LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS DEPARTAMENTO DE PRODUCCIN E INDUSTRIA ANIMAL CTEDRA DE CIENCIAS Y TECNOLOGA DE LA LECHE

MICROBIOLOGA DE LA L ECHE I GUA P RCTICA

M ARACAIBO, OCTUBRE 2003

I PARTE. RECUENTO TOTAL DE BACTERIAS

INTRODUCCIN l nmero total de microorganismo presentes en la leche o sus derivados por unidad de volumen o de peso es indicativo de las condiciones sanitarias de produccin y conservacin, as como de la vida comercial del producto. Recuentos bacterianos muy altos en leche cruda son indicativos de fuerte contaminacin durante las operaciones de ordeo, manipulacin o almacenamiento, o bien de conservacin a temperatura de refrigeracin insuficientes para retardar al crecimiento microbiano. En productos lcteos pasteurizados, altas cuentas bacterianas indican deficiente procesamientos y/o mala conservacin. Los valores obtenidos en los recuentos bacterianos de estos productos se toman como base para su clasificacin en diferentes grados de calidad. De all la gran importancia que esta determinacin reviste, tanto desde el punto de vista del control de calidad a nivel de las industrias del ramo, como del control sanitario de las agencias gubernamentales. Los mtodos comnmente utilizados para el recuento total de microorganismo en la leche y sus productos son el macroscpico en placas de agar y el microscpico directo. Ambos mtodos al igual que otras tcnicas microbiolgicas aplicadas a estos productos, generalmente se rigen por las normas establecidas por la Asociacin Americana de Salud Publica (Standard Methods for the Examination of Dairy Products) que a su vez han sido recomendadas y traducidas por la Organizacin Panamericana de la Salud (Normas para el Examen de Productos Lcteos). En el presente trabajo prctico se estudian el recuento estndar en placa, previa consideracin de las normas que deben seguirse para la toma adecuada de muestras de diferentes productos lcteos.

1.- TOMA DE M UESTRAS PARA EL ANLISIS M ICROBIOLGICO Cuando las muestras de leche o derivados lcteos se destinan a anlisis de tipo microbiolgicos, es necesario tomar una serie de precauciones que adems de garantizar la obtencin de muestras verdaderamente representativas, eviten la contaminacin por fuentes externas y la proliferacin de la carga bacteriana ya presente en los productos. Entre esas precauciones destacan las siguientes: a) Todos los equipos empleados en la toma de muestras deben encontrarse estriles y desinfectados antes de cada recoleccin. Por ejemplo, para tomar varias muestras de leche cruda puede emplearse un probador adecuado que se va esterilizando en un bao de agua hirviente (1 minuto) o una solucin que contenga 250 a 500 ppm de cloro residual (esterilizacin qumica) cuyo exceso se elimina por enjuague en agua estril a fin de evitar que el desinfectante contamine el producto, donde actuara como inhibidor microbiano. b) Tomar precauciones para evitar la contaminacin externa, incluso de las manos de la persona que hace la operacin. c) Recolectar porciones representativas (no menos de 150 g) directamente de tanques, recipientes de transporte o pesada, pero no de envases al por menor, los cuales deben tomarse completos en numero proporcional al lote. d) Tomar adems las precauciones sealadas para muestras destinada al anlisis fsico o qumico (1:1) con el propsito de obtener, conservar e identificar muestras representativas, excepto en lo que se refiere a la adicin de preservativos, los cuales solo pueden adicionarse para recuentos bacterianos por el mtodo microscpico directo (0,08 % de formaldehdo para un anlisis a efectuarse dentro de las 36 horas que siguen a la recoleccin) pero nunca para otros exmenes microbiolgicos.

1.1.- TOMA DE M UESTRAS DE LECHE Y D ERIVADOS FLUIDOS Para tomar directamente del animal, lavar la ubre con agua potable, eliminando el exceso de humedad con un pao limpio. Recolectar directamente, sobre recipientes estriles, muestras de cada teta por separado, desechando los primeros chorros que

posiblemente estn contaminados con microorganismos que se desarrollan en los conductos galactoforos. Recolectar muestras en cantaras o recipientes similares utilizando probadores de acero inoxidable. La leche se agita bien con un agitador y se toma la muestra del centro (empleando l cucharn o del fondo (con el tubo de muestreo). Un procedimiento similar puede emplearse para tomar muestras de camiones cisternas o de tanques de pesada, tratando en lo posible de mezclar toda la leche de un solo productor y de obtener homogeneidad antes de hacer la recoleccin. Cuando la muestra ha de tomarse de grandes tanques de almacenamiento, la leche debe agitarse por un tiempo suficiente para lograr completa homogeneidad, el cual depende del tamao y forma del tanque as como del tamao, forma, localizacin y velocidad del agitador; del volumen de leche presente, etc. En general, el agitador debe de funcionar por lo menos durante 3 minutos antes de hacer la recoleccin y la muestra puede tomarse con un cucharn, un tubo de muestreo o bien con una botella colocada dentro de un recipiente pesado inerte, que se suspende hasta el centro del tanque. Cualquiera que sea el caso, una vez obtenida la muestra se transfiere a un frasco estril y se conserva de acuerdo a lo indicado en las instrucciones generales.

