RNA de interferencia: el silencio de los genes

Toms Lpez, Daniela Silva, Susana Lpez y Carlos Arias

El camino a todas las cosas grandes pasa por el silencio Friedrich Nietzsche

Biologa del RNA de interferencia

Uno de los avances ms importantes en la biologa de las ltimas dcadas ha sido el descubrimiento de molculas de RNA que regulan la expresin de genes. La principal funcin que se le ha reconocido al RNA es como parte de la maquinaria de produccin de protenas. Los RNA mensajeros (mRNA) son los intermediarios en la expresin de genes, transmitiendo informacin entre el DNA y la maquinaria de sntesis de protenas. Los RNA de transferencia (tRNA) son el elemento decodificador que permite traducir de un lenguaje de nucletidos (el que tiene el DNA y el mRNA) a un lenguaje de aminocidos (el de las protenas), y los RNA ribosomales (rRNA) son parte de la maquinaria que produce las protenas. El silenciamiento por RNA es un mecanismo altamente conservado en la naturaleza en el que molculas de RNA de doble cadena (dsRNA) regulan la expresin de genes. El fenmeno fue inicialmente descubierto en 1990, cuando botnicos que se encontraban trabajando con petunias intentaron sobre-expresar a la enzima que produce el color prpura (llamada chalcona sintasa). Para ello introdujeron varias copias del gen que codifica para esta enzima esperando encontrar que las plantas que sobre-expresaran a la chalcona sintasa fueran prpuras. Sin embargo, descubrie-

ron que se generaban flores sin color o con parches blancos. Al analizar los niveles de la enzima encontraron que eran 50 veces menores a los de las plantas originales. Esta observacin implicaba que los genes que introdujeron no se estaban expresando, pero tambin que el gen natural de la planta dejaba de expresarse, por esta razn al fenmeno se le llam co-supresin. Un fenmeno equivalente fue descrito dos aos despus en un hongo conocido como Neurospora crassa; a este fenmeno le llamaron quelling (detener abruptamente). Estas observaciones fueron mejor entendidas en 1998 gracias a Andrew Fire y Craig Mello, quienes por su trabajo recibieron el premio Nobel de medicina 2006. Ellos descubrieron que tras la inyeccin de dsRNA dentro del nemtodo Caenorhabditis elegans se produca un silenciamiento de la expresin de genes que era especfico de secuencia, es decir, que la expresin del gen que presenta la misma secuencia que el dsRNA se inhiba. Este fenmeno explicaba tanto la co-supresin como el quelling y fue denominado interferencia de RNA (RNAi). El mecanismo de la RNAi fue descrito in vitro utilizando extractos de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster. Estos estudios revelaron que molculas largas de dsRNA eran cortadas en fragmentos pequeos con una estructura

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especfica: dos cadenas de 21 a 25 nucletidos interaccionado en forma de dplex, donde 19 nucletidos se encuentran formando RNA de doble cadena y dos nucletidos sin aparearse en los extremos (figura 1). Estas molculas fueron denominadas RNA interferentes pequeos (siRNA) y se demostr que son las mediadoras del proceso de interferencia. Hasta el ao 2000, la RNAi fue una herramienta que se utiliz para apagar la expresin de genes en varios organismos, pero no en mamferos. Esto debido a que las molculas grandes de dsRNA (de ms de 30 pares de bases) inducen en clulas de mamfero una respuesta que generalmente desencadena la muerte de la clula. Sin embargo, ese ao el grupo de Tom Tuschl describi que cuando se utilizan directamente los siRNA, es posible inducir el proceso de interferencia en clulas de mamfero sin que despierte la respuesta que conduce a la muerte celular. Este descubrimiento abri la posibilidad de utilizar la interferencia de RNA como una herramienta en la investigacin enfocada a clulas de mamferos.

