Excitotoxicidad retrgrada en la enfermedad de Parkinson

Autores: Adrin Garca Hernndez, Paula Fernndez-Caldas Gonzlez y ngel Recuenco Betancor

Tutores del trabajo: doctor Manuel Rodrguez Daz y doctora Ingrid Morales Prez,

Resumen (en espaol e ingls)

Se ha propuesto la sobre estimulacin de los receptores de glutamato nigrales como una de las causas en la progresin de la degeneracin de las neuronas dopaminrgicas (excitotoxicidad) caracterstico de la enfermedad de Parkinson. La posible accin txica del glutamato estriatal sobre estas clulas, y sobre otras que inervan el estriado (intralaminares del tlamo) y que degeneran tambin en la enfermedad de Parkinson ha sido poco estudiado (excitotoxicidad retrgrada). En este trabajo se estudi la excitotoxicidad retrgrada del glutamato estriatal sobre las neuronas dopaminrgicas meso-estriatales y sobre las glutamatrgicas tlamoestriatales,4- 6 semanas despus de su perfusin por microdilisis reversa. El aumento de la actividad glutamatrgica en el estriado indujo denervacin de las terminaciones talmicas (VGluT2) y degeneracin remota de las neuronas talmicas de los ncleos intralaminares. Ambos centros presentaron adems activacin microglial. Esto no se observ en las proyecciones nigroestriatales, donde no se produjo ni denervacin estriatal, ni cambios en el nmero de neuronas dopaminrgicas en la sustancia negra, ni tampoco activacin microglial. La inhibicin de la transmisin dopaminrgica incrementa los niveles de glutamato extrasinpticos en el estriado (microdilisis), efecto que tambin se observ tras la administracin local de agonistas y antagonistas de la transmisin dopaminrgica, y tras la administracin perifrica de levodopa (incrementando la dopamina y disminuyendo el nivel de glutamato estriatal en ratas con denervacin dopaminrgica parcial de la va nigro-estriatal). Los datos que se muestran indican que el glutamato estriatal induce excitotoxicidad retrgrada afectando de forma desigual a las terminaciones nerviosas que proyectan al estriado y que puede estar relacionado con la degeneracin de las neuronas intralaminares del tlamo que generalmente se observa en la enfermedad de Parkinson. An over-stimulation of nigral glutamate receptors has been proposed as a cause of the progression of the dopamine (DA) cell degeneration (excitotoxicity) which characterizes Parkinson's disease. The possible toxic action of striatal glutamate (retrograde excitotoxicity) on these cells, and on other neurons which innervate the striatum and which also degenerate in Parkinson's disease (thalamostriatal cells of the intralaminar thalamic nuclei), is still practically unexplored. The retrograde excitotoxicity of striatal glutamate on DAergic mesostriatal and glutamatergic thalamostriatal cells was tested here by studying these cells 4-6 weeks after striatal perfusion of glutamate by reverse microdialysis glutamate perfusion induced the striatal denervation of thalamic inputs (as revealed by VGluT2) and the remote degeneration of intralaminar neurons. In both centers, these effects were accompanied by microglial activation. Similar responses were not observed for nigrostriatal neurons, which showed no dopaminergic striatal denervation, no microglial activation in the substantia nigra and no changes in the number of dopaminergic cells in the substantia nigra. The inhibition of DAergic transmission increased the extrasynaptic glutamate levels in the striatum (evaluated by microdialysis), an effect observed after the local administration of agonists and antagonists of DAergic transmission, and after the peripheral

administration of levodopa (which increased the DA and decreased the glutamate levels in the striatum of rats with an experimental DAergic denervation of this centre). The data presented show that striatal glutamate induced a retrograde excitotoxicity which did not affect all striatal inputs in the same way and which could be involved in the cell degeneration of the intralaminar nuclei of the thalamus generally observed in Parkinson's disease.

Introduccin y justificacin del trabajo.

La marca caracterstica de la enfermedad de Parkinson es la degeneracin de las neuronas dopaminrgicas del sistema nigro-estriatal. Sin embargo, existen otras poblaciones neuronales, caso de las neuronas glutamatrgicas tlamo-estriatales que tambin degeneran en la enfermedad. Estas neuronas de los ncleos intralaminares del tlamo (Berendse & Groenewegen, 1990; Smith & Bolam, 1990; Sadikot et al., 1992; Smith et al., 1994; Henderson et al., 2000a; Rub et al., 2002; Van der Werf et al., 2002; Vercelli et al., 2003; Smith et al., 2004; Halliday et al., 2005) proyectan un gran nmero de terminales glutamatrgicas al estriado (Berendse & Groenewegen, 1990; Sadikot et al., 1992; Smith et al., 2004; Sadikot & Rymar, 2009), que pueden ser identificado por la presencia del transportador vesicular de glutamato (VGlut2) (Fremeau et al., 2001; Herzog et al., 2001; Smith et al., 2009). Los ncleos intralaminares del tlamo presentan una extensa prdida neuronal en la Enfermedad de Parkinson (EP) (Henderson et al., 2000b; 2000a; Halliday et al., 2005; Halliday, 2009) y teniendo en cuenta las funciones de estos centros (Matsumoto et al., 2001; Minamimoto & Kimura, 2002; Kimura et al., 2004; Minamimoto et al., 2009), podra ser la base de las distintas anomalas no motoras de la EP (Kusnoor et al., 2009).

El mecanismo de la degeneracin tlamo-estriatal en la EP es desconocido. Se ha sugerido que la degeneracin de estas neuronas sea por la degeneracin previa de las neuronas dopaminrgicas de la sustancia negra (SN) pars compacta que inerva el tlamo (hiptesis de la degeneracin dopaminrgica transinptica). Sin embargo, esta posibilidad es materia de debate porque aunque la prdida de las neuronas talmicas intralaminares que proyectan al estriado se han descrito despus de la degeneracin de las neuronas dopaminrgicas nigrales (Aymerich et al., 2006; Lanciego et al., 2009), otros estudios no hallaron lo mismo (Henderson et al., 2005; Kusnoor et al., 2009; Kusnoor et al., 2012). De hecho, la mayora de las neuronas nigrales que proyectan a los ncleos intralaminares son GABArgicas de las SN pers reticulata, estando en discusin la inervacin dopaminrgica de estos centros (Kusnoor et al., 2009; Cebrian & Prensa, 2012; Kusnoor et al., 2012). Por tanto la hiptesis de la degeneracin dopaminrgica transinptica necesita de experimentos adicionales para ser corroborada. Una posibilidad alternativa es estudiada en este trabajo. Hay evidencias que sugieren que la dopamina inhibe la liberacin de glutamato en el estriado (Maura et al., 1988; Wullner et al., 1994; Kulagina et al., 2001; Borland & Michael, 2004; Wagner et al., 2005; Morales et al., 2012) y que un exceso de glutamato extracelular puede inducir excitotoxicidad en este centro (Morales & Rodriguez, 2012). Por consiguiente, la denervacin del estriado (en vez de la denervacin talmica) podra ser la causa inicial de la degeneracin en los ncleos intralaminares del tlamo, de forma que el aumento extracelular de glutamato estriatal inducido por una disminucin en la transmisin dopaminrgica en el estriado podra daar las vas glutamatrgicas tlamo-estriatales induciendo degeneracin retrgrada en las neuronas tlamo-estriatales (hiptesis de degeneracin retrgrada glutamatrgica).

Objetivo del trabajo.

El objetivo de este trabajo fue estudiar si el incremento extracelular de glutamato estriatal inducido por una disminucin en la transmisin dopaminrgica estriatal podra daar las vas glutamatrgicas tlamo-estriatales induciendo degeneracin retrgrada en las neuronas tlamo-estriatales (hiptesis de degeneracin retrgrada glutamatrgica). Para ello se desglos en los siguientes puntos: La evaluacin por tcnicas de microdilisis de la influencia de la transmisin dopaminrgica sobre el glutamato extracelular del estriado. La toxicidad local del glutamato en el estriado y los efectos del glutamato y de los agonistas de los receptores ionotrpicos glutamatrgicos sobre las sinapsis dopaminrgicas nigro-estriatales y sobre las glutamatrgicas intralaminares del tlamo. La accin txica de estos altos niveles de glutamato en las neuronas talmicoestriatales (excitotoxicidad retrgrada). La accin txica de estos altos niveles de glutamato sobre las neuronas dopaminrgicas nigro-estriatales (excitotoxicidad retrgrada).

Material y Mtodos.
Los estudios se llevaron a cabo en ratas Sprague-Dawley macho con pesos comprendido entre 300 y 350 g. Los animales fueron suministrados por el Animalario Central de la Universidad de La Laguna y mantenidos en grupos de dos por jaula con libre acceso a comida y bebida. Las ratas para experimentacin permanecieron en un ciclo estndar de luz-oscuridad (12-12 horas; luz encendida entre las 8:00 y las 20:00) durante las dos semanas previas a su uso y con temperatura ambiental regulada (20-22 C).

ANESTESIA Y CIRUGA ESTEREOTXICA. Todos los trabajos fueron realizados en animales anestesiados para evitar artefactos poco controlables (dolor o el estrs) en el estudio de los mecanismos locales. El anestsico usado fue distinto segn los metabolitos a estudiar. Para la cuantificacin de catecolaminas extracelulares y sus metabolitos derivados se anestesiaron las ratas intraperitonealmente con hidrato de cloral (Acofarma, Barcelona) al 8% en salino (350 l de hidrato de cloral / 100 gramos de rata), mientras que en los estudios de los niveles extracelulares de aminocidos se utiliz equitensn (Rozza et al., 2000), un anestsico generado por la mezcla de agentes depresores (pentobarbital asociado a hidrato de cloral y a etanol) que no modifica los niveles basales de estas molculas y que permite una anestesia prolongada y estable (Rodrguez et al. 1998).

El animal anestesiado fue colocado en el aparato estereotxico (modelo SR-6, Narishige, Japn), donde se fij por el maxilar superior (4 mm por debajo de la lnea interaural) y por los conductos auditivos internos. Una vez en el estereotxico al animal se le introdujo una sonda rectal y se le cubri con una manta trmica (termorregulador RTC-1, Cibertec, Madrid) para mantener su temperatura estable (36,5 0,5 C) durante todo el experimento (Rodrguez y Gonzlez-Hernndez 1999). Se practic una incisin longitudinal en la piel de la cabeza dejando al descubierto la calota, se separ la piel, se localiz el bregma (referencia para el clculo de las coordenadas estereotxicas del estriado y del tercer ventrculo) para la posterior trepanacin del crneo (con un trocar que gira a baja velocidad) en la zona correcta de estudio. Se seccion y retir la duramadre, y se insert en funcin del experimento realizado, bien una cnula de microdilisis o bien una jeringa Hamilton.