1.2.- TOMA DE M UESTRAS DE PRODUCTOS LCTEOS VISCOSOS Los productos viscosos tales como crema de alto contenido de grasa, mezcla para helados, leche evaporada o leche condensada deben agitarse bien, hasta obtener su homogeneidad, empleando un agitador estril adecuado. Luego pueden recolectarse las muestras, insertando lentamente un tubo de muestreo de dimetro superior al empleado para la leche, de modo que el tubo se vaya llenando con la misma velocidad con que va penetrando en el producto. Si este se presenta demasiado viscoso, el llenado puede facilitarse por succin, de la extremidad superior del tubo. La muestra obtenida se transfiere a un frasco estril en la forma ya indicada. Cuando el producto se encuentra en lata de tamao comercial, se deben recolectar los envases completos cerrados. Una vez en el laboratorio, se eliminan las etiquetas de papel, se lava el exterior de la lata con agua tibia y jabn o detergente, y se desinfecta uno de sus extremos con solucin de fenol al 5% o por inmersin durante 2 minutos en una

solucin de cloro conteniendo 100-200 ppm. Seguidamente la lata se agita, seca y se abre con un punzn previamente esterilizado en igual forma que la lata, dejando un orificio lo suficientemente grande como para introducir una pipeta estril, con la cual se extrae la cantidad requerida para el anlisis, o bien se transfiere el contenido a un frasco tambin estril.

1.3.- TOMA DE M UESTRAS DE LECHE Y D ERIVADOS FLUIDOS PASTEURIZADOS Las muestras de leche u otros derivados fluidos pasteurizados se pueden recolectar desde varios puntos: a) A la salida de la leche de la seccin de calentamiento o de enfriamiento del pasteurizador. b) Del tanque de almacenamiento donde se mantienen el producto ya pasteurizado antes de ser envasado c) De la envasadora despus del envasado, retirando un numero de envases representativo del lote.

1.4.- TOMA DE M UESTRAS DE PRODUCTOS LCTEOS S EMISLIDOS Y SLIDOS Las muestras de aquellos productos que por su consistencia no pueden agitarse ni recolectarse con probadores tipo cucharn o tubo de muestreos, como ocurre con los helados, quesos, mantequilla y productos desecados, pueden tomarse con diferentes instrumentos segn sea el caso, entre ellos cucharas, cuchillos, esptulas acanaladas o probadores especiales, con los cuales se toman una porcin representativa que abarque la parte interna. En ciertos casos, sin embargo, es necesario tomar solo porciones expuestas o bien nicamente la parte interna. En general, las muestras de esta naturaleza se toman siguiendo procedimientos similares a los indicados para los anlisis del tipo fsico-qumico de cada producto particular, pero siempre manteniendo las condiciones aspticas propias del anlisis microbiolgico. Si los productos se presentan en latas, se procede a su apertura conforme a la tcnica que se ha indicado para productos viscosos envasados.

2.- RECUENTO ESTNDAR EN PLACAS DE AGAR (R ECUENTO DE AEROBIOS M ESFILOS ) El recuento estndar en placas (REP) o recuento de aerobios mesfilos, es un mtodo macroscpico, emprico, universalmente utilizado para determinar en forma aproximada la carga bacteriana. Esencialmente consiste en determinar el numero de colonias que se desarrollan cuando se siembra una cantidad medida o pesada de muestras, en placas de agar de composicin estndar preparadas bajo condiciones estipuladas, a objeto de obtener reproductividad en los resultados en diferentes laboratorios. Antes de la siembra, la muestra se prepara para asegurar su homogeneidad, dispersar los grumos de bacterias y distribuirlas uniformemente. Esto se logra por agitacin bajo condiciones especiales. Luego, la muestra se diluye por lo menos dos veces (1:10 y 1:1000) con agua amortiguada (amortiguador de fosfato) en botella especiales que se agitan con la muestra. Seguidamente, con pipetas esterilizadas de 1,1 mL, se transfieren 0,1 y 1,0 mL de cada dilucin a placas de Petri estriles, donde se mezclan con 10-12 mL de agar estndar fundido a 45C. Una vez solidificado el agar, las placas se incuban invertidas a 32 o 35C por 48 3 horas y finalmente se cuentan aquellas placas que presentan entre 30 y 300 colonias (25 a 250 segn las nuevas normas de la APHA). Multiplicando l nmero de colonias de una placa, aproximadamente hasta el segundo digito, por la dilucin correspondiente, se obtiene l nmero aproximado de bacterias que se desarrollan a partir de 1 mL o g de muestra, el cual se expresa como recuento total en placas. Los resultados obtenidos por este mtodo permiten establecer la calidad sanitaria de la leche. Una comparacin de los resultados obtenidos en la leche antes y despus de ser pasteurizadas, permite deducir la resistencia de los microorganismos presentes en el producto a la accin del calor. Un conteo superior en el producto pasteurizado ind ica recontaminacin post-pasterizacin o bien presencia de microorganismos termoflicos. Este mtodo puede aplicarse tanto a la leche y derivados fluidos como a los productos lcteos semislidos o slidos, variando fundamentalmente el procedimiento de preparacin de las diferentes muestras y de la primera dilucin. Particularmente en los productos slidos es necesario pesar la muestra directamente sobre una botella de dilucin bajo cond iciones aspticas. A continuacin se presentan los procedimientos para varios productos lcteos.

