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LABORATORIO DE MICROBIOLOGA DOCENTE: Dra.

Celia Bowen Fernndez


1. DATOS INFORMATIVOS

MATERIA O MDULO: LABORATORIO MICROBIOLOGA PRCTICAS CARRERA: MEDICINA NIVEL: CUARTO N CRDITOS: 5 -CRDITOS TEORA: 4 -CRDITOS PRCTICA: 1 DATOS DEL PROFESOR: Nombre: Celia Annabel Bowen Fernndez Grado Acadmico o Ttulo Profesional: Dra. Bioqumica y Farmacia opcin Bioq. Clnica Breve indicacin de la lnea de actividad acadmica: Docencia en diferentes en diferentes ramas de la patologa clnica (Laboratorio clnico y Microbiologa), coordinadora de los laboratorios en el rea de Destrezas Clnico Quirrgicas Indicacin de horario de atencin a estudiantes: Martes, Mircoles y Viernes 12:00 a 13.00 horas Correo Electrnico: bowencelia@yahoo.es Telfono: 084678618 PROFESOR: Grado acadmico o ttulo profesional: Dra. Bioqumica y Farmacia opcin: Bioq. Clnica/ Diplomado Superior en Pedagogas Innovadoras 2. DESCRIPCIN DE LA MATERIA: La unidad tiene como propsito facilitar el aprendizaje de los principales mtodos de diagnstico microbiolgico, en lo que se refiere a las enfermedades infecciosas humanas: medios de cultivo, tinciones, pruebas inmunolgicas y de microscopa y relacionarlos con los objetivos de la teora de Microbiologa. 3. OBJETIVO GENERAL: Introducir al estudiante de medicina en los mtodos de identificacin de microorganismos patgenos responsables de las principales enfermedades infecciosas humanas. 4. OBJETIVOS ESPECFICOS: 4.1. ACTITUDINALES: a. Cumplir las normativas de bioseguridad b. Escoger las pruebas de laboratorio adecuadas de acuerdo al tipo de infeccin c. Compartir conocimientos y experiencias durante el proceso de aprendizaje 4.2. COGNITIVOS: a. Identificar los diferentes microorganismos como bacterias, parsitos, hongos y virus causantes de enfermedades b. Conocer los principales mtodos de anlisis inmunolgico c. Revisar los principales mtodos, medios de cultivos y coloraciones empleados para la identificacin de microorganismos infecciosos 4.3. PROCEDIMENTALES: a. Ejecutar correctamente la toma y recogida de muestras para anlisis microbiolgicos b. Reconocer a travs del microscopio, los principales microorganismos patgenos a travs de tinciones y montajes bsicos c. Realizar siembras en los medios de cultivos comunes d. Observar las caractersticas de crecimiento y multiplicacin de los microorganismos CONTENIDOS

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PARALELO 1,2,3,4
1. 2. Bioseguridad en el laboratorio de Microbiologa: Primera semana Coloraciones: Gram, Ziehl-Neelsen, Giemsa:

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Segunda semana Medios de cultivo, requerimientos nutricionales, clasificacin y tcnicas de siembra; utilizacin de asas y campanas microbiolgicas: Tercera Semana 4. Tcnica para realizacin del antibiograma: medios apropiados y antimicrobianos: Cuarta semana 5. Estudio microbiolgico del esputo: coloraciones, siembras e interpretacin. Quinta semana 6. Identificacin de cocos gram positivos: estafilococos y estreptococos. Streptococos del grupo A (Bacitracina, Optoquina, Catalasa, coagulasa): Sexta semana PRIMERA EVALUACIN: Sptima semana 7. Urocultivos: medios apropiados, manejo de la muestra, siembra, identificacin e interpretacin: Octava semana 8. Identificacin bioqumica y serolgica de bacilos gram negativos; grupo bacterianos de importancia mdica Novena semana 9. Coproparasitario, identificacin microscpica de parsitos Dcima semana 10. Exmen de Heces-Coprocultivos: medios apropiados, manejo de la muestra, siembra, identificacin e interpretacin. Coproparasitario, identificacin microscpica de parsitos Dcima primera semana 11. Infecciones de transmisin sexual: Principales microorganismos que la producen, diagnstico por laboratorio Dcima segunda semana 12. Micosis.Toma de muestras y observacin de hongos: montajes y preparaciones Dcima tercera semana 13. Tcnicas bsicas de inmunologa: aglutinacin, floculacin, micro-ELISA Dcima cuarta semana 14. Investigacin de hematozoario: frotis, tincin e identificacin microscpica Dcima quinta semana SEGUNDA EVALUACIN: Dcima sexta semana TERCERA EVALUACIN (PRCTICA): Dcima sptima semana METODOLOGA, RECURSOS: 6.1. Mtodos didcticos a. Charla de fundamentacin terica b. Explicacin prctica y observacin c. Realizacin de prcticas de pruebas de laboratorio d. Lectura e interpretacin de resultados 6.2. Recursos a. Uso del manual de prcticas de Laboratorio Microbiologa b. Uso de Atlas de Microbiologa c. Equipos de Laboratorio de Microbiologa (Microscopio, incubadora, esterelizadora, etc.) d. Medios de cultivo e. Reactivos varios f. Muestras biolgicas varias EVALUACIN: 3.

