ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

Oleh: Nama NIM Rombongan Kelompok Asisten : Suminar Sundari M.H. : B1J009013 : VIII :3 : Lia Rahayu

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN NASIONAL UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2011

I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang

Elektroforesis merupakan metode yang sudah dipakai oleh banyak peneliti terutama peneliti yang berkaitan dengan genetika ataupun molecular. Seiring dengan kemajuan zaman yang semakin pesat dinegara-negara berkembang akan selalu diikuti pula dengan kemajuan ilmu pengetahuan yang semakin marak dibidang teknologi. Salah satu diantaranya adalah pengembangan di bidang Biologi Molekul. Bidang ilmu pengetahuan Bidang Molekuler ini telah dimulai pada akhir abad ke 19, setelah metode elektroforesis ditemukan dan dipakai untuk menganalisa berbagai kegiatan penelitian di bidang Kimia, Biologi (Genetika, Taksonomi dan Bio-sistematik). Metode elektroforesis mulai berkembang akhir abad ke-19 setelah ditemukan penelitian yang menunjukkan adanya penelitian yang menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap partikel-partikel atau molekul-molekul yang bermuatan listrik, dalam hal ini termasuk juga protein. Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai arti transport atau perpindahan melalui partikelpartikel listrik. Metode elekroforesis telah digunakan dan dikembangkan didalam teknik analisa untuk penelitian di bidang biologi dan genetika. Metode tersebut berkembang sangat pesat sekali di zaman kemajuan teknologi, disebabkan karena pengerjaannya sangat sederhana dan sangat mudah. Di dalam ilmu biologi maupun biologi molekuler, metode elektrorofesis banyak digunakan untuk taksonomi, sistematik dan genetik dari tumbuhan. B. Tujuan Tujuan praktikum adalah untuk mengetahui cara kerja dan prinsip kerja elektroforesis..

II. MATERI DAN METODE A. Materi

Alat-alat yang digunakan pada praktikum ini yaitu DNA marker, misalnya DNA yang dipotong dengan HindIII, DNA produk PCR, agarosa, larutan buffer TAE 50x (242 g tris-base; 57,1 g asam asetat glacial; 100 ml EDTA 0,5 M pH 8; dilarutkan dalam akuades hingga 1000 ml), akuades, Loading dye 6x (0,25% bromophenol blue; 0,25% xylene cyalol; 15% ficoll tipe 4000; EDTA 120 mM), larutan Etidium Bromid (EtBr). Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah gelas ukur 1000 ml, labu erlenmeyer 50 ml, tabung mikrosentrifuga, sarung tangan, seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific), kertas parafilm, seperangkat alat elektroforesis, UV transluminator, kaca mata UV, kamera digital. B. Matode Praktikum ini dilakukan dengan cara sebagai berikut: 1. Dibuat larutan buffer TAE 1x dengn cara mencampurkan 10 ml TAE 50x ditambah dengan akuades hingga 50 ml. 2. Agarosa dibuat, yaitu dengan agarosa 0,2 gram ditambah TAE 1x hingga 20 ml, TAE : Agarosa (100 ml : 1 %). 3. Disiapkan baki elektroforesis, selotip diletakan di setiap ujung kaki baki elektroforesis ( harus dipastikan bahwa selotip melekat kuat pada masing ujung baki). 4. Dipasangkan sisir elektroforesis disalah satu ujung kaki baki dengan posisi hampir menyentuh dasar baki. 5. Larutan suhu diperiksa dengan cara menempelkan erlenmeyer ke tangan, jika suhunya sudah turun hingga sekitar 600 C, dituangkan larutan agarosa ke dalam baki elektroforesis, dibiarkan hingga larutan berubah menjadi gel padat. 6. Setelah memadat, sisiran diambil, selotip dilepas dari ujung ujung baki.

7. Baki yang berisi gel agarosa dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi dengan sisa larutan buffer TAE 1x (dipastikan bahwa gel terendam seluruhnya dalam TAE). 8. Disiapkan kertas parafilm didekat tangki elektroforesis. 9. Dimasukkan 15l sampel DNA dan 3 loading dye 6x ke dalam sumuran dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebh dahulu secara merata pada ketras parafim dengan menggunakan mikropipet. 10. Dimasukkan pula DNA marka ( DNA ) sebanyak 10l ke dalam sumuran. 11. Dibuat catatan mengenai nomor sumuran dan jenis DNA yang dimasukkan. 12. Kedua kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis dihubungkan, (kutub negatif berada didekat sumuran, sedangkan kabel yang tersambung ke kutub positif berada jauh dari sumuran. 13. Sumber arus dinyalakan, voltase dan waktu running diatur hingga diperoleh 70 Volt. 14. Elektroforesis dijalankan (melakukan running) dengan menekan tombol run pada sumber arus. 15. Elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis, yang ditandai oleh adanya bunyi alarm. Sumber arus dimatikan dan baki diangkat dari tangki elektroforesis. 16. Dengan menggunkan sarung tangan, gel agarosa dimasukkan ke dalam larutan Etbr selama 10 menit, kemudian diletakkan di atas UV transiluminator (selubung kacahitam diletakkan di atas UV transiluminator). 17. UV transiluminator dinyalakan, diamati pita pita DNA yang tervisualisasi. 18. Didokumentasikan dengan menggunakan kamera.