Materiales y Equipos: Pipetas de 1,1 y 11 mL; Botellas de dilucin (180 mL) graduadas a 99 1 mL con tapas de rosca; Mechero de Bunsen; Placas de Petri 100 * 15 mm, de vidrio o plstico; Bao termoregulado ( 45 1C); Estufa de incubacin 32 o 35 1C); Contador de colonias, tipo Qubec, de campo oscuro; Balanza 500g, de sensibilidad reciproca de 53g, con pescas; Equipos comunes para preparacin de medios de cultivo

Reactivos: Solucin de fosfato (pH 7,2); Agua para dilucin

Medios de cultivo: Agar estndar comercial o preparado de acuerdo a lo siguiente (Estndar Methods AHPA): Digerido pancretico de casena (usp)........................... 5 g Extracto de levadura.......................................................2,5 g Glucosa (Dextrosa).........................................................1 g Agar, grado de bacteriolgico.......................................15 g Agua destilada..........................................................1000 mL PH 7,0 +/- 0,1 Muestras: Leche cruda y pasteurizada de diferentes marcas

Procedimiento: 1) Limpieza y esterilizacin del materia de vidrio en Horno: a) Limpiar las botellas de dilucin, tubos de ensayo, placas de Petri, pipetas y dems material de vidrio sucesivamente con agua jabonosa tibia, agua del grifo y agua destilada. El material de vidrio, especficamente las pipetas, deben mantenerse sumergidos en agua de grifo hasta el momento de la limpieza y peridicamente debe sumergirse en mezcla sulfocromica. Despus del lavado, el material debe escurrirse y protegerse del polvo. Para

evitar su ruptura se recomienda desecarlo antes de la esterilizacin por aire caliente. b) Esterilizar el material de vidrio limpio y seco en el horno de aire caliente. Para ello las pipetas se colocan en estuches metlicos que se llenan solamente hasta 2/3 de su capacidad, o bien se envuelven en papel. La boca de los frascos de vidrio se tapan con algodn y encima se recubren con papel que se fija al cuello con hilo o liga. El horno no debe llenarse en forma excesiva y su temperatura debe mantenerse por encima de 160C (320F). La esterilizacin se obtiene por calentamiento a 170C durante 2 horas. El material esterilizado debe conservarse en gabinetes adecuados, protegidos del polvo y la humedad.

2) Preparacin y esterilizacin de los blancos de dilucin en autoclave: a) Llenar las botellas de dilucin con suficiente cantidad de agua amortiguada (102-103 mL) de modo que despus de la esterilizacin contenga 99 +/- 2 mL b) Cerrar las botellas dejando la tapa floja para permitir la expansin durante la esterilizacin. Llevarlas al autoclave. c) Esterilizar a 121C (15 libras/pulgada cuadrada de presin) durante 15 minutos, contados a partir del momento en el cual se obtiene la temperatura indicada. d) Despus de la esterilizacin, ajustar las tapas y guardar las botellas al abrigo del polvo. Estos blancos de dilucin pueden usarse solo durante unos pocos das despus de esterilizados.

3) Preparacin y esterilizacin del medio de cultivo en autoclave: a) Disolver el medio deshidratado o los ingredientes del mismo, en 500 mL de agua en un recipiente de vidrio o acero inoxidable. Aplicar agitacin ocasional durante 3-5 minutos, seguida de calentamiento. Ajustar el pH, si es necesario, a 7,0 +/- 0,1, haciendo las mediciones con un potencimetro a 45C.

b) Diluir hasta 1000 mL a 20C. c) Distribuir el medio en frascos (120 mL) o en tubos (10-12 mL) y taparlos con algodn. d) Esterilizar en el autoclave a 121C durante 15 minutos y conservar al abrigo del polvo y humedad.

4) Identificacin de las diluciones y placas: a) Antes de hacer las diluciones de la (s) muestra (s) se deben colocar en orden sobre el mesn perfectamente horizontal y cerca del mechero encendido, se requieren de 2 blancos de dilucin y 4 placas de Petri por cada muestra a analizar. A veces se utilizan una quinta placa para sembrar la muestra no diluida. b) Rotular las botellas con la dilucin a obtener, por ejemplo 1:10 (1:101 o 10-1 ) y 1:1000 (1:103 o 10-3 ). Rotular las placas indicando el nmero de la muestra, la dilucin que se ha de sembrar, la fecha y hora de la siembra, as como l numero del equipo del estudiante, este ultimo encerrado en un circulo. Por ejemplo, si el equipo 16 analiza una muestra de leche cuyo numero es 8, diluida 11 mL en 99 mL (10-1 ) y se siembra 1 mL y 0,1 mL en placas diferentes. La primera se rotulara: leche 8, 10-1 , 22/8-9:30 am, 16; mientras que la segunda se rotulara leche 8,10-2 , 22/8-9:30 am, 16. c) El estudiante deber recordar tambin el nmero o letra que corresponden a la incubadora donde mantiene sus placas.