numerosas protenas celulares. La incorporacin del siRNA al siRISC est acoplada a la separacin de las dos cadenas en cadenas sencillas, slo una de las cuales, conocida como cadena gua, se mantiene asociada al complejo y sirve para identificar el mRNA con la secuencia complementaria. Cuando las molculas de mRNA complementarias son encontradas, la interaccin entre el siRNA y este mRNA desemboca en el corte del mRNA y su posterior degradacin. En plantas, los siRNA pueden ser transportados al ncleo e inhibir la sntesis del mRNA a partir del gen correspondiente, fenmeno que se conoce como silenciamiento transcripcional. Otro fenmeno importante que ocurre en varios organismos, pero no en mamferos, es que los mediadores de la interferencia pueden viajar desde las clulas en que se producen hasta otras clulas del organismo. De esta manera es posible lograr que se silencie la expresin de un gen en el organismo completo, aunque la induccin original haya sido solamente en una parte. En este tipo de organismos, como el gusano C. elegans, el silenciamiento es heredable. microRNA Aunque presentan mucha similitud con los siRNA, los microRNA son producidos por una va de sntesis diferente. Los precursores de los microRNA son transcritos a partir de genes celulares, tal y como se producen los mRNA. A esta primer molcula de RNA se le denomina microRNA primario (pri-microRNA) y es procesada en el ncleo por otra enzima de la familia RNAsa tipo III denominada drosha. El resultado del corte de drosha es una molcula de RNA de entre 70 y 100 nucletidos con una estructura compleja. Partes de la molcula forman una estructura de doble cadena de RNA unida por una seccin de cadena sencilla. A este tipo de estructura le llamamos de tipo tallo-asa (figura 1). A esta molcula de RNA se le llama el precursor del microRNA (premicroRNA), el cual posee mltiples burbujas y una serie de missmatches (zonas dentro de las regiones de doble cadena que no pueden unirse entre s) (figura 1). El pre-microRNA es posteriormente exportado del ncleo al citoplasma por

El silenciamiento: biognesis y mecanismos de interferencia

Se han descrito varias clases de molculas pequeas de RNA que desencadenan el proceso de silenciamiento por interferencia, las ms ampliamente los RNA interferentes pequeos (siRNA) y los microRNA (miRNA). siRNA Estas molculas tienen un tamao de 21 a 25 nucletidos y son producidas a partir de precursores de RNA de doble cadena que pueden variar de tamao y origen (figura 1). Estos precursores son procesados por miembros de la familia de enzimas que degradan RNA, conocidas como la familia de la RNAsa tipo III. En particular, la enzima que degrada los precursores de dsRNA hasta siRNA se conoce como dicer. Los siRNA resultantes son incorporados a un complejo denominado siRISC (RNA-induced silencing complex). Este complejo est compuesto por

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Figura 1.
Va del RNA de interferencia. Las dos vas de procesamiento se indican con los nmeros 1 y 2. Los pasos de cada va se sealan con letras. 1. Biognesis de microRNA: a) procesamiento por drosha en el ncleo, b) exportacin de la molcula pre-microRNA del ncleo al citoplasma por exportina-5, c) segundo procesamiento por dicer, d) identificacin y desnaturalizacin del microRNA por miRISC, e) seleccin asimtrica de una de las cadenas del microRNA, f) apareamiento con el mRNA blanco y represin de la traduccin. 2. Biognesis de los siRNA: a) presencia de un RNA de doble cadena en el citoplasma, b) procesamiento por dicer, c) identificacin del dplex de 19 a 12 pares de bases por siRISC, d) seleccin asimtrica de una de las cadenas del dplex, e) apareamiento con el RNAm blanco y subsiguiente degradacin.

