LABORATORIO DE MICROSCOPIA BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR BMA124 BIOLOGIA MARINA 2013 Prof.

Fernando Silva Aciares PhD

Conceptos
Un microscopio es un instrumento que amplifica una imagen y permite la observacin de mayores detalles de los posibles a simple vista. El microscopio ms simple es una lente de aumento o un par de anteojos. El poder de resolucin del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para ver dos objetos separados estos deben estar como mnimo a esa distancia. El microscopio aumenta la imagen hasta el nivel de la retina, para captar la informacin. La resolucin depende de la longitud de onda de la fuente luminosa, el espesor de la muestra a observar, la calidad de la fijacin y la intensidad de la coloracin. Tericamente la mxima resolucin que se puede alcanzar es de 0,2 m, dada por una luz con longitud de onda de 540 nm, la cual pasa por un filtro verde (muy sensible por el ojo humano) y con objetos condensadores adecuados. El ocular aumenta la imagen producida por el objetivo, pero no puede aumentar la resolucin. Podemos clasificar los microscopios segn su descubrimiento: - Microscopio simple o lupa: lente convergente situada entre el ojo y el objeto. - Microscopio compuesto: formado por 2 sistemas de lentes: oculares y objetivos. - Microscopio moderno: produce una imagen aumentada e invertida. Formado por tres sistemas de lentes. - Condensador: situado entre la fuente de luz y la muestra. Concentra el haz luminoso sobre la preparacin. - Objetivo: produce una imagen real y aumentada, situado entre el objeto y el revlver. - Ocular: formado por dos lentes convergentes, produce una imagen virtual y aumentada, situados entre el ojo y el revlver.

Cuando se acerca un observador a un objeto, crece el ngulo visual y ese objeto parece ser mayor. Sin embargo, por debajo de una determinada distancia (unos 25 cm) entre el ojo y el objeto, ste no se ve con claridad. Este lmite se debe a la capacidad mxima de deformacin del cristalino. Si se sita entre el ojo y el objeto un sistema ptico capaz de aumentar el ngulo visual, se podr ver el objeto con mayor amplitud y claridad. Ese sistema ptico es el MICROSCOPIO. Produce una imagen aumentada de un objeto no visible de forma que sea perceptible por el ojo humano. Se consigue mediante el uso de lentes u otros sistemas. Esta ampliacin de la imagen se puede conseguir de dos formas: - ondas luminosas: m. ptico - haz de electrones (): m. Electrnico Trminos que describen las caractersticas pticas del microscopio AUMENTO: relacin entre el tamao a simple vista y el tamao observado con el microscopio (es el nmero de veces que se ve el tamao de un objeto por encima de su valor real). En el microscopio compuesto se calcula multiplicando el aumento individual del objetivo por el aumento individual del ocular. Se expresa mediante un nmero seguido del signo por (x). CONTRASTE: diferencia en la absorcin de luz entre el objeto estudiado y el medio que lo rodea. Puede aumentarse mediante procedimientos de tincin. PODER DE RESOLUCIN: capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy cercanos. Determina la mxima amplificacin til del microscopio. Depende de la longitud de onda (L) y de la apertura numrica (AN): cuanto menor es L y/o mayor la AN, mayor es la resolucin. La resolucin mxima de un microscopio ptico es de 200 nm.

Fundamentos

d = (0,5 x L) / AN
APERTURA NUMRICA: capacidad de la lente para juntar los rayos de luz proyectados hacia ella. Determina la eficacia del condensador y del objetivo. La AN depende del ndice de refraccin del medio que hay entre la muestra y la lente (IR), y del seno de la mitad del ngulo del cono de luz que penetra en la lente (sen ).

AN = IR x sen
Si se rellena el espacio existente entre la muestra y el objetivo no con aire, sino con una sustancia de mayor IR (p.e. aceite), se consigue que la mayor parte de los rayos perdidos por los fenmenos pticos ocasionados en el condensador y en el portaobjetos, se refracten y penetren en el objetivo, con lo que se incrementa la resolucin del microscopio. PROFUNDIDAD DE CAMPO: espesor de la preparacin enfocada en cualquier momento. Ser mayor cuanto menor sea el aumento. 2

REA DEL CAMPO: es el dimetro de la parte de la preparacin que se est viendo. Ser mayor cuando menor sea el aumento.