Zonas de actuacin Estriado 3er ventrculo

Anteroposterior (AP) 1,0 mm al bregma - 2,0 mm al bregma

Lateral (lnea media) 2,5 m 0,0 m

Profundidad * 7,5 mm 8,0 mm

SN: Sustancia negra. * Bajo la dura. Coordenadas estereotxicas de las zonas donde se realizaron los trabajos experimentales (Paxinos y Watson, 1986)

LESIN DE LAS CLULAS DOPAMINRGICAS. A algunos animales (9 ratas) se les practic una leve degeneracin del sistema dopaminrgico nigro-estriatal, segn protocolo publicado con anterioridad (Rodriguez Diaz, et al. 2001, Rodriguez et al. 2001), que indujo una degeneracin moderada y simtrica de las neuronas dopaminrgicas nigro-estriatales similar a la observada en las primeras etapas la enfermedad de Parkinson. Para la prctica de estas lesiones se inyect (Hamilton 701RN) en el tercer ventrculo 300 g de 6-OHDA (6-hidroxidopamina clorhidrato, Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) en una dosis nica (12 l) de solucin salina estril (0,9%; Fisiolgico Braun NaCL-0.9) con un 0.03% de cido ascrbico jeringas.

MICRODILISIS La microdilisis es una tcnica bioqumica que permite monitorizar las concentraciones extracelulares de las sustancias qumicas presentes en el lquido intersticial circundante, capaces de atravesar la membrana semipermeable (5 kDa de dimetro de poro), desde los tejidos donde se implanta la cnula mediante el paso continuo de lquido de perfusin a travs de la cnula.

El paso de sustancias del medio extracelular al interior de la cnula para su posterior estudio es la dilisis directa. En estos experimentos se analiz la Dopamina, el Glutamato, El DOPAC (cido 3,4-dihidroxifenilacetico) y la Glutamina. La microdilisis tambin permite la perfusin al medio extracelular de distintas sustancias, que en nuestros caso fue el AMPA (cido -amino-3-hidroxi-5-metil-4isoxazolepropionico), la Dopamina, el Glutamato, el KA (Kainato), el NMDA (cido Nmetil-D-asprtico) y el Haloperidol.

Intervalo de adaptacin de la cnula. El implante de la cnula de microdilisis produce algunas reacciones inespecficas en los tejidos implantados (Benveniste y Diemer 1987, Benveniste et al. 1989, Shuaib et al. 1990), pudiendo provocar inflamacin interfiriendo en los resultados de los experimentos. Para minimizar las interferencias, se establece un intervalo de tiempo de espera o de adaptacin tisular desde el implante de la cnula hasta el comienzo del estudio que permita la estabilizacin de las concentraciones de las sustancias presentes en el espacio extracelular. Los estudios se realizaron tras un tiempo de adaptacin comprendido entre 120 y 150 minutos, tras el cual, se recogieron muestras cada 10 o 20 minutos (segn el estudio) durante el curso del experimento. Los dializados obtenidos son procesados on line para el estudio de catecolaminas o bien almacenados a -80 C hasta el momento de su procesamiento y anlisis en el estudio de aminocidos (Garcia Dopico et al. 2004, Rodriguez Diaz et al. 2005)..

Medio de perfusin. El lquido cefalorraqudeo artificial (LCR artificial) o Ringer fue el medio de perfusin empleado en los experimentos (Herrera-Marschitz et al. 1996). Una vez preparado y antes de ser utilizado se le ajusta el pH a 7,2 y se pasa a travs de filtros de 0,2 m de dimetro.

Producto NaCl* KCl* CaCl2 2 H2O** MgCl2 6 H2O* *Merck **Panreac,

PM 58,44 74,55 147,02 203,30

[ ] (g/l) 8,649 0,201 0,176 0,172

[ ]final(mM) 148 2,70 1,20 0,85

Cdigo 1.06404.1000 1.04936.0500 23821.0550 5833.0250

Composicin de la solucin de perfusin: LCR o Ringer

Los componentes aadidos al ringer en los experimentos eran lo suficientemente pequeos para atravesar la membrana semipermeable de la cnula e influir en el tejido.

Nombre del producto AMPA cido ascrbico DA L-GLU Haloperidol KA NMDA cido -amino-3-hidroxi-5metil-isoxazol-propinico Vitamina C 3-Hidroxi-tiramina, Dopamina L-Glutamato -------------cido kanico N-metil-D-aspartato

Cdigo producto / Casa comercial A-1455/ Sigma, 100127/ Merck H-8502/ Sigma G-2128/ Sigma H-1512/ Sigma G-020/ Sigma M-3262/ Sigma

Reactivos perfundidos por la cnula de microdilisis en los distintos experimentos.

Recuperacin de la cnula. La capacidad de recuperacin de las cnulas es uno de factores a tener en cuenta en los experimentos. La recuperacin de una sustancia se define como la relacin entre la concentracin de una sustancia en el dializado y su concentracin uniforme fuera de la cnula. La mayora de los autores realiza una medida sencilla de la recuperacin [o eficiencia de extraccin (EE) de la cnula] (Ao et al. 2004) introduciendo la cnula en una solucin externa de idntica composicin que la del lquido de perfusin y con una concentracin conocida del analito a estudiar. Tras determinar la concentracin del analito en el dializado se realiza por extrapolacin el clculo de las concentraciones de soluto fuera de la cnula en funcin de las cuantificadas en el dializado. Antes de la utilizacin de la cnula, sta es introducida en un vial con una concentracin conocida de un analito, recogido el dializado durante 30 min y analizado su concentracin tanto en la muestra del vial como en el dializado. A partir de la concentracin de ambas muestras se calcula la recuperacin relativa de la cnula (Wang et al. 2007). Slo se usaron las cnulas que posean una tasa de recuperacin de entre un 10% y un 15%, el resto fueron desechadas.

Recuperacin de la cnula. Ejemplo para aspartato y glutamato

La microdilisis se realiz por el procedimiento relatado con anterioridad en los artculos Garcia Dopico et al. 2004 y Rodriguez Diaz et al. 2005. La cnula de dilisis se introdujo en el estriado y tras descartar los primeros 150 minutos del ringer perfundido (2.0 l/min), se procedi a recoger el dializado. Todas las sustancias usadas en los experimentos (DA, haloperidol, glutamato y agonistas ionotrpicos de glutamato) fueron administradas por microdilisis reversa para minimizar el dao inespecfico de la inyeccin en el tejido.

CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN (HPLC) El anlisis bioqumico de las sustancias objetivo de las muestras obtenidas se realiza mediante la tcnica de Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC) de fase reversa acoplado a un detector. Esta tcnica es altamente eficiente en la separacin de los analitos debido al empleo en la fase estacionaria de columnas empaquetadas con componentes de tamao de partcula pequeo y con una capacidad de interaccin muy superior a la de la cromatografa convencional. El cromatograma es la presentacin grfica de la respuesta del detector (valores digitales), bien de la concentracin o bien de otra magnitud de medida de la concentracin de un analito en la fase mvil que abandona la columna frente al volumen del eluyente o frente al tiempo (Garca Dopico et al. 2004, Rodrguez Daz et al. 2005). El glutamato y la glutamina fueron analizados usando HPLC con mtodos de deteccin fluorimtrica de acuerdo con publicaciones previas (Morales et al. 2012; Morales y Rodrguez, 2012).
Componentes * Muestreadorautomtico Horno Control de Temperatura Desgasificador Bombas Columna Detector Fluorescencia Programainformtico Nombre comercial 717 Autosampler TCM, Horno Waters InlineDegasserAF 1525 BinaryHPLCPump NovapackC18, 3.9 x 150 mm 474 ScanningFluorescence Empower Software

* Water Chromatography Division, Milipore Corporation.

Componentes del equipo de HPLC para glutamato y glutamina.

La Dopamina y el DOPAC se estudiaron usando HPLC con detector electroqumico (Rodrguez et al 2007) modificado para poder trabajar con alta sensibilidad con los pequeos volmenes de las muestras de microdilisis. Este equipo presenta varias

novedades en comparacin con el usado para las medidas de la glutamina y el glutamato, como son: la deteccin on line de forma que la muestra sale de la cnula directamente al HPLC, la deteccin electroqumica (por oxidacin) y el uso de una sola fase mvil (Afonso et al. 1990, Rodriguez y Castro 1991). Las muestras para la determinacin de Dopamina y DOPAC fueron inyectadas cada 20 minutos desde la cnula y detectadas con un potencial de 0,3 V, evitando as la interferencia de otras sustancias cuyos tiempos de elucin fueran mayor a 20 minutos.
Componentes Inyector Desgasificador Bomba Columna Detector electroqumico Programa informtico Nombre comercial Two-Position Six-Port Switching Valve InlineDegasserAF 515 HPLCPump Symmetry C18 Column, 3.5 m, 1.0 x 150 mm 2465 Electrochemical Detector Empower Software

* Water Chromatography Division, Milipore Corporation.

Componentes del equipo de HPLC para la determinacin de Dopamina y DOPAC

EXTRACCIN CEREBRAL, HISTOLOGA Y TINCIN DE LAS MUESTRAS. Al final de los experimento las ratas recibieron una sobredosis de hidrato de cloral y fueron perfundidas transcardialmente con 200 ml de solucin salina 0,9% (B. Braun Medical S.A., Barcelona) y 400 ml de paraformaldehido (PFA) (Panreac, Barcelona) al 4% (Fox et al.1987) en tampn fosfato salino o PBS 0,1M (PH = 7,4). Se extrajeron los cerebros y se almacenaron en la misma solucin de fijacin durante 12 horas a 4C, siendo luego incluidos en una solucin crioprotectora de sacarosa (Panreac, Barcelona) al 30% en tampn fosfato hasta su completa inmersin (48h). Los cerebros se cortaron en secciones de 30 m de grosor siguiendo el plano transversal en un microtomo de congelacin (Microm HM 450, ThermoScientific). Las secciones se recogieron en 7 series paralelas que fueron conservadas a -80C en la misma solucin de sacarosa al 30% hasta su uso, tras comprobar con tincin de Nissl que la colocacin de la cnula era la adecuada. Las tcnicas de inmunohistoqumica y de inmunofluorescencia fueron realizados por el mtodo de flotacin o freefloating donde los cortes quedan suspendidos en recipientes a los que se van aadiendo de forma consecutiva los distintos reactivos. Todas las incubaciones y lavados se hacen con agitacin constante asegurando una reaccin homognea en todo el corte y una mxima penetracin del anticuerpo.