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una va que depende de la protena exportina-5. Esta permite y regula el paso de molculas entre el ncleo y el citoplasma. Ya en el citoplasma, el pre-microRNA es cortado hasta adquirir la estructura del microRNA maduro; es decir, una molcula de dsRNA lineal de entre 21 y 24 nucletidos en donde de los extremos 5 sobresalen dos nucletidos. Este ltimo procesamiento es realizado, al igual que en el caso de los siRNA, por dicer. Los microRNA maduros se incorporan a un complejo ribonucleoprotenico (miRNP o miRISC) que es similar, y posiblemente idntico, al siRISC. Una vez que estas molculas de RNA se encuentran ensambladas en el miRISC, el complejo dirige el silenciamiento gentico. Una diferencia importante entre la va de los siRNA y los microRNA es el mecanismo por el cual estas molculas silencian la expresin de los genes. En general, los microRNA de animales reprimen la expresin gentica bloqueando la traduccin de los mRNA, esto es, evitando la sntesis de protenas; en este caso el mRNA no es degradado, pero ya no se puede utilizar para fabricar protenas. Otra diferencia importante radica en el hecho que el apareamiento entre el blanco y el microRNA no es perfecto.

Para qu utilizan las clulas la interferencia de RNA

El mecanismo de interferencia est presente en todos los eucariotes en los que se ha buscado; esto sugiere que es un mecanismo muy antiguo que apareci temprano en la evolucin y que tiene un papel importante en el mantenimiento del funcionamiento celular. Una de las ideas ms aceptadas que explican su persistencia es que funciona como un sistema inmune a nivel celular. Es decir, que le permite a la clula distinguir informacin gentica que le es propia, de la que no lo es, la cual actuara como un parsito molecular, aprovechando la maquinaria celular para reproducirse y causando dao a la clula. La informacin gentica que puede estar en la clula y que pudiera actuar como un parsito molecular tiene dos fuentes, los llamados elementos transponibles y los virus. La mayor parte

de las familias de virus conocidos generan estructuras de dsRNA durante su replicacin, las cuales pueden disparar el proceso de interferencia de RNA, que la clula utilizara para destruir al RNA invasor. Si la interferencia de RNA funcionara como un mecanismo de proteccin contra la infeccin por virus, se esperara que se cumplieran tres condiciones. La primera es que el virus indujera la aparicin de molculas de siRNA dirigidas contra la secuencia del propio virus. La segunda condicin es que cualquier bloqueo del mecanismo de interferencia favorecera la replicacin del virus. Finalmente, sera de esperar que, si la interferencia de RNA fuera un mecanismo antiviral, los virus, a su vez, adquirieran durante la evolucin mecanismos para combatir esta interferencia. Las tres condiciones mencionadas con anterioridad se cumplen para el caso de plantas y de invertebrados. Sin embargo, en mamferos no es claro el papel de la interferencia de RNA como un sistema de defensa antiviral que opere naturalmente. A pesar de esto, ha sido demostrado ampliamente que la maquinaria de la interferencia persiste en clulas de mamfero y puede ser utilizada como un mecanismo antiviral inducido exgenamente utilizando siRNA. La segunda funcin importante que se reconoce al sistema de interferencia es la de regular la expresin de genes durante el desarrollo. Algunos de los ejemplos mejor estudiados fueron descubiertos estudiando Arabidopsis thaliana. En esta planta, cuando se pierde parcialmente el gen dcl1 (el cual codifica para una de las protenas dicer), se generan alteraciones en el desarrollo, que incluyen un florecimiento tardo, prdida de sus meristemos y desregulacin en sus clulas madres meristemticas (el meristemo lo forman las clulas de la planta que le permiten seguir creciendo). La prdida completa de este mismo gen en C. elegans, genera un defecto en el cambio de fase celular durante el desarrollo post-embrinico, generando un arresto embrionario, por lo que el nemtodo no puede completar su desarrollo. En ratones, al anular el gen que codifica para dicer se generan embriones sin clulas madre o troncales.