Tipos de microscopios
Microscopios pticos
- M. Simple: el microscopio ms simple es una lente convergente, la lupa (o microscopio estereoscpico). El objeto se coloca entre la lente y el foco, de modo que la imagen es virtual y est a una distancia que es la distancia mnima de visn ntida, alrededor de 25 cm. Consta de una base, en la que se sita la pletina, y de la que emerge una columna que soporta las lentes y el mando de enfoque. Slo sirve para exmenes superficiales (diseccin de animales, observacin de colonias, deteccin de quistes de parsitos,). Se consigue un nmero de aumentos entre 4 y 60. - M. Campo luminoso u ptico compuesto: imgenes oscuras frente al campo luminoso. Permite el estudio de las estructuras internas de la muestra, para lo cual sta debe ser dispuesta en una fina capa que puede ser atravesada por la luz. - M. Campo oscuro: fondo oscuro sobre el que se ven los objetos intensamente iluminados. o Permite ver el contorno de las bacterias y su movilidad o Permite ver los microorganismos sin teir o Permite ver el Treponema pallidum, bacteria espiroqueta de la sfilis. Consta de un condensador especial que debe estar muy cercano a la preparacin y que lanza sobre la muestra un cono hueco de luz. Con esto se logra que, solamente los rayos que chocan con las estructuras sometidas a estudio y son reflejados hacia arriba, puedan ser visualizados a travs del objetivo. - M. Contraste de fases: produce variaciones de luminosidad de forma que sean visibles las distintas partes de una muestra. Para ver parsitos y bacterias en cortes histolgicos, y para objetos transparentes y no coloreados (sediemento urinario). Consta de un dispositivo, situado dentro o debajo del condensador, que produce diferencias de longitud de onda en los distintos rayos. - M. Fluorescencia: la fluorescencia es la propiedad que tienen ciertas sustancias de emitir, cuando son iluminadas por una radiacin de Longitud corta, otra radiacin de Longitud ms larga. Consta de una fuente de luz muy potente y un filtro de excitacin que slo deja pasar la radiacin UV deseada. sta, tras interaccionar con la muestra, es de nuevo filtrada, dejando pasar solamente la luz fluorescente hacia los oculares. La principal aplicacin es en inmunofluorescencia, es decir, reacciones de antgenos con anticuerpos. o Fuente de luz: la L va desde la luz ultravioleta hasta los infrarrojos. o Filtro de excitacin: delimita la banda de excitacin, generalmente ultravioleta. o Muestra: fluorescente por s misma (microscopia primaria) o marcada con fluorocromos (microscopia secundaria). o Filtro de barrera: deja pasar slo la fluorescencia. 3

El microscopio de luz ultravioleta utiliza una Longitud entre 180 400 nm o Ventaja: - tiene mayor PR. o Inconvenientes: - lentes de cuarzo ms caras. - imagen invisible al ojo humano, hay que utilizar fotografas, fluorescencias o cualquier otra tcnica de foto-emisin.

Microscopios Electrnicos:
La luz es un haz de electrones. Utilizado en investigacin. Los electrones son propagados a travs de un tubo, inciden sobre el objeto y son refractados y recogidos en una pantalla. Se utiliza para conocer el tamao, estructura y morfologa de los seres vivos. Estos microscopios proveen un aumento de hasta 200.000 veces (200.000X) el tamao de los organismos. - M. E. de transmisin (muestra muy fina, gran amplificacin, no observacin de elementos vivos, alto coste). - M. E. de barrido (congelacin especial de la muestra y recubrimiento con metal, menor poder de resolucin, tridimensionalidad).

Partes del microscopio ptico

Parte mecnica:
- Sistema de soporte o estativo: o Pie o Brazo o Tubo o Platina o Revolver - Sistema de ajuste: o Tornillo macromtrico o Tornillo micromtrico PIE: Sirve como base del microscopio y tiene un peso suficiente para dar estabilidad al aparato. En los microscopios antiguos tena forma de herradura o de trpode pero en la actualidad suele ser una plataforma rectangular. En l se integra la fuente luminosa. BRAZO: Es una columna perpendicular al pie. Puede ser arqueado o vertical y une al pie con el tubo. TUBO: Es una cmara oscura unida al brazo mediante una cremallera. Tiene el revlver con los objetivos en su parte inferior y los oculares en el extremo superior. PLATINA: Es una plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que se coloca la preparacin, que permite el paso de los rayos procedentes de la fuente de iluminacin situada por debajo. Dos pinzas sirven para retener el portaobjetos sobre la platina y un sistema de cremallera guiado por dos tornillos de desplazamiento permite mover la preparacin de delante hacia atrs o de izquierda a derecha y viceversa. En la parte posterior de uno de los laterales se encuentra un nonius que permite fijar las coordenadas de cualquier campo ptico; de esta forma se puede acudir a el cuando interesa. REVOLVER: Es un sistema que coge los objetivos, y que rueda para utilizar un objetivo u otro. TORNILLOS MACRO Y MICROMTRICO: Son tornillos de enfoque, mueven la platina hacia arriba y hacia abajo. El macromtrico lo hace de forma rpida y el micromtrico de forma lenta. Llevan incorporado un mando de bloqueo que fija la platina a una determinada altura.