5) Preparacin de la muestra y diluciones: a) El tiempo empleado entra la dilucin de la primera muestra y la siembra de la ultima placa de una serie, no debe ser superior a 20 minutos. Por lo tanto, el trabajo debe planificarse de modo que se ajuste a esta condicin. b) Mezclar la muestra en forma completa y vigorosa hasta homogeneizarla bien. Adems, inmediatamente antes de transferir un volumen de muestra o dilucin, agitar el frasco 25 veces en 7 segundos, con movimientos de vaivn vertical de aproximadamente 30 cm.

c) Preparar una dilucin 1:10 (10-1 ). Para ello, con pipeta estril, transferir 11 mL de leche a un blanco de dilucin (99 mL). La operacin debe hacerse introduciendo la punta de la pipeta en la muestra no mas de1,5-2,5 cm para evitar succionar aire o espuma, tocando con ella la parte inferior interna del frasco y ajustando el volumen a medir hasta la seal (11 mL) de manera que se mantengan un ngulo de 45 entre la pipeta y la normal. Descargar el volumen medido en el blanco de dilucin rotulado, tocando con la punta la parte inferior del cuello, dejando caer l liquido durante 2-3 segundos y tocando luego una sola vez un punto seco en el vidrio, sin soplar la ultima gota. d) Preparar una dilucin 1:1000 (10-3 ) transfirie ndo, con pipeta estril, 1 mL de la dilucin 1:10 (10-1 ) a un segundo blanco de dilucin rotulado, siguiendo la misma tcnica anterior. e) Si es necesario, se pueden continuar haciendo diluciones en la misma forma anterior.

6) Siembra e incubacin de las placas: a) Colocar los frascos o tubos conteniendo el medio de cultivo en un bao Maria hirviendo para fundirlo. Esta operacin debe hacerse sin emplear mas medio del que pueda utilizar en un espacio de 3 horas, evitando su exposicin prolongada a temperaturas excesiva altas durante y despus de la fusin. Una vez fundido el medio, mantenerlo en bao Maria o incubadora a 45 1C, controlando la temperatura con un termmetro que se introduce en un frasco o tubo similar a los del medio, pero conteniendo agua. b) Utilizando una pipeta estril de 1,1 mL, transferir 0,1 mL y 1 mL de la primera dilucin (10-1 ) a las placas correspondiente, debidamente rotuladas (10-2 y 10-1 ). Esta operacin debe hacerse manteniendo la pipeta de manera que forme un ngulo de 45, levantando la tapa de la placa solo lo suficiente para introducir la punta de la pipeta, tocando el fondo de la placa durante la descarga y luego levantando la pipeta sin tocar otra rea seca de la placa.

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c) Con una nueva pipeta estril, repetir la operacin anterior transfiriendo 0,1 y 1,0 mL de la siguiente dilucin (10-3 ) a las placas rotuladas (10-4 y 10-3 ). Continuar con las siguientes diluciones en la misma forma, en caso de que se hayan preparado. d) Verter 10-12 mL del medio de cultivo fundido (45 1C) en cada placa de Petri, flameando la boca del recipiente antes de la adicin. En cada caso mezclar completamente el medio con las porciones liquidas previamente colocadas, haciendo girar la placa primero en una direccin y luego en la opuesta, evitando derramar la mezcla por los bordes y dejando solidificarse sobre una superficie nivelada (5-10 minutos). e) Es conveniente preparar un control de esterilidad utilizando 1 mL de agua de dilucin a fin de verificar la asepsia del proceso y la esterilidad del medio y dems materiales empleados. f) Levar las placas solidificadas a la incubadora (35C) en forma invertida, donde deben distribuirse en pilas de no ms de 6 placas, separadas entre s por lo menos 2,5 cm. Mantener la incubacin durante 48 3 horas en condiciones de humedad relativa normal. La perdida de peso del medio durante las 48 horas de incubacin no debe ser superior al 15 %.

7) Seleccin de las placas y recuento de las colonias: a) Despus del periodo de incubacin, seleccionar aquellas que presentan de 30 a 300 colonias no difusas. b) Contar las colonias con ayuda de amplificacin, preferiblemente con un contador de colonias tipo Qubec de campo oscuro, provisto de una placa gua marcada en centmetros cuadrados. Deben contarse las colonias incluyendo las puntiformes, que no deben confundirse con partculas de medio no disueltas o sustancias precipitadas. c) Multiplicar el numero total de colonias por l reciproco de la dilucin correspondiente, haciendo la aproximacin hasta el segundo digito que se sigue de tantos ceros como sean necesarios para indicar la dilucin correcta. Por ejemplo, s el conteo de una placa cuya dilucin es de 10-3 muestra el

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desarrollo de 128 colonias, el resultado se expresara Recuento estndar en placas por mL = 130.000. No deben expresarse los resultados como numero de bacterias por mL. d) Cuando se preparan placas de la misma dilucin en duplicado, se debe tomar el promedio de los recuentos obtenidos. Si solo una de las placas presenta 30-300 colonias, debe promediarse ese resultado con el otro aunque se salga de dichos valores. e) Cuando se observa ausencia de placas con 30-300 colonias, se debe contar aquella cuyo recuento se aproximan ms a 300 colonias. f) Si l nmero de colonias observado es excesivamente alto y por lo tanto difcil de contar, se puede calcular contando solamente 13 cuadros (centmetros cuadrados) representativos diferentes y multiplicando el resultado por el factor 5. Si l nmero de colonias por centmetros cuadrados es mayor de 10, se pueden contar solamente las colonias presentes en 5 cuadros y multiplicar el resultado por 13. g) Cuando ninguna placa presenta mas de 30 colonias, se debe contar aquellas de menor dilucin sealndose como menos de 30 veces la dilucin correspondiente; as, en el caso de la dilucin 10-2 , el resultado se expresar Recuento estndar en placas = menos de 3.000. h) Si se observa n colonias difusas, el recuento total puede estimarse contando reas representativas bien distribuidas pero libres de dichas colonias. Sin embargo esto solo puede hacerse cuando el rea cubierta por esas colonias no es superior a la mitad de la placa.

