UNAM Facultad de Ciencias. Biologa Molecular de la Clula I. Equipo 4.

. Integrantes: Alfaro Lpez Gerardo, Daz Guzmn Hilda Eugenia, Martinez Becerril Hilda Anglica, Ortiz Cruz Carlos Alberto y Villanueva Patraca Liliana.

CINTICA ENZIMATICA DE LA POLIFENOL OXIDASA. Introduccin Los compuestos que aceleran las reacciones qumicas sin ser alterados por la reaccin, es decir, que al final de la reaccin vuelven a su estado original, se denominan catalizadores. Las enzimas son protenas que actan como catalizadores biolgicos. En una reaccin enzimtica, la enzima (E) reacciona con uno o varios compuestos denominados sustratos (S) y los modifica durante la reaccin para convertirlos en productos (P).(Ortega et al; 2010) La enzima sale de la reaccin sin cambio y lista para ligar otra molcula de sustrato. Una muy pequea cantidad de enzima puede convertir una relativamente mucha mayor cantidad de sustrato. El sitio de la enzima donde se lleva a cabo la reaccin es denominado sitio activo, constituido por radicales de los aminocidos involucrados en la reaccin y los que permiten la unin especfica del sustrato. Esta unin forma el complejo enzima-sustrato (ES).(Ortega et
al; 2010)

alterar su velocidad de actividad. Otras sustancias pueden reducir o impedir la actividad de las enzimas. Estos son los inhibidores irreversibles, que se unen covalentemente a la enzima, y los inhibidores reversibles, que se unen por medio de interacciones no covalentes (puentes de hidrgeno e interacciones inicas e hidrofbicas). Los reversibles pueden ser clasificados en competitivos, que son los que se unen al sitio activo de la enzima; no competitivos, los que se unen a la E o ES en un lugar distinto al sitio activo; y acompetitivos los que se unen solo a ES fuera del sitio activo.
(Ortega et al; 2010)

La velocidad inicial (Vo) de la reaccin, es decir la cantidad de sustrato consumido o producto formado por unidad de tiempo al principio de la reaccin depende de la concentracin de sustrato. (Ortega et al; 2010) La grfica entre la concentracin inicial de sustrato y la velocidad inicial de la reaccin produce una hiprbola rectangular, la cual se explica con la ecuacin de Michaelis- Menten: Vo = Vmax [S] / [S] + Km. La Vmax es un valor terico que no se alcanza experimentalmente y que indica la capacidad cataltica de la enzima. La Km es una constante que indica la afinidad

La actividad de una enzima es afectada por factores ambientales. Cambios en estas condiciones, tales como pH o temperatura, pueden cambiar la estructura tridimensional de la enzima y

con la que la enzima reconoce al sustrato. La Km tiene unidades de concentracin (mM, M o nM) y es igual a la concentracin de sustrato con la cual se alcanza la mitad de la Vmax. Mientras menor es el valor de la Km mayor es la afinidad que la enzima tiene por el sustrato. (Ortega et al; 2010)
Polifenol Oxidasa (PPO)

ablandamiento de algunos vegetales se han estudiado y reportado ampliamente durante las distintas fases de desarrollo en las cuales la polifenol oxidasa cumple un papel importante.(BELITZ et al. 2004) La polifenoloxidasa conocida como tirosinasa, fenolasa, catecol oxidasa, odifenoloxidasa, monofenol oxidasa cresolasa, fue descubierta y aislada inicialmente de championes; ella acta sobre dos tipos de sustratos: monohidroxifenoles como por ejemplo el p-cresol hidroxilndolos y sobre odihidroxifenoles tales como el catecol, oxidndolos a benzoquinona por remocin de hidrgenos del grupo hidroxilo.(BELITZ et al. 2004)

Esta clase de enzimas tambin se denominan tirosinasas, catecol oxidasas y difenol oxidasas. En presencia de oxgeno, esta enzima cataliza la oxidacin (remocin de electrones e hidrgenos) de varios compuestos fenlicos, tales como catecol, DOPA, tirosina,etc. lo que indica que tiene una baja especificidad de sustrato, aunque tiene mayor afinidad por unos que por otros. En mamferos participan en la formacin de melanina; su ausencia provoca albinismo. En plantas, diferentes formas de la enzima se localizan en raz, tubrculos, frutos y hojas, contenidas en plstidos y sirven como mecanismo de defensa contrapatgenos e insectos invasores. (Ortega et al; 2010)

La Polifenol oxidasa, PPO, es una de las enzimas ms estudiadas en la industria de los alimentos ya que es la responsable de las reacciones de pardeamiento enzimtico en frutas y verduras. Una de las razones por las cuales es importante su estudio es porque comercialmente es indeseable, ya que modifica las propiedades sensoriales, nutricionales y en general de calidad que perjudica la comercializacin de un producto. Los cambios asociados a la maduracin como bioqumicos, fisiolgicos y de composicin as como el

Figura 1. Representacin general de la reaccin de la polifenol oxidasa en plantas.

