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Citologa de Ganglios Linfticos

Elena M. Martnez de Merlo; Dpto. Medicina y Ciruga Animal; Hospital Clnico Veterinario (UCM), Madrid

Foto 1.

Indicaciones del estudio citolgico de los ganglios linfticos

El estudio citolgico de los ganglios linfticos es una herramienta diagnstica fundamental en la clnica de pequeos animales. Numerosas enfermedades cursan con afectacin ganglionar, bien localizada, bien generalizada, debido al importante papel que juegan los ganglios linfticos en la inmunidad celular y humoral. As mismo, sus funciones en el drenaje linftico los convierten en rganos diana de reaccin en procesos inflamatorios localizados o de metstasis en procesos neoplsicos. La localizacin externa de numerosos ganglios permite que el aumento de tamao ganglionar se detecte fcilmente en una exploracin fsica rutinaria; de hecho, si el tamao es considerable, son los mismos dueos los que perciben el problema cuando acarician a sus mascotas. Estos ganglios aumentados de tama- Linfadenitis granulomatosa; abundantes amastigotes de leishmania extracelulares o, adems, son rganos fcilmente y en el interior de un macrfago (1: linfocito pequeo, 4: clula plasmtica, 8: accesibles para la toma de muestras macrfago). mediante aspiracin con aguja fina. El examen citolgico de muestras ganglionares constituye la tcnica diagnstica de eleccin en cualquier aumento de ganglios linfticos, tanto de forma localizada como generalizada. Permite, en la mayor parte de los casos, diferenciar enfermedades linfoides benignas (procesos reactivos) de malignos (tumores primarios o secundarios) de forma rpida y sencilla. Adems, en procesos neoplsicos es conveniente realizarla en todos los ganglios de la zona de drenaje, incluso aunque no estn aumentados de tamao, con
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el fin de poder establecer el estadio clnico de la enfermedad. En los casos en que el estudio citolgico de los ganglios linfticos no permita establecer un diagnstico, al menos presuntivo, debe procederse a realizar una biopsia incisional o escisional, que permita su estudio histopatolgico. Adems, en procesos neoplsicos, si el ganglio regional se extirpa junto al tumor primario, siempre debe remitirse al laboratorio de histopatolo-

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Foto 2.

Linfadenitis eosinoflica con hiperplasia de clulas plasmticas (1: linfocito pequeo, 2: linfocito de tamao medio, 3: linfoblasto, 4: clula plasmtica, 6: neutrfilo, 7: eosinfilo; ND: ncleo desnudo, CL: cuerpo linfoglandular). ga para confirmar o descartar la presencia de clulas metastsicas Las muestras citolgicas deben obtenerse antes de instaurar cualquier tratamiento, sobre todo si se sospecha de linfoma. Esto es especialmente importante si se emplean corticoides, ya que su efecto linfoltico reduce el valor diagnstico de la muestra. El tejido linfoide se caracteriza por su fragilidad. La rotura celular dificulta el diagnstico citolgico, ya que se observan numerosos restos celulares que pueden complicar la interpretacin. Para minimizar la rotura celular se recomienda, en primer lugar, realizar una toma de muestras sin succin, basada en introducir en el tejido ganglionar slo la aguja, realizando varios movimientos, en diferentes direcciones y profundidades. La riqueza de la poblacin linfoide permite que, en la mayora de los casos, se obtenga una poblacin suficiente para conseguir un diagnstico citolgico. Adems, esta tcnica permite disminuir la hemodilucin o la obtencin de material necrtico, lo que es frecuente en linfadenopatas de gran tamao. El segundo momento en el que debemos extremar las precauciones es al realizar la extensin de la muestra. Debe realizarse con mucha suavidad, evitando ejercer una presin excesiva que provoque la rotura celular.
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Tcnica (toma de muestras, extensin y tincin)

La eleccin del ganglio linftico que vaya a ser objeto de la aspiracin depende de los hallazgos clnicos. En casos de linfadenopata generalizada debe aplicarse sobre, al menos, dos ganglios diferentes, evitando los que se encuentran reactivos incluso en condiciones normales, como los que drenan la cavidad oral o el tracto gastrointestinal (submandibulares, mesentricos). En caso de afectacin local, deben realizarse varios aspirados, en diferentes direcciones y profundidades. En general, los aspirados de ganglios superficiales no son dolorosos (salvo en casos de inflamaciones agudas) y pueden realizarse sin sedar al paciente. Para evaluar ganglios intracavitarios (torcicos o abdominales) es conveniente realizar la toma de muestras ayudados por la ecografa para incrementar la seguridad diagnstica. Puede ser necesario sedar al paciente para evitar movimientos bruscos durante la aspiracin de ganglios profundos o poco accesibles .