Parte ptica:
- Fuente de iluminacin - Condensador y diafragma - Lentes: oculares (10x y 12x) y objetivos (4x, 10x, 40x y 100x). FUENTE DE ILUMINACIN: Se trata de una lmpara halgena de intensidad graduable. Est situada en el pie del microscopio. Se enciende y se apaga con un interruptor y en su 5

superficie externa puede tener una especie de anillo para colocar filtros que facilitan la visualizacin. CONDENSADOR Y DIAFRAGMA: El condensador es un sistema de lentes situadas bajo la platina su funcin es la de concentrar la luz generada por la fuente de iluminacin hacia la preparacin. En el interior del condensador existe un diafragma (iris) cuya funcin es limitar el haz de rayos que atraviesa el sistema de lentes eliminando los rayos demasiado desviados (regula la cantidad de luz y ajusta la Apertura Numrica). OCULARES: Estn colocados en la parte superior del tubo. Se denominan as, porque estn muy cercanos al ojo. Su funcin es la de captar y ampliar la imagen formada en los objetivos. En los modernos microscopios hay dos oculares (microscopios binoculares) (microscopios binoculares) que estn unidos mediante un mecanismo que permite ajustar la distancia interpupilar. En general los ms utilizados son los de 10X ( producen un aumento de 10 veces ). OBJETIVOS: Estn colocados en la parte inferior del tubo insertados en una pieza metlica, denominada revolver, que permite cambiarlos fcilmente. Generan una imagen real, invertida y aumentada. Los ms frecuentes son los de 4, 10, 40, y 100 aumentos. Este ltimo se llama de inmersin ya que para su utilizacin se necesita utilizar aceite de cedro sobre la preparacin. En la superficie de cada objetivo se indican sus caractersticas principales, aumento, apertura numrica, y llevan dibujado un anillo coloreado que indica el nmero de aumentos (rojo 4X, amarillo 10X, azul 40X y blanco 100X). Ejercicio Localice las siguientes partes del microscopio y rotlelas en la figura. Aprenda la funcin de cada parte.

Manejo y uso del microscopio

1- Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de empleo y bajar la platina completamente. 2- Si el microscopio se recogi correctamente en el uso anterior, ya debera estar en esas condiciones. 3- Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas. 4- Comenzar la observacin con el objetivo de 4x (ya est en posicin) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparacin es de bacterias. Para realizar el enfoque: a. Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el tornillo macromtrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a travs del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin pudindose daar alguno de ellos o ambos. b. Mirando, ahora s, a travs de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparacin con el macromtrico y, cuando se observe algo ntida la muestra, girar el micromtrico hasta obtener un enfoque fino. 5- Pasar al siguiente objetivo. La imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micromtrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdi por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operacin desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparacin y por ello es fcil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparacin si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersin si se observa una preparacin que ya se enfoc con el objetivo de inmersin. 6- Empleo del objetivo de inmersin: - Bajar totalmente la platina. a. Subir totalmente el condensador para ver claramente el crculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habr que echar el aceite. b. Girar el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio camino entre ste y el de x40. 9

c. Colocar una gota mnima de aceite de inmersin sobre el crculo de luz. d. Terminar de girar suavemente el revlver hasta la posicin del objetivo de inmersin. e. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente. f. Enfocar cuidadosamente con el micromtrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersin y la preparacin es mnima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande. g. Una vez se haya puesto aceite de inmersin sobre la preparacin, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se manchara de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operacin desde el paso 3. h. Una vez finalizada la observacin de la preparacin se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revlver. En este momento ya se puede retirar la preparacin de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersin en posicin de observacin. i. Limpiar el objetivo de inmersin con cuidado empleando un papel especial para ptica. Comprobar tambin que el objetivo 40x est perfectamente limpio.

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Mantenimiento y precauciones
1- Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posicin de observacin, asegurarse de que la parte mecnica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda. 2- Cuando no se est utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y daen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo. 3- Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de ptica. 4- No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se est utilizando el microscopio. 5- Despus de utilizar el objetivo de inmersin, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pauelos especiales para ptica o con papel de filtro (menos recomendable). En cualquier caso se pasar el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden daar las lentes y su sujecin. 6- No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macromtrico, micromtrico, platina, revlver y condensador). 7- El cambio de objetivo se hace girando el revlver y dirigiendo siempre la mirada a la preparacin para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrndolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se est observando a travs del ocular. 8- Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algn lquido, secarlo con un pao. Si se mancha de aceite, limpiarla con un pao humedecido en xilol. 9- Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesin prctica y, al acabar el curso, encargar a un tcnico un ajuste y revisin general de los mismos.

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