Curso de Mestrado em Cincias Odontolgicas

ALEXANDRE MELO KARAM

OZONIOTERAPIA NA REPARAO TECIDUAL DE FERIDAS INDUZIDAS EM PELE DE RATOS

BARRETOS 2012

Curso de Mestrado em Cincias Odontolgicas

OZONIOTERAPIA NA REPARAO TECIDUAL DE FERIDAS INDUZIDAS EM PELE DE RATOS

Dissertao apresentada ao Curso de Mestrado em Cincias da Odontolgicas Fundao do Centro de Universitrio Educacional

Barretos, como parte dos requisitos para obteno do Ttulo de Mestre em Cincias Odontolgicas, na rea de Implantodontia Orientadora: Profa. Dra. Juliana Rico Pires Co-Orientadores: Prof. Dr. Valdir Gouveia Garcia Profa. Dra. Elizngela Partata Zuza

BARRETOS 2012

Karam, Alexandre Melo. Ozonioterapia na reparao tecidual de feridas induzidas em pele de ratos / Alexandre Melo Karam. Barretos: [s.n.], 2012. 59 f.; 30 cm. Dissertao (Mestrado) Educacional de Barretos, Odontolgicas Centro Universitrio da Fundao Curso de Mestrado em Cincias

Orientadora: Profa. Dra. Juliana Rico Pires 1. Ozonioterapia 2. Terapia bio-oxidativa 3. Oznio 4. Ratos 5. Reparao tecidual 6. Pele de ratos I. Ttulo.

DADOS CURRICULARES
ALEXANDRE MELO KARAM

Nascimento Filiao

15 de outubro de 1974, em Salvador/BA - Brasil Alfredo Augusto Karam Maria Jos Melo Karam

1993/1999

Curso de Odontologia da Universidade Estadual de Feira de Santana BA.

2007/2009

Curso de especializao em Periodontia do Centro Baiano de Estudos Odontolgicos - CEBEO BA.

2010/2012

Curso de Mestrado em Cincias Odontolgicas do Centro Universitrio da Fundao Educacional de Barretos, rea de concentrao - Implantodontia.

DEDICATRIA
A Deus, Sobre todas as coisas, sobre todos ns, dedico este trabalho. Que ele possa de alguma forma, ajudar a odontologia e a medicina a desvendar um pouco dos mistrios que guarda para a humanidade em sua infinita sabedoria e bondade.

Aos meus pais, Maria Jos e Alfredo Karam que me deram o dom da vida e a oportunidade de estudo, fazendo possvel minha realizao profissional com dignidade e honestidade.

A minha esposa, Luciana Karam, amor da minha vida. Com admirao, agradeo por sua compreenso, carinho, presena e incondicional apoio ao longo do perodo da elaborao deste trabalho, sendo fundamental para sua concluso.

Ao meu filho, Arthur Karam pelos dias de renncia e compreenso, quando das minhas ausncias nas viagens a Barretos, das horas dedicadas pesquisa em dentrimento das nossas brincadeiras e lutas pueris, sendo sempre a alegria e a razo do meu viver. Ao meus sogros, Vera e Luciano, que muito nos apoiaram e continuam nos apoiando no nosso regresso de Portugal.

"A todos Aqueles que atravancam o meu caminho... Eles passaro. Eu passarinho!" Mrio Quintana (Adaptado)

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
"Se de cada minuto, os sessenta segundos, tu puderes tornar com o teu suor

fecundos... A Terra ento ser tua, e os bens que se no somem, e o que melhor, meu filho, ento sers Homem!".
Rudyard Kipling minha orientadora, Prof. Dr Juliana Rico Pires, que com sua brilhante capacidade profissional, inteligncia e conhecimentos profundos transformou meu rude e tosco projeto numa obra laboriasamente vicejante. Com sua infinita afabilidade sempre agradecia minha colaborao, quando na verdade a gratido era toda minha.

Ao coordenador do Mestrado em Barretos, Prof. Dr. Benedicto Eghbert Corra de Toledo, que com sua compreenso ateno e apoio, tornou possvel a realizao de mais uma etapa acadmica. Muito Obrigado!

coordenadora do Mestrado em Salvador, Prof. Dr Letcia Helena Theodoro, que com sua experincia nos orientou, com sua pacincia e cordialidade soube habilidosamente nos conduzir no caminho do saber e nos deu ferramentas valiosssimas para nossa atual conquista, ferramentas essas que nortearo tantos outros passos que viro.

