Controle da Expresso Gnica - Eucariotos Princpios de Bioquimica Lehninger- Quarta Edio Biologia Molecular da Clula Bruce Alberts et al.

l. Quinta Edio

Clulas eucariotas

Contedo genmico x diferenciao celular

Regulao da expresso gnica em eucariotos

Em procariotos, os genes so normalmente controlados na forma de operons. Em eucariotos, genes so controlados individualmente e operons no so conhecidos. O controle da expresso gnica muito mais complexa: Existncia de um ncleo e assim transcrio e traduo no so acopladas. A RNA polimerase II muito maior e complexa do que sua contraparte procaritica. Os mRNA so processados durante a transcrio (capacete 5, caula poliA, introns).

Expresso gnica em eucariotos

Possveis pontos de controle

Inciao da transcrio Processamento de RNA

Transporte de mRNA para o

citoplasma Degradao do mRNA Iniciao da traduo Modificao ps-traducional e

degradao de protenas

Regulao Transcricional

Estado basal de Transcrio

As RNA polimerases eucariticas possuem baixa afinidade pelos regies promotoras.

A iniciao da transcrio dependente da ao de mtliplas protenas reguladoras.

Ocorre uma predominncia da regulao positiva: o armazenamento do DNA dentro da cromatina torna a maioria dos promotores inacessveis. Maior eficincia da regulao positiva.

Estado basal de Transcrio

Em eucariotos promotores esto geralmente inativos e os genes silenciados:
O acesso aos promotores restrito pela estrutura da cromatina. Predominncia dos mecanismos reguladores positivos. Presena de protenas reguladoras complexas.

Como ligar um gene eucaritico?

Remodelagem da cromatina Protenas regulatrias
Recrutamento de fatores de transcrio ao complexo de iniciao.

Como ligar um gene eucaritico?

Remodelagem da cromatina Protenas regulatrias
Recrutamento de fatores de transcrio ao complexo de iniciao.

Remodelagem da cromatina
Essencial para tornar o DNA mais acessvel aos fatores de transcrio

A Estrutura do Cromossomo Eucaritico

Duas cromtides (10 espiras cada) Uma espira (30 rosetas)

Forma da cromatina em colar de contas

Uma roseta (6 alas)

Uma ala ~75Kb

Fibra de 30nm

Remodelagem da cromatina
O DNA interfsico ainda bem condensado.
A inacessibilidade da cromatina pode ser

demonstrada por ensaios de sensibilidade da a nucleases.

Genes inativos so resistentes a DNAse. Genes ativos so mais sensveis ao tratamento com DNAse.

Sensibilidade da cromatina DNAse

Em eritrcitos de galinha o gene da ovoalbumina totalmente insensvel ao tratamento com DNAse I : est inativo

Sensibilidade da cromatina DNAse

Em eritrcitos de galinha o gene da ovoalbumina totalmente insensvel ao tratamento com DNAse I : est inativo

O gene da beta-globina adulta mais sensvel a digesto com DNAse I enquanto o gene da beta-globina embrinica menos sensvel.

O papel da cromatina na expresso Gnica Eucaritica

As regies heterocromticas altamente condensadas tm menos genes e menores frequncias de recombinao do que as regies eucromticas menos condensadas. Entretanto a cromatina eucromtica pode ser alterada e alm disso, genes ativos nessas regies podem ser se tornar inativos por diferentes mecanismos.

A cromatina
A estrutura da cromatina est diretamente relacionada com o controle da expresso gnica. O primeiro nvel de organizao da cromatina o nucleossomo. Os nucleossomos so capazes de bloquear o acesso da RNA polimerase II ao promotor.

Organizao do Nucleossomo
O cerne do nucleossomo formado por 8 proteinas histonas (histonas nucleossomais)
duas H2A, duas H2B, duas H3 duas H4
Poro N-terminal da cadeia polipeptdica

Octmero de histonas

Papel da histona H1 (histona no-nucleossomal)

Tratamento da cromatina com DNAse

DNA ligante Histonas

Cromatina na forma de contas em colar

Nuclease digere o DNA ligante

Unidade repetida de 200pb

Tratamento da cromatina com DNAse

Perfil de eletroforese
DNA ligante Histonas

Cromatina na forma de contas em colar

Nuclease digere o DNA ligante

Unidade repetida de 200pb

A Remodelagem da Cromatina
A remodelagem da cromatina ocorre atravs de trs mecanismos:
Reposicionamento dos nucleossomos Modificaes ps-traducionais das histonas Metilao do DNA

Reposicionamento dos Nucleossomos

A organizao da cromatina no permite que os fatores de transcrio e a RNA polimerase acesse os stios de ligao no DNA

Reposicionamento dos Nucleossomos

Complexo SWI/SNF:
11 subunidades

Inclui atividades de ligao ao DNA e ATPase Comum em eucariotos (leveduras a humanos)

Remodelador global da cromatina permitindo que regies do DNA sejam mais acessveis s protenas da transcrio. Movem ou deslocam os nucleossomos hidrolisando ATP.