CRONOGRAMA DE EVALUACIONES: a. 1ra. Evaluacin: Sptima semana b. 2da. Evaluacin: Dcima sexta semana c. 3era. Evaluacin: Dcima sptima semana SISTEMA DE CALIFICACIN: EVALUACIONES PARCIALES PRCTICA Y TERICA: 30 puntos 10 puntos de cada prueba parcial (dos parciales) ms 10 puntos entre examen prctico al microscopio (6 puntos) y trabajos (consultas, reportes, otros) (4 puntos)

Nota final: 20 puntos Primera parte: 10 puntos con un examen final del rea de Prcticas en la semana 18 de la rotacin Segunda parte (examen integrador de la Macrorea de Morfofuncin): semana 18 de la rotacin 8. BIBLIOGRAFA: TEXTOS DE REFERENCIA: Forbes-Sahm-Weissfeld, Diagnstico Microbiolgico (Bailey & Scott), 11 a edicin, Editorial Mdica Panamericana, Argentina, 2004 ngel M., G. y M. ngel R., Interpretacin Clnica del Laboratorio, 6. edicin, Editorial Mdica Panamericana, Bogot, 2.001 lvarez, M. V., et al, Manual de Tcnicas en Microbiologa Clnica, Asociacin Espaola de Farmacuticos Analticos, Salamanca, 1.995 Henry, J. B., Diagnstico y Tratamiento Clnicos por el Laboratorio, 9. Edicin, Editorial Salvat Mdica, Mxico, 1.993 OPS/OMS, Manual de Tcnicas Bsicas en Bacteriologa Clnica, 1.995 TEXTOS RECOMENDADOS: Atlas y apuntes de Microbiologa de la Dra. Celia Bowen disponibles en la pgina web ftp.puce.edu.ec Francisco Javier Prez Pazmio-Elena Granda Moreno, Manual de Prcticas de Laboratorio de Microbiologa, para estudiantes de Medicina

PRCTICA No. 1 TEMA: Bioseguridad en el Laboratorio de Microbiologa EL MECHERO DE BUNSEN La llama ms utilizada en el laboratorio es la producida por la combustin de un gas (propano, butano o gas ciudad), con el oxgeno del aire. La combustin completa (con exceso de oxgeno) produce agua y dixido de carbono, una llama poco luminosa y de gran poder calorfico. La combustin incompleta produce, adems de dixido de carbono y agua, carbono, nonxido de carbono y otros productos intermedios, da origen a llamas de bajo poder calorfico y altamente luminosas (debido a la incandescencia de las partculas de carbono que se producen). Para controlar las llamas se utiliza el mechero de laboratorio que, a pesar de existir diversos tipos, el mecanismo de funcionamiento es similar en todos ellos. Esencialmente constan de un tubo, llamado can, a cuya base llega la entrada de gas a traves de un pequeo orificio (chicl). En esta zona existen unas aberturas, regulables mediante una anilla (virola), que permiten la entrada del aire al can. La expansin del gas a travs del pequeo orificio succiona el aire exterior produciendose, de este modo, una mezcla gas-oxgeno que asciende por el can hasta la boca del mismo que es donde se produce la llama.

Sosteniendo con unas pinzas una cpsula de porcelana en la parte superior de la llama producida con la entrada de aire cerrada, se observa un ennegrecimiento producido por el depsito de carbn, lo que indica que la combustin es incompleta. Sosteniendo con unas pinzas una cpsula de porcelana en la parte superior de la llama producida con la entrada de aire abierta, se observa el depsito de pequeas gotitas de agua, lo que indica la combustin completa del gas a dixido de carbono y agua. Si el mechero arde con la entrada de aire cerrada, la combustin es incompleta y la llama presenta un color anaranjado debido a la presencia de partculas incandescentes de carbono. Al abrir el paso de aire, la combustin es completa y en la llama se aprecian dos zonas claramente separadas por un cono azul plido. En el exterior del cono la combustin es completa, existe un exceso de oxgeno y se producen altas temperaturas (zona oxidante). En el interior del cono los gases todava no se han inflamado y en el cono mismo hay zonas donde la combustin no es todava completa y existen gases no oxidados a dixido de carbono y agua por lo que se tiene una zona reductora de la llama

ENCENDIDO DEL MECHERO Cerrar totalmente la entrada de aire, abrir ligeramente la llave de paso del gas y acercar, lateralmente, una cerilla encendida a la boca del can. Regular la llave hasta obtener una llama con la altura deseada, gradualmente, abrir la entrada de aire. No abrir repentinamente porque puede apagarse el mechero. Para obtener mayor temperatura, abrir ms el flujo de gas y la entrada de aire. EL MECHERO SE APAGA AL CERRAR LA LLAVE DE GAS.

PRCTICA No. 2 TEMA: Coloraciones: Gram, Ziehl-Neelsen, Giemsa (ver pg. 8 del manual de prcticas Lab. Microbiologa del Dr. F. Prez y mirar atlas con el nmero de prctica correspondiente colocado en la pgina ftp.puce.edu.ec) PRCTICA No. 3 TEMA: Medios de cultivo (ver pg. 13 del manual de prcticas Lab. Microbiologa del Dr. F. Prez y mirar atlas con el nmero de prctica correspondiente colocado en la pgina ftp.puce.edu.ec) Metodologa para realizar un cultivo bacteriano: Antes de realizar un cultivo es necesario contar con todo el material debidamente esterilizado, adems de tener la precaucin de trabajar junto a una fuente de calor que impida tanto un contagio de la persona que procesa la muestra, as como una posible contaminacin del cultivo donde se va a trabajar. Para realizar un cultivo bacteriano es necesario tomar el asa e introducirla al fuego para que se esterilice, dejar enfriar unos segundos y tomar la muestra que se va a estudiar; abrir la caja petri y flamear delante del mechero, con el asa impregnada de la muestra se efecta un pequeo inculo en el borde, de all se parte la primera estriacin; luego de la esquina de una de las estras de la primera estriacin se realiza la segunda estriacin y finalmente de la esquina de una de las estras de la segunda estriacin, se realiza la tercera estriacin, procurando hacer las estras mucho ms separadas de las dos primeras, con la finalidad de separar las colonias que sean sembradas; se tapa la caja y se lleva a la incubadora, colocndola de lado contrario al que se sembr y se la deja en las condiciones apropiadas para el crecimiento de cada bacteria (temperatura, atmsfera, potencial rdox, tiempo, etc.)