Observaciones: Mayores detalles sobre la tcnica que se estudia, pueden ser observadas en Standards Methods o su traduccin el espaol Normas para el examen de productos lcteos. Existen diferentes mtodos menos costosos y ms rpidos que el recuento estndar en placas para la determinacin del numero de grmenes viables en la leche y derivados. Estos mtodos, aunque relativamente menos exactos, son

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mejores que los de reduccin para clasificar leches crudas de bajo contenido bacteriano. Entre ellos se encuentran el mtodo del tubo ovalado, el mtodo de la siembra en placa con asa calibradas, el mtodo de la microplaca y el mtodo del tubo rotatorio. Pueden emplearse tcnicas aun ms sencillas pero que permiten obtener cierta informacin cualitativa, como son el mtodo del agar inclinado de Burro o el mtodo de la tira de papel impregnada con medio de cultivos (Bactostrip). Informacin detallada sobre estos mtodos puede consultarse en Standards Methods o en el Laboratory Manual de la Milk Industry Foundation.

3.- R ECUENTO ESTNDAR EN LECHE CONDENSADA Y EN LECHE EN POLVO Materiales y Medios de Cultivo: Los mimos utilizados para leche

Muestras: Leche condensada en latas y Leche en polvo en latas.

Procedimiento: 1. Abrir la lata y tomar una muestra representativa de acuerdo con las instrucciones sealadas en 1.4. 2. Proceder como en la leche fluida, utilizando 11 g de muestra, que se debe pesar rpidamente bajo condiciones aspticas, directamente sobre un blanco de dilucin (99 mL) previamente calentado a 45C. 3. Mezclar bien hasta obtener completa disolucin dejando que se enfre a temperatura ambiente antes de la siembra. 4. Continuar el anlisis en la forma sealada para la leche fluida, pero incubando las placas por 72 horas y expresando los resultados como Recuento estndar en placas por g de muestra, indicando la temperatura de incubacin.

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4.- R ECUENTO ESTNDAR EN Q UESOS Materiales y Equipos: Esptula acanalada esterilizada; Cuchillo esterilizado; Papel esterilizado; Arena fina esterilizada; Mortero y pistilo esterilizado; Otros utilizados en 2.

Procedimiento: 1. Con una esptula acanalada estril separar 3 porciones cilndricos del queso suministrado, de diferentes partes. 2. Con un cuchillo estril cortar la parte ms cercana a la concha (aproximadamente 2 cm) de cada cilindro, partes que pueden emplearse para tapar los orificios dejados en el queso. 3. Pesar 11 g del resto de las porciones separadas, cortndolas en pequeas trozos con un cuchillo estril. 4. Llevar la muestra pesada a un mortero estril y triturarla con cantidad suficiente de arena fina estril hasta molerla bien. 5. Transferir la mezcla de queso molido con arena a un blanco de dilucin (99 mL) previamente calentado a 45C. Tapar y agitar bien durante 2-3 minutos. 6. Continuar el anlisis como en la leche, utilizando pipetas con punta ancha y haciendo las mediciones de los volmenes requeridos mientras se agitan las botellas para evitar que la arena al sedimentar arrastre al fondo las partculas de queso. 7. Es de hacer notar que las diluciones y otras condiciones del anlisis pueden variarse de acuerdo con el tipo de queso. 8. Expresar los resultados obtenidos como Recuento estndar por g de queso.

5.- R ECUENTO ESTNDAR EN CREMA Y M ANTEQUILLA El procedimiento utilizado para cremas delgadas es el mismo empleado para la leche, o sea utilizando 11 mL de la muestra preparada que se diluyen con 99 mL de blanco de dilucin. Pero cuando se analizan cremas de alto contenido de grasa (40% o m s) o mantequilla, se prefiere pesar la muestra (11 g) previamente calentada a 45C y bien mezclada, sobre un blanco de dilucin (99 mL) utilizando pipetas estriles. Para evitar que

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la muestra fundida se adhiera a las paredes de la pipeta, esta se calienta a 40-45C por succin de agua para dilucin a 45C, que se descarga inmediatamente antes de succionar la muestra homognea. El resto del procedimiento es igual al empleado para la leche, con la diferencia de que generalmente basta hacer 2 diluciones (10-1 y 10-2 ).

6.- R ECUENTO ESTNDAR EN H ELADOS El procedimiento que se emplea para el recuento estndar en helados es el mismo utilizado para la leche, con la diferencia de que la muestra primero se funde por calentamiento en bao Maria a 35C durante no ms de 15 minutos y luego se mide (11 mL) o se pesa (11 g) segn la consistencia de la mezcla, recibindola sobre un blanco de dilucin estril (99 m L) previamente calentando a 45C. El resto del procedimiento se contina como se ha indicado por la leche.

REQUISITOS M ICROBIOLGICOS PARA LA LECHE CRUDA La norma COVENIN clasifica la leche cruda segn el nmero de aerobios mesfilos en cuatro categoras:

Categoras Categora A Categora B Categora C Sin clasificacin

ufc/mL hasta 500.000 500.001 a 1.500.000 1.500.001 a 5.000.000 ms de 5.000.000

Para leche pasteurizada se exige lo siguiente: o o Recuentos de Aerobios Mesfilos: mximo: 2,0 x 104 ufc/mL Coliformes Totales: mximo: 93 NMP/mL.