La caracterstica estructural ms importante de la PPO es la presencia en su centro activo de dostomos de cobre, unidos a histidinas; alrededor de los cobres, se sitan aminocidos hidrofbicos, con anillos aromticos importantes para la unin de los sustratos. (Gomez et al., 2011)

El mecanismo de reaccin de la PPO, se basa en la catlisis de dos etapas: oxidacinde un monofenol a o-difenol y la subsiguiente oxidacin de este a oquinona, actividad cresolasa y catecolasa respectivamente. Siguiendo un mecanismo ordenado, la enzima liga primero el oxgeno y despus el monofenol. Se produce un cambio de valencia de los iones de cobre de Cu1+ a Cu2+ formndose un complejo que tiene un enlaceO - O bien polarizado donde se produce la hidroxilacin a o-difenilo. La oxidacin del o-difenol a o-quinona finaliza el ciclo (Belitz&Grsosh 2004). La polifenol oxidasa es capaz de catalizar reacciones de oxidacin de compuestos polifenlicos en presencia de oxigeno molecular y la presencia de los compuestos oxidados por la enzima son precursores de las reacciones de pardeamiento que ocurren en los procesos de pos-recoleccin y manipulacin de frutas y hortalizas.(Bruening et al. 1987)

La polifenol oxidasa de la papa ataca a los siguientes compuestos en orden de mayor a menor actividad: cido clorhdrico, catecol, quercitina, pirogalol, cido cafeico, 3,4-dihidroxifenilalanina, pcreso, tirosina entre otros. Las quinonas resultantes de la reaccin de la polifenol oxidasa pueden continuar oxidndose y polimerizndose, para dar compuestos finales que son muy complejos y coloridos.(BELITZ et al. 2004) En las plantas, los polifenoles se encuentran localizados principalmente en las vacuolas y su oxidacin es catalizada por la enzima Polifenol Oxidasa, que se encuentra en el citoplasma de la clula, sin embargo, la localizacin de la enzima en las clulas de las plantas depende de la especie y estado de madurez. La distribucin de PPO en diferentes partes de frutas y vegetales puede ser diferente ya que la proporcin de enzimas solubles vara con la madurez.(BELITZ et al. 2004) Materiales y mtodos Se pesaron en balanza analtica 0.4gr de papa (Solanumtuberosum), y se colocaron en un tubo de ensaye con 1mL de amortiguador de fosfato 0.1M a un pH 6.8. Con una varilla de vidrio, se machac perfectamente hasta formar una masa homognea, la cual se coloc en un tubo Ependorf, que se llev a centrifugar a 14000rpm por un minuto. Despus, se hizo una dilucin 1:10 del extracto con el amortiguador de fosfatos, mezclando 0.5ml del extracto de papa con 4.5ml del buffer. Esta muestra contena la Polifenol Oxidasa.La muestra se mantuvo en hielotodo el tiempo, desde el momento de machacar la papa hasta el momento en que se utiliz, con el fin de evitar la desnaturalizacin de la enzima (polifenol oxidasa).

Figura 2. Estructura de algunos sustratos naturales de la PPO.

Posteriormente, se encendi el espectrofotmetro, ajustando la longitud de onda a 325nm. Se tom 0.1mL de la disolucin del extracto que contena la enzima y se coloco en el tubo 6 y se agit brevemente. Con la disolucin resultantese lleno poco ms de la mitad de la celda del espectrofotmetro, aparato en el que se coloc dicha celda y se dio lectura de la absorbanciacada 15segundos.

Figura 3. Extracto de papa en hielo

Se preparan 6 tubos de ensaye con las cantidades de amortiguador de fosfato 0.1M y pirogalol que se muestran a continuacin:
Tabla 1. Concentraciones de Amortiguador de fosfato y de Pirogalol Tubo Amortiguador de fosfato 0.1 M pH 6.8 (mL) Disolucin de Pirogalol (6.3mg/mL)

1 2 3 4 5 6

4.8 4.6 4.3 3.7 3.1 2.5

0.1 mL 0.3 mL 0.6 mL 1.2 mL 1.8 mL 2.4 mL

Figura 5. Preparacin de la mezcla de enzima y pirogalol

Finalmente se repiti este proceso con los 5 tubos que contenan la mezcla de pirogalol restantes, dndole a cada uno lectura de la absorbancia en el espectrofotmetro cada 15segundos. Resultados.
Lectura de las Absorbancias
Tubo 1 Tiempo (seg) 0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 Absorbancia a (325mm) 0.5 0.528 0.538 0.552 0.560 0.570 0.584 0.581 0.594 0.597 0.610 0.617

Figura 4. Preparacin de los tubos con pirogalol y buffer de fosfatos

165

180 Tubo 2 Tiempo (seg) 0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 Tubo 3 Tiempo (seg) 0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 Tubo 4 Tiempo (seg) 0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165

0.622

180

1.414

Absorbancia a (325mm) 0.751 0.765 0.780 0.793 0.812 0.820 0.835 0.849 0.862 0.871 0.883 0.879 0.901

Tubo 5 Tiempo (seg) 0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 Tubo 6.

Absorbancia a (325mm) 0.209 1.358 1.374 1.391 1.400 1.418 1.431 1.444 1.456 1.465 1.478 1.4886 1.497

Absorbancia a (325mm) 0.033 1.058 1.077 1.092 1.106 1.126 1.136 1.150 1.159 1.173 1.180 1.1195 1.203

Tiempo (seg) 0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180

Absorbancia a (325mm) 1.347 1.361 1.370 1.396 1.396 1.410 1.420 1.434 1.446 1.456 1.467 1.477 1.491

Absorbancia a (325mm) 0.149 1.299 1.322 1.330 1.336 1.348 1.360 1.368 1.376 1.389 1.396 1.405

BIBLIOGRAFIA:
ORTEGA G. J. et al.Manual de Prcticas de Biologa Molecular de la Clula I. 2 ed. UNAM, Facultad de Ciencias, Mxico, 2010. 81-82. Gomez et al. Biologa Molecular: Principios y Aplicaciones, CIB, Colombia, 2011. CONN, E.S., BRUENING, G. & DOI, R. Bioqumica Fundamental. 5ta. ed, ed. I. Ed.JonhWiley and Sons. 1987., Balderas (Mexico). Noriega Editores. 131-182.

BELITZ, H.D. & GROSH, W. 2004.Quimica de los Alimentos. Editorial Acribia S.A., Zaragoza. p.105-

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