PRCTICA No. 4 TEMA: Tcnica para la realizacin del antibiograma (ver pg. 23 del manual de prcticas Lab. Microbiologa del Dr. F. Prez y mirar atlas con el nmero de prctica correspondiente colocado en la pgina ftp.puce.edu.ec)

DISCOS DE ANTIBITICOS USADOS PARA GRMENES GRAM POSITIVOS Y GRAM NEGATIVOS TOMANDO EN CUENTA AL PACIENTE AMBULATORI GRAM POSITIVOS GRAM NEGATIVOS Oxacilina (ox) Ampicilina (am) Eritromicina (E) Cefuroxima (cxm) Clindamicina (cc) Ampicilina + sulbactam (sam) Cefoxitin (fox) Gentamicina (gm) Sulfas (sxt) Norfloxacina (nor) Ciprofloxacina (cip) Nitrofurantona (fm) Vancomicina (va) Sulfas (sxt)

PRCTICA No. 5 1. TEMA: ESTUDIO MICROBIOLGICO DEL ESPUTO: Coloraciones, siembras e interpretacin (ver pg. 26 del manual de prcticas Lab. Microbiologa del Dr. F. Prez)

PRCTICA No. 6 2. TEMA: IDENTIFICACIN DE COCOS GRAM POSITIVOS:

Estafilococos y estreptococos (ver pg. 44 del manual de prcticas Lab. Microbiologa del Dr. F. Prez y mirar atlas con el nmero de prctica correspondiente colocado en la pgina ftp.puce.edu.ec) Catalasa: la catalasa es una enzimaque descompone el perxido de hidrgeno (H2O2) en oxgeno y agua.El perxido de hidrgeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativo o aerbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular, el perxido de hidrgeno es letal para las clulas bacterianas. 2H2O2 2H2O + O2 (burbujas de gas) La prueba de la catalasa, llevada a cabo en portaobjetos o en tubos, es muy comnmente utilizada para diferenciar estreptococos (negativos) de estafilococos (positivos). Coagulasa: la coagulasa es una enzima proteca de composicin qumica desconocida, con actividad semejante a la protrombina, capaz de transformar el fibringeno en fibrina, provocando la formacin de un coagulo visible en un sistema analtico adecuado. En el laboratorio, la prueba de la coagulasa se utiliza ms comnmente para diferenciar al S. aureus (coagulasa positivo) de otros estafilococos y micrococos. La coagulasa se halla en 2 formas, libre y fija, cada una de las cuales posee diferentes propiedades que requieren el uso de tcnicas separadas: Coagulasa libre (prueba en tubos): la coagulasa libre es una sustancia semejante a la trombina, que se haya presente en los filtrados de cultivos. Cuando una suspensin de bacterias productoras de coagulasa se mezclan en partes iguales con una pequea cantidad de plasma en un tubo de ensayo, se forma un coagulo visible como consecuencia de la utilizacin de los factores de la coagulacin del plasma de manera similar a cuando se aade trombina. Bacitracina:Las pruebas presuntivas en la identificacin del EbHGA (Estreptococo beta hemoltico del grupo A) se basan en la susceptibilidad e inhibicin del crecimiento en una placa de agar sangre, y que tienen la mayor parte (95%) de las cepas al ponerlas en contacto con discos que contienen dosis bajas (0.04U) de bacitracina. Optoquina: se usa el disco de optoquina para diferenciar entre S. pneumoniae (sensibles) y otras especies de estreptococos a hemolticos (resistentes). La sensibilidad a la optoquina es una medida de la fragilidad de la membrana celular bacteriana. La optoquina, que es el clorhidrato de etilhidrocuprena.

2. PARTE EXPERIMENTAL : 2.1.Tcnica o procedimiento: Estudio microbiolgico del esputo Nota: Se utilizan tres medios de cultivo para el esputo que son: agar Macconkey, agar sangre y caldo de tioglicolato. En la prctica haremos con agar sangre y caldo de tioglicolato a. Siembra en agar sangre (para identificacin de bacterias gram-negativas y gram-positivas):

Sacamos el agar sangre de la refrigeradora y esperamos a que adquiera la temperatura ambiente Encendemos el mechero de bunsen, colocamos las asas y las muestras de esputo cerca del mismo Tomamos un cotonete de algodn estril y tomamos un poco de muestra de esputo en una lado del agar, luego tomamos el asa lo esterelizamos en el mechero y luego de enfriar lo pasamos por el agar, justo en el sitio por donde paso el cotonete, estriamos en tres direcciones alrededor de la caja Tapamos el agar y colocamos en la incubadora alrededor de 35- 37C y dejamos por 24 a 48 horas en la misma Una vez transcurrido el tiempo de incubacin se realiza la lectura de la siembra y la interpretacin de la misma b.Siembra en caldo de tioglicolato Con el cotonete de algodn que se tom la muestra de esputo y se sembr en agar sangre, introducir un poco de la misma en el caldo e incubar de 35 a 37C durante 48 horas. Este medio se usa para determinar el efecto del oxgeno sobre el crecimiento microbiano. Un tubo con medio semislido contiene tioglicolato para reducir el potencial redox del medio. As slo hay oxgeno en la superficie y no en el resto del tubo. Si el microorganismo es aerobio estricto crecer en la parte de arriba del tubo, si es anaerobio estricto no crecer en la parte ms alta del tubo y si es anaerobio facultativo crecer por todo el medio. c. Observacin de placas coloreadascon coloracin gram de muestra de esputo Mirar al microscopio con el lente de gran aumento (100 x) y con aceite de inmersin, las colonias de Stafilococcus, de Streptecoccus, de otras bacterias y otros elementos patgenos presentes anotar el color y las formas que presentan. 2.2. Tcnica o procedimiento: Identificacin de cocos gram positivos 2.2.1. Catalasa En una placa portaobjetos aadir 1 o 2 gotas de perxido de hidrgeno al 3% (diluir la solucin al 30% con agua destilada), transferir clulas del centro de una colonia bien aislada y mezclar. La rpida aparicin y produccin sostenida de burbujas de gas o efervescencia indica una reaccin positiva. 2.2.2.Coagulasa Prueba en tubos (coagulasa libre): 1.- colocar aspticamente 0.5 ml de plasma de conejo reconstituido en el fondo de un tubo estril. 3.- mezclar por rotacin suave del tubo, evitando remover o agitar el contenido. 4.- colocar el tubo en la incubadora de 4 a 24 horas. Observar la formacin de un coagulo visible. La reaccin se considera positiva ante cualquier grado de coagulacin visible dentro del tubo.