III.HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil

1 3

Keterangan : 1. DNA Marker 2. DNA Kromosom 3. DNA Plasmid 4. DNA Plasmid Enzim Retriksi

B. Pembahasan

Metode Elektroforesis Gel Agarosa didasarkan pada pergerakan molekul bermuatan dalam media penyangga matriks stabil di bawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA (sekuensing). Prinsip pemisahan dalam elektroforesis didasarkan atas perbedaan migrasi komponen pada fase pendukung, karena adanya perbedaan muatan dan masa molekul ( Zubay, 1989). Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp). Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet ( Pratiwi, 2001). Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya

panas dari arus listrik yang digunakan. Elektroforesis biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat bemigrasinya molekul-mulekul biologi. Media penyangganya bermacam-macam tergantung pada tujuan dan bahan yang akan

dianalisa. Media penyangga yang sering dipakai dalam elektroforesis antara lain yaitu kertas, selulose, asetat dan gel. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat ( Zubay, 1989). Larutan DNA yang bermuatan negatif dimasukkan ke dalam sumur-sumur yang terdapat pada gel agarosa dan diletakkan di kutub negatif, apabila dialiri arus listrik dengan menggunakan larutan buffer yang sesuai maka DNA akan bergerak ke kutup positif. Laju migrasi DNA dalam medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran panjang dan bentuk DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat dibanding yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya. Untuk visualisasi maka ditambahkan larutan etidium bromida yang akan masuk diantara ikatan hidrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan kelihatan dibawah lampu UV. Panjang amplikon bisa diperkirakan dengan membandingkannya dengan pita DNA standar ( Pratiwi, 2001). Gel elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukurannya. Dimana jika sentrifugasi berarti memisahkan molekul menggunakan kekuatan gravitasi sementara gel elektroforesis berarti memisahkan molekul dengan menggunakan kekuatan elektrik. Gel elektroforesis mengambil keuntungan bahwa, sebagai asam organik, DNA bermuatan negatif. Ketika diletakkan di dalam medan listrik, molekul DNA menuju ke kutub positif (anoda) dan menjauhi kutub negatif (katoda). Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA terlebih dahulu harus ditambahkan loading buffer (dye), yang berfungsi untuk menambah densitas, sehingga DNA akan selalu berada di dasar sumur; pewarna untuk memudahkan meletakkan sampel DNA ke dalam sumur, agar dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA. Pewarna yang biasa digunakan adalah bromophenol blue dan xylene cyanol. Selain itu, pembacaan pita DNA di dalam gel yang telah diwarnai dengan ethidium bromida di atas lampu UV yang

dibandingkan dengan DNA standar juga sering dilakukan untuk menganalisis kuantitas jumlah DNA (Suharsono dan Widyastuti , 2006). Menurut Soedarmadji (1996), beberapa faktor mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein yakni: 1. Ukuran molekul protein Migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran kecil. 2. Konsentrasi gel Migrasi molekul protein pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat daripada migrasi molekul protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi. 3. Bufer (penyangga) dapat berperan sebagai penstabil medium pendukung dan dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion sebagai pembawa protein yang bermuatan. Kekuatan ion yang tinggi dalam bufer akan meningkatkan panas sehingga aliran listrik menjadi maksimal. Hal ini dapat mempercepat gerakan molekul protein. Kekuatan ion rendah dalam bufer akan menurunkan panas sehingga aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi molekul protein sangat lambat. 4. Medium penyangga Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia inert yang bersifat relatif stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang baik, sebagai migrasi elektron atau penyaringan berdasarkan ukuran molekul seperti gel poliakrilamid (Sudarmadji, 1996). Jika ukuran pori dari medium kira-kira sama dengan molekul, maka molekul yang lebih kecil akan berpindah lebih bebas di dalam medan listrik, sedangkan molekul yang lebih besar akan dibatasi dalam migrasinya. Besarnya pori-pori dapat diatur dengan mengubah konsentrasi penyusun gel poliakrilamidnya yaitu akrilamid dan bisakrilamid. 5. Kekuatan voltase Voltase yang dipakai rendah (100-500) V, kecepatan migrasi molekul sebanding dengan tingginya voltase yang digunakan. Voltase yang dipakai tinggi (50010000) V, mobolitas molekul meningkat secara lebih tajam dan digunakan untuk memisahkan senyawa dengan BM rendah serta jenis arus yang dipakai selalu harus searah (bukan bolak balik).

6. Temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung. Jika temperatur tinggi akan mempercepat proses bermigrasinya protein dan sebaliknya jika temperatur rendah akan mengurangi kekuatan bermigrasinya protein. Pada saat elektroforesis berlangsung, protein akan bergerak dari elektroda negatif menuju elektroda positif sampai pada jarak tertentu pada gel poliakrilamid tergantung pada berat molekulnya. Semakin rendah berat molekulnya maka semakin jauh pula protein bergerak atau mobilitasnya tinggi. Sebaliknya protein dengan berat molekul lebih besar akan bergerak pada jarak yang lebih pendek atau mobilitasnya rendah (Sumitro et al., 1996). Hasil praktikum menunjukkan bahwa DNA sampel tidak terbaca, melainkan terjadi penumpukan. Hal ini terjadi mungkin karena kurang tepat dan kurang hati-hati dalam memasukkan DNA marka ke dalam sumuran, sehingga DNA marka terlalu banyak dan hingga memenuhi sumur sebelahnya. Hasil elektroforesis akan didapatkan pita-pita protein yang terpisahkan berdasarkan berat molekulnya. Tebal tipisnya pita yang terbentuk dari pita protein menunjukkan kandungan atau banyaknya protein yang mempunyai berat molekul yang sama yang berada pada posisi pita yang sama. Hal ini sejalan dengan prinsip pergerakan molekul bermuatan, yakni molekul bermuatan dapat bergerak bebas di bawah pengaruh medan listrik, molekul dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi pada zona atau pita yang sama atau berdekatan (Soedarmadji, 1996). Fungsi dari alat dan bahan yang digunakan dalam elektroforesis gel agarosa: Aquades : sebagai pelarut Etidium bromide Baki gel agarosa Sisir elektroforesis : sebagai pewarna DNA : sebagai cetakan gel agarosa : untuk membuat sumuran pada gel agarosa

Tangki elektroforesis: untuk running DNA Loading dye Mikropipet : sebagai pemberat DNA : untuk mengambil dan menghomogenkan sampel DNA dan loading dye

Kertas Parafilm

: untuk tempat menghomogenkan sampel DNA dan loading dye

UV Transiluminator : untuk melihat pita-pita DNA TAE : Trisbase sebagai buffer sesuai dengan pH, Asam Asetat Glasial sebagai elektrolit gram, EDTA (Etylen Diamine Tetra Asetic Acid) sebagai pe-non aktif DNA-se

DNA marka Sarung tangan

: DNA penanda : Melindungi terkena DNA-se yang dapat merusak DNA

IV. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan Berdasarkan hasil dan pembahasan, dapat disimpulkan : 1. Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik . 2. Hasil yang didapat dilihat dari pendaran pita-pita DNA yang terbentuk pada elektroforesis,DNA marka mengalami degradasi atau mengumpul tetapi DNA sampel bisa terbaca. Hal ini yang mungkin terjadi karena beberapa kemungkinan antara lain kesalahan dalam memasukkan DNA marka ke dalam sumur gel.

B. Saran Acara praktikum sudah berjalan cukup baik,hanya saja keterbatasan alat untuk praktikum masih kurang memadai, sehingga tidak memungkinkan masing-masing praktikan untuk mencoba.

DAFTAR REFERENSI Pratiwi, R. 2001. Mengenal Metode Elektroforesis. Oseana. Volume XXVI. Nomor 1. Balitbang Biologi Laut, Puslitbang Osenologi LIPI, Jakarta Sudarmadji, S., 1996. Teknik Analisa Biokimiawi. Edisi Pertama Liberty. Yogyakarta. Suharsono dan Widyastuti, U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi, IPB. Sumitro, S. B, Fatchiyah, Rahayu, Widyarti, dan Arumningtyas. 1996. Kursus Teknik-Teknik Dasar Analisis Protein dan DNA. Jurusan Biologi FMIPA Universitas Brawijaya. Malang Zubay, G.L. 1989. Biochemistry 2nd Edition . Mcmillan Publishing Coorporation. New York.