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II PARTE DETERMINACIN D E BACTERIAS TERMODRICAS , TERMFILAS Y PSICRFILAS

INTRODUCCIN La temperatura de la leche durante su transporte y almacenamiento es uno de los factores ms importantes que afectan el crecimiento bacteriano y por lo tanto determinan su tiempo de conservacin. Este factor influye igualmente en los tipos de microorganismo que se desarrollan y por ende en los cambios o tipos de descomposicin que experimentan el producto. Cuando la leche se mantiene a temperatura normal, sin refrigeracin generalmente experimenta acidificacin debido al crecimiento de bacterias lcticas (flora normal) con produccin de cido lctico por fermentacin de la lactosa, bajando el pH e inhibiendo as el desarrollo de otros microorganismos y ocasionando la precipitacin de la casena al acercarla a su punto isoelctrico (pH 4,7). Estos microorganismos reciben el nombre de mesfilos por tener temperaturas ptimas de crecimiento entre la de un ambiente normal y la temperatura corporal. Si la leche cruda se conserva a temperaturas de refrigeracin, la velocidad de acidificacin se reduce al disminuir el crecimiento de las bacterias lcticas comunes (v.g. Lactococcus lactis), es probable que ocurran ciertos cambios en el sabor y olor y que se produzca proteolisis lctea por accin de grmenes capaces de crecer a temperaturas relativamente bajas. Estos microorganismos reciben la denominacin de psicroflicos (v.g. Pseudomona fluorescens). Cuando la leche cruda es sometida a la pasteurizacin comercial, aproximadamente un 95-99% de los microorganismos son destruidos, entre ellos todos los patgenos, pero pueden sobrevivir ciertos grmenes termorresistentes, no patgenos que se han clasificado en dos grupos: termoflicos que son capaces de reproducirse a temperatura de pasteurizacin baja (63C/30 min) como por ejemplo el Lactobacillus termophillus, y los termodricos, que resisten la pasteurizacin, pero no pueden desarrollarse a esa temperatura, presentado mas bien comportamiento mesfilo para su crecimiento, como es el caso del Streptococcus salivarius subsp. themophillus. Ambos grupos son responsables de altas recuentos bacterianos en la leche pasteurizada. 16

En las industrias lcteas, los recuentos de estos grupos de microorganismos es de inters, debido a que pueden ocasionar muchos problemas de carcter funcional. Por lo tanto, altos recuentos de ellos deben evitarse mediante buenas practicas de produccin y procesamiento, y en caso de presentarse, deben ponerse en evidencia las causas que las originaron y corregirse, en beneficio de la calidad y vida comercial de los productos que se elaboran. A continuacin se estudia cada grupo en particular, indicndose los procedimientos que se utilizan en los laboratorios de control de calidad para su determinacin.

1. - D ETERMINACIN DE BACTERIAS TERMODURICAS EN LA LECHE. Las bacterias termoduricas son microorganismos termoresistentes, generalmente mosoflicos, en su mayora no esporulados, que frecuentemente se presentan en la leche cruda bajo malas condiciones sanitarias o procesada en plantas mal limpiadas y saneadas y/o que utilizan malas practicas de procesamiento. Se incluyen en este grupo el Streptococcus termophyllus y otros Streptococcus (S. bovis, S. zymogenes, S. liquefaciens, S. faecalis) as como el Microbacterium lacticum, ciertos Micrococcus y algunas especies esporuladas del gnero Bacillus. Cuando los establos o los utensilios de ordeo no son bien lavados o saneados pueden darse condiciones bajo las cuales mueren las especies o cepas microbianas mas dbiles, pero sobreviven aquellas ms resistentes al calor, las cuales crecen en la superficie de esos utensilios, representando una fuente de contaminacin. Otras veces suele ocurrir que una o varias vacas de la hacienda, frecuentemente animales viejos, presenten como huspedes crnicos de la ubre, especies o cepas bacterianas muy resistentes al calor (v.g. ciertas capas de micrococos) en estas condiciones, es muy posible la contaminacin de la leche de esa hacienda con termodricos que luego van a contaminar el producto almacenado en la planta lechera. Esto sucede con mayor frecuencia durante el verano, por asociacin de malas condiciones de produccin con deficiente refrigeracin. Por otra parte, la contaminacin con termodricos puede ocurrir en la planta, cuando los mtodos de limpieza y saneamiento de los equipos son inadecuados o cuando se mezcla la leche cruda con el producto pasteurizado sobrante. Una de las causas mas frecuentes de contaminacin con estos microorganismos es la prctica errnea de emplear leche descremada pasteurizada para estandarizar, o la de re-pasteurizar la s leches sobrantes.

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Una vez contaminada la leche cruda con termodricos, cualquiera que sea la causa, puede suceder que el tratamiento trmico involucrado en la pasteurizacin no reduzca el nmero de bacterias, determinando que el producto no cumpla las normas sanitarias para leche pasteurizada, o que se descomponga con gran facilidad bajo condiciones deficientes de refrigeracin. Para solucionar esos problemas, se debe establecer y corregir la causa de la contaminacin. En tal sentido es recomendable hacer recuentos de bacterias termodricas en la misma planta, utilizando muestras recolectadas en diferentes etapas del procedimiento y en caso de que la planta no sea responsable, debe hacerse anlisis de muestras de cada productor hasta localizar el causante de la contaminacin. En la practica, el recuento de bacterias termodricas se obtiene mediante una pasteurizacin de laboratorio (retencin en tubos a 62,3C durante 30 minutos) y efectuando un recuento estndar en placas (REP) de los grmenes termoresistentes. El resultado se expresa como recuento de bacterias termoduricas por mL ( RETd/ mL).