2.2.3. Prueba de la Bacitracina Se toma un agar sangre y en un lado de la placa se estria con el asa en forma continua la cepa de estreptococo beta hemoltico, con una pinza estril se coloca el disco de bacitracina en el centro del estriado realizado. La placa de agar sangre es incubada a 35-37 C durante toda la noche. Los resultados son cualitativos y es positiva para estreptococo beta hemoltico del grupo A si se encuentra cualquier halo de inhibicin alrededor del disco. 2.2.4. Prueba de la optoquina Mtodo: se toma una suspensin de colonias puras en caldo Mueller Hinton o tioglicolato y con un hisopo se estra una placa de agar sangre de carnero al 5 %. Sobre la estra se coloca el disco de optoquina. Se incuba con atmsfera de CO2 al 5 % ( jarra con vela ). durante 24 hs. a 35 C. Interpretacin: Sensible, cuando hay inhibicin alrededor del disco. Se considera como punto de corte 16 mm. (discos de 10 mm) o 14 mm (discos de 6 mm). Resistente, cuando el crecimiento no es inhibido alrededor del disco. Los casos de halos intermedios deben resolverse por acumulacin de pruebas a favor o en contra. 3. MATERIALES Y REACTIVOS (este literal no necesita ser memorizado): Materiales Asas microbiolgicas Reactivos Placas coloreadas por mtodo de gram Incubadora a temperatura Agar sangre 35-37 C Mechero de Bunsen Caldo de tioglicolato Cajas petri Muestras de esputo Hisopos estriles Perxido de hidrgeno Microscopio Plasma de conejo Placas portaojetos Discos de bacitracina Tubos de ensayo Palillos de dientes PRCTICA No. 7 TEMA: UROCULTIVOS (ver pg. 29 del manual de prcticas Lab. Microbiologa del Dr. F. Prez y mirar atlas con el nmero de prctica correspondiente colocado en la pgina ftp.puce.edu.ec) 1. Instrucciones para recoger una muestra parcial de orina para EMO a. El frasco tiene que ser suministrado por el Laboratorio, o adquirir en la farmacia uno estril apropiado para la recoleccin de orina. b. Es preferible que la orina sea la primera orina de la maana. c. Practicar previo aseo genital, con agua y jabn, sin dejar residuos. Esto es especialmente importante en la mujer que debe lavarse el rea entre los labios de la vagina y evitar la contaminacin de la muestra con crema, antispticos y secreciones vaginales. Los hombres y nios deben limpiarse la cabeza del pene 10

d. Deje escapar la porcin inicial de la miccin al inodoro, a continuacin recolecte en el frasco la porcin media (10 ml) y descarte la porcin final de la miccin nuevamente en el inodoro. e. Tape bien el frasco y entrguelo rpidamente al Laboratorio (mximo dos horas luego de tomar la muestra). f. NO recoger la muestra durante el Periodo Menstrual 2. Mtodo para el anlisis de orina macroscpico y qumico: a. Despus de recibir la orina en el laboratorio, analizarla tan pronto como sea posible. Antes del anlisis las muestras de orina deben estar a la temperatura ambiente b. Realizar la homogenizacin de la orina c. Con movimientos moderados en el recipiente transportado hasta el laboratorio (bien mezclada y no agitada) d. Verter en un tubo de ensayo de 16 x 100 mm aproximadamente 10 ml e. Determinar el color, aspecto (nitidez) f. Registrar la presencia de un olor inusual y de cantidades anormales de espuma coloreada g. Sumergir brevemente la tira reactiva, no ms de un segundo (evitar tocarla con los dedos, ya sea antes o despus de sumergirla) h. Eliminar el exceso de orina en la tira,: limpiar el borde de la misma con el reborde del tubo o con papel secante i. No permitir que los reactivos de la tira se junten j. No depositar la tira reactiva directamente sobre la superficie de trabajo k. Seguir exactamente las recomendaciones en cuanto al tiempo para cada test qumico l. Mantener la tira reactiva junto a la carta de colores y leer bajo una buena iluminacin m. Tener en cuenta las fuentes de error, la sensibilidad y la especificidad de cada prueba con la tira reactiva 1.1.Parmetros que se observan en el examen macroscpico : En el examen macroscpico se analiza el aspecto como por ejemplo si es trasnparente, ligeramente turbia, turbia, espesa, opaca y el color de la orina que puede ser amarilla plida, amarilla oscura, mbar, roja, verde, azul entre otros. 1.2.Parmetros que se observan en el examen qumico:

Densidad ( gravedad especfica): Registra la concentracuin inica de la orina (es decir, qu tan concentrada o diluida se encuentra). Se basa en la liberacin de protones por un formador de complejos en presencia de cationes. Esto causa un viraje de color del indicador azul de bromotimol, de azul hacia amarillo, pasando por verde azulado pH: Indican la acidez o alcalinidad de la orina. Los valores pH ms frecuentes en orina fresca de personas sanas se encuentran entre 5 y 6. El test es especfico para la deteccin de iones hidronio, siendo el valor pH el logaritmo decimal negativo de la concentracin de iones hidronio. El papel reactivo contiene los indicadores rojo de metilo, fenolftalena y azul de