Se realizaron controles para ambas tcnicas, inmunohistoquimia e inmunofluorescencia, en donde se omiti el anticuerpo primario, dando como resultado marcaje negativo. Tincin de Nissl (violeta de cresilo) Para la comprobacin de la colocacin de la cnula de microdilisis realizaremos una tincin de Nissl con Violeta de Cresilo (Sigma). Las secciones fueron lavadas en PBS 0.1 M, montadas en portas gelatinizados y dejadas secar en una estufa durante 48 horas. Posteriormente, los portaobjetos fueron sumergidos durante 15 minutos en violeta de cresilo al 0.5% y posteriormente aclarados durante 5 minutos con agua destilada. Seguidamente fueron deshidratados sumergindolos durante 5 minutos en alcoholes (Panreac, Barcelona) de concentraciones crecientes, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% y 100%, y aclarados durante 10 minutos en xileno (Panreac, Barcelona). Finalmente se cubiertos con EUKITT (Panreac, Barcelona) y con un cubreobjetos. Estos cortes fueron examinados bajo el microscopio ptico Leica DM2500. Inmunohistoqumica. Los cortes histolgicos fueron descongelados y lavados varias veces en PBS 0,1 M, posteriormente fueron tratados con una solucin de H202 al 3% durante 30 minutos para desactivar las peroxidasas endgenas y evitar su interferencia durante el revelado. Seguidamente los cortes se lavaron varias veces en PBS 0,1M e incubados durante una hora en la solucin de bloqueo: 4% suero normal de cabra (NGS, Sigma) y 0.05% Tritn X-100 (Sigma) en PBS para minimizar las posibles uniones inespecficas anticuerpo-tejido y facilitar la penetracin del anticuerpo. Al trmino de la hora, las secciones fueron depositadas durante toda la noche y a temperatura ambiente, en una solucin igual que la anterior, pero con los anticuerpos primarios a la concentracin correspondiente (vase tabla 1). Al da siguiente y tras varios lavados en PBS0,1 M, los cortes fueron incubaron 2 horas con el anticuerpo secundario biotinilado apropiado (vase la tabla 2) y 1:200 NGS en PBS. Posteriormente, las secciones se volvieron a lavar con PBS 0,1M y se incubaron de 1 a 2 horas en extravidina-HRP en PBS0,1 M. Seguidamente, se aadi a los cortes una solucin de diaminobencidina (DAB), H2O2 y tampn cacodilato, que tras unos minutos (3-5 minutos) revel la inmunohistoqumica. Las secciones fueron nuevamente lavadas en PBS 0,1 M y montadas en portas gelatinizados donde se dejaron secar al aire y a temperatura ambiente. Una vez secos, los cortes fueron deshidratados pasndolos por alcoholes cada vez ms concentrados (80, 90, 96, 100 %), aclarados con xileno y cubiertos con EUKITT (Panreac, Barcelona) y un cubreobjetos. Los cortes fueron examinados bajo el microscopio ptico LeicaDM2500. Se realizaron controles para cada estudio inmunohistoqumico inmunofluorescencia mediante la eliminacin del anticuerpo primario. y de

Producto ClNa NaH2PO4.H20 Na2HPO4.2H20 Agua destilada

Cantidad 83 g/l 3.45 g/l 10.65 g/l 1 litro

Cdigo 10604 106346 106580

Casa comercial Merck, Whitehouse station NJ Merck, Whitehouse station NJ Merck , Whitehouse station NJ Merck-Millipore

Tampn fosfato salino o PBS 0.1M

Inmunofluorescencia. El procesamiento general es similar al de la inmunohistoqumica con la excepcin de que no se inhiben las peroxidasas endgenas del tejido porque no hay revelado con DABpara la visualizacin de las protenas que nos interesan sino que se usan fluorforos. Tras 60 minutos inmersos en la solucin de bloqueo, los cortes permanecieron toda la noche en una mezcla de dos anticuerpos primarios (obtenidos de diferentes especies). Fueron varias veces lavados en PBS0,1 M, e incubados durante 2 horas en anticuerpos secundarios frente a inmunoglobulinas de los huspedes de los que se extrajeron los anticuerpos primarios, conjugados con rodamina X red (emiten en longitud de onda del rojo-naranja a 590 nm) o con biotina en las concentraciones correspondientes (vase tabla 2) junto con 1:200 de NGS en PBS 0,1 M. Despus de varios lavados en PBS 0,1 M y en caso necesario (al utilizar secundarios con biotina), se incub durante 2 horas en una solucin de estreptavidina unido al fluorforo Cy2 (emite en la longitud de onda del verde, en 506 nm). En algunos estudios se marcaron los ncleos aadiendo a los cortes una solucin 30 nM de DAPI (4',6-Diamidino-2-fenilindol, emite en azul a 455 nm) durante 1 minuto para marcar los ncleos de las clulas. Finalmente, tras ser lavados en PBS0,1 M se montaron los cortes en portas gelatinizados, fueron secados ligeramente en una cmara oscura, y cubiertos con Vectashield (Vector Laboratories) y con un cubreobjetos. Para preservar la muestra, el cubreobjetos fue sellado con esmalte transparente de uas. Las secciones fueron examinadas en el microscopio de epifluorescencia Leica DM2500 o en el confocal OlympusFV10-ASW2Q mediante el uso de los filtros apropiados.

Anticuerpo primario
Producto Anti-TH Anti-TH Anti-GFAP Anti-GFAP Anti-GLU Anti-NeuN Anti-CD68 Anti-vGluT2 Anti-CB Antgeno al que reconoce/ Concentracin de uso/ Animal de procedencia Tipo de anticuerpo Tirosina hidroxilasa / ratn Tirosina hidroxilasa / conejo Protena cida fibrilar glial / conejo Protena cida fibrilar glial / ratn Aminocido glutamato / conejo Protena especfica neuronal nuclear / ratn Macrosialin- microga activada / ratn Transportador vesicular de glutamato isoforma 2 (tlamo)/ ratn Calbindina/ ratn monoclonal/ 1:12000 policlonal/ 1:1000 policlonal/ 1:1000 monoclonal/ 1:800 policlonal/ 1:1000 monoclonal/ 1:600 monoclonal/ 1:1000 monoclonal/ 1:600 monoclonal/ 1:500 Casa comercial T2928- Sigma T8700- Sigma G9269- Sigma MAB360-Chemicon (Millipore) MCA341GA-AbdSerotec, MAB377-Chemicon (Millipore) MCA341GA-AbdSerotec, MAB5504-Chemicon (Millipore) C9848- Sigma

Tabla 1. Lista y concentraciones de anticuerpos primarios utilizados.

Anticuerpo secundario/estravidinas/otros reactivos

Producto/ Animal de procedencia Biotina anti ratn/ cabra X red rhodamine anti conejo / cabra Cy2-streptavidina Dapi (4',6-Diamidino-2-Penilindol) Triton X-100 NGS (suero normal de cabra) ExtrAvidina conjugada HRP (HRP:peroxidasa de rbano) DAB (diaminobencidina) Concentracin de uso/ Tipo de reactivo 1:1200/ anticuerpo 2 1:3000/anticuerpo 2 1:200/estreptavidina 300nM 0.05%/ disolvente 4% o 0.5% /bloqueante de uniones inespecficas 1:5000/estreptavidina 0.005% Casa comercial 115-065-003 /Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. 111-295-144 / Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. 016-220-084 / Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. D1603 / Life Technologies . X-100 / Sigma G9023- Sigma E-2886 / Sigma D-5637 / Sigma

Tabla 2. Lista y concentraciones de anticuerpos secundarios, estravidinas y otros reactivos utilizados.

ESTUDIOS CUANTITATIVOS Densitometra de las inervaciones al estriado El estudio densitomtrico de la inervacin dopaminrgica nigro-estriatales y glutamatrgicas tlamo-estriatales alrededor de la cnula de microdilisis se realiz cuantificando la intensidad del marcaje para la TH+ y Vglut2 en cubos de 20 alto x 20 ancho x 3 micras de espesor localizados a diferentes distancias de la cnula de microdilisis (se contabilizaron 49 reas alrededor de la cnula). La densitometra fue realizada de acuerdo con los mtodos mencionados previamente (Gonzalez-Hernandez et al. 2002; Gonzalez-Hernandez et al. 2004, Cruz-Muros et al. 2007) y mediante el uso de microscopa confocal (microscopio FV1000, Olympus) del programa FV10-ASW (versin 01.07.01.00) Image-Pro Plus (Medios de comunicacin ciberntica). Los valores de densitometra obtenidos en el estriado inyectado fueron normalizados como un porcentaje de los valores calculados para la misma regin estriatal del estriado contralateral. La degeneracin neuronal en la regin circundante a la cnula de microdilisis fue evaluada mediante inmunohistoqumica para NeuN. Para evitar las variaciones las condiciones en el protocolo y en los reactivos usados para las inmunohistoqumicas, todos los cortes fueron procesados simultaneamente.

Cuantificacin neuronal. Para el estudio de la degeneracin retrgrada se realiz un recuento de las neuronas dopaminrgicas de la sustancia negra y de las neuronas glutamatrgicas talmicas en el cerebro ipsilateral y en el contralateral a la perfusin. En el estudio de la posible degeneracin retrgrada de las clulas DArgicas se contabiliz el nmero de clulas TH+ en el mesencfalo con la ayuda del programa Image-Pro Plus (Maryland, EE.UU.). Se cuantific tres regiones correspondientes a las clulas de las reas A8, A9 y A10 en seis cortes por rata y siguiendo los procedimientos de estudios anteriores (Gonzalez-Hernandez et al. 2004, Gonzalez-Hernandez et al. 2000, Rodriguez et al. 2001). El nmero de clulas contadas para cada regin se refiri al clculo para la misma regin en el mesencfalo contralateral. De forma que, de no haber degeneracin, el porcentaje de clulas TH contadas en el mesencfalo ipsilateral del estriado inyectado sera alrededor del 100%. El estudio de la degeneracin retrgrada de las clulas del tlamo se realiz contando en seis cortes por rata el nmero de neuronas (clulas NeuN+) en los ncleos del tlamo que proyectaban al estriado. Los ncleos talmicos estudiados fueron: el centrolateral (CL), el paracentral (PC), el paratenial (PT), el ncleo parafascicular pars lateral (LPF), el central medial (CM) y el ncleo parafascicular de la pars medialis (MPF). El nmero de clulas contadas en los ncleos del tlamo ipsilateral perfundido se normaliz como el porcentaje del total de clulas contadas en los ncleos de ambos lados del cerebro. Si no hubiera degeneracin, el porcentaje de clulas cuantificado en los ncleos intralaminares ipsilaterales al estriado inyectado sera del 50%.

ANLISIS ESTADSTICO Los datos fueron inicialmente evaluados mediante un anlisis de varianza simple (one way ANOVA) seguido por el test LSD o Scheff para comparaciones "post-hoc" mltiples. La comparacin de frecuencia fue realizada mediante el test de X2. Se utiliz para ello el programa Statistic (Statsoft; Tulsa, EE.UU.). Se utiliz un nivel de probabilidad p < 0,05 para asignar significacin estadstica.

Experimentos. Procedimiento.
N1. Efecto de la dopamina en la transmisin glutamatrgica estriatal. La influencia de la transmisin dopaminrgica sobre el glutamato y la glutamina se estudi mediante la administracin por microdilisis reversa de 3,33 mM de dopamina o 0,1 M de haloperidol a lo largo de 60 minutos. La solucin ringer utilizada durante el perodo anterior a la administracin de dopamina contena 0,4 mM de cido ascrbico al igual que la solucin perfundida de dopamina para evitar la oxidacin de la dopamina durante su administracin. El haloperidol se disolvi inicialmente en cido actico y luego se diluy en ringer (1 mM haloperidol en 19,1 mM de cido actico / ringer; pH: 6,0). Los experimentos se llevaron a cabo en 2 grupos de 8 ratas. La concentracin extracelular de glutamato y de la glutamina fue cuantificado por HPLC con detector fluorimtrico en muestras perfundidas recolectadas cada 15 minutos.

