PADRONIZAO DE EXAMES DE DNA EM PERCIAS CRIMINAIS

1) Objetivos a) Assegurar a qualidade, integridade e segurana em exames periciais envolvendo a utilizao de DNA; b) Estabelecer os procedimentos para conduo da percia criminal, anlise e apresentao de resultados para a investigao criminal; c) Estabelecer os requisitos para os laboratrios de gentica forense, bem como a qualificao dos peritos que neles realizaro as percias baseadas em DNA.

2) Coleta e Custdia de Amostras e Instalaes Ambientais a) Coleta i) Os procedimentos de coleta e as anlises iniciais devero ser padronizados, atravs de manuais de coleta; ii) Em casos de crimes sexuais, deve-se coletar pelo menos dois suabes de algodo (haste plstica) de cada cavidade (vaginal, anal e /ou bucal). aconselhvel que cada Estado formalize, em dispositivo legal, os aspectos tcnicos relacionados coleta, preservao e custdia de amostras para exames de DNA. A Rede Nacional de Gentica Forense recomenda a adoo de dispositivo nos moldes da Resoluo 194 SSP/SP (disponvel em http://www.mj.gov.br/senasp/SUSP/pericias/pericia_dna.htm); iii) Todos os laboratrios devem ter um termo de consentimento informado, dispondo sobre os objetivos da coleta de material biolgico de pessoas vivas, de acordo com modelo a ser definido posteriormente; iv) Os manuais de coleta devem conter especificaes sobre a embalagem, o transporte e armazenamento de amostras biolgicas; v) Todas as pessoas que participarem da custdia de amostras para exames de DNA, desde a coleta at a realizao do exame, devem ser preparadas tecnicamente em procedimentos de coleta, acondicionamento, transporte e conservao de amostras biolgicas. A preparao ou treinamento especfico dever estar inserido dentro dos cursos de formao a serem ministrados pelos laboratrios que integram a Rede Nacional de Gentica Forense (ver item 6). b) Custdia i) Os materiais e resultados obtidos a partir de amostras de evidncias criminais devem ser organizados e armazenados adequadamente, pelo menos, at o fim do processo (julgamento); ii) A amostra bruta ou frao til da mesma, e/ou DNA extrado, devem ser preservados para contraprova. As amostras devem ser armazenadas adequadamente com o objetivo de evitar a degradao;

iii) A armazenagem das amostras deve ser definida com a ajuda da SENASP, atravs de consulta ao poder judicirio, tendo em vista a falta de normas, tanto em nvel federal quanto estadual, sobre o prazo mnimo de armazenagem; iv) A cadeia de custdia deve ser o mais curta possvel, a fim de evitar a possibilidade de troca de amostras ou de degradao do material; v) Preferencialmente, o perito que coleta as amostras no deve ser o mesmo que realiza os exames de DNA; vi) Os laboratrios devem manter um sistema documentado de controle de vestgios, evidncias e/ou amostras, que assegure sua integridade; vii) Recomenda-se que os tcnicos e/ou peritos que trabalhem em exames de DNA forense disponibilizem uma alquota do seu prprio material gentico para genotipagem e sequencimento de DNA mitocondrial, quando este for de uso no mbito do laboratrio. c) Instalaes Ambientais i) O desenho e instalaes dos laboratrios devem respeitar as normas de segurana e minimizar os riscos de contaminao; ii) O acesso e uso das reas de anlises devem ser controlados de modo apropriado aos fins a que esto destinados; iii) Recomenda-se que os laboratrios disponham de reas de trabalho separadas, com rea para manejo de evidncias e armazenamento de materiais, rea de extrao, rea para PCR, rea de extrao de amostras mnimas e rea para Ps-PCR. Como rea mnima, os laboratrios devem conter: rea de extrao de DNA, rea de pr -PCR e rea de ps-PCR.