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bromotimol. Leucocitos: Comprueba la actividad estersica de granulocitos. Esta enzimas desdoblan un ster de indoxilo a indoxilo, que reacciona con una sal de diazonio formando un colorante violeta. se detectan leucocitos intacto y tambin los lisados (indicio de IVU) Nitrito: Los agentes patgenos ms frecuentemente causantes de infecciones de las vas urinarias, E. coli y la mayora de los grmenes patgenos urinarios, transforman el nitrato absorbido con la alimentacin en nitrito. Este es detectado por una coloracin del rosa al rojo de la zona reactiva. El ensayo se basa en el principio de la prueba de Griess y es especfico para el nitrito. (indicio de IVU) Protenas: El test se basa en el principio del error proteico de indicadores de pH y reacciona de manera especialmente sensible a la albmina. Glucosa: La deteccin de glucosa se efecta segn el mtodo especfico de la glucosa-oxidasa-peroxidasa. Cuerpos cetnicos: La deteccin se realiza en el principio de la prueba de legal y reacciona ms intensamente al cido acetilactico que a la acetona. Las cetonas son un subproducto del metabolismo de las grasas, presente con inanicin y diabetes. Urobilingeno: Es un producto de degradacin de la bilirrubina. El test se basa en que una sal de diazonio estable produce con el urobilingeno, casi instantneamente un colorante azico rojo Bilirrubina: En la orina es un producto de degradacin de la hemoglobina. La deteccin se basa en la copulacin de una sal de diazonio con bilirrubina para formar un colorante azoico. Incluso los ms leves matices rosa ya deben ser considerados como positivos. Hemoglobina: Es un indicio de hemlisis. La mioglobina cataliza la oxidacin del indicador por el hidroperxido orgnico contenido en el papel reactivo. Puntos verdes aislados hasta acumulados en la zona reactiva amarilla indican la presencia de eritrocitos intactos. La hemoglobina as como los eritrocitos hemolizados o la mioglobina son indicados por una coloracin verde homognea de la zona reactiva.

2. Mtodo para realizar el examen microscpico del sedimento urinario a. Una vez realizado el examen microscpico y qumico de la orina, se la centrifuga por 5-10 minutos a 1500-2000 rpm con la orina previamente homogenizada b. Eliminar cuidadosamente el sobrenadante. El volumen final utilizado para resuspender el sedimento puede variar segn el sistema estandarizado que se use, pero debe ser siempre constante en cualquier laboratorio dado. c. Resuspender con suavidad el sedimento, eliminar las dos primeras gotas y colocar la tercera gota en una placa portaobjetos, cubrir con un cubreobjetos. Dejar que la orina se deposite durante 30 a 60 segundos. d. Observar al microscopio con objetivos de pequeo y gran aumento. Para detectar algunas entidades del sedimento con un ndice bajo de refraccin ser necesaria una luz amortiguada o una iluminacin de contraste de fase. El foco fino debe variarse continuamente mientras se examina. Progresar de manera sistemtica a lo largo de toda la placa, teniendo cuidado de examinar los bordes en busca de cilindros.

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e. Recuento del nmero de cilindros por lo menos en 10 campos de pequeo aumento (10x) y anotar en el informe el nmero de cilindros por campo. Puede utilizarse un margen razonable, es decir, 0 a 2, 2 a 5, 5 a 10, etc. Usar el gran aumento (40x) para indicar el tipo de cilindros. Los cilindros se apreciarn si se utiliza microscopio de contraste de fase. f. Identificacin y recuento de los eritrocitos, leucocitos y clulas epiteliales renales utilizando el objetivo de gran aumento (40x). Efectuar el recuento por lo menos 10 campo de gran aumento y expresarlo como clulas por campo. En el informe puede utilizarse un margen razonable. g. Reportar: h. Las clulas epiteliales (bajas) y altas si estn presentes en gran nmero o como fragmentos (clulas transicionales) i. Bacterias, levaduras, microorganismos. Una bacteriuria detectable a pequeo aumento puede expresarse por lo menos como 2 +. j. Los cristales se cuantifican bajo pequeo aumento. La presencia de cristales anormales debe confirmarse qumicamentey correlacionarse con la historia del paciente k. Grandes cantidades de moco OBSERVACIN: Para el siguiente literal por favor revisar el atlas para segundo nivel ubicado en el internet cuya pgina es ftp.puce.edu.ec 2.1.Elementos que se observan en el examen microscpico: Las bacterias y otros microorganismos (normalmente no estn presentes) Cilindros urinarios Cristales Grasa Moco Glbulos rojos (un indicio de dao en los tbulos) Clulas tubulares renales Clulas epiteliales de transicin Glbulos blancos (un indicio de infeccin del tracto urinario)

3. PARTE EXPERIMENTAL PARA REALIZAR UN UROCULTIVO: 3.1. Siembra en agar Mc conkey (para identificacin de bacilos Gram negativo): 3.1.1. Sacamos el agar Mc conkey de la refrigeradora y esperamos a que adquiera la temperatura ambiente 3.1.2. Encendemos el mechero de bunsen, colocamos las asas y las muestras de orina cerca del mismo 3.1.3. Tomamos el asa calibrada la esterelizamos en el mechero y luego de enfriar metemos en la muestra de orina retirando los excesos en el borde del envase que contiene la orina 3.1.4. Tomamos el agar Mc conkey y realizamos la siembra estriando en cuatro direcciones alrededor de la caja (colocar el estudiante el grfico de forma de estriado en el informe) 3.1.5. Tapamos el agar y colocamos en la incubadora alrededor de 35- 37C y

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dejamos por 24 horas en la misma 3.1.6. Una vez transcurrido el tiempo de incubacin se realiza la lectura de la siembra y la interpretacin de la misma 3.2. Siembra en agar sangre (para cuantificacin de colonias bacterianas U.F.C./ml) 3.2.1. Sacamos el agar sangre de la refrigeradora y realizamos el mismo procemiento anterior hasta el literal 4.1.6, variando la tcnica de estriado 3.2.2. Para el contaje de las colonias que crecieron, contamos las mismas como U.F.C. (unidad formadora de colonias) en uno de los cuatro cuadrantes de la caja de agar sangre, multiplicamos por cuatro y obtenemos el U.F.C contenido en 0.001 ml que nos proporcion el asa calibrada a ese volumen, luego efectuamos una regla de tres, ejemplo: 350 U.F.C 0.001 ml X 1 ml X= 350.000 U.F.C./ml 3.2.3. El resultado obtenido se lo compara con los rangos de valores normales siguientes: Menos de 10.000 U:F:C/ml se considera contaminacin Entre 10.000 y 100.000 U.F.C./ml se considera sospecha de infeccin Mayor a 100.000 U.f.c./ml se considera infeccin B. Materiales y reactivos: Materiales Asas calibradas 0.001 ml Incubadora a temperatura 35-37 C Mechero de Bunsen Cajas petri Reactivos Agar Mc conkey Agar sangre Muestras de orina