N2. Efecto de la levodopa intraperitoneal en la transmisin dopaminrgica y glutamatrgica estriatal de ratas denervadas con 6-OHDA. La relevancia de la interaccin dopamina-glutamato para la accin de la levodopa en la enfermedad de Parkinson fue estudiada en ratas a las que previamente se les haba degenerado una parte importante de la inervacin dopaminrgica del estriado como ya se explic en Material y mtodos. La accin de la levodopa sobre el nivel estriatal de la dopamina, del DOPAC, del glutamato y de la glutamina fue estudiada por medio de microdilisis reversa en un grupo de 9 ratas lesionadas 30 das antes con 6-OHDA. Se les inyect en primer lugar benserazida (40 mg / kg; intraperitoneal), inhibidor perifrico de la enzima dopa descarboxilasa, y 20 minutos ms tarde levodopa (100 mg / kg; intraperitoneal), tratamiento ms usado en el control sintomtico de la enfermedad de Parkinson. La concentracin extracelular de dopamina y de DOPAC fue monitorizada "on line" mediante HPLC con detector electroqumico, mientras que la variacin del glutamato y de la glutamina fue cuantificado "off line" por HPLC con detector fluorimtrico en muestras perfundidas recolectadas cada 20 minutos, comenzando la colecta de muestras 90 minutos antes de la administracin de levodopa y continundola durante 200 minutos despus de la administracin de levodopa.

N3. Excitotoxicidad glutamatrgica estriatal y degeneracin retrograda. Se evalu el efecto txico inducido por la administracin extracelular de glutamato y de los agonistas ionotrpicos de los receptores glutamatrgicos sobre las terminales sinpticas dopaminrgicas y glutamatrgicas, y se estudi la produccin de excitotoxicidad retrgrada a distancia sobre las clulas dopaminrgicas nigro-estriatales (cuantificada en la sustancia negra) y glutamatrgicas tlamo-estriatales (cuantificada en los ncleos intralaminares del tlamo) (Smith 2009, 2004). Para ello fueron necesarios 5 grupos de 6 ratas, dos para el estudio de las concentraciones de glutamato perfundidas (1mM y 10 mM) y tres grupos para cada uno de los agonistas glutamatrgicos (AMPA, NMDA y kainato). Todos los frmacos se administraron por microdilisis reversa durante 60 minutos. Las ratas fueron sacrificadas, segn el protocolo descrito, de cuatro a seis semanas despus de la perfusin para el posterior estudio histolgico de los cerebros. Se les realiz una inmunohistoqumica anti-TH, anti-CD68 y anti-NeuN todos hechos en ratn y revelados con DAB y tambin un doble marcaje de inmunofluorescencia con anti-TH de conejo y VGlut2 o anti-TH de ratn y anti -NeuN de conejo, o anti-VGluT2 de ratn y anti-NeuN de conejo. Posteriormente, las secciones fueron sumergidas en una solucin de PBS que contena anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo conjugado con Rodamina Red X, anticuerpo de cabra anti-IgG de ratn biotinilado, seguido de una solucin de PBS con estreptavidina conjugada con Cy2. Despus de varios lavados, las secciones fueron montadas en portaobjetos gelatinizados, secado al aire, cubiertas con Vectashield (Vector), y examinada bajo un microscopio confocal utilizando los filtros adecuados. Algunas de las secciones se las ti con DAPI justo antes de ser montados.. Se realiz la cuantificacin tanto de la inervacin dopaminrgica y glutamatrgica alrededor de la cnula de microdilisis, como del nmero de neuronas en los ncleos del tlamo que proyectan al estriado y en la sustancia negra segn lo descrito en Material y Mtodos.

Resultados
N1. Efecto de la dopamina en la transmisin glutamatrgica estriatal. La concentracin basal del los niveles extracelulares de glutamato se situ entre 0.65 and 1.9 M (1.20.3 M). La perfusin de dopamina produjo un descenso rpido y marcado en la concentracin extracelular de glutamato (F (8) = 14,53, p <0,001; figura 2) y de glutamina (F (8) = 17,30, p <0,001; figura 2). El efecto opuesto se observ cuando los receptores de dopamina fueron bloqueados con haloperidol, circunstancia que aument el glutamato (vase lado izquierdo de la figura 2.2) y la glutamina (vase el lado derecho de la figura 2.2).

Estriado
Glutamato
200 200 180 180 160 160 140 140 120 120

Glutamina
350 300 250

%% 100 100
% %

80 60

40 20
0
-40 0 40

** ** *
80 120

200 150 100 50 0

-40 0 40

** ** *
80 120

min cido ascrbico

cido ascrbico dopamina

cido ascrbico dopamina

* p<0.05 vs. cido ascrbico

* *

p<0.01 vs. cido ascrbico

Figura 22. Efecto del cido ascrbico y de la dopamina sobre el nivel extracelular de glutamato y glutamina en el estriado. Los datos se muestran como porcentajes de la media de las tres muestras (40 min) anteriores a la perfusin del cido ascrbico en cada experimento (media error estndar).

Estriado: Haloperidol
* * ** ** * * * *
40

700 600 500

%

Glutamato

350 300

Glutamina

* * * *
% 0 40 80 120

250 200 150 100 50 0

400 300 200 100 0

min * p<0.05 vs. nivel basal

Figura 23: Efecto del haloperidol sobre el nivel extracelular de glutamato y glutamina en el estriado. Los datos se muestran como porcentajes del valor calculado de la muestra anterior a la administracin de haloperidol (media error estndar).

* *

min p<0.01 vs. nivel basal

80

120

Estos datos sugieren que la dopamina estriatal induce una inhibicin de la liberacin de glutamato donde probablemente estn involucrados los receptores D2 de dopamina (como sugiere el efecto provocado por el haloperidol)

N2. Efecto de la levodopa en la transmisin dopaminrgica y glutamatrgicaestriatal de ratas denervadas con 6-OHDA. La administracin intraperitoneal de levodopa aument el nivel extracelular de dopamina (F (9) = 2.13, p <0,05) y DOPAC (F (9) = 8.84, p <0,001) en el estriado (figura 3 lado izquierdo) de ratas lesionadas con 6-OHDA. El estudio de la transmisin glutamatrgica en las mismas muestras de dializado mostraron una disminucin marcada de glutamato (F (9) = 17.23, p <0,001) y glutamina (F (9) = 9.44, p <0,001) durante la administracin de levodopa (figura 3 lado derecho).

Estriado: administracin de levodopa a ratas lesionadas con 6-OHDA

1000 800 600
% %

Dopamina

* * * *
%

140 120 100 80 60 40

%

Glutamato

400 200 0
0 40 80 120 160

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *

20 0
0 40 80 120 160

min

min

300 250 200

%%

DOPAC

* * * * * * * * * * * * *

120 100 80
% %

150 100 50 0
0 40 80 120 160

60 40 20 0
0

* Glutamina * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *

40

80

120

160

min

min

levodopa

levodopa

* p<0.05 vs. ringer

* p<0.01vs. cido ascrbico *

* * *

p<0.001 vs. cido ascrbico

Figura 24: Efecto de la levodopa en el nivel extracelular de la dopamina, el DOPAC, la glutamina y el glutamato en un estriado denervado. Los datos se muestran como porcentajes del valor calculado justo antes de la perfusin de la levodopa (media error)

N 3. Excitotoxicidad glutamatrgica estriatal y degeneracin retrograda. La administracin de glutamato indujo un aumento transitorio de la concentracin extracelular de dopamina (F (9) = 4.12, p <0,001) y una disminucin persistente del DOPAC (F (9) = 49.27, 0 <0,001) en el estriado (figura 1).

Estriado: glutamato
DA
2500

120 100

DOPAC

* * * *
%

2000

80

* * * *

1500

1000

* * * * *

60 40 20 0

** * ** * ** * * * *

500

-40

40

80

120

min

-40

40

80

120

min

Glutamato

Glutamato

p<0.01 vs. Nivel basal

Figura 19: Efecto del glutamato sobre el nivel extracelular de dopamina y DOPAC en el estriado. Los datos se muestran como porcentajes de la media de las tres muestras que precedieron a la perfusin de glutamato en cada experimento (media error estndar).

* *

p<0.001 vs. Nivel basal

La administracin de glutamato 1 y 10mM (figuras 4.2A-4.2D), de NMDA (figuras 4.2E y 4.2F), de AMPA (figuras 4.2G y 4.2H) y de kainato (figuras 4.2I y 4.2J) indujeron prdida de neuronas (NeuN +) estriatales sin disminucin de las terminales sinpticas TH + en las regiones estriatales alrededor de la cnula de microdilisis (figuras 4.2T-4.2X). Las figuras 4.3D-4.3G son un ejemplo de la prdida sinptica observada en las neuronas tlamo-estriado (VGluT2 en verde) de la regin del estriado alrededor de la cnula de microdilisis (figuras 4.2D-4.2E) Las figuras 4.4I y 4.4J muestran una prdida selectiva de terminales glutamatrgicas (4.4J) en la regin del estriado alrededor de la cnula de microdilisis donde no se observ prdida alguna de terminales dopaminrgicas (4.3J).

500 m

GLU 1 mM D

500 m

CD68

NeuN

TH

CD68

NeuN

TH

GLU 10 mM J 250 m

250 m

CD68

NeuN
250 m

TH

CD68
250 m

NeuN

TH
250 m

NMDA 0.5 mM K L

AMPA 0.5 mM M

Kainato 0.5 mM

CD68

CD68

CD68

NeuN

NeuN

NeuN

TH

TH

TH Les

T
Iny

Les

100 m

30 m

Les

Les

3 m

20 m

Figura 14. Ejemplos que muestran la distribucin tpica de la microgla activada (CD68), las neuronas (NeuN) y la inervacin dopaminrgica (TH) en el tejido estriatal que rodeaba a la cnula de microdilisis (cortes perpendiculares a la trayectoria de la cnula). Las reas que muestran prdida de neuronas despus de la perfusin de glutamato (Glu) 1 mM (A a F),de Glu 10 mM (G a L), de n-metil-d-asprtico (NMDA) 0,5 mM (K, N y Q), cido RS--amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol propinico (AMPA) 0,5 mM (L, S y R) y kainato 0,5 mM (M, P y S) estn rodeados con una lnea de puntos. Ejemplo de la persistencia de la inervacin dopaminrgica en regiones del estriado que mostraron degeneracin celular despus de la perfusin de GLU (imgenes de la parte inferior, T a X). Las sinapsis y los axones dopaminrgicos se muestran en rojo (TH +) y las neuronas del estriado se muestran en verde (NeuN +). Iny: rea de la inyeccin, Les: regin con degeneracin de las clulas del estriado.