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Foto 3.

Ganglio reactivo, hiperplasia de clulas plasmticas (1: linfocito pequeo, 2: linfocito de tamao medio, 3: linfoblasto, 4: clula plasmtica; ND: ncleo desnudo, CL: cuerpo linfoglandular) En muchas ocasiones, la gran riqueza celular del tejido linfoide favorece que las extensiones sean demasiado gruesas. Para evitar este problema deben realizarse mltiples extensiones con el material obtenido de una sola aspiracin. Las muestras gruesas se tien de forma irregular, sobre todo en la zona central; por ello, es necesario basar el estudio citolgico en las reas perifricas donde las clulas se encuentran en monocapa o incrementar los tiempos de tincin para permitir que todas las clulas capten el colorante de forma adecuada. Como en el resto de muestras citolgicas, las tcnicas de tincin Romanowsky (incluyendo las versiones rpidas) son adecuadas, en la mayor parte de los casos, para resaltar los detalles celulares que permiten el diagnstico.
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En casos de linfoma, existen numerosos estudios que confirman la posibilidad de realizar tinciones inmunohistoqumicas en muestras citolgicas, para definir el fenotipo celular. Podra ser til, en estos casos, reservar alguna extensin para realizar estas tinciones especficas

Interpretacin citolgica
La validez del diagnstico citolgico de los ganglios linfticos depende de que las muestras sean adecuadas, tanto en cantidad de clulas como en su calidad. Una cantidad insuficiente de material o la presencia de numerosas clulas rotas o degeneradas conlleva una falta de representatividad de la muestra. En ocasiones, estos problemas son consecuencia de las alteraciones necrticas del tejido, pero, en muchas otras, depende de la toma de muestras. Por lo tanto, siempre es recomenda-

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ble evaluar varias extensiones y, en caso de muestras de muy baja calidad, repetir la aspiracin. El aumento de tamao ganglionar puede deberse a tres causas: inflamacin, hiperplasia o neoplasia. La diferenciacin se basa en definir la presencia de los diferentes tipos celulares y, sobre todo, en establecer la proporcin de cada uno de ellos (tabla 1). La aplicacin de la citologa ganglionar en la clnica reside en diagnosticar uno de estos tres procesos. El objetivo de este trabajo es definir las bases del diagnstico citolgico de los ganglios linfticos, encaminado a diferenciar entre linfadenitis, hiperplasia linfoide o ganglio tumoral (linfosarcoma o tumor metastsico), para su aplicacin inmediata en la clnica. Un estudio ms profundo de las muestras citolgicas llevado a cabo por citlogos muy expertos puede proporcionar informacin adicional referente a los estadios especficos de maduracin linfoide y algunos tipos celulares ms difciles de clasificar (como las clulas dendrticas). Foto 4.

Tipos celulares y otros elementos que pueden estar presentes en una citologa ganglionar
(Fotos 1-7) 1. Linfocitos pequeos: son clulas pequeas, menores que los neutrfilos, con un ncleo redondo de tamao semejante a un hemate, con cromatina densa, y citoplasma escaso azul plido. 2. Linfocitos de tamao medio: el dimetro nuclear de estas clulas es semejante a dos hemates; tienen una cromatina menos densa y mayor cantidad de citoplasma que puede rodear completamente el ncleo. 3. Linfoblastos o linfocitos grandes: El tamao de los linfoblastos es variable, dependiendo de su grado de maduracin; generalmente se encuentra entre dos y cuatro veces el tamao de un linfocito pequeo. El ncleo es redondo, pero la cromatina se dispone de forma ms fina y difusa y pueden observarse uno o varios nucleolos. La cantidad de citoplasma, fuertemente