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El nmero de genes que codifican para microRNA encontrados en diferentes animales vara de 0.5 a 1% del nmero total de genes en sus genomas. En el genoma del nematodo Caenorhabditis elegans y en el de la mosca de fruta Drosophila melanogaster se calcula que hay entre 100 y 140 genes para microRNA, mientras que los humanos tienen entre 200 y 255 genes. Al menos 0.2% de los genes en Arabidopsis thaliana codifican para microRNA. La representacin relativa de los genes de microRNA (0.2-1%) es comparable a las familias de otros genes reguladores, tales como factores transcripcionales (el grupo de protenas que se encarga de regular la transcripcin de los genes). Casi el 30% de los microRNA son altamente conservados y tienen sus equivalentes en genomas de vertebrados e invertebrados. Esto pudiera sugerir que una fraccin significativa posee funciones biolgicas evolutivamente conservadas.

La interferencia de RNA es un mtodo eficiente para inhibir la expresin de genes

Una de las principales estrategias utilizadas en la investigacin cientfica para el estudio de los distintos mecanismos celulares se denomina prdida de funcin. Este concepto se refiere a la eliminacin especfica de la funcin de una protena en la clula para despus evaluar los cambios y as definir el papel que juega dicha protena. Por ejemplo, si se tratara de una protena que se requiere para promover la replicacin celular, al anular su funcin encontraramos que las clulas ya no se replican. Esta estrategia ha sido extensamente utilizada desde hace tiempo. La anulacin de la funcin se puede hacer de varias maneras. Una de las estrategias ms antiguas es la de inducir un cambio (denominado mutacin) en el gen que genera la protena de inters; esta mutacin debe ocasionar la prdida de funcin de la protena. Una segunda tcnica es lo que denominamos noquear el gen (KO), en este caso el gen que genera la protena de inters ya no es expresado en la clula. Estas estrategias

requieren de modificar la informacin a nivel del DNA, es decir, del gen. Regularmente estos enfoques requieren de entrenamiento especializado y de mucho trabajo. La interferencia de RNA ha demostrado ser una herramienta muy eficiente para reducir la expresin de un gen. Adems, resulta fcilmente utilizable por laboratorios sin experiencia previa. El diseo de los efectores de esta va (siRNA o microRNA) est muy avanzado, existen sin costo los programas para su diseo, y la produccin comercial de siRNA se ha extendido. Actualmente existen compaas que tienen disponibles siRNA contra virtualmente todo el genoma de algunos organismos (por ejemplo humano y ratn). La interferencia de RNA ha demostrado su enorme potencial, lo que se refleja en el creciente nmero de artculos cientficos que la refieren como estrategia experimental. Una bsqueda sencilla en el principal buscador de artculos cientficos (el PubMed del National Center for Biotechnology Information) arroja ms de diez mil referencias bibliogrficas; igualmente, en buscadores como Google hay ms de dos y medio millones de entradas. Estos datos demuestran la importancia de esta herramienta, comparable con otras metodologas igualmente potentes como lo fue el desarrollo de la reaccin en cadena de la polimerasa, PCR. No es coincidencia que el premio Nobel de medicina 2006 fuera otorgado a los doctores Andrew Fire y Graig C. Mello, los que originalmente describieron que fragmentos de dsRNA tienen la capacidad de inhibir la expresin de genes.

Estrategias para el uso efectivo de la interferencia de RNA

En general hay dos tipos de ensayos: los transitorios, donde la expresin del gen se interfiere slo temporalmente) y los estables (las clulas o el organismo permanentemente interferidos). En el primer caso suelen utilizarse los siRNA sintetizados qumicamente; para el segundo se requiere que la clula incorpore a su genoma los elementos necesarios para fabricar una mol-