Reposicionamento dos Nucleossomos

Complexo SWI-SNF

Em leveduras, o complexo protico SWI-SNF reposiciona os nucleossomos de maneira a expor as sequncias promotoras e acentuadoras no DNA

Modificaes nas Histonas

As histonas do nucleossomo sofrem modificaes ps-traducionais: Acetilao Fosforilao nos resduos de Serina e Treonina Metilao nos resduos de Lisina (irreversvel) Ubiquitinao

Acetilao da Histonas
Acetilao dos resduos de lisina remove cargas positivas global das histonas. Isto provoca uma reduo da afinidade das histonas pelo DNA. Assim, a RNA Polimerase II e fatores de transcrio tm acesso mais fcil a regio promotora. Acetilao das histonas est associada a genes ativamente expressos.

Diminuio das cargas positivas das histonas por modificao de Lys (Acetilao e metilao)
Menor interao DNA-histona

Ativao do gene

irreversvel

Acetilao de histonas

Vdeo
Acetilao/Desacetilo de Histonas

Metilao de histonas

Metilao do DNA
Metilao do DNA a adio de um grupo CH3 nas bases do DNA O padro de metilao mais conhecido nas regies ricas em Citosina e Guanina Estas regies so conhecidas como ilhas CpG

Metilao da Citosina
O nvel de metilao do DNA geralmente est correlacionado ao estado transcricional de um gene: genes ativos so menos metilados

Como a metilao afeta a transcrio?

Como ligar um gene eucaritico?

Remodelagem da cromatina Protenas regulatrias
Recrutamento de fatores de transcrio ao complexo de iniciao.

Caractersticas das Protenas Regulatrias

As protenas regulatrias precisam desempenhar pelo menos duas funes: Ligar ao DNA Ativar ou Reprimir a Transcrio

Protenas Regulatrias

Interaes nos sulcos maior e menor do DNA

Aceptores de LH Interaes hidrofbicas

Doadores de LH

Ligao de uma protena regulatria ao sulco maior do DNA

Domnios de ligao ao DNA

A maioria dos domnios de ligao ao DNA so carregados de aminocidos positivos, de modo que so atrados para o arbabouo de fosfato do DNA. Os domnios de ligao se ajustam ao sulco maior do DNA. Os domnios de ligao ao DNA das protenas regulatrias possuem estruturas conservadas de leveduras aos humanos que so classificadas como:
Hlice-volta-hlice Dedo de zinco (zinc finger) Hlice-ala-hlice Ziper de leucina

Interao com o DNA

Heterodimerizao de protenas Ziper de leucina

Como ligar um gene eucaritico?

Remodelagem da cromatina Protenas regulatrias
Recrutamento de fatores de transcrio ao complexo de iniciao.

Iniciao da transcrio

Iniciao da transcrio
Provavelmente, o mais comum nvel de regulao. Iniciao pode envolver a ao de mais de 100 protenas diferentes. A maioria dos fatores atuam para ativar a expresso. So poucos os repressores da iniciao da transcrio.

Iniciao da transcrio
RNA polimerase II transcreve os mRNAs
Controle da expresso gnica em eucariotos requer a ao de fatores de transcrio:
Fatores de transcrio gerais so necessrios para a iniciao da transcrio
Fatores de transcrio especficos que aumentam a transcrio gnica em certos tipos de clulas ou em resposta sinais especficos

Fatores Gerais de Transcrio

Fatores Gerais de Transcrio

O incio da transcrio ocorre atravs do reconhecimento dos promotores pelos fatores gerais de transcrio (FGT) A regio promotora eucaritica tpica se localiza na posio -30 (TATA box) FGT posicionam a RNA pol II no local correto para iniciar a transcrio O complexo de pr-iniciao formado por 6 FGTs mais RNA pol. II (Complexo Basal de Transcrio)

Fatores Especficos de Transcrio

Fatores Especficos de Transcrio so protenas que reconhecem sequncias de DNA que ocorrem acima do stio de iniciao da transcrio Cada FET reconhece sequncias cis especficas prximas ao promotor Um ou mais FET podem regular a expresso de um mesmo gene

Elementos regulatrios cis

1) Promotor (core): TATA

2) Proximal promoter regions (Upstream Promoter Elements):

- CAAT ou CCAAT box - GC box (consenso GGGCGG)

Promotores eucariticos

Existem Fatores Especficos de Transcrio que reconhecem sequncias de DNA localizadas a considervel distncia tanto acima quando abaixo do stio de incio da transcrio.