Ganglio reactivo, clula de Mott (1: linfocito pequeo, 3: linfoblasto, 4: clula plasmtica de Mott); sealadas con una flecha se observan dos clulas en mitosis
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basfilo, es mayor. Segn la morfologa celular, se puede definir el tipo celular especfico: centrocito, centroblasto, inmunoblasto o linfoblasto. Sin embargo, todos ellos pueden encuadrarse en un genrico linfoblasto adecuado para un diagnstico citolgico bsico. 4. Clulas plasmticas: Las clulas plasmticas derivan de los linfocitos B estimulados antignicamente. Son clulas ovaladas, con ncleo redondo excntrico de cromatina condensada y citoplasma amplio fuertemente basfilo en el que destaca un rea perinuclear ms clara (aparato de Golgi). Las clulas plasmticas muy activadas pueden presentar numerosas vacuolas citoplasmticas (cuerpos de Russell) o tener un citoplasma teido de rojo; se denominan clulas de Mott y clulas en llama, respectivamente. Las clulas plasmticas inmaduras son semejantes a linfoblastos, pero presentan un citoplasma ms amplio, de un color grisceo, que puede contener vacuolas. 5. Clulas reticulares y endoteliales del estroma ganglionar: generalmente no se observan intactas, sino en forma de ncleos desnudos. Foto 5.

6. Neutrfilos: los neutrfilos presentes en los ganglios linfticos son semejantes a los observados en otros tejidos. 7. Eosinfilos: los eosinfilos presentes en los ganglios linfticos son semejantes a los observados en otros tejidos. 8. Macrfagos: son clulas fagocticas que pueden contener restos celulares o microorganismos en sus vacuolas citoplasmticas. 9. Mastocitos: caracterizados por la presencia de grnulos citoplasmticos metacromticos. 10. Otros elementos: Ncleos desnudos: son ncleos liberados de las clulas rotas. Son estructuras hinchadas, de color rosado, en contraste con el color azulado de las clulas intactas. Cuerpos linfoglandulares: son restos de citoplasma de tamao variable, distribuidos alrededor de las clulas. Son estructuras redondas, homogneas y basfilas. No deben confudirse con plaquetas o microorganismos.

Metstasis ganglionar de un mastocitoma.- se observa ms de un 3% de mastocitos (1: linfocito pequeo, 9: mastocito).

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Foto 6.

Linfosarcoma, predominio de linfoblastos (1: linfocito pequeo, 3: linfoblasto; ND: ncleo desnudo, CL: cuerpo linfoglandular). Pigmentos: es frecuente observar restos de hemosiderina o melanina, fundamentalmente en el interior de macrfagos. 0.04%, eosinfilos.- 0.3% o mastocitos.- 0.02%). En los gatos es frecuente encontrar un nmero superior de mastocitos, incluso en ausencia de eosinfilos.

Citologa de un ganglio normal

En los ganglios linfticos normales existe una gran heterogenicidad celular. Por lo tanto, en las extensiones citolgicas de un ganglio normal se advierte la presencia de diferentes tipos celulares que confieren a la muestra un aspecto marcadamente pleomrfico. La clula predominante en un ganglio normal es el linfocito pequeo, que debe constituir un 75-95% de la poblacin total. Tambin pueden observarse linfocitos de tamao medio, en nmero variable. Los linfoblastos y las clulas plasmticas suelen estar presentes, pero en un pequeo porcentaje, inferior al 5% (algunos autores definen que los linfoblastos pueden alcanzar un 10%). Ocasionalmente, se observa un pequeo nmero de clulas clulas inflamatorias (neutrfilos.- 0.1%, macrfagos.-

Linfadenitis
En general, la linfadenitis se caracteriza por el incremento en el nmero de clulas inflamatorias, que en casos extremos, pueden llegar a predominar sobre las clulas linfoides. En cualquier caso, los linfocitos pequeos siguen siendo el tipo celular linfoide predominante, aunque aumenta ligeramente el nmero de linfoblastos y clulas plasmticas. Los ganglios afectados por linfadenitis purulenta (inflamaciones agudas, de origen sptico o asptico) presentan un aumento de neutrfilos (mayor del 5% de la poblacin total). En procesos spticos, presentan caracteres degenerativos; si existen bacterias, son ms fciles de observar en las reas perifricas de la extensin.
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Foto 7.