3) Marcadores Moleculares a) Para os Exames Interlaboratoriais e Bancos de Dados, os marcadores moleculares utilizados devem seguir os treze marcadores definidos pelo CODIS (TPOX, D3S1358, D5S818, FGA, CSF1PO, D7S820, D8S1179, TH01, vWA, D13S317, D16S539, D18S51 e D21S1) e a amelogenina; b) Estes marcadores devem ser disponibilizados em kits comerciais multiplex ou, quando no comerciais, devem ser de kits validados, com primers com escadas allicas clonadas e seqenciadas; c) Os laboratrios, dentro de seus exames rotineiros, podem estabelecer os marcadores necessrios para a execuo de seus laudos periciais. Contudo, recomenda-se a utilizao dos treze marcadores mnimos acima citados; d) Deve ser incentivada a produo de kits multiplex de fluorescncia desenvolvidos no Brasil, os quais preferencialmente devem ser validados por laboratrios da Rede Nacional de Gentica Forense, antes de seu uso, conforme o item b; e) Recomenda-se que o Fundo Nacional de Segurana Pblica/SENASP/MJ e o Ministrio da Cincia e Tecnologia destinem recursos para pesquisas na rea de gentica forense, principalmente no que tange a produo e validao de marcadores moleculares e tambm de estudos populacionais e criao de banco de dados.

4) Interpretao dos Resultados e Anlise Estatstica. a) Recomenda-se a utilizao da razo de verossimilhana para os casos de comparao entre amostra questionada e de referncia onde as amostras no podem ser excludas como sendo originadas da mesma pessoa; b) desaconselhado o uso de probabilidade de coincidncia em casos de estudos de identificao gentica; c) Para o clculo da razo de verossimilhana, de maneira conservadora, recomendvel realizar uma correo em relao ao equilbrio de Hardy-Weinberg de uma eventual estruturao. Considerar a utilizao do parmetro de subestruturao = 0,01, em populaes urbanas, e = 0,03 em populaes mais isoladas e potencialmente mais estruturadas, ou outro valor definido a partir de dados da populao brasileira, nas seguintes frmulas: para loci homozigotos = [2 + (1 - )pi][3 + (1 - )pi] (1 + )(1 + 2) para loci heterozigotos = 2[ + (1 - )pi][ + (1 - ) pj] (1 + )(1 + 2) d) Para a identificao de vnculo gentico, recomenda-se a utilizao dos relatrios ANNUAL REPORT SUMMARY FOR TESTING publicados pela AABB em
http://www.aabb.org/Content/Accreditation/Parentage_Testing_Accreditation_Program/;

e) Em casos de identificao de vnculo gentico em primeiro grau, deve ser considerada excluso a no coincidncia em no mnimo dois loci, nos casos onde os gentipos forem heterozigotos e, de no mnimo trs loci, quando pelo menos um dos gentipos forem homozigotos; f) Onde no ocorrer coincidncia em no mnimo dois loci, outros marcadores devero ser analisados para ser certificada a excluso ou confirmada a ocorrncia de mutao. Na existncia de no coincidncia, dever ser estudado e includo no laudo tanto as ocorrncias das excluses (inexistncia de perfil coincidente para x loci) como as possibilidades de ocorrncia de mutao (se disponvel, incluir informao da taxa de mutao publicada para a situao). As mutaes e taxas em que ocorrem devero ser consideradas nos clculos estatsticos de probabilidades de coincidncias; g) Para os casos de paternidade criminal onde for considerada a ocorrncia de mutao, o ndice de Paternidade parcial do locus onde foi detectado o evento mutacional ser calculado a partir da frmula / , onde = taxa de mutao do locus e = poder mdio de excluso do locus; h) Para tabelas de freqncias allicas de amostras populacionais com 250 ou mais indivduos deve-se aplicar a freqncia mnima de 1% independente do valor obtido experimentalmente. Para tabelas de freqncias allicas de amostras populacionais menores que 250 indivduos, deve-se aplicar a frmula: 1-[1-(1-)1/c]1/2n, onde o intervalo de confiana = 0,05; c o nmero de alelos do local analisado e n o nmero de pessoas da amostra (Budowle et al, 1996);