Materiales y Medios de Cultivo: Para la pasteurizacin de laboratorio: o Tubos de ensayos esterilizados, Gradilla de alambre, Pipetas estriles de 10 mL, Bao Mara elctrico termoregulado (62,8+ 0,5C) con gitador y termmetro, Termmetros. Para el recuento estndar en placas: o Los mismos empleados para leche (REP).

Muestras: Leche cruda y Pasteurizada

Procedimiento: 1. Pasteurizacin de laboratorio: a. Transferir con pipeta estril, 5 mL de cada muestras homognea a un tubo de ensayo estril con tapa de rosca, evitando contaminar el borde y la parte superior del tubo.

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b. Llevar los tubos a una gradilla sumergida en un bao Mara regulado a 63 0,5C. Los tubos deben quedar sumergidos de tal manera que la superficie del agua se encuentre aproximadamente 4 cm sobre el nivel de la leche en los tubos. c. Observar la temperatura de la leche en los tubos con un termmetro que se introduce en otro tubo conteniendo 5 mL de leche. d. Cuando la temperatura en el tubo de control alcance 62,3C (debe ocurrir en 5 minutos) empezar a contar el tiempo de pasteurizacin y mantener el tratamiento trmico por exactamente 30 minutos. e. Al cumplirse el tiempo de pasteurizacin, colocar la gradilla con los tubos en un bao de agua helada, para enfriar las muestras a 10C o menos.

2.- D ETERMINACIN DE BACTERIAS TERMOFLICAS EN LECHE Las bacterias termoflicas son aquellas que, adems de resistir la temperatura de pasteurizacin baja, son capaces de crecer a esa temperatura. Generalmente son bacilos no esporulados, aunque no necesariamente (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus). No son patgenas, pero su presencia en la leche es indeseable por que producen acidez, sabores desagradables y tendencia de la leche a coagular despus de la pasteurizacin. Adems, junto con los temodricos, son responsables de recuentos bacterianos elevados en leches pasteurizadas. Crecen bien a 55C pudiendo hacerlo hasta mas de 70C. Las fuentes de contaminacin con bacterias termoflicas mas frecuentes son: la leche cruda obtenida bajo condiciones sanitarias deficientes (utensilios mal lavados y saneados, agua de lavado), los equipos de planta mal limpiados y saneados, el empleo de precalentadores, tanques de retencin u otros equipos de calentamiento o mantenimiento de la leche caliente por tiempos prolongados sin sanearlos (3-6 horas); los filtros de tela empleados para filtrar leche caliente, cuando se usan por ms de 1-2 horas sin cambiarlos; y la practica de re-pasteurizar la leche. La existencia de bacterias termoflicas se pone de manifiesto cuando en las placas de agar, obtenidas en recuentos estndar, aparecen numerosas colonias puntiformes; o por la observacin de muchos bacilos grandes coloreados en las frotis obtenidos por el mtodo de recuento microscpico directo. La

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determinacin de tales grmenes se efecta con un recuento estndar en placas de agar, pero incubando a 55C.

Materiales y Medios de Cultivo: Los mismos utilizados en REP.

Muestras: Leche cruda y pasteurizada.

Procedimiento: 1. Proceder como en el caso del REP, pero empleando 15-18 mL de medio de cultivo en la preparacin de las placas y haciendo la incubacin de las mismas a 55C durante 48 3 horas. 2. Informar los resultados como RBTF/mL.

3.- D ETERMINACIN DE BACTERIAS PSICROFLICAS EN LA LECHE. En microbiologa General se define con el nombre de bacterias psicroflicas aquellas que crecen " mejor " a temperaturas de refrigeracin. En las industrias lcteas, el termino se aplica a las bacterias que se desarrollan relativamente rpido a temperaturas por debajo de 15C, aun cuando su temperatura optima esta por encima de ese valor. Son grmenes no patgenos, pero que al crecer lentamente a bajas temperaturas (1-10C) ocasionan problemas en el almacenamiento de muchos productos lcteos, originando recuentos bacterianos elevados que a su vez determinan disminucin de la calidad de la leche, y a menudo producen sabores u olores extraos descritos corrientemente como "a sucio", "a frutas", "rancia", "agrio", "ptrido", etc. Tales alteraciones generalmente ocurren cuando los recuentos de estos microorganismos llegan a 5-20 millones por mL y se deben a su accin sobre los sustratos mas importantes de la leche, especialmente sobre las protenas y las grasas. En estos grupos de bacterias estn incluidas especies de los generos Pseudomonas, Alcaligenes, Flavobacterium y Acinetobacter e incluso algunas cepas de Enterobacter, que pueden encontrarse en el polvo (suelo), agua, vegetales y equipos de ordeo o de la planta