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cula de RNA de doble cadena que llegue hasta el citoplasma. Esto se logra a partir de vectores que producen shRNA (small hairpin RNA) o microRNA. Los shRNA son molculas que forman una estructura del tipo tallo-asa (similar pero ms sencilla que la de un microRNA), los cuales son procesados por dicer y forman siRNA. El uso de microRNA resulta muy eficiente porque se utilizan molculas producidas naturalmente en la clula; de esta manera se genera un proceso de silenciamiento ms eficaz. Cuando se utiliza microRNA es comn que se ocupe una secuencia equivalente al pre-microRNA, en donde el tallo que formar el microRNA maduro es cambiado por la secuencia del gen que se desea interferir. La sntesis de los siRNA puede hacerse por varias vas. En el caso de plantas e invertebrados, se pueden utilizar molculas grandes de dsRNA (que sern procesadas a siRNA dentro de la clula). En vertebrados no se pueden utilizar molculas de ms de 30 pares de bases, por lo que es necesario producir directamente molculas de siRNA o bien shRNA ms cortos. La fuente ms comn es la sntesis qumica del dsRNA. Si lo que se desea es utilizar shRNA o microRNA, entonces hay que seguir otra estrategia. Primero hay que fabricar un fragmento de DNA a partir del cual se pueda sintetizar el shRNA o miRNA. Regularmente se disea para que se produzca una molcula de RNA que adoptar la estructura de tipo tallo-asa. Para poder introducirlo en la clula y que pueda producirse a partir de la maquinaria celular, se requiere de un vector. Regularmente este vector ser un plsmido diseado para este propsito. Una de las ventajas de esta estrategia es que se pueden seleccionar las clulas en las que este vector se integre al genoma de la clula; en este caso todas las clulas hijas tendrn integrado el vector y, por lo tanto, toda la poblacin estar permanentemente silenciada. Otro elemento importante a considerar es el mecanismo para introducir el siRNA o el vector. Aqu tambin hay diferencias fundamentales entre organismos. Por ejemplo, en insectos es posible simplemente sumergir al organismo en una solucin con el dsRNA y ste penetrar

en la clula, ya que en los insectos existen trasportadores de dsRNA (molculas que permiten tomar el dsRNA del medio extracelular e introducirlos a la clula). En el caso del nematodo C. elegans se puede alimentar al gusano con bacterias que produzcan el dsRNA. Otra estrategia es la de microinyectar a la clula, sin embargo esta tcnica es muy especializada (requiere de utilizar una aguja extremadamente delgada para inyectar el dsRNA al citoplasma celular). En los vertebrados la tcnica ms comnmente utilizada es la de transfectar las clulas. La transfeccin consiste en introducir material gentico al interior de una clula. La forma ms comnmente utilizada de transfeccin es la lipofeccin (transfectar utilizando lpidos). En el mercado existen una gran cantidad de lpidos que pueden utilizarse para introducir RNA o DNA. Una alternativa a la lipofeccin es el uso de vectores de origen viral que permitan introducir el shRNA a la clula blanco. Tal y como podemos utilizar un plsmido como vector para la expresin del shRNA o el microRNA, tambin se puede utilizar un virus. A diferencia de la transfeccin, con un vector viral es posible alcanzar eficiencias del 100% (infectar todas las clulas). Se han desarrollado varios vectores virales, en particular derivados de adenovirus, retrovirus y lentivirus. Una segunda ventaja de los vectores virales es que pueden ser utilizados en organismos completos, lo cual es indispensable cuando se piensa en el potencial teraputico de la interferencia de RNA.

Genes en silencio: prctica experimental, una promesa para la medicina del futuro
Son mltiples las investigaciones en las que se utiliza la interferencia de RNA para establecer la funcin de un gen en particular. La otra gran aplicacin est en el rea de la medicina. En general, cualquier patgeno utiliza la maquinaria celular para replicarse; sin embargo, los elementos importantes para cada patgeno pueden ser particulares. Un enfoque interesante consiste en eliminar de la clula los elemen-