i) Quando da utilizao de marcadores uniparentais (cromossomo Y e DNA mitocondrial) para os propsitos citados no item anterior, devem ser seguidas as seguintes normas: i) nos casos de microssatlites de cromossomo Y, recomenda-se a utilizao de pelo menos o hapltipo extendido (DYS19, DYS385a,b; DYS389I/II; DYSDYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS438 e DYS43) proposto pelo SWGDAM (2004) e amplamente utilizado em Y Chromosome Haplotype Reference Database www.yhrd.org; ii) nos casos de DNA mitocondrial, recomenda-se a utilizao das regies hipervariveis I e II (HVI e HVII), valendo-se de primers que compreendam cada regio inteira, ou mesmo da utilizao sucessiva de primers com produtos de amplificao menores, que somados abranjam as regies HVI e HVII completas; iii) Se houver no mnimo duas diferenas de nucleotdeos entre as amostras questionadas e de referncia, as amostras podem ser excludas como sendo originadas da mesma pessoa; iv) Se houver somente uma diferena de polimorfismos entre as amostras questionadas e referncia, o resultado ser dado como inconclusivo; v) Se as seqncias obtidas entre as amostras questionadas e de referncia coincidirem, as amostras no podem ser excludas como sendo originadas da mesma linhagem matrilnea; vi) Se os hapltipos obtidos entre as amostras questionadas e de referncia coincidirem, as amostras no podem ser excludas como sendo originadas da mesma linhagem patrilnea; vii) A interpretao dos tratos homopolimricos deve ser feita de maneira padronizada seguindo as recomendaes publicadas por (Wilson et al, 2002); viii) Nos casos envolvendo marcadores uniparentais onde for detectada coincidncia entre as amostras questionadas e de referncia, recomenda-se a busca em banco de dados internacionais, ou, de preferncia, nacionais. Aps a busca em bancos de dados, recomendvel a utilizao do mtodo de contagem, relatando-se o nmero de vezes que o mesmo hapltipo foi encontrado em uma base de dados de n hapltipos; j) Na valorizao da prova do DNA, para os clculos estatsticos, devero ser utilizadas informaes de populaes e de base de dados legtimas. Ou seja, na inexistncia de informao sobre uma dada populao brasileira, devero ser consideradas base de dados cujas diferenas e semelhanas com as populaes brasileiras estejam estabelecidas e cujos resultados tenham sido produzidos em laboratrios com creditao para a anlise do DNA como instrumento de prova judicial;

5) Laudos Periciais a) O laudo pericial dever conter, no mnimo, as seguintes informaes: i) Custdia das amostras ii) Identificao do caso iii) Tipo de caso iv) Solicitao do exame

v) Objetivo da Percia vi) Descrio do vestgio vii) Descrio precisa da metodologia. viii) Interpretao dos resultados, com os resultados dos parmetros utilizados. ix) Concluses x) Assinaturas

6) Exames Interlaboratoriais e de Proficincia Tcnica a) Os laboratrios devem realizar os seus controles de qualidade internos (ex: registros de gentipos do corpo tcnico, medidas para evitarem contaminao exgena, etc..), e tambm participar de controles de qualidade no Brasil (entre laboratrios da Rede Nacional de Gentica Forense) e tambm internacionais (por exemplo GEP e GITAD); b) Recomenda-se a SENASP financiar o aparelhamento dos laboratrios regionais, com o intuito de estabelecer o(s) laboratrio(s) responsvel(is) pela coordenao dos exames interlaboratoriais no pas; c) Os exames de proficincia devero ser anuais, definidos com os laboratrios regionais em conjunto com as universidades; d) Os laboratrios regionais de DNA devem realizar anlises exclusivamente em casos criminais.