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PRCTICA No. 8 TEMA: IDENTIFICACIN BIOQUMICA DE BACILOS GRAM NEGATIVOS (mirar atlas con el nmero de prctica correspondiente colocado en la pgina ftp.puce.edu.ec) A. Disponer a la temperatura ambiente en gradilla una serie doble de tubos de cultivo para reacciones bioqumicas. B. Resembrar del medio de cultivo que contiene las colonias de bacilos gramnegativos selecionadas como sospechosas a los medios para bioqumicas En los medios inclinados sembrar por estrias En los medios verticales sembrar por picadura En los medios lquidos sembrar por emulsin C. Etiquetar con los datos correspondientes. Llevar a la incubadora por 24 horas. D. Retirar las series de tubos con las reacciones bioqumicas. E. Interpretar las reacciones bioqumicas en cada uno de los tubos, de la siguiente manera. 1. ENSAYO DEL ROJO DE METILO I. Principio El test se usa para determinar la presencia de iones hidrgeno cuando un microorganismo fermenta glucosa. Todos los miembros de la familia Enterobacteriaceae convierten glucosa en cido pirvico por el camino de Embden-Meyerhof. Los organismos que metabolizan cido pirvico producen cido y bajan el pH a menos de 4.4. Los organismos que utilizan, en cambio, el camino del butilenglicol producen acetona y butanodiol (diacetilo). El indicador del medio, rojo de metilo, es rojo a pH < 5.0 y amarillo a pH > 5.8. El test es til para la diferenciacin de Escherichia coli (rojo metilo positivo) de Klebsiella (rojo metilo negativo). II. Procedimiento A. Con un asa estril tomar material e inocular un tubo con caldo RM/VP. B. Incubar a 35 C por un mnimo de 48 horas. C. Transferir 2.5 ml de la suspensin a un tubo. D. Agregar 5 gotas del indicador y observar si hay cambio de color. III. Resultados Ensayo positivo: el reactivo permanece rojo. Ensayo negativo: el reactivo se torna amarillo-naranja. Si el resultado es negativo continuar la incubacin de la bacteria por 24 horas ms. 2. ENSAYO DE VOGES-PROSKAUER I. Principio El piruvato es un intermediario en el metabolismo de la glucosa. A partir del cido pirvico un microorganismo puede seguir varios caminos. Algunos lo rompen para formar como productos finales cidos lctico, actico o frmico. Otros metabolizan el piruvato por el camino del butilenglicol para formar como productos finales acetona (acetilmetilcarbinol) y 2,3-butanodiol (diacetilo). El ensayo de VogesProskauer (VP) detecta estos productos metablicos. En presencia de oxgeno e KOH, la acetona se oxida a diacetilo, que da un complejo rojo. La sensibilidad del

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-naftol antes del agregado de KOH. II. Procedimiento A. Con un asa estril tomar material e inocular un tubo de caldo RM/VP B. Incubar a 37C por un mnimo de 48 horas C. Transferir 2.5 ml de la suspensin a otro tubo -naftol E. Agregar 0.2 ml del reactivo de KOH F. Agitar el tubo y dejar descansar 10 a 15 minutos G. Observar la formacin de un color rosado a rojo III. Resultados Ensayo positivo: desarrollo de color rojo dentro de los 15 minutos Ensayo negativo: no hay desarrollo de color 3. PRUEBA DE LA UREA I. Principio La urea es una diamida del cido carbnico, cuya hidrlisis por accin de la ureasa da 2 molculas de amonaco. La ureasa es una enzima constitutiva que se sintetiza independientemente de la presencia o no de la urea. La prueba determina la capacidad de la bacteria de desdoblar la urea, con la consiguiente alcalinizacin del medio. Es una actividad caracterstica de especies de Proteus y se usa para diferenciar Klebsiella (+) de Escherichia (-) y Proteus (+ rpido) de Providencia (); Yersinia pseudotuberculosis (+) de Yersinia pestis (-) II. Procedimiento A) Con un asa estril se toma abundante material y se inocula por puncin B) Se incuba a 37C y se efectan lecturas a las 2, 4, 6 y 18 horas. Los tubos negativos se observan diariamente por 4 a 7 das para detectar reacciones tardas que dan ciertos miembros de la familia, registrando los resultados da por da. III. Resultados Ensayo positivo: aparicin de color rojo en el medio por una alcalinizacin del mismo. Ensayo negativo: no hay cambio de color. 4. PRUEBA DEL SIM (H2S, indol, motilidad) Determinar si la bacteria a travs de Triptofanasas puede degradar el Triptfano a indol. Determinar si hay produccin de H2S a partir de aminocidos azufrados dando como resultado un color negro Determinar si la bacteria es mvil mediante la difuminacin de la misma hacia los lados, de lo contrario, la bacteria slo crece en la lnea de inoculacin I. Principio del Indol El indol es uno de los productos del metabolismo del aminocido triptofano. Con un medio rico en triptofano, el indol se puede detectar por su habilidad para combinarse con ciertos aldehidos para formar un compuesto coloreado. El ensayo constituye un mtodo rpido para detectar organismos productores de indol. Como

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indicador de la presencia del aldehdo se usa el reactivo de Erlich. Es especialmente til en la identificacin preliminar de Escherichia coli, y para diferenciar Edwardsiella (+)de Salmonella (-). II. Procedimiento 1) Con un asa tomar material de una colonia aislada e inocular el caldo que contiene triptofano. 2) Incubar a 37C por 18 a 24 horas. 3) Transferir 2 ml de la suspensin de caldo a un segundo tubo. 4) Agregar 5 gotas del reactivo de Erlich por la pared del tubo. 5) Agitar el tubo y observar un color rosado en la interfase entre el caldo y el reactivo. 6) Si el ensayo es negativo, el cultivo se debe reincubar otras 24 horas. III. Resultados Ensayo positivo: desarrollo de un color rojo en la interfase del reactivo y el caldo, segundos despus de agregar el reactivo. Ensayo negativo: no hay cambio de color o hay un color amarillo en la interfase.