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tos que son esenciales para el patgeno, ya sea virus, bacteria o parsito. Otra aplicacin es anular la funcin de protenas que estn involucradas en enfermedades humanas. En particular, el cncer es uno de los padecimientos que podra llegar a ser tratado con interferencia de RNA. El principio del tratamiento se basa en el hecho de que las clulas cancerosas crecen constantemente; los productos de los genes que se requieren para este crecimiento podran ser anulados con RNAi y as evitar el crecimiento de las clulas cancerosas. Otro enfoque en la bsqueda de alternativas teraputicas es el de interferir la expresin de genes de patgenos. En el caso de los virus, la lista de ejemplos en los que se ha utilizado la interferencia es amplia y crece continuamente. Se ha demostrado que es posible reducir la replicacin de muchos de estos virus en la clula utilizando siRNA dirigidos contra el genoma viral. El uso de la interferencia de RNA para combatir el cncer o la infeccin de virus como el de la inmunodeficiencia humana (VIH) o el de la hepatitis C (VHC) depender de dos elementos. El primero es elegir los blancos adecuados, y el segundo el direccionamiento e introduccin del mediador de la interferencia (siRNA, shRNA o microRNA) a las clulas blanco adecuadas.

efectos que tiene la infeccin de rotavirus es la destruccin de los enterocitos. Se ha sugerido que, al menos en parte, es por la destruccin de estas clulas que se produce la diarrea. No existen medicamentos para inhibir especficamente la replicacin de rotavirus, por lo cual el tratamiento mdico para los nios que han sido infectados y que presentan diarrea est ms enfocado a evitar la deshidratacin. Los rotavirus se definen por una serie de caractersticas estructurales. Como primer particularidad son virus no envueltos (no tienen membrana lipdica rodeando a la partcula viral). Segundo, su genoma est compuesto por once molculas independientes de RNA de doble cadena, cada una de las cuales representa un gen y codifica para una protena (a cada una de estas molcula le llamamos segmento o gen). Tercero, la partcula est formada por tres capas concntricas de protenas. La capa ms interna se llama core (ncleo) y est formada principalmente por la protena VP2. La capa intermedia est formada por la protena VP6. La capa ms externa est formada por dos protenas, VP7 y VP4. A la partcula completa con las tres capas se le conoce como TLP (triple-layered particle).

Silenciar el ciclo replicativo de rotavirus Rotavirus: un problema de salud global

Los rotavirus son la causa ms importante de gastroenteritis severas en infantes. Generalmente la enfermedad desaparece en el transcurso de unos cuantos das. Sin embargo, dado lo intenso de la deshidratacin producida por las evacuaciones y el vmito, los nios pueden llegar a morir. En el mundo se calculan 600 000 muertes de infantes al ao ocasionadas por estos virus. Los virus infectan unas clulas muy especializadas localizadas en las puntas de las vellosidades del intestino delgado, llamadas enterocitos maduros. Estos enterocitos son las clulas encargadas de absorber los nutrientes que se encuentran en los alimentos que han pasado por nuestro tracto digestivo. Uno de los Las primeras interacciones del virus con la clula hospedera involucran a las dos protenas de superficie del virus, VP4 y VP7, as como al menos 5 molculas celulares (receptores y co-receptores) diferentes, que estn presentes en la superficie de la membrana plasmtica de la clula. Como resultado de estas varias interacciones, la partcula viral entra a la clula a travs de un mecanismo complejo, no bien caracterizado. Durante el proceso de ingreso del virus a la clula, ste pierde la capa ms externa de protenas, generndose partculas conocidas como DLP (double-layered particles). Las DLP dirigen la sntesis de los mRNA del virus. Estos mRNA son utilizados por la clula para producir las protenas del virus y tambin son la fuente a partir de la cual se produce el genoma para la descendencia del virus. Tanto las protenas virales como el