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mal limpiados y saneados. Se presentan como bacilos Gram negativos, no esporulados que se destruyen fcilmente por el calor. Tambin se incluyen en este grupo, al menos en las industrias lcteas por los problemas que causan, algunas especies de Streptococcus y ciertos mohos y levaduras. Los microorganismos psicroflicos, invariablemente contaminan la leche cruda en la hacienda o en la planta, ellos constituyen parte de la flora normal de la leche cruda, al igual que los coliformes, termodricos y tormoflicos. Los mtodos modernos de conservacin de la leche cruda en tanques refrigerados a nivel de las haciendas, favorecen el crecimiento de estos grmenes y retardan el desarrollo de las bacterias lcticas. Afortunadamente, bajo buenas condiciones de produccin y conservacin no alcanzan a desarrollarse en nmeros capaces de ocasionar los problemas mencionados y adems se destruyen por la pasteurizacin, con excepcin de algunos estreptococos entricos, que pueden sobrevivir al tratamiento trmico y crecer luego a temperaturas por encima de 7C. La presencia de psicrfilos en productos lcteos pasteurizados no se considera normal y es indicativa de posible contaminacin post-pasteurizacin en equipos mal limpiados o s aneados, o bien tratados con aguas de lavado contaminadas. Por ello, el recuento de bacterias psicroflicas en la leche pasteurizada da informacin sobre la bondad del tratamiento post-pasteurizacin y de la vida comercial del producto (bajo refrigeracin). La presencia de algunas bacterias psicroflicas en la leche recin pasteurizada o de altas cuentas despus de 3-4 das de almacenamiento, refleja deficiente limpieza y saneamiento de los equipos en contacto con la leche despus de la pasteurizacin. Estos resultados indican adems que la leche no podr mantenerse por mucho tiempo sin descomponerse, es decir que su tiempo de conservacin normal (vida til) ser reducido. La determinacin de microorganismos psicroflicos en el laboratorio, se efecta mediante un recuento estndar en placas de la muestra sospechosa, haciendo la incubacin a temperatura de refrigeracin. La Asociacin de Salud Pblica Americana (APHA) recomienda incubar las placas a 5-7C durante 7-10 das. Este procedimiento, sin embargo, presenta el inconveniente de requerir mucho tiempo y da resultados satisfactorios solo cuando el nmero de bacterias psicroflicas es muy alto, por esta razn, a veces se emplean otras temperaturas de incubacin, segn la urgencia del caso y el tipo de informacin que se desea obtener, como son: 10C durante 5 das, 15C durante 4 das o 20C durante 3-5 das.

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Un procedimiento que proporciona mejor informacin sobre la vida comercial de la leche pasteurizada consiste en hacer dos recuentos en placas con 5 das de diferencia, a partir de la misma muestra, se conserva hasta el segundo recuento a 7C, en este procedimiento la incubacin de las placas en ambos recuentos se hace a 32C por 2 das o 25C por 3 das. Cualquier aumento perceptible en el segundo recuento indica la presencia de bacterias psicroflicas que pueden reducir la vida comercial del producto.

Materiales y Medios de Cultivo: Refrigerador (7C), Otros utilizados en el REP

Muestras: Leche recin pasteurizada.

Procedimiento: 1. Proceder como en el REP haciendo la incubacin de las placas a 5-7C durante 7-10 das. 2. Contar las colonias y reportar como RBPs/mL

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AUTOEVALUACIN

1. Qu informacin puede obtenerse del recuento total de microorganismos en la leche por el mtodo de recuento en placas (REP) ? 2. Cuales son las normas establecidas para la clasificacin de las leches cruda y pasteurizada, tomando como base el recuento total de microorganismo por el mtodo REP? 3. Cuales son las fuentes de error ms comunes en el mtodo REP? Indique tambin cuales son las limitaciones de este mtodo. 4. Cuales otros mtodos pueden ser utilizados para el anlisis microbiolgico rpido de los productos lcteos? 5. Mencione los grupos de microorganismo que pueden ocasionar problemas en la produccin e industrias de la leche y derivados. 6. Cuales son las diferencias que existen entre las bacterias termodricas, termoflicas y psicroflicas en lo que respecta a temperatura optima de crecimiento y resistencia a la pasteurizacin? 7. Mencione los problemas que pueden derivarse de la presencia de bacterias termodricas, termofilicas y psicrofilicas en la leche y derivados. 8. Cuales son las principales especies de bacterias termodricas, termoflicas y psicrofilicas que pueden presentarse en la leche y derivados? 9. Indique independientemente, las principales fuentes de contaminacin de la leche con bacterias termodricas, termofilicas y psicroflicas. 10. Qu precauciones deben adoptarse en una planta lechera para evitar la contaminacin con bacterias termodricas, termoflicas y psicroflicas?

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REFERENCIA CONSULTADAS

1. Foster E.M.,P.E. Nelson, M.L Seeck, R.N. Doetsch and J. C Olson. "Dairy Microbiology", U.S.A.(1957). 2. Garassini L. A. Microbiologa Tecnolgica, p. 183_195. Ediciones de la biblioteca de la Universidad Central de Venezuela, Caracas (1964). 3. Laboratory Manual. Methods of Analysis of Milk ands its Products, p 36-96, 153-164. Milk Industry Foundation, 1145 19th St., N.W., Washington, D.C. 20036 (1964). 4. Lampert L.M. "Modern Dairy Products", p.96-106 .Chemical Publishing Co., Inc. New York, N.Y., U.S.A.(1965). 5. Levowitz D. An Inquiry into The Usefulness of the Standard Methods Direct Macroscopic Count. Journal of Milk and Food technology, 20: 288-293 (1957). 6. Normas para el examen de productos lcteos". Organizacin panamericana de la salud,1501 New Hampshire Av.,N. W., Washington 6, D.C., U.S.A. ( 1963). 7. Standards Methods for Examination of Dairy Products, American Public Health Association, 1790 Broadway, New York 19, N.Y., U.S.A. 8. Witter L. D. Psycrophylic Bacteria-A Review. Journals of Dairy Science 44: 983-100 (1961). p.205-227. Pretice-Hall, inc, Englewood Cliffs, NewJersey,

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