanger de estas muestras con el cebador en sentido directo coincidi con el anlisis HRM, detectndose un 98% (94/96) homocigotos CC y 2% (2/96) homocigotos GG (apartado B-3 de la Figura 8). La secuenciacin de las dos nicas muestras homocigotos GG ms 10 muestras de la otra variante se corrobor con el cebador antisentido. SNP de tipo IV: A/T Para la deteccin del SNP de tipo IV A/T mediante HRM se procesaron las muestras en dos tandas de 30 y una de 36, resultando dos grupos de muestras en las tres tandas analizadas. (A-4 de la Figura 8). La validacin por Sanger de estas muestras con el cebador en sentido directo produjo un 9.4% (9/96) homocigotos AA, 38.5% (37/96) fueron homocigotos TT y 52% (50/96) heterocigotos AT. (apartado B-4 de la Figura 8).

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Figura 8: A.- Deteccin mediante HRM del: A-1) SNP tipo I; A-2) SNP tipo II; A-3) SNP tipo III y A-4) SNP tipo IV; B.- Comparacin del genotipado mediante HRM versus secuenciacin Sanger del: B-1) SNP tipo I; B-2) SNP tipo II; B-3) SNP tipo III y B-4) SNP tipo IV. A-1) HRM del SNP tipo I: G/A G/A B-1) Sanger del SNP tipo I:
SNP clase I: G/A
80 70 60

San g er

50 40 30 20 10 0 1

GG AA AG

HRM

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A-2) HRM del SNP tipo II: G/T

B-2) Sanger del SNP tipo II: G/T

SNP clase II: G/T Tanda de m uestras 1 16 14 12 10 8 6 4 2 0 1 Grupos HRM 2

Sanger

CC CA AA

SNP clase II: G/T Tanda de m ue stras 2

20 18 16 14

Sanger

TT GT GG

12 10 8 6 4 2 0 1 2 3

Grupos HRM

SNP clase II: G/T Tande de m uestras III

20 18 16 14

Sanger

12 10 8 6 4 2 0 1 2 3

CC CA AA

Grupos HRM

SNP clase II:G/T Tanda de m uestras IV

3,5 3

Sanger

2,5 2 1,5 1 0,5 0 1 2 3

CC CA AA

HRM

A-3) HRM del SNP tipo III: G/C

B-3) Sanger del SNP tipo III: G/C

SNP clase III:G/C

100 80

Sa n g e r

60 40 20 0 1 2

GG CC

HRM

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A-4) HRM del SNP SNP tipo IV: A/T

B-4) Sanger del SNP tipo IV: A/T

SNP clase IV: A/T Tanda de muestras I
18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

Sanger

TT AT AA

1 HRM

SNP clase IV: A/T Tanda de muestras II

16 14 12

Sanger

10 8 6 4 2 0

TT AT AA

1 HRM

SNP clase IV: A/T Tanda de muestras III

20 15 TT 10 5 0 AT AA

Sanger

1 HRM

Diferenciacin entre variantes genotpicas Con el fin de diferenciar entre las tres variantes genotpicas para los SNPs de tipo I, tipo II y tipo IV, se repiti el genotipado mediante HRM de 10 muestras con cada una de las parejas de cebadores correspondientes a los tres tipos de SNPs y se aadi en todas ellas un 50% de DNA homocigoto conocido. En el caso de los SNPs de tipo I y II se consiguieron diferenciar los tres genotipos esperados, sin embargo para la deteccin del SNP tipo IV no fue posible dicha discriminacin. La figura 9-A) muestra un ejemplo del electroferograma de las secuencias Sanger de cada genotipo para el SNP tipo I, indicado con una flecha; los grupos asignados mediante HRM de las 10 muestras amplificadas sin y con DNA Spike para la deteccin del SNP-I; y la comparacin entre ambas tecnologas para dicho SNP-I. La figura 9-B), muestra lo mismo para la deteccin del SNP tipo II.

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Figura 9-A)

Diferenciacin de las variantes genotpicas para el SNP tipo I: A/G

AA
B8 D5

AG
F1

GG

Muestras sin Spiking

Resultado Sanger GG GG AG AA AA AG GG GG GG GG

Sin Spiking

Con Spiking

Muestras con Spiking

SNP Clase I: A/G Muestras sin Spiking

2,5

SNP Clase I: A/G Muestras Spiking con DNA Homocigoto AA

8 7

Sanger

Sanger

6 5 4 3 2 1 0 1 2

GG AA AG

1,5 1

GG AA AG

0,5 0 1 2 3

HRM

HRM

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Figura 9-B)

D ife re nci aci n d e la s varian tes g e no tp ica s p a ra el SN P tip o II: G/T CC

Rv_H7 Rv_H11

CA
Rv_H9

AA

Mu estras Sin Spik ing

Resu ltado Sa ng er
AA CA CC CA CC CC AA AA AA CC

Mues tras Con Spik ing

SNP tipo II: G/T Muestras sin Spiking

8 7

SNP tipo II: G/T Muestras con Spiking

4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0

Sanger

GT GG

Sanger

TT

TT GT GG

1 HRM

2 HRM

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Conclusiones
HRM es una tcnica simple, fcilmente accesible y de bajo coste que sirve para analizar de forma rpida mltiples variantes genticas. No obstante, el cuidado en la preparacin de la muestra y el planteamiento del diseo experimental, en especial el diseo de cebadores, son cruciales para la obtencin de resultados robustos y reproducibles. De la experiencia adquirida en la realizacin de este anlisis, consideramos que para la realizacin de un estudio de genotipado mediante HRM son cruciales los siguientes puntos: 1.- Testado de ms de una pareja de cebadores por SNP 2.- Mismo mtodo de extraccin de DNA de todas las muestras 3.- Triplicados de las muestras Est descrito que aunque el genotipado de SNPs mediante HRM es posible en aproximadamente un 90% de los casos amplificando productos cortos de PCR, en el caso de algunos SNPs los amplicones procedentes de las diferentes variantes homocigotas a veces generan curvas de disociacin con formas tan similares que son difciles de distinguir entre s (Liew et al. 2004). En nuestra experiencia, incluso las variantes heterocigotas son a veces difciles de distinguir respecto a las variantes homocigotas. En cualquier caso, hemos podido comprobar que la adicin en todas las muestras de una cantidad conocida de ADN tipo salvaje (spiking) ofrece una solucin a dicho problema, asegurando una clara discriminacin entre las diferentes variantes genotpicas. Adems hemos podido comprobar que: 1.- Los cebadores no purificados por HPLC son ptimos para anlisis de HRM. 2.- No es necesario purificar el producto HRM, obtenido con el reactivo LightCycler480 High Resolution Melting Master Mix (Roche), para la validacin por Sanger. 3.- La adicin a las muestras de una cierta cantidad de ADN de tipo salvaje claramente mejora la discriminacin de las diferentes variantes genotpicas.

Bibliografa
High Resolution Melting: Optimization Strategies. Technical Note No.1. ROCHE A practical guide to High Resolution Melt Analysis Genotyping. Technical Note 6004. 2010 Bio-Rad Laboratories. Beginners Guide to High Resolution Melt (HRM) analysis M. Liew, R. Pryor, R. Palais, C. Meadows, M. Erali, E. Lyon, C. Wittwer, Genptyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons, Clin. Chem. 50(7) (2004) 1156-64.