Acentuadores e Silenciadores

Acentuadores
Acentuadores so sequncias no DNA nos quais fatores de transcrio especficos (ativadores) se ligam para aumentar a taxa de transcrio.

Quando estas protenas se ligam ao DNA ocorre a formao de alas aproximando as sequncias acentuadoras ao RNA pol II

Acentuadores e Ativadores

O complexo acentuador/ativador interage a distncia com a RNA polimerase no promotor resultando em uma transcrio mais eficiente e aumentada.

Acentuadores e Ativadores

Protenas HMG

O complexo acentuador/ativador interage a distncia com a RNA polimerase no promotor resultando em uma transcrio mais eficiente e aumentada.

Co-ativadores e Mediadores
Co-ativadores e mediadores so tambm necessrios para a ativao dos fatores de transcrio. Co-activadores e mediadores se ligam aos fatores de transcrio e se associam a outras partes do complexo de ativao da transcrio

Mediadores

O complexo protico dos mediadores e os fatores de transcrio interagem com a RNA polimerase II para aumentar a transcrio

Silenciadores
Silenciadores so sequncias no DNA nos quais fatores de transcrio especficos (repressores) se ligam para diminuir a taxa de transcrio

Silenciadores (Silencers) e Repressores

Mecanismos de ao dos repressores transcricionais eucariticos

Silenciadores (Silencers) e Repressores

Mecanismos de ao dos repressores transcricionais eucariticos

Silenciadores (Silencers) e Repressores

Mecanismos de ao dos repressores transcricionais eucariticos

Alguns exemplos de regulao da transcrio em eucariotos

Regulao da transcrio dos genes do metabolismo da galactose em leveduras

As enzimas requeridas para a importao e metabolismo da galactose so codificadas por seis genes dispersos em 3 cromossomos.
Todos os genes GAL possuem promotores semelhantes e so regulados coordenadamente por um conjunto de protenas. Os promotores para os genes GAL contm as sequncias TATA, Inr e UAS (enhancer) Ativador de transcrio que se liga a UAS: Gal4p Outras protenas acessrias: Gal80p, Gal3p

Regulao da transcrio dos genes do metabolismo da galactose em leveduras

Ausncia de galactose
Complexo Gal80p e Gal4p inativo na ativao

Regulao da transcrio dos genes do metabolismo da galactose em leveduras

Ausncia de galactose
Complexo Gal80p e Gal4p inativo na ativao

Presena de galactose e Gal3p Gal3p se liga a Gal80p

Regulao da transcrio pelos hormnios esterides

Hormnios Esterides: estrgeno, progesterona, cortisol...

Hidrofbicos transportados na corrente sangunea via protenas de transporte at o local de ao difundem-se pela membrana ncleo celular ligao a protenas regulatrias Sequncias regulatrias especficas do DNA (elementos responsivos ao hormnio, HREs) expresso de protenas especficas.

Regulao da transcrio pelos hormnios esterides

(Pro-Ala-Thr-Asn-Glu)

A regulao pode resultar da fosforilao de fatores de transcrio nucleares

Compreende a ativao de uma protena quinase no ncleo que fosforila protenas especficas de ligao ao DNA.

Hormnios no-esterides

Se ligam aos receptores na superfcie celular desencadeando uma via de sinalizao que pode levar fosforilao de uma protena reguladora afetando sua atividade.

Regulao da expresso gnica da insulina

O receptor da insulina uma protena tirosina quinase-especfica

Resumindo...