7) Qualificao Acadmico-Profissional a) Os peritos que realizaro os exames laboratoriais devero ser profissionais de nvel superior, graduados em reas de cincias biolgicas, cincias da sade ou reas afins. Quando no graduados nestas reas, devero ter ps-graduao em gentica ou reas afins; b) O responsvel pela chefia do Laboratrio de DNA Criminal dever ser perito oficial, graduado em reas de Cincias Biolgicas, Sade ou reas afins. Deve tambm possuir ps-graduao em Gentica Forense, ou reas afins, e experincia comprovada, de ao menos dois anos, em realizao de exames periciais na rea de gentica forense. Os laboratrios em implantao, nos quais esta recomendao no tenha condio de ser contemplada, se reportaro SENASP para a indicao dos laboratrios regionais que tenham as condies necessrias para auxlio tcnico e/ou superviso dos mesmos at que a condio sugerida seja contemplada; c) Os peritos que trabalharem em exames de DNA forense devero ser aprovados no Curso de Especializao em Gentica Forense para realizarem exames simples monitorados, e no Curso Prtico Avanado para realizarem exames mais complexos, conforme o Programa dos Cursos. O Curso de Especializao em Gentica Forense ser ministrado pelos laboratrios das universidades e o Curso Prtico Avanado pelos laboratrios regionais de DNA;

d) Para a realizao dos cursos citados no item anterior, os peritos devero ser indicados pelos Estados e aprovados por uma comisso criada pela SENASP, sendo esta comisso formada por integrantes da Rede Nacional de Gentica Forense; e) Aos peritos que tiverem experincia em exames de DNA forense ser facultada a participao nos cursos descritos no item anterior; f) Deve ser estimulado, atravs do apoio financeiro dos Estados e da Unio, via SENASP, o aperfeioamento contnuo dos peritos envolvidos com as anlises de DNA forense, bem como incentivar a publicao de trabalhos em revistas do Brasil e do exterior; g) Com o objetivo de prover os laboratrios com a formao necessria para os mesmos realizarem os exames de DNA com elevados nveis de confiabilidade, segurana e eficincia, sero ministrados, pelos laboratrios regionais em conjunto com universidades, os seguintes cursos:

Curso de Especializao em Gentica Forense Pblico Alvo: Peritos sem experincia prvia em anlise de DNA forense, cuja minuta do programa se encontra a seguir (360 horas): i) Gentica Mendeliana 1. Transmisso da Informao Gentica 2. Teoria Cromossmica da Herana 3. Mitose e Meiose 4. Ligao 5. Leis de Mendel 6. Modos de Herana (mitocndria, cromossomos X e Y, autossmicos, heredogramas) ii) Gentica de Populaes 1. Polimorfismos 2. Equilbrio de Hardy-Weinberg 3. Desequilbrio de Ligao 4. Fatores Evolutivos 4.1.Migrao 4.2.Seleo 4.3.Mutao 4.4.Deriva 5. Endogamia, Gargalo Gentico 6. Parmetros populacionais (estatstica de Wright) (vide Vogel e Motulsky, 2000) iii) Gentica Molecular 1. Estrutura e propriedades do DNA 2. Hibridizao 3. Mtodos de anlise 3.1.Eletroforese 3.2.PCR 3.3.Seqenciamento iv) Estatstica Forense (vide Conselho Nacional de Pesquisa, 2001) 1. Banco de Dados de Freqncia 2. ndice de Mxima Verossimilhana (Paternidade, Irmandade, Avuncular, Kinship...) 3. Probabilidade de coincidncia de dois perfis (match probability) 4. Clculo de Mistura de Amostra (vide Gill et al, 2006) 5. Marcadores de Linhagem (Cromossomo Y e DNA mitocondrial) v) Coleta (terico/prtico) (vide Silva e Passos, 2002) 1. Fundamentos da coleta 1.1.Amostra Questionada X Amostra Referncia (no local de crime X, no IML) 2. Estudo de Local de Crime 2.1.Reconstruo da Dinmica do Crime