Linfosarcoma en fases iniciales: aproximadamente 50% de linfoblastos (1: linfocito pequeo, 3: linfoblasto; ND: ncleo desnudo, CL: cuerpo linfoglandular) En casos de linfadenitis granulomatosa se observa un aumento del nmero de macrfagos. En ocasiones, puede observarse fagocitosis del agente etiolgico responsable del proceso (leishmanias, hifas) (Foto 1). Pueden aparecer como clulas gigantes multinucleadas o clulas epitelioides, caracterizadas por citoplasma basfilo con escasas vacuolas y pocos restos fagocitados. Las infecciones por micobacterias, los procesos inmunomediados crnicos y las infecciones crnicas no supurativas cursan con este patrn citolgico. Los procesos micticos pueden cursar, tambin, con una inflamacin mixta piogranulomatosa. Los ganglios que responden a procesos de hipersensibilidad presentan un aumento significativo de eosinfilos (mayor del 3%) (Foto 2) y mastocitos
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(menor del 3%). La linfadenitis eosinoflica tambin forma parte del complejo del granuloma eosinoflico felino y de infecciones por microfilarias.

Hiperplasia reactiva (hiperplasia linfoide benigna)

En ocasiones, no puede establecerse una diferenciacin clara entre un ganglio normal y un ganglio hiperplsico. El ganglio hiperplsico es la respuesta a altas concentraciones antignicas que estimulan el sistema inmune. Las reacciones ganglionares pueden ser localizadas o generalizadas, como en casos de infecciones felinas vricas o ehrlichiosis y leishmaniosis canina. En ocasiones, estos antgenos tambin atraen clulas inflamatorias, por lo que se produce un patrn mixto de linfadenitis y ganglio reactivo.

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La forma ms frecuente de hiperplasia reactiva se caracteriza por una reaccin de clulas plasmticas. Se mantiene la imagen pleomrfica con predominio de linfocitos pequeos. Sin embargo, se observa un incremento en el nmero de linfoblastos, en diferentes fases de maduracin, que pueden alcanzar el 15% de la poblacin total (hasta un 25% segn algunos autores). Tambin se observa un aumento de macrfagos, que puede superar el 2%. En la mayora de los casos, el hallazgo ms caracterstico del ganglio reactivo es el incremento de clulas plasmticas, cuyo nmero puede superar el 10% en determinadas zonas de la extensin (Foto 3). Pueden observarse clulas de Mott (Foto 4) o clulas en llama. En casos de hiperplasia plasmtica severa, el incremento de clulas plasmticas no es proporcional al aumento de linfoblastos. En casos extremos debe establecerse un diagnstico diferencial con el mieloma mltiple, cuya diferenciacin reside ms en el aspecto morfolgico de las clulas que en su nmero. Las enfermedades vricas felinas (leucemia o inmunodeficiencia) pueden desencadenar una reaccin ganglionar extrema con incremento masivo de diferentes tipos de linfoblastos, que puede ser difcil de diferenciar del linfosarcoma. Por ltimo, existe una forma de hiperplasia linfoide, denominada folicular, que se caracteriza por una poblacin monomrfica de linfocitos pequeos con ncleo condensado y escaso citoplasma en ausencia de clulas plasmticas u otras clulas linfoides. Puede ser difcil de distinguir de linfosarcomas de clulas pequeas, por lo que puede ser necesario establecer el diagnstico con tinciones inmunohistoqumicas.

Hay que tener en cuenta que los mastocitos son clulas que pueden encontrarse en ganglios normales y, en mayor nmero, en linfadenitis o ganglios reactivos; por lo tanto, en ocasiones hay que tener precaucin para definir la presencia de clulas metastsicas. En general, el hallazgo de ms de un 3% de mastocitos suele ser indicativo de infiltracin tumoral (Foto 5). Los melanfagos tambin son clulas habituales en ganglios linfticos. No deben confundirse con melanocitos, que presentan grnulos de melanina ms finos y dispersos y que son indicativos de metstasis de un melanoma. Las clulas de los procesos leucmicos pueden infiltrar de forma secundaria los ganglios linfticos. En ocasiones es difcil diferenciar blastos mieloides de linfoblastos. En leucemias linfoides puede ser difcil diferenciar una afectacin secundaria ganglionar de un linfosarcoma primario. No obstante, siempre debe recordarse que la ausencia de clulas neoplsicas en una citologa no descarta la presencia de las mismas en el tejido. Los tumores que invaden ganglio de forma difusa son fciles de diagnosticar, pero, en ocasiones, los tumores metastatizan en focos que pueden no ser aspirados.