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RNA se acumulan en estructuras llamadas viroplasmas. El viroplasma es el lugar en donde se arman los virus, hasta generar DLP. La ltima capa del virus se adquiere en el retculo endoplsmico, cuando la DLP gema hacia el interior del retculo, y durante este proceso de maduracin adquiere las protenas VP4 y VP7, para convertirse as en una TLP. Finalmente, el virus destruye la clula, permitiendo que las nuevas TLP sean liberadas al medio extracelular en busca de una nueva clula para infectar y repetir el ciclo. En el proceso de replicacin e induccin de la muerte celular, es muy importante un conjunto de protenas del virus que no estn presentes en la partcula pero s en la clula infectada. Este tipo de protenas se conocen como protenas no estructurales. En el caso de rotavirus hay seis de estas protenas, denominadas NSP1 a NSP6. Cada una de estas protenas se produce a partir de un segmento de RNA diferente (con excepcin de NSP5 y NSP6 que se producen a partir del mismo segmento). Entender el papel de cada una de estas protenas puede brindar nuevas oportunidades para buscar medicamentos que bloqueen la replicacin del virus. Uno de los enfoques que ms se utiliza en la investigacin con virus para determinar la funcin de sus protenas, es el que llamamos gentica reversa. Este enfoque se basa en generar mutaciones especficas en alguna parte de la informacin gentica del virus. Posteriormente se reintroduce el gen modificado a partculas virales y se evala el efecto de las mutaciones introducidas sobre la capacidad del virus para replicarse. Sin embargo, este enfoque no haba podido utilizarse en el caso de los rotavirus, donde es muy difcil conseguir que las mutaciones que se generan en su informacin gentica puedan ser incorporadas en el virus (slo hasta hace muy poco tiempo se ha reportado un mtodo para lograrlo, pero que funciona de manera muy ineficiente). Dada la dificultad para realizar gentica reversa en rotavirus, en nuestro grupo hemos enfocado la atencin en la interferencia de RNA, la cual es una estrategia con tremendo potencial para estudiar la funcin de protenas

a travs de generar la prdida de su funcin. Nuestro grupo fue el primero en demostrar que la interferencia de RNA es aplicable para anular la expresin de genes de rotavirus. Gracias a esta nueva herramienta, hemos podido descubrir y confirmar mltiples actividades de las protenas de este virus. La caracterizacin de la funcin de la protena VP4 fue la primera que abordamos utilizando la interferencia. Observamos que al interferir la expresin del gen de VP4, las partculas fueron capaces de madura hasta el ltimo paso, esto es, el de perder la envoltura de lpidos, adquiriendo la tercer capa de protenas, aunque en este caso, al no expresarse VP4, slo se ensambl VP7. Por otro lado, la inhibicin de la sntesis de VP7 por interferencia result en la acumulacin de partculas envueltas con lpidos en el interior del retculo endoplsmico, sugiriendo que VP7 es la responsable de la prdida de esta envoltura durante el proceso de morfognesis del virus.

Una visin global de la biologa de rotavirus utilizando interferencia de RNA

Al conjunto de genes de un organismo le llamamos genoma, y genmica a la ciencia que estudia los genomas de los diferentes organismos. Es una ciencia reciente con variedad de enfoques para estudiar cmo, dnde y cundo se expresa la informacin del genoma, cmo interaccionan los productos de la informacin gentica entre ellos y en qu procesos biolgicos estn involucrados. La disponibilidad de la informacin gentica en muchos organismos ha permitido el desarrollo de herramientas genmicas que permiten el manejo de grandes cantidades de datos para el estudio de los sistemas celulares. Actualmente, la utilizacin de este tipo de estrategias en el estudio de la biologa de sistemas se ha utilizado para indagar fenmenos biolgicos en varios organismos, como levaduras, gusanos, moscas y mamferos. Dentro de las preguntas que pretende contestar la genmica, una de las que ms interesa es la de la funcin de los genes. Cuando

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Figura 2.
Diseo experimental. 1) Empaquetamiento del plsmido miR30 en partculas retrovirales utilizando clulas HEK293. 2) Transduccin de clulas MA104, modelo de clula hospedera, con los retrovirus recombinantes. 3) Infeccin con rotavirus de las clulas transformadas. 4) Seleccin de clulas resistentes a la infeccin por rotavirus.