r1 r2
V

iny

TH NeuN

r1

r2

A
iny iny

TH NeuN

iny

TH NeuN

Dapi NeuN

Dapi VGlut2

Dapi NeuN

Dapi vGluT2

A C D

iny

iny

iny

r3

r3 r4
vGluT2

r4

TH

r4 r3
F

F r4 r3
F

L
F

iny TH Dapi vGluT2

Figura 15. La denervacin tlamo-estriatal y nigro-estriatal despus de la perfusin de glutamato en el estriado. A: sinapsis dopaminrgicas (botones TH + en rojo) del estriado no lesionado distribuidas alrededor de los tractos estriatales (marcadas en pseudocolor cian -F-), vasos (V) y neuronas (las neuronas NeuN + en verde). B y C: inervacin dopaminrgica (botones TH + en rojo) en las regiones del estriado circundantes a la cnula de microdilisis (INY) que present (r1) o no (r2) prdida neuronal (NeuN + neuronas en verde). D-G: inervacin tlamo-estriatal (botones VGluT2 en verde) alrededor de la cnula de microdilisis (D y E) donde se observ prdida de la misma e inervacin tlamo-estriatal en la regin homloga del estriado contralateral (F y G) (ncleos de clulas DAPI + en color azul y neuronas DAPI + / NeuN + en azul / rosa). H-J: regin del estriado (r3) alrededor de la cnula de microdilisis (iny) que mostr una inervacin dopaminrgica normal (botones rojos TH + en I) con prdida de inervacin glutamatrgica (botones verdes VGluT2 + en J). Regin (r4) alejada de la cnula de microdilisis con inervacin dopaminrgica y glutamatrgica normal. K-M: otro ejemplo de denervacin tlamoestriatal (r3) alrededor de la cnula de microdilisis (INY). L: regin del estriado (r4) mostrando una inervacin dopaminrgica (botones TH + en rojo) y glutamatrgica (botones VGlut2 + en verde) normales. M: regin (r3) con una inervacin dopaminrgica normal (botones TH + en rojo) acompaado de denervacin glutamatrgica (botones VGlut2 + en verde) (F apunta a las zonas de fibras).

No se observ prdida de neuronas dopaminrgicas mesenceflicas tras la administracin de los distintos productos perfundidos en el estriado (figuras 4.4A-4.4C muestran clulas TH + y figuras 4.4D-4.4F muestran clulas NeuN +). La parte inferior de la figura 4.4 muestra el nmero de neuronas TH inmunorreactivas en la sustancia negra (clulas A9), en el rea tegmental ventral (clulas A10) y en el ncleo retrorrubral (clulas A8) como porcentaje del nmero de clulas TH contadas en la misma regin mesenceflica del lado contralateral del cerebro. No se observ ningn efecto significativo en este caso para ninguno de los frmacos en ninguna de las regiones mesenceflicas estudiadas. Sustancia negra
A
A9
MFB

B
A9
A10

A10

A8

A8

TH

-7.6 mm

NeuN

-7.6 mm

1 mm

C D

THNeuN TH NEUN
TH

% cerebro contralateral brain contralateral %

140 120 100 80 60 40 20 0

A8
SHAM (Ringer) NMDA 0.5 mM

NeuN

A9
GLU 1 mM AMPA 0.5 mM GLU 10 mM Kainato0.5 mM

A10

Figura 16. La distribucin en corte axial de las clulas mesenceflicas A (clulas TH +) y B (NeuN + clulas). Un detalle de la porcin anterior de la sustancia negra se muestran en C y D (clulas TH + en rojo y ncleos de neuronas NeuN + en verde). El nmero de las clulas dopaminrgicas se calcul contando las neuronas NeuN+ y TH+ (flechas amarillas). Las flechas de color turquesa indican dos ejemplos de neuronas nigrales no computado en el estudio. ANOVA: F = 0,98 / p = 0,42 para el A8 clulas, F = 1,03 / p = 0,39 para clulas A9, y F = 1,38 / p = 0,23 para las clulas A10.

El nmero de neuronas (clulas NeuN) en los ncleos intralaminares del tlamo no disminuy en las ratas control (figura 4.5). La administracin de glutamato no indujo ningn efecto sobre el nmero de neuronas cuantificadas en los ncleos intralaminares dorsal (figura 4.5A), lateral (figura 4.5B) y medial (figura 4.5C) del tlamo. Los agonistas ionotrpicos glutamatrgicos perfundidos en el estriado disminuyeron el nmero de neuronas talmicas. La disminucin celular en los ncleos intralaminares del tlamo observada para todos los agonistas glutamatrgicos, fue ms evidente para el AMPA en el tlamo medial (figura 4.5C). As, mientras que los agonistas glutamatrgicos inducen efectos en el estriado y el tlamo, el glutamato induce un claro efecto en el cuerpo estriado, pero no en el tlamo. Ncleos talmicos intralaminares

A
NMDA
1V 2V

Tlamo dorsal
55

CL + CP

sm

50

%
45

*** ***

CL
3V

fr
Lado no inyectado
300 m

Lado inyectado

CL

40

Tlamo lateral
55

AMPA

fr

lPF

3V

50

* ** ***

lPF

%
45

lPF
Lado inyectado Lado no inyectado
300 m

4 0

C
AMPA CM

Tlamo medial
55

mPF + CM

50

*
%
45 3V

* ** *

fr
Lado no inyectado
300 m

CM
40

Lado inyectado

* p<0.01 lado inyectado vs. no inyectado

SHAM

GLU-1

NMDA

* p<0.001 lado inyectado vs. no inyectado *

AMPA kainato

Figura 17. Neuronas NeuN + de los ncleos intralaminares del tlamo despus de la perfusin de ringer (control), glutamato 1 mM, NMDA 0,5 mM, AMPA 0,5 mM y kainato 0,5 mM (KA). Ejemplo de la imagen (arriba) y del contaje de clulas (inferior) para cada centro. ANOVA para los ncleos intralaminares del: tlamo ventral (ANOVA F = 11,35 / p <0,001), tlamo dorsal (F = 18,60 / p <0,001), tlamo medial (F = 12,18 / p <0,001), tlamo lateral (F = 5,23 / p <0,001), y tlamo dorsal (F = 11,35 / p <0,001). 1V: 1 ventrculo; 2V: 2 ventrculo; 3V: 3 ventrculo; SM: estra medularis; fr: fascculo retroflexus; LPF: parafascicular ncleo pars lateral; CM: ncleo central medial, ncleo centrolateral (CL), ncleo de paracentral (PC); parafascicular ncleo pars medialis (MPF). Los valores se muestran como un porcentaje del nmero medio de clulas computado para las mismas regiones del cerebro contralateral (media error estndar).

Las regiones talmicas que mostraban prdida neuronal despus de la administracin estriatal de agonistas glutamatrgicos mostraron siempre una activacin microglal local. En la figura 4.6 se muestra la activacin microglial (expresin CD68) en uno de los ncleos intralaminares (ncleo centrolateral) que mostr prdida neuronal (vase las clulas NeuN en la parte inferior de la figura 4.6) despus de la perfusin estriatal de kainato. Este doble efecto (prdida neuronal + activacin de la microgla) se observ slo en el lado del cerebro ipsilateral a la perfusin en el estriado. No se observ una activacin microglial similar en la sustancia negra.
A
3V (dorsal)

B
B

100 m

100 m

CL
CD68

CL
500 m

C
3V (dorsal)

100 m

100 m

CL

CL

NeuN
Lado inyectado

500 m

Lado no inyectado

Figura 18. Clulas de la microgla activada (CD68 +) y neuronas (NeuN +) en los ncleos intralaminares tras de las lesiones del estriado. Ejemplo de la activacin microglial (arriba) y de la degeneracin neuronal a distancia (abajo) en el ncleo centrolateral (CL) del tlamo dorsal. El nmero de neuronas es menor en el CL ipsilateral al estriado inyectado con kainato 0.5mM (C) que en el CL contralateral (D). La microgla activada se observ en el CL ipsilateral al estriado de la inyeccin de kainato (A), pero no en el CL contralateral. 3V: ventrculo tercero.

Discusin.
La inhibicin de la transmisin dopaminrgica aumenta los niveles de glutamato en el estriado, un efecto confirmado mediante la administracin local de agonistas y antagonistas de la transmisin dopaminrgica y mediante la administracin perifrica de L-Dopa (que incrementa la dopamina y reduce el nivel de glutamato en el estriado). La facilitacin de la accin extrasinptica estriatal del glutamato (perfusin local de glutamato y de los agonistas de los receptores glutamatrgicos) degenera las terminales sinpticas y los somas de las neuronas de las neuronas tlamo-estriatales sin daar las neuronas nigroestriatales. Estos datos sugieren que la reduccin de la dopaminrgica en el estriado y el consiguiente aumento de glutamato extracelular es el mecanismo de degeneracin tlamo-estriatal en la EP, apoyando la hiptesis de la degeneracin glutamatrgica retrgrada.

La dopamina inhibe la liberacin de glutamato en el estriado La dopamina perfundida por microdilisis reversa disminuye el glutamato extracelular a valores por debajo del 10% de su concentracin basal, sugiriendo que la dopamina induce una inhibicin importante de la liberacin del glutamato en el estriado. El aumento de glutamato observado despus de la perfusin local de haloperidol, sugiere que los receptores de DA estn implicados en la respuesta, receptores que se encuentran en los terminales sinpticos de las aferencias glutamatrgicas de la corteza y del tlamo Mitchell y Doggett, 1980; Rowlands y Roberts, 1980; Maura et al., 1988; Carlsson y Carlsson, 1990; Garcia-Munoz et al., 1991; Calabresi et al., 1993; Fisheret al., 1994; Moss & Bolam, 2008). El glutamato glial podra participar en la respuesta del glutamato a la dopamina. Los astrocitos tienen un amplio reservorio de glutamato (Morales y Rodriguez, 2012) que puede ser liberado al medio extracelular por diferentes mecanismos (Pasti et al., 1997; Bezzi et al., 1998, 2004; Araque et al., 1999; Overstreet, 2005) incluyendo la estimulacin de receptores D2 de dopamina que se expresan en estas clulas (Bal et al., 1994; Khan et al., 2001; Miyazaki et al., 2004; Morales et al., 2012). Esta posibilidad se encuentra respaldada por el hecho de que el reservorio de glutamato de la gla es la principal fuente del glutamato extracelular, y que seguramente el glutamato que podemos estudiar por microdilisis sea ste (Del Arco et al., 2003; Garcia Dopico et al., 2004; Rodriguez Diaz et al., 2005). El reservorio de glutamato extrasinptico puede difundir varias micras a lo largo del medio extracelular (Rodriguez Diaz et al., 2004), produciendo efectos tardos y persistentes en los receptores glutamatrgicos extrasinpticos de larga distancia (Agnati et al., 1995; Zoli et al., 1998; Contreras et al., 2002; Del Arco et al., 2003) que pueden ser la base de los efectos txicos del glutamato sobre las terminales aferentes al estriado. La accin de la dopamina sobre la concentracin de glutamato extracelular tambin es efectiva incluso cuando el sistema nigro-estriatal dopaminrgico se encuentra degenerado parcialmente. La administracin perifrica de levodopa en ratas

con denervacin dopaminrgica estriatal parcialmente degenerada (Rodriguez et al., 2001; Rodriguez Diaz et al., 2001) incrementa los niveles estriatales de dopamina y dopac, de acuerdo con estudios previos publicados donde se expone que la administracin de levodopa facilita la liberacin en el estriado de DA en ratas con degeneracin dopaminrgica parcial (Abercrombie et al., 1990; Kannari et al., 2000; Marburger et al., 2000). Este efecto se acompa de un descenso de glutamato y glutamina extracelular, lo cual muestra que la accin inhibitoria de la dopamina sobre el glutamato extracelular no se desvanece tras la degeneracin de la inervacin dopaminrgica nigro-estriatal. Todos estos datos sugieren que la deplecin dopaminrgica en la EP est seguida de una activacin del glutamato extrasinptico, un efecto que puede ser parcialmente revertido con la administracin de levodopa perifrica.