Linfosarcoma
El estudio citolgico de los ganglios linfticos permite diagnosticar el 90% de los linfosarcomas caninos. En la especie felina no se alcanza este nivel de sensibilidad, ya que, en ocasiones, es difcil diferenciar las neoplasias linfoides de las hiperplasias de linfoblastos en gatos jvenes afectados por leucemia felina. En el linfosarcoma se produce la suspensin de la maduracin de un clon maligno de clulas linfoides. A medida que la enfermedad avanza, la poblacin ganglionar normal es sustituida por una poblacin, ms o menos homognea, de linfoblastos. Cuando las clulas inmaduras constituyen ms del 50% de la poblacin linfoide puede diagnosticarse un linfoma; cuanto mayor sea este porcentaje, mayor seguridad diagnstica (Foto 6). En estadios iniciales del proceso, antes de alcanzar un porcentaje suficiente de clulas inmaduras, es ms complicado confirmar el diagnstico (Foto 7). El clon celular del que proceden las clulas neoplsicas marca la morfologa celular predominante. La mayora de los linfosarcomas en el perro son de alto grado, que proceden de clulas muy inmaduras (tamao nuclear
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Ganglio metastsico
El diagnstico de metstasis ganglionar es sencillo, ya que se basa en la observacin de clulas que no forman parte del tejido ganglionar normal. Los tumores que metastatizan con mayor frecuencia a ganglio linftico son los carcinomas, mastocitomas y melanomas. La imagen citolgica depende del grado de afectacin. Normalmente, la poblacin linfoide se mantiene dentro de la normalidad o aparecen cambios reactivos; en casos avanzados, las clulas tumorales pueden sustituir completamente al tejido linfoide, sobre todo en mastocitomas y melanomas. Las clulas del carcinoma deben diferenciarse de clulas de estroma ganglionar y de macrfagos epitelioides.

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Tabla 1: proporcin de los tipos celulares presentes en las principales patologas ganglionares Gg normal
Linfocitos maduros Linfoblastos Clulas plasmticas Macrfagos 75-95% <5% (<10%) <5% 0.04%

Linfadenitis
75-90%

Hiperplasia plasmtica
70-80%

Metstasis
Predominio (si no existe una invasin masiva) 5-10% Hiperplasia Aumento

Linfoma
< 50% >50% Escasas o ausentes Escasas o ausentes

5-10% <5% Hasta un 2% (procesos granulomatosos) <5% (procesos purulentos) >3% (procesos de hipersensibilidad) <3% (procesos de hipersensibilidad) Ausencia Abundantes Escasas

10-25% Puede superar el 10% Hasta un 2%

Neutrfilos

0.1%

Aumento en casos de Aumento en casos de Aumento en casos de necrosis necrosis necrosis Escasos Aumento en metstasis de mastocitoma > 3% en metstasis Presencia Abundantes Atpicas en la poblacin neoplsica Escasas o ausentes

Eosinfilos

0.3%

Mastocitos Clulas neoplsicas no linfoides Restos celulares Mitosis

0.02% (> en gatos) Ausencia Moderada cantidad Escasas

Escasos Ausencia Abundantes Escasas

Escasas o ausentes Ausencia Muy abundantes Frecuentes, atpicas

mayor de 3 hemates) y fciles de diferenciar de linfocitos normales. El linfosarcoma de bajo grado procede de linfocitos pequeos (tamao nuclear entre 1 y 2 hemates) y puede ser muy difcil establecer una diferenciacin con hiperplasias foliculares. En general, la caracterstica que sobresale en el diagnstico citolgico de los linfosarcomas es la prdida del pleomrfismo tpico de ganglios normales o hiperplsicos, ya que se observa una imagen montona de clulas en semejante estadio de maduracin. Este concepto, ms que la propia morfologa de las clulas o la presencia de los tpicos caracteres citolgicos de malignidad, es la base del diagnstico. Segn el tipo celular neoplsico, el proceso puede clasificarse segn alguno de los esquemas propuestos para el perro (Kiel, Working Formulation), aunque esta diferenciacin no es bsica para establecer un diagnstico. Adems, esta clasificacin de linfosarcomas es ms fiable en muestras procesadas por histopatologa. Otras caractersticas que acompaan a la citologa de linfosarcoma son: mayor cantidad de cuerpos linfoglandulares o ncleos desnudos (que no deben confundirse con
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linfoblastos), ya que el tejido linfoide neoplsico es todava ms fragil escasa cantidad o ausencia de clulas plasmticas, lo que permite establecer la diferencia con ganglios reactivos escasas clulas inflamatorias (salvo en los casos de necrosis tisular) aumento del nmero de mitosis, con formas atpicas (la presencia de 2-3 mitosis por campo de 400 suele ser indicativo de linfomas de alto grado).

Bibliografa
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