5. AGAR KLIGLER I.Principio El agar de Kligler contiene dos azcares: lactosa (1%) y glucosa (0.1%). Si el microorganismo fermenta glucosa, tanto la puncin como la estra aparecern de color amarillo. Si el organismo fermenta lactosa y, la estra permanecer cida (amarilla). Si no fermenta lactosa, la estra se vuelve alcalina (roja). Los organismos que no fermentan glucosa no producen cambios en el pH del medio o producirn productos alcalinos y el medio permanecer rojo. La produccin de SH2 se manifiesta por un ennegrecimiento del medio. II. Resultados A. Estra cida/fondo cido (amarillo/amarillo): fermentacin de glucosa, lactosa (E. coli) B. Estra alcalina/fondo cido (rojo/amarillo): fermentacin de glucosa solamente (Shigella spp.) C. Estra alcalina/fondo alcalino (rojo/rojo): no fermentador (Pseudomonas aeruginosa) D. Precipitado negro en el fondo: produccin de SH2 (Salmonella spp) E. Burbujas o roturas: produccin de gas (E. coli, Salmonella spp.)

6. PRUEBA DE LA LISINA (CARBOXILASA-DIHIDROLASA) I. Principio La descarboxilacin es un proceso en el cual las decarboxilasas atacan el extremo carboxilo de los aminocidos, formando la correspondiente amina. La decarboxilacin de lisina da cadaverina (diaminas). Como la decarboxilacin es una reaccin anaerbica, se debe cubrir el medio con una capa de aceite mineral estril. El proceso ocurre en dos etapas: por fermentacin de la glucosa se produce una acidificacin del medio (pH < 6.0), apareciendo color amarillo. La

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acidificacin es necesaria para que ocurra la decarboxilacin. Este ltimo proceso de lugar a la formacin de las aminas que elevan el pH con el consiguiente viraje del indicador al color violeta. La prueba de la lisina ayuda en la diferenciacin de Edwardsiella (+), y Salmonella (+) de Citrobacter (-); de Enterobacter aerogenes (+) de Enterobacter cloacae (-) y Enterobacter agglomerans (-) II. Procedimiento A. Tomar material con un asa e inocular el tubo control y los tubos con los aminocidos B. Cubrir todos los tubos con una capa de vaselina estril. C. Incubar a 37C D. Efectuar las lecturas da por da hasta 4 das, registrando los resultados da por da III. Resultados Ensayo positivo: medio turbio y prpura a prpura amarillento Ensayo negativo: color amarillo Tubo control: permanece con su color original o se vuelve amarillo si el organismo es un fermentador de glucosa (se debe ver turbidez en el tubo) 7. PRUEBA DEL CITRATO I. Principio Es uno de los test del IMVIC (Indol, Rojo de metilo, Vogues-proskauer y Citrato) usado para diferenciar enterobacterias. Hay microorganismos capaces de utilizar el citrato como nica fuente de carbono produciendo alcalinidad, se detecta en un medio de cultivo con citrato como nica fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinizacin del medio Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6. Cuando el resultado es positivo el medio de cultivo se vuelve azul y cuando es negativo se mantiene verde. II. Procedimiento Se inocula el agar inclinado en una sola estra en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio slido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inculo. Incubar a 35C durante 4 das. El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estra, acompaado o no de un viraje del indicador al azul. III. Resultados (+)Klebsiella spp , ( - ) Escherichia Coli 8. FENILALANINA DESAMINASA Las desaminasas catalizan la prdida de NH3 en un aminocido originando un cido carboxlico. Las bacterias que desaminan la fenilalanina producen cido fenilpirvico que con Fe3Cl en solucin cida produce un color verdoso ( resultado positivo) y cuando es negativo es de color amarillo (reactivo es de color amarillo). 9. MALONATO El fundamento es igual al citrato, para ver si se utiliza al malonato como fuente de carbono.

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PRCTICA No. 9 TEMA: HECES FECALES. EXAMEN COPROPARASITARIO (ver pg. 33-41 del manual de prcticas Lab. Microbiologa del Dr. F. Prez y mirar atlas con el nmero de prctica correspondiente colocado en la pgina ftp.puce.edu.ec) 1. MARCO TERICO: 1.1.Parsitos NEMATODOS: Gusanos redondos Ascaris lumbricoides: Se observan huevos miden aprox. 45-75 x 30-50 mm, presenta una clula rodeada por tres capas, producen una patologa de dolor de estmago y desnutricin. Tricocfalo: El huevo mide de 50-55 x 22-25 mm Tiene la forma de baln de ftbol americano, produce anemia intensa, dolores abdominales, prolapso rectal ocasional. Uncinarias: Tienen una forma elptica, estn cubiertas de una membrana lisa, transparente y fina, mide de 60 - 40 x mm producen anemia. Strongyloides stercolaris: Se observan larvas. Produce diarrea, vmito, desnutricin. Enterobius vermiculares (Oxyurus):Los huevos son ovoides con una cara convexa y una plana, presenta una membrana interna y delicada y otra gruesa hialina y mamelonada, mide de 50-60 x 20-30 mm. Produce prurito en la regin perianal, insomnio, cambios de conducta. CESTODOS: Gusanos planos Taenia: Los huevos miden 20-30 x 30-40 mm, son ovoides con membrana gruesa, amarillenta que se encuentra estriada en forma de empalizada y encierra un embrin de seis ganchos poco visibles. Produce trastornos nerviosos. Hymenolepis nana : Huevos ovoides, mide aprox. 50 mm tiene una membrana interna y una externa, tambin puede causar trastornos nerviosos. PROTOZOARIOS: Amebas Entamoeba histoltica: Se observan quistes miden aprox. 20 mm se observa con cuatro ncleos. Pueden causar lesin de la mucosa intestinal. Entamoeba coli: Son quistes ms grandes que los de histoltica, tiene ms de cuatro ncleos. Es considerada como no patgena. Endolimax nana: Los quistes son ovalados miden de 6 - 10 mm presentan de uno a cuatro ncleos.