La alta vulnerabilidad de las neuronas glutamatrgicas tlamo-estriatal La sobre estimulacin glutamatrgica del estriado afecta a las terminales glutamatrgicas (estriado) y a los somas neuronales (ncleos intralaminares del tlamo) tlamo-estriatales, y se acompa de microgliosis talmica y estriatal. La tasa de transferencia a la que los productos cruzaban la membrana de microdilisis (10-15 % cuando fue valorada in vitro, antes del experimento) sugiere que la perfusin de 5mM de glutamato incrementa la concentracin extracelular de glutamato hasta 500 M, una concentracin que rpidamente disminua por difusin y por la accin de los transportadores glutamatrgicos. Esta concentracin de glutamato es ms de 10 veces inferior a la que se encuentran en las hendiduras sinpticas (3-5 mM) durante la neurotransmisin, pero unas 10 veces mayor que la observada en el espacio extrasinptico (1-2 M). Por consiguiente, el glutamato perfundido pudo haber incrementado el nivel de glutamato no sinptico y no el sinptico, sugiriendo que las acciones sobre las neuronas probablemente estn ligadas a receptores de glutamato de transmisin de volumen ms que a los de neurotransmisin (Keefe et al., 1993; Lowy et al., 1993; Saulskaya y Marsden, 1995; Tucci et al., 1998; Shinohara et al., 2000; Del Arco et al.,2003; Bezzi et al., 2004). La baja dosis de glutamato aplicada en el estriado sugiere que no es la difusin del txico la causante de la degeneracin neuronal talmica (a milmetros de distancia del estriado). Algunos centros muestran degeneracin neuronal despus de su denervacin (degeneracin transinptica), esta posibilidad tambin ha sido sugerida para la degeneracin de las neuronas intralaminares en la EP (hiptesis de la degeneracin transinptica dopaminrgica). sta hiptesis propone que las neuronas intralaminares son degeneradas transinpticamente por la prdida previa de la inervacin dopaminrgica del tlamo (Aymerich et al., 2006; Lanciego et al., 2009). Este mecanismo no explica la degeneracin talmica observada aqu ya que no se encontr prdida de neuronas dopaminrgicas en la sustancia negra y adems, no existen proyecciones directas desde el estriado a los ncleos intralaminares del tlamo (Smith et al., 2004, 2009) que pudiera causar una denervacin

dopaminrgica talmica. Por lo tanto, no se aportan evidencias que apoyen la hiptesis de la degeneracin transinptica en este estudio. La degeneracin retrgrada axonal es otro posible mecanismo para explicar la prdida de neuronas intralaminares. Este centro enva gran cantidad de proyecciones al estriado (Berendse y Groenewegen, 1990; Smith y Bolam, 1990; Sadikot et al., 1992; Smith et al., 1994, 2004; Van der Werf et al., 2002; Vercelli et al., 2003) cuyas terminales sinpticas (identificadas por inmunohistoqumica VGluT2; Fremeau et al., 2001; Herzog et al., 2001; Smith et al., 2009) degeneran despus de la estimulacin de sus receptores glutamatrgicos. sta prdida sinptica se acompa de una reduccin en el nmero de neuronas intralaminares y microgliosis en ambos centros (estriado y ncleos intralaminares del tlamo). Esto sugiere que la degeneracin retrgrada est envuelta en la accin deletrea del glutamato estriatal sobre las neuronas intralaminares. Los receptores presinpticos de kainato de las aferencias glutamatrgicas podran estar detrs de la accin excitotxica retrgrada del kainato (Bernard et al., 1997; Smith et al., 2004). sta posibilidad no puede ser argumentada para el AMPA y el NMDA porque las terminales glutamatrgicas presinpticas de las neuronas tlamo-estriatales no presentan estos receptores ionotrpicos (Smith et al., 2004). Estos si se expresan en los oligodendrocitos que tras una sobre estimulacin de estos receptores degeneran (Oka et al., 1993; Matute et al., 2006) y tambin las neuronas ligadas a ellos (Matute et al., 2006, 2007; Karadottir y Attwell, 2007; Bakiri et al., 2009). Por tanto, los receptores glutamatrgicos de los oligodendrocitos pueden estar envueltos en la excitotoxicidad retrgrada inducida por el AMPA y el NMDA. Tomado en su conjunto, todos estos datos sugieren que la degeneracin retrgrada podra explicar la prdida de las neuronas talmicas inducidas por el glutamato estriatal, una degeneracin que podra estar inducida por la sobre estimulacin de los receptores de kainato de las terminales sinpticas de las neuronas tlamo-estriatales y por los receptores de AMPA y NMDA de los oligodendrocitos asociados a los axones mielinizados de estas neuronas.

Baja vulnerabilidad de las neuronas nigro-estriatales al glutamato estriatal. A pesar de las crecientes evidencias sugiriendo que la degeneracin de las neuronas dopaminrgicas empiezan en sus terminales sinpticas estriatales y progresa retrgradamente hacia el soma (Cheng et al., 2010) la toxicidad estriatal del glutamato en la EP est sin explorar. En este estudio se consider la posibilidad de que un aumento del nivel de glutamato estriatal (que en la EP puede estar provocado por una prdida parcial de la inervacin dopaminrgica; Carlsson y Carlsson, 1990; Whitton, 1997; Borland y Michael, 2004; Morales et al., 2012) puede activar retrgradamente la degeneracin de las neuronas dopaminrgicas. Pero, ni las sinapsis dopaminrgicas al estriado, ni las neuronas de la sustancia negra degeneraron tras la perfusin estriatal de glutamato ni de ninguno de sus agonistas ionotrpicos. Las neuronas nigro-estriatales poseen receptores ionotrpicos de glutamato en sus somas (Chatha et al., 2000)

pero no en sus terminales estriatale (Bernard et al., 1997; Bernard y Bolam, 1998; Chen et al., 1998; Gracy et al., 1999). Esto hecho junto con la carencia de mielina en sus axones (Rodriguez y Gonzalez-Hernandez, 1999; que previene la accin del glutamato sobre los oligodendrocitos), podra explicar la baja vulnerabilidad que presentan estas neuronas al glutamato estriatal. Estos datos sugieren que el incremento de dopamina por el aumento de glutamato (Obeso et al., 2010; Morales et al., 2012) probablemente conlleva a una inhibicin de la recaptacin de la dopamina (Page et al., 2001; Rodriguez et al., 2006).

Toxicidad del glutamato estriatal y la EP La hiptesis de la degeneracin dopaminrgica transinptica sugiere que la denervacin dopaminrgica del tlamo es el mecanismo desencadenante de la degeneracin de los ncleos intralaminares del tlamo en la EP (Henderson et al., 2000a,b; Ghorayeb et al., 2002; Aymerich et al., 2006; Sedaghat et al., 2009; Smith et al., 2009). Aunque algunos datos apoyan esta posibilidad (Aymerich et al., 2006; Lanciego et al., 2009), hay datos incompatibles con esta hiptesis (Henderson et al., 2005; Kusnoor et al., 2009), estando en debate la relacin entre la degeneracin de las neuronas dopaminrgicas y la prdida de neuronas talmicas (Henderson et al., 2005; Smith et al., 2009). Los datos presentados sugieren la participacin del glutamato extrasinptico del estriado en la degeneracin de las neuronas talmicas intralaminares. El mecanismo sugerido se resumira de la siguiente forma: degeneracin de las neuronas dopaminrgicas (inducida por cualquier causa) denervacin de terminales dopaminrgicas incremento sustancial de la liberacin de glutamato estriatal (probablemente desde astrocitos) sobre estimulacin de los receptores de kainato de las terminales presinpticas tlamoestriatales y de los receptores AMPA/NMDA de los oligodendrocitos degeneracin retrgrada de las neuronas tlamo-estriatales (hiptesis de la degeneracin retrgrada glutamatrgica).

Bibliografa
Abercrombie A.E., Bonatz E.D. & Zigmond, M.J. (1990) Effects of L-dopa on extracellular dopamine in striatum of normal and 6-hydroxydopamine-treated rats. Brain Res., 525, 3644. Afonso, D., M. A. Castellanos and M. Rodriguez (1990). Determination of monoamines and indoles in amniotic fluid by high-performance liquid chromatographyelectrochemical detection. J Chromatogr 528(1): 101-109. Agnati L.F., Bjelke, B. & Fuxe, K. (1995) Volume versus wiring transmission in the brain: a new theoretical frame for neuropsychopharmacology. Med. Res. Rev., 15, 33 45. Ao, X., T. J. Sellati and J. A. Stenken (2004). Enhanced microdialysis relative recovery of inflammatory cytokines using antibody-coated microspheres analyzed by flow cytometry. Anal Chem 76(13): 3777-3784.

Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R.P. & Haydon, P.G. (1999) Tripartite synapses: glia, the unacknowledged partner. Trends Neurosci.,22, 208215. Aymerich, M.S., Barroso-Chinea, P., Perez-Manso, M., Munoz-Patino, A.M., MorenoIgoa, M., Gonzalez-Hernandez, T. & Lanciego, J.L.(2006) Consequences of unilateral nigrostriatal denervation on the thalamostriatal pathway in rats. Eur. J. Neurosci., 23,20992108. Bakiri, Y., Burzomato, V., Frugier, G., Hamilton, N.B., Karadottir, R. & Attwell, D. (2009) Glutamatergic signaling in the brain's white matter. Neuroscience, 158, 266 274. Bal, A., Bachelot, T., Savasta, M., Manier, M., Verna, J.M., Benabid, A.L. & Feuerstein, C. (1994) Evidence for dopamine D2 receptor mRNA expression by striatal astrocytes in culture: in situ hybridization and polymerase chain reaction studies. Brain Res. Mol. Brain Res., 23, 204212. Benveniste, H. and N. H. Diemer (1987). Cellular reactions to implantation of a microdialysis tube in the rat hippocampus. Acta Neuropathol 74(3): 234-238. Benveniste, H., A. J. Hansen and N. S. Ottosen (1989). Determination of brain interstitial concentrations by microdialysis. J Neurochem 52(6): 1741-1750. Berendse, H.W. & Groenewegen, H.J. (1990) Organization of the thalamostriatal projections in the rat, with special emphasis on the ventral striatum. J. Comp. Neurol., 299, 187228. Bernard, V. & Bolam, J.P. (1998) Subcellular and subsynaptic distribution of the NR1 subunit of the NMDA receptor in the neostriatum and globus pallidus of the rat: colocalization at synapses with the GluR2/3 subunit of the AMPA receptor. Eur. J. Neurosci., 10,37213736. Bernard, V., Somogyi, P. & Bolam, J.P. (1997) Cellular, subcellular, and subsynaptic distribution of AMPA-type glutamate receptor subunits in the neostriatum of the rat. J. Neurosci., 17, 819833. Bezzi, P., Carmignoto, G., Pasti, L., Vesce, S., Rossi, D., Rizzini, B.L., Pozzan, T. & Volterra, A. (1998) Prostaglandins stimulate calcium-dependent glutamate release in astrocytes. Nature, 391, 281285. Bezzi, P., Gundersen, V., Galbete, J.L., Seifert, G., Steinhauser, C., Pilati, E. & Volterra, A. (2004) Astrocytes contain a vesicular compartment that is competent for regulated exocytosis of glutamate. Nat. Neurosci., 7, 613620. Borland, L.M. & Michael, A.C. (2004) Voltammetric study of the control of striatal dopamine release by glutamate. J. Neurochem., 91,220229. Brannan, T., Prikhojan, A. & Yahr, M.D. (1997) Peripheral and central inhibitors of catechol-O-methyl transferase: effects on liver and brain COMT activity and L-DOPA metabolism. J. Neural Transm., 104, 7787. Calabresi, P., Mercuri, N.B. & Bernardi, G. (1993) Chemical modulation of synaptic transmission in the striatum. Prog. Brain Res., 99,299308. Carlsson, M. & Carlsson, A. (1990) Interactions between glutamatergic and monoaminergic systems within the basal gangliaimplications for schizophrenia and Parkinson's disease. Trends Neurosci., 13, 272276. Cebrian, C. & Prensa, L. (2012) Basal ganglia and thalamic input from neurons located within the ventral tier cell cluster region of the substantia nigra pars compacta in the rat. J. Comp. Neurol., 518, 12831300. Chatha, B.T., Bernard, V., Streit, P. & Bolam, J.P. (2000) Synaptic localization of ionotropic glutamate receptors in the rat substantia nigra. Neuroscience, 101, 1037 1051. Chen, Q., Veenman, L., Knopp, K., Yan, Z., Medina, L., Song, W.J., Surmeier, D.J. & Reiner, A. (1998) Evidence for the preferential localization of glutamate receptor-1 subunits of AMPA receptors to the dendritic spines of medium spiny neurons in rat striatum.Neuroscience, 83, 749761.

Cheng, H.C., Ulane, C.M. & Burke, R.E. (2010) Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons. Ann. Neurol., 67, 715725. Contreras, J.E., Sanchez, H.A., Eugenin, E.A., Speidel, D., Theis, M., Willecke, K., Bukauskas, F.F., Bennett, M.V. & Saez, J.C. (2002)Metabolic inhibition induces opening of unapposed connexin 43 gap junction hemichannels and reduces gap junctional communication in cortical astrocytes in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 495500. Cragg, S.J. & Rice, M.E. (2004) DAncing past the DAT at a DA synapse. Trends Neurosci., 27, 270277. Cruz-Muros, I., Afonso-Oramas, D., Abreu, P., Barroso-Chinea, P., Rodriguez, M., Gonzalez, M.C. & Hernandez, T.G. (2007) Aging of the rat mesostriatal system: differences between the nigrostriatal and the mesolimbic compartments. Exp. Neurol., 204,147161. Del Arco, A., Segovia, G., Fuxe, K. & Mora, F. (2003) Changes in dialysate concentrations of glutamate and GABA in the brain: an index of volume transmission mediated actions? J. Neurochem., 85, 2333. Fisher, R.S., Levine, M.S., Sibley, D.R. & Ariano, M.A. (1994) D2 dopamine receptor protein location: Golgi impregnation-gold toned and ultrastructural analysis of the rat neostriatum. J. Neurosci. Res., 38, 551564. Fox, C. H., F. B. Johnson, J. Whiting and P. P. Roller (1985). Formaldehyde fixation. J Histochem Cytochem 33(8): 845-853. Fremeau, R.T. Jr., Troyer, M.D., Pahner, I., Nygaard, G.O., Tran, C.H., Reimer, R.J., Bellocchio, E.E., Fortin, D., Storm-Mathisen, J. &Edwards, R.H. (2001) The expression of vesicular glutamate transporters defines two classes of excitatory synapse. Neuron, 31,247260. Garcia Dopico, J., Perdomo Diaz, J., Alonso, T.J., Gonzalez Hernandez, T., Castro Fuentes, R. & Rodriguez Diaz, M. (2004) Extracellular taurine in the substantia nigra: taurine-glutamate interaction. J. Neurosci. Res., 76, 528538. Garcia-Munoz, M., Young, S.J. & Groves, P.M. (1991) Terminal excitability of the corticostriatal pathway. I. Regulation by dopamine receptor stimulation. Brain Res., 551, 195206. Ghorayeb, I., Fernagut, P.O., Hervier, L., Labattu, B., Bioulac, B. & Tison, F. (2002) A single toxin-double lesion rat model of striatonigral degeneration by intrastriatal 1 methyl-4-phenylpyridinium ion injection: a motor behavioural analysis. Neuroscience, 115, 533546. Gonzalez-Hernandez, T. & Rodriguez, M. (2000) Compartmental organization and chemical profile of dopaminergic and GABAergic neurons in the substantia nigra of the rat. J. Comp. Neurol., 421, 107135. Gonzalez-Hernandez, T., Barroso-Chinea, P., Perez de la Cruz, M.A., Valera, P., Dopico, J.G. & Rodriguez, M. (2002) Response of GABAergic cells in the deep mesencephalic nucleus to dopaminergic cell degeneration: an electrophysiological and in situ hybridization study. Neuroscience, 113, 311321. Gonzalez-Hernandez, T., Barroso-Chinea, P., De La Cruz Muros, I., Del Mar PerezDelgado, M. & Rodriguez, M. (2004) Expression of dopamine and vesicular monoamine transporters and differential vulnerability of mesostriatal dopaminergic neurons. J. Comp. Neurol., 479, 198215. Gracy, K.N., Clarke, C.L., Meyers, M.B. & Pickel, V.M. (1999) N-methyl-D-aspartate receptor 1 in the caudate-putamen nucleus: ultrastructural localization and coexpression with sorcin, a 22,000 mol. wt calcium binding protein. Neuroscience, 90, 107117. Halliday, G.M. (2009) Thalamic changes in Parkinson's disease. Parkinsonism Relat. D., 15(Suppl 3), S152S155.

Halliday, G.M., Macdonald, V. & Henderson, J.M. (2005) A comparison of degeneration in motor thalamus and cortex between progressive supranuclear palsy and Parkinson's disease. Brain, 128, 22722280. Henderson, J.M., Carpenter, K., Cartwright, H. & Halliday, G.M. (2000a) Degeneration of the centre median-parafascicular complex in Parkinson's disease. Ann. Neurol., 47, 345352. Henderson, J.M., Carpenter, K., Cartwright, H. & Halliday, G.M. (2000b) Loss of thalamic intralaminar nuclei in progressive supranuclear palsy and Parkinson's disease: clinical and therapeutic implications. Brain, 123(Pt 7), 14101421. Henderson, J.M., Schleimer, S.B., Allbutt, H., Dabholkar, V., Abela, D., Jovic, J. & Quinlivan, M. (2005) Behavioural effects of parafascicular thalamic lesions in an animal model of parkinsonism. Behav. Brain Res., 162, 222232. Herzog, E., Bellenchi, G.C., Gras, C., Bernard, V., Ravassard, P., Bedet, C., Gasnier, B., Giros, B. & El Mestikawy, S. (2001) The existence of a second vesicular glutamate transporter specifies subpopulations of glutamatergic neurons. J. Neurosci., 21,RC181. Kannari, K., Tanaka, H., Maeda, T., Tomiyama, M., Suda, T. & Matsunaga, M. (2000) Reserpine pretreatment prevents increases in extracellular striatal dopamine following L-DOPA administration in rats with nigrostriatal denervation. J. Neurochem., 74,263269. Karadottir, R. & Attwell, D. (2007) Neurotransmitter receptors in the life and death of oligodendrocytes. Neuroscience, 145,14261438. Keefe, K.A., Sved, A.F., Zigmond, M.J. & Abercrombie, E.D. (1993) Stress-induced dopamine release in the neostriatum: evaluation of the role of action potentials in nigrostriatal dopamine neurons or local initiation by endogenous excitatory amino acids. J. Neurochem., 61, 19431952. Khan, Z.U., Koulen, P., Rubinstein, M., Grandy, D.K. & Goldman-Rakic, P.S. (2001). An astroglia-linked dopamine D2-receptor action in prefrontal cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 19641969. Kimura, M., Minamimoto, T., Matsumoto, N. & Hori, Y. (2004) Monitoring and switching of cortico-basal ganglia loop functions by the thalamo-striatal system. Neurosci. Res., 48, 355360. Kulagina, N.V., Zigmond, M.J. & Michael, A.C. (2001) Glutamate regulates the spontaneous and evoked release of dopamine in the rat striatum. Neuroscience, 102, 121128. Kusnoor, S.V., Muly, E.C., Morgan, J.I. & Deutch, A.Y. (2009) Is the loss of thalamostriatal neurons protective in parkinsonism?Parkinsonism Relat. D., 15(Suppl 3), S162S166. Kusnoor, S.V., Bubser, M. & Deutch, A.Y. (2012) The effects of nigrostriatal dopamine depletion on the thalamic parafascicular nucleus. Brain Res., 1446, 4655. Lanciego, J.L., Lopez, I.P., Rico, A.J., Aymerich, M.S., Perez-Manso, M., Conte, L., Combarro, C., Roda, E., Molina, C., Gonzalo, N.,Castle, M., Tunon, T., Erro, E. & Barroso-Chinea, P. (2009) The search for a role of the caudal intralaminar nuclei in the pathophysiology of Parkinson's disease. Brain Res. Bull., 78, 5559. Lowy, M.T., Gault, L. & Yamamoto, B.K. (1993) Adrenalectomy attenuates stressinduced elevations in extracellular glutamate concentrations in the hippocampus. J. Neurochem., 61, 19571960. Marburger, A., Sohr, R., Reum, T. & Morgenstern, R. (2000) Comparison by microdialysis of striatal L-DOPA after its systemic administration in rats with probes implanted acutely or through a guide cannula. J. Neurosci. Meth., 102, 127132. Matsumoto, N., Minamimoto, T., Graybiel, A.M. & Kimura, M. (2001) Neurons in the thalamic CM-Pf complex supply striatal neurons with information about behaviorally significant sensory events. J. Neurophysiol., 85, 960976. Matute, C., Domercq, M. & Sanchez-Gomez, M.V. (2006) Glutamate-mediated glial injury: mechanisms and clinical importance. Glia,53, 212224.