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Categora funcional

Genes totales

Diseos totales
4088 227 1716 7147 1681 1644 839 709 1604 958

3 shRNA
675 59 363 1470 360 333 189 172 329 201

1-2 shRNA
66 10 120 730 184 170 63 77 287 159

Cinasas 741 Fosfatasas 69 Ciclo celular 483 Seal de transduccin 2200 GPCR 544 Apoptosis 503 Metabolismo de ADN 252 Protelisis 249 Factores transcripcionales 616 Proteasas 360 Tomado de Paddison et al., en Nature 428:427, 2006.

se utilizan enfoques genmicos para estudiar la funcin de los genes, decimos que se est haciendo genmica funcional. La gran eficiencia y especificidad que tiene la interferencia de RNA para anular la expresin de los genes, ha desembocado en el desarrollo de procedimientos que permitan la aplicacin de esta tcnica a gran escala; es decir, se puede interferir la expresin de genomas completos. Por ello, la principal estrategia para hacer genmica funcional es justamente la interferencia de RNA. El primer paso para poder interferir un genoma es tener la secuencia de ese genoma. Posteriormente se requiere de tener los mediadores de la interferencia para cada uno de los genes del genoma (estos mediadores sern siRNA, shRNA o microRNA). Al conjunto de estos mediadores de interferencia le denominamos bibliotecas. As, por ejemplo, podemos tener una biblioteca de siRNA para anular la expresin de cada uno de los genes del genoma de algn organismo. Finalmente, requerimos de un ensayo que nos permita preguntar por una funcin en particular. Los criterios para el diseo y la sntesis de estas bibliotecas son los mismos que describimos en secciones anteriores, y lo mismo aplica en cuanto a la seleccin del tipo de mediador de interferencia a elegir. Cuando se utilizan bibliotecas de siRNA, es muy importante ensayar el efecto de cada siRNA por separado, ya que la inhibicin es transitoria. Las bibliotecas se pueden construir tambin con plsmidos que expresen shRNA o microRNA. Una de las ventajas de usar este tipo de bibliotecas es que los plsmidos pueden integrarse al genoma de la clula de manera permanente, por lo cual se puede usar la biblioteca

con los elementos (shRNA) mezclados, y posteriormente, a travs de un mtodo de seleccin positivo, obtener las clulas con el fenotipo deseado. Mltiples investigaciones han demostrado que las secuencias de este tipo pueden ser usadas para estudios genticos a gran escala en mamferos y son una fuente viable para el anlisis y descubrimiento de nuevas funciones de genes. In vitro, los virus inducen alteraciones estructurales y funcionales en la clula hospedera; sin embargo, poco se sabe de los mecanismos moleculares de la respuesta celular a una infeccin viral. Un estudio sobre la variacin en los niveles de expresin de genes celulares subsecuente a la infeccin por rotavirus, result en la identificacin de 508 genes diferencialmente regulados; este anlisis global describe un nuevo escenario en la respuesta celular a la infeccin por estos virus. Con el fin de identificar y caracterizar la funcin de genes celulares que participan en la infeccin por rotavirus, en nuestro laboratorio estamos utilizando una biblioteca de microRNA (miR-30) (figura 2) que contiene aproximadamente 231 000 secuencias verificadas contra 35 000 genes humanos. sta se encuentra clonada en el vector viral pMSCV y fue suministrada por el Dr. Stephen J. Elledge, del Departamento de Gentica de la Escuela de Medicina en Harvard. En la siguiente tabla se presentan algunos de los genes representados en la biblioteca miR-30. Con ayuda de esta biblioteca, podremos silenciar en ensayos individuales cada una de las protenas celulares y descifrar cual de ellas participa en la replicacin y proliferacin del virus en la clula hospedera.

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