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Iodamoeba btschlii: Su quiste se caracteriza por la presencia de una vacuola de yodo, no es una ameba patgena. Gardia lamblia: Es una ameba en forma de pera simtricamente lateral, con un extremo ancho y redondeado, el quiste presenta cuatro ncleos y dos cuerpos parabasales, produce una diarrea amarillenta y vmito. TREMATODOS : Forma de hoja plana Fasciola heptica: Dao en hgado . quistes

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1.2.Rotavirus: Los rotavirus del grupo A constituyen la principal causa de gastroenteritis grave en nios de todo el mundo. Producen unos 125 millones de infecciones cada ao en los pases en desarrollo y son causa de 873.000 fallecimientos anuales . Tres protenas estructurales de rotavirus tienen gran importancia para clasificar a estos virus segn su antigenicidad. La protena VP6, que constituye la cpsida interna del virin, es responsable de la existencia de siete serogrupos (A-G). Las infecciones humanas son producidas principalmente por rotavirus del grupo A y, en menor medida, o con otras caractersticas epidemiolgicas, por los grupos B y C. El resto de grupos de rotavirus producen infecciones en los animales, aun cuando los del A infectan tambin algunas especies animales, adems del hombre. Los rotavirus humanos del grupo A se subdividen en dos subgrupos (I y II) en funcin de la especificidad de la VP6. PRCTICA No. 10 TEMA: HECES FECALES. Coprocultivo. Aislamiento de enterobacterias (ver pg. 42-43 del manual de prcticas Lab. Microbiologa del Dr. F. Prez y mirar atlas con el nmero de prctica correspondiente colocado en la pgina ftp.puce.edu.ec) AISLAMIENTO. 1. Sembrar una asada de materia fecal sospechosa en el tubo de caldo de tetrationato. Inocular con asa por emulsin. 2. De la misma manera sembrar otra asada de la misma muestra en el tubo de caldo nutritivo. 3. Etiquetar con los datos respectivos 4. Levar a la incubadora a 37C durante 24 horas. Colocar los tubos en gradilla, de tal manera que se mantengan en posicin vertical para evitar que el lquido se derrame.

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5. A las 24 horas retirar los tubos de la incubadora. 6. Disponer sobre la mesa el medio selectivo (agar entrico Hektoen) para resembrar el cultivo del caldo de tetrationato. 7. Resembrar en cada placa el inculo correspondiente 8. Tapar las placas. Etiquetar con los datos correspondientes 9. Llevar las placas a la incubadora. Colocarlas en posicin invertida. Mantenerlas durante 24 horas. 10. Al da siguiente: 11. Retirar las placas de la incubadora. 12. Efectuar anlisis macroscpico de cada una para valoracin de la prueba presuntiva 13. Efectuar anlisis microscpico por el mtodo de Gram de cada una de las placas para confirmacin de la morfologa de los bacilos entricos gramnegativos

PRCTICA No. 11 TEMA: INFECCIONES DE TRANSMISIN SEXUAL (ver pg. 48 del manual de prcticas Lab. Microbiologa del Dr. F. Prez y mirar atlas con el nmero de prctica correspondiente colocado en la pgina ftp.puce.edu.ec)

PRCTICA No. 12 TEMA: MICOSIS (ver pg. 52 del manual de prcticas Lab. Microbiologa del Dr. F. Prez y mirar atlas con el nmero de prctica correspondiente colocado en la pgina ftp.puce.edu.ec) PRCTICA No. 13 TEMA: TCNICAS BSICAS DE INMUNOLOGA (ver pg. 55 del manual de prcticas Lab. Microbiologa del Dr. F. Prez y mirar atlas con el nmero de prctica correspondiente colocado en la pgina ftp.puce.edu.ec) 24

Durante la prctica los estudiantes se realizarn voluntariamente pruebas de ASTO, VIH, y VDRL para poder observar la reaccin Ag-Ac. Estas pruebas tienen los siguientes fundamentos: VIH: La prueba VIH 1&2 es un inmunoensayo rpido de un solo uso basasdo en inmunocromatografa. Emplea reactivos nicos para la deteccin rpida y segura de anicuerpos a VIH1 y VIH2 en suero y plasma humano sin instrumental. Las protenas recombinantes que representan las regiones inmunodominantes de las protenas envoltura y gag de VIH-1 y VIH-2 son inmovilizadas en la regin de Prueba de la tira de nitrocelulosa y un agente bioqumico que reconoce anticuerpos humanos es dispersado en la regin de Control de la tira. Las protenas de VIH-1 y VIH-2, unidas a oro coloidal, son impreganadas por debajo de la regin de Prueba del dispositivo. Una banda estrecha de la membrana de nitrocelulosa es tambin sensibilizada como regin de control. Los complejos de anticuerpos de protena VIH-oro coloidal se desplazan por cromatografa a lo largo de la membrana nitrocelulosa hacia las regiones de pruebas. Se indica una reaccin positiva mediante la presencia de dos bandas de color (ver en la prctica). ASTO: Es una prueba rpida por el mtodo de aglutinacin utilizando partculas de ltex para la deteccin de anticuerpos anti-estreptolisina del grupo O (ASO) en suero humano. Los anticuerpos ASO son encontrados en el suero del paciente en respuesta a una infeccin con Streptococo hemoltico del grupo A, C o G (ver el mtodo de aglutinacin en el atlas).

PRCTICA No. 14 TEMA: INVESTIGACIN DE HEMATOZOARIOS (ver pg. 57 del manual de prcticas Lab. Microbiologa del Dr. F. Prez y mirar atlas con el nmero de prctica correspondiente colocado en la pgina ftp.puce.edu.ec)

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