Matute, C., Alberdi, E., Domercq, M., Sanchez-Gomez, M.V., Perez-Samartin, A., Rodriguez-Antiguedad, A. & Perez-Cerda, F. (2007)Excitotoxic damage to white matter. J. Anat., 210, 693702. Maura, G., Giardi, A. & Raiteri, M. (1988) Release-regulating D-2 dopamine receptors are located on striatal glutamatergic nerve terminals. J. Pharmacol. Exp. Ther., 247, 680684. Minamimoto, T. & Kimura, M. (2002) Participation of the thalamic CM-Pf complex in attentional orienting. J. Neurophysiol., 87,30903101. Minamimoto, T., Hori, Y. & Kimura, M. (2009) Roles of the thalamic CM-PF complexBasal ganglia circuit in externally driven rebias of action. Brain Res. Bull., 78, 7579. Mitchell, P.R. & Doggett, N.S. (1980) Modulation of striatal [3H]-glutamic acid release by dopaminergic drugs. Life Sci., 26,20732081. Miyazaki, I., Asanuma, M., Diaz-Corrales, F.J., Miyoshi, K. & Ogawa, N. (2004) Direct evidence for expression of dopamine receptors in astrocytes from basal ganglia. Brain Res., 1029, 120123. Morales, I. & Rodriguez, M. (2012) Self-induced accumulation of glutamate in striatal astrocytes and basal ganglia excitotoxicity. Glia,60, 14811494. Morales, I., Fuentes, A., Ballaz, S., Obeso, J.A. & Rodriguez, M. (2012) Striatal interaction among dopamine, glutamate and ascorbate.Neuropharmacology, 63, 1308 1314. Moss, J. & Bolam, J.P. (2008) A dopaminergic axon lattice in the striatum and its relationship with cortical and thalamic terminals. J. Neurosci., 28, 1122111230. Obeso, J.A., Rodriguez-Oroz, M.C., Goetz, C.G., Marin, C., Kordower, J.H., Rodriguez, M., Hirsch, E.C., Farrer, M., Schapira, A.H. &Halliday, G. (2010) Missing pieces in the Parkinson's disease puzzle. Nat. Med., 16, 653661. Oka, A., Belliveau, M.J., Rosenberg, P.A. & Volpe, J.J. (1993) Vulnerability of oligodendroglia to glutamate: pharmacology, mechanisms, and prevention. J. Neurosci., 13, 14411453. Overstreet, L.S. (2005) Quantal transmission: not just for neurons. Trends Neurosci., 28, 5962. Page, G., Peeters, M., Najimi, M., Maloteaux, J.M. & Hermans, E. (2001) Modulation of the neuronal dopamine transporter activity by the metabotropic glutamate receptor mGluR5 in rat striatal synaptosomes through phosphorylation mediated processes. J. Neurochem., 76, 12821290. Pasti, L., Volterra, A., Pozzan, T. & Carmignoto, G. (1997) Intracellular calcium oscillations in astrocytes: a highly plastic, bidirectional form of communication between neurons and astrocytes in situ. J. Neurosci., 17, 78177830. Paxinos, G. & Watson, C. (1986) The rat brain in stereotaxic coordinates. Academic Press Inc., Orlando, Florida, USA. Rice, M.E. & Cragg, S.J. (2008) Dopamine spillover after quantal release: rethinking dopamine transmission in the nigrostriatal pathway. Brain Res. Rev., 58, 303313. Rodriguez, M. and R. Castro (1991). Apomorphine lowers dopamine synthesis for up to 48 h: implications for drug sensitization. Neuroreport 2(7): 365-368. Rodriguez, M. and E. Mendez (1998). Quantal processing of visual information in the brain. Neuroscience. United States. 84: 641-644. Rodriguez, M. & Gonzalez-Hernandez, T. (1999) Electrophysiological and morphological evidence for a GABAergic nigrostriatal pathway. J. Neurosci., 19, 4682 4694. Rodriguez, M., Barroso-Chinea, P., Abdala, P., Obeso, J. & Gonzalez-Hernandez, T. (2001) Dopamine cell degeneration induced by intraventricular administration of 6hydroxydopamine in the rat: similarities with cell loss in Parkinson's disease. Exp. Neurol.,169, 163181.

Rodriguez, M., Morales, I., Gomez, I., Gonzalez, S., Gonzalez-Hernandez, T. & Gonzalez-Mora, J.L. (2006) Heterogeneous dopamine neurochemistry in the striatum: the fountain-drain matrix. J. Pharmacol. Exp. Ther., 319, 113. Rodriguez, M., Morales, I., Gonzalez-Mora, J.L., Gomez, I., Sabate, M., Dopico, J.G., Rodriguez-Oroz, M.C. & Obeso, J.A. (2007)Different levodopa actions on the extracellular dopamine pools in the rat striatum. Synapse, 61, 6171. Rodriguez Diaz, M., Abdala, P., Barroso-Chinea, P., Obeso, J. & Gonzalez-Hernandez, T. (2001) Motor behavioural changes after intracerebroventricular injection of 6hydroxydopamine in the rat: an animal model of Parkinson's disease. Behav. Brain Res.,122, 7992. Rodriguez Diaz, M., Alonso, T.J., Perdomo Diaz, J., Gonzalez Hernandez, T., Castro Fuentes, R., Sabate, M. & Garcia Dopico, J. (2005)Glial regulation of nonsynaptic extracellular glutamate in the substantia nigra. Glia, 49, 134142. Rowlands, G.F. & Roberts, P.J. (1980) Activation of dopamine receptors inhibits calcium-dependent glutamate release from corticostriatal terminals in vitro. Eur. J. Pharmacol., 62, 241242. Rub, U., Del Tredici, K., Schultz, C., Ghebremedhin, E., de Vos, R.A., Jansen Steur, E. & Braak, H. (2002) Parkinson's disease: the thalamic components of the limbic loop are severely impaired by alpha-synuclein immunopositive inclusion body pathology.Neurobiol. Aging, 23, 245254. Sadikot, A.F. & Rymar, V.V. (2009) The primate centromedian-parafascicular complex: anatomical organization with a note on neuromodulation. Brain Res. Bull., 78, 122130. Sadikot, A.F., Parent, A., Smith, Y. & Bolam, J.P. (1992) Efferent connections of the centromedian and parafascicular thalamic nuclei in the squirrel monkey: a light and electron microscopic study of the thalamostriatal projection in relation to striatal heterogeneity.J. Comp. Neurol., 320, 228242. Saulskaya, N. & Marsden, C.A. (1995) Extracellular glutamate in the nucleus accumbens during a conditioned emotional response in the rat. Brain Res., 698, 114 120. Sedaghat, K., Finkelstein, D.I. & Gundlach, A.L. (2009) Effect of unilateral lesion of the nigrostriatal dopamine pathway on survival and neurochemistry of parafascicular nucleus neurons in the ratevaluation of time-course and LGR8 expression. Brain Res., 1271,8394. Shinohara, K., Honma, S., Katsuno, Y. & Honma, K. (2000) Circadian release of excitatory amino acids in the suprachiasmatic nucleus culture is Ca(2+)independent. Neurosci. Res., 36, 245250. Smith, A.D. & Bolam, J.P. (1990) The neural network of the basal ganglia as revealed by the study of synaptic connections of identified neurones. Trends Neurosci., 13, 259 265. Smith, Y., Bennett, B.D., Bolam, J.P., Parent, A. & Sadikot, A.F. (1994) Synaptic relationships between dopaminergic afferents and cortical or thalamic input in the sensorimotor territory of the striatum in monkey. J. Comp. Neurol., 344, 119. Smith, Y., Raju, D.V., Pare, J.F. & Sidibe, M. (2004) The thalamostriatal system: a highly specific network of the basal ganglia circuitry.Trends Neurosci., 27, 520527. Smith, Y., Raju, D., Nanda, B., Pare, J.F., Galvan, A. & Wichmann, T. (2009) The thalamostriatal systems: anatomical and functional organization in normal and parkinsonian states. Brain Res. Bull., 78, 6068. Shuaib, A., K. Xu, B. Crain, A. L. Siren, G. Feuerstein, J. Hallenbeck and J. N. Davis (1990). Assessment of damage from implantation of microdialysis probes in the rat hippocampus with silver degeneration staining. Neurosci Lett 112(2-3): 149-154. Thornburg, J.E. & Moore, K.E. (1975) Supersensitivity to dopamine agonists following unilateral, 6-hydroxydopamine-induced striatal lesions in mice. J. Pharmacol. Exp. Ther., 192, 4249.

Tucci, S., Rada, P. & Hernandez, L. (1998) Role of glutamate in the amygdala and lateral hypothalamus in conditioned taste aversion.Brain Res., 813, 4449. Ungerstedt, U. (1971) Adipsia and aphagia after 6-hydroxydopamine induced degeneration of the nigro-striatal dopamine system.Acta Physiol. Scand. Suppl., 367, 95122. Van der Werf, Y.D., Witter, M.P. & Groenewegen, H.J. (2002) The intralaminar and midline nuclei of the thalamus. Anatomical and functional evidence for participation in processes of arousal and awareness. Brain Res. Brain Res. Rev., 39, 107140. Vercelli, A., Marini, G. & Tredici, G. (2003) Anatomical organization of the telencephalic connections of the parafascicular nucleus in adult and developing rats. Eur. J. Neurosci., 18, 275289. Wagner, A.K., Sokoloski, J.E., Ren, D., Chen, X., Khan, A.S., Zafonte, R.D., Michael, A.C. & Dixon, C.E. (2005) Controlled cortical impact injury affects dopaminergic transmission in the rat striatum. J. Neurochem., 95, 457465. Wang, W., K. Ameno, M. Jamal, M. Kumihashi, I. Uekita, S. Ameno and I. Ijiri (2007). Effect of direct infusion of acetaldehyde on dopamine and dopamine-derived salsolinol in the striatum of free-moving rats using a reverse microdialysis technique. Arch Toxicol 81(2): 121-126. Whitton, P.S. (1997) Glutamatergic control over brain dopamine release in vivo and in vitro. Neurosci. Biobehav. R., 21, 481488. Wullner, U., Testa, C.M., Catania, M.V., Young, A.B. & Penney, J.B. Jr. (1994) Glutamate receptors in striatum and substantia nigra: effects of medial forebrain bundle lesions. Brain Res., 645, 98102. Zigmond, M.J. & Stricker, E.M. (1973) Recovery of feeding and drinking by rats after intraventricular 6-hydroxydopamine or lateral hypothalamic lesions. Science, 182, 717 720. Zoli, M., Torri, C., Ferrari, R., Jansson, A., Zini, I., Fuxe, K. & Agnati, L.F. (1998) The emergence of the volume transmission concept.Brain Res. Brain Res. Rev., 26, 136 147.