Cromatina (DNA + histonas)

Cromatina (DNA + histonas)

Complexo de remodelamento da cromatina

Remodelamento da cromatina

Cromatina (DNA + histonas)

Complexo de remodelamento da cromatina (SWI/SNF)

Remodelamento da cromatina
Enzimas de modificao de histonas

Modificao covalente de histonas

Cromatina (DNA + histonas)

Complexo de remodelamento da cromatina

Remodelamento da cromatina
Enzimas de modificao de histonas

Modificao covalente de histonas

Outras protenas ativadoras

Protenas ativadoras adicionais ligadas regio de regulao gnica

Cromatina (DNA + histonas)

Complexo de remodelamento da cromatina

Remodelamento da cromatina
Enzimas de modificao de histonas

Modificao covalente de histonas

Outras protenas ativadoras

Protenas ativadoras adicionais ligadas regio de regulao gnica

Mediador Fatores gerais de transcrio RNA polimerase

Montagem do complexo de pr-iniciao no promotor

Cromatina (DNA + histonas)

Complexo de remodelamento da cromatina

Remodelamento da cromatina
Enzimas de modificao de histonas

Modificao covalente de histonas

Outras protenas ativadoras

Protenas ativadoras adicionais ligadas regio de regulao gnica

Mediador Fatores gerais de transcrio RNA polimerase

Montagem do complexo de pr-iniciao no promotor

Rearranjo das protenas no complexo de priniciao

Incio da transcrio

Regulao Ps-Transcricional

Processamento Alternativo
Introns so removidos dos pre-mRNA para produzir o mRNA maduro para ser traduzido

Processamento Alternativo reconhece diferentes stios de corte para remoo dos introns
Cada mRNA maduro ter diferentes exons o que resulta em diferentes cadeias polipetdicas originados de uma mesmo gene O dogma Um gene, uma protena no verdadeiro

Processamento Alternativo
(diferentes maneiras de emendar um mRNA)

Controles negativo e positivo do processamento alternativo do mRNA

Controles negativo e positivo do processamento alternativo do mRNA

Transporte de mRNAs para o citoplasma

Transporte de mRNAs para o citoplasma

A medida que a molcula de mRNA processada ela perde determinadas protenas e adquire outras.

Protenas perdidas: snRNA (RNAs

nucleares pequenos)

Protenas adquiridas: Complexos de ligao ao capacete Complexos de Juno de exons Protenas de ligao cauda poli-A Protenas ribonucleares nucleares heterogneas (hnRNPs)

Introns excisados, RNAs quebrados e mRNAs que sofreram splicing anormal so degradados no exossomo nuclear.

Transporte de mRNAs para o citosol

Somente os mRNA eucariticos maduros so seletivamente exportados do ncleo. Receptores de exportao nuclear

Entretanto alguns mRNA processados de forma incorreta so enviados para o citoplasma e mRNAs podem quebrar durante o tranporte.

Uma das formas de controle traducional evitar que estes mRNA defeituosos sejam traduzidos nos ribossomos.

Clulas eucariticas: mecanismos de controle de qualidade que reconhecem e degradam mRNAs com danos.

NMD Nonsense-mediated mRNA decay

(Degradao do mRNA mediada por ausncia de sentido)

Poderoso sistema de vigilncia que elimina os mRNA defectivos antes que eles sejam traduzidos em protenas.

(Behm-Ansmant, et al, 2007)

NMD Nonsense-mediated mRNA decay

(Degradao do mRNA mediada por ausncia de sentido)

NMD Nonsense-mediated mRNA decay

(Degradao do mRNA mediada por ausncia de sentido)

NMD Nonsense-mediated mRNA decay

(Degradao do mRNA mediada por ausncia de sentido)

NMD acelera deadenilao, decapeamento e a degradao 5- 3.

Degradao do mRNA
A quantidade de protena produzida de um determinado gene pode ser influenciada pela meia-vida do mRNA O mRNA maduro possuem diferentes tempos de vida dependendo da sua estabilidade na clula. Tamanho da cauda Poli(A).

Estabilidade de mRNA: Meia-vida

P-bodies (Corpos de Processamento)

Estruturas citoslicas compostas de grandes complexos de mRNA e enzimas que degradam o mRNA.
Stios onde ocorrrem a destruio final da maioria dos mRNA
- enzimas de decapeamento Dcp1 e Dcp2 - exonuclease 5-3 - Xrn1p

Inibio da Traduo
Um dos mecanismos mais importantes para a regulao da traduo em eucariotos envolve a ligao de repressores da traduo em stios especfcos da regio 3 UTR O posicionamento destas protenas impedem diretamente o incio da traduo

Inibio da Traduo
IRES (Internal Ribosome Entry Site): presentes na extremidade 5 do mRNA

Regulao da traduo dos mRNA de transferrina e ferritina: metabolismo do ferro

Regulao da traduo dos mRNA de transferrina e ferritina: metabolismo do ferro

Inibio da Traduo
Reciclagem de eIF-2 (Eucaryotic initiation factor)
O eIF2 se liga ao tRNA iniciador (Met tRNA)