3. Coleta de Amostra 3.1.Fluidos Biolgicos 3.2.Fibras (cabelos, plos, etc.) 3.3.Suportes (cigarro, copo, ...) 3.4.Coleta no cadver (saliva, sob unhas, ...) 3.5.Exumaes 3.6.Corpo carbonizado vi) Kit de coleta vii) Preservao do DNA viii) Embalagem e envio de amostras ix) Prtica Forense (concomitante com o Curso Terico dever ser gerada uma apostila com os principais protocolos) 1. Extrao de DNA 2. Mtodos de extrao (fenol/clorofrmio, proteinases, detergentes, sais, lcoois) 3. Sangue Lquido (orgnico x chelex) 4. Manchas de sangue 5. Manchas de esperma 6. Suabe 7. Extrao Diferencial (manchas com smen) x) Purificao e Concentrao do DNA 1. Quantificao do DNA 2. Quantificao de DNA total x DNA Humano 3. Hibridizao 4. PCR em Tempo Real (teoria) xi) PCR 1. Concentrao de DNA 2. Inibidores 3. Monoplex, Multiplex xii) Eletroforese 1. Em gel (agarose e poliacrilamida) (vide Ferreira e Grattapaglia, 1995) 2. Capilar (vide Butler, 2001) xiii) Mtodos de Deteco 1. Prata 2. Fluorescncia (vide Butler, 2001) xiv) Interpretao (estatstica) e Laudo (vide pgina www.dna-view.com) 1. Taxa de Mutao (casos com mutao; freqncia de mutao em STRs) 2. Dados fora de escala (para fluorescncia) 3. Alelos nulos 4. Alelos raros xv) Avaliao Final Monografia

Curso Prtico Avanado em Anlise de DNA Pblico Alvo: Peritos com experincia na realizao de exames de DNA menos complexos, cuja minuta do programa se encontra a seguir (40 a 180 horas): 1. Cromossomos X e Y; 2. Seqenciamento e mtDNA; 3. Amostras crticas (plo sem bulbo, osso,...); 4. STRs - Casos Complexos (reconstruo, estatstica avanada 5. Outros, de acordo com as dificuldades.

8) Recomendaes Finais A comisso elaboradora destas padronizaes entende que: a) a SENASP deve trabalhar em estreita colaborao com o Ministrio da Cincia e Tecnologia, visando apoiar programas de pesquisa e desenvolvimento que estimulem as cincias forenses, cursos de mestrado e doutorado, bem como a participao em reunies acadmicas no Brasil e no exterior; b) as anlises de DNA sero realizadas exclusivamente em materiais biolgicos relacionados a ilcitos penais, conforme determina o Cdigo de Processo Penal; c) devem ser realizadas revises peridicas com o intuito de aprimorar as recomendaes aqui presentes; d) a SENASP deve catalogar, organizar e disponibilizar, por meio eletrnico, gentipos dos principais locais genticos estudados de diferentes regies etnogrficas do Brasil.

9) Bibliografia Balding, D.J. e Nichols, R.A. DNA profile match probability calculations: how to allow for population stratification, relatedness, database selection and single bands. Forensic Science International, vol. 64, pp. 125140. 1994. Budowle, B.; Smith, J.; Moretti, T. e DiZinno, J. DNA Typing Protocols: Molecular Biology and Forensic Analysis. Eaton Publishing, Natick, MA, EUA. 2000. Budowle, B.; Monson, K.L. e Chakraborty, R. Estimating minimum allele frequencies for DNA profile frequency estimates for PCR-based loci. International Journal of Legal Medicine, vol. 108, pp. 173-176. 1996. Butler, J.M. Forensic DNA Typing: biology and Technology behind STR Markers. Academic Press Ed, New York, NY, EUA. 2001. Conselho Nacional de Pesquisa. Comit sobre Tecnologia do DNA na Cincia Forense. A Avaliao do DNA como Prova Forense. FUNPEC Ed, Ribeiro Preto, SP, Brasil. 2001.

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