Ao Mestre querido e amigo, Prof. Dr. Valdir Gouveia Garcia, pela dedicao e sabedoria, pelos incentivos pesquisa, pelos conhecimentos profundos e experincia em tcnicas de laboratrio e pela inestimvel contribuio no experimento desse trabalho que, sem o mesmo, ao final no chegaramos.

 Mestre querida e amiga, Prof. Dr. Ana Emlia Faria Pontes, pela expressiva e marcante contribuio em nossa formao, pela inestimvel contribuio nas anlises estatsticas desse trabalho.

Ao Mestre querido e amigo, Prof. Dr. Celso Eduardo Sakakura, pelas exaustivas viagens a Salvador; por muitas vezes pegar na mo nos momentos mais difceis das cirurgias nos ambulatrios.

Ao Mestre querido e mais novo amigo, Prof. Dr. Cleverton Roberto de Andrade pela sua inestimvel contribuio para o desenvolvimento deste trabalho, junto s anlises histopatlgicas, cujo conhecimento muito enriqueceu nossos resultados.

secretria do Departamento de Coordenao de Ps-Graduao do UNIFEB Sr Snia Augusto que com sua dedicao e pacincia nos acolheu em Barretos e de tudo fez para que o transcorrer do curso fosse o mais proveitoso possvel.

Ao comandante do biotrio do UNIFEB, Senhor Darcy, que com a benevolncia de um pai me acolheu em seu recinto e tratou com a mxima ateno a prole do nosso estudo.

AGRADECIMENTOS

Ao Reitor do Centro Universitrio da Fundao Educacional de Barretos Prof. Dr. Reginaldo da Silva, Pr-Reitora de Graduao Profa. Dra. Sissi Kawai Marcos e Pr-Reitora de Ps-Graduao e Pesquisa Profa. Dra. Fernanda Scarmato de Rosa.

A todos os demais Professores do Programa de Ps-Graduao em Cincias Odontolgicas: Elcio Marcantonio Jr., Elizangela Partata Zuza, Fernando Salimon Ribeiro, Alex Tadeu Martins.

A todos os colegas da ps- graduao, pelo apoio que demos uns aos outros, durante todo perodo que estivemos juntos, tornando essa jornada muito mais agradvel. Sucesso e felicidades a todos!

A todos os Funcionrios da Clnica de Odontologia do CEBEO-BA, que por estarem sempre presentes e disposio, proporcionaram na clnica um aprendizado muito mais eficiente.

A todos, Que de alguma maneira, contriburam para o resultado final deste trabalho.

SUMRIO

RESUMO ................................................................................................................ 8 ABSTRACT............................................................................................................ 9 1 INTRODUO ................................................................................................. 10 2 OBJETIVO......................................................................................................... 13 3 METODOLOGIA .............................................................................................. 14 4 RESULTADOS.................................................................................................. 23 5 DISCUSSO ..................................................................................................... 35 6 CONCLUSO ................................................................................................... 40 7 REFERNCIAS................................................................................................. 41 8 ANEXOS ........................................................................................................... 46

RESUMO Karam, A. M. Ozonioterapia na reparao tecidual de feridas induzidas em pele de ratos. [Dissertao de Mestrado]. Barretos: Curso de Mestrado em Cincias Odontolgicas do UNIFEB; 2012. A literatura tem destacado a utilizao da oxignio-ozonioterapia como terapia coadjuvante em situaes mdicas de necroses isqumicas, spticas e avasculares. At o momento, em revista da literatura, no foi encontrado algum trabalho que avaliasse os efeitos sistmicos da utilizao desta terapia em reparao tecidual. Dessa forma, o presente estudo indito teve por finalidade avaliar os efeitos da terapia bio-oxidativa com gs oznio, na cicatrizao de ferida de pele em ratos. Para tanto, 30 ratos Wistar machos foram submetidos leso tecidual (1,0cm) na pele do dorso (baseline). Logo aps a induo da ferida, os animais foram aleatoriamente divididos em dois grupos de 15 animais, sendo o grupo I constitudo de animais que receberam simulao da aplicao do gs oznio (controle) e o grupo II- constitudo de animais que receberam tratamento com gs oznio (teste). Os animais foram eutanasiados aos 7 e 15 dias aps baseline, amostras da regio lesionada foram removidas, fixadas em formol e submetidas analise macroscpica, histomorfolgica e histomtrica. Os resultados deste ensaio randomizado mostraram que os grupos tratados com oznio (grupo II) apresentaram inflamao mista aos 7 dias, transladando para ausncia de inflamao no 15 dia, enquanto o grupo controle (grupo I) exibiu inflamao aguda no 7 dia, transladando para inflamao crnica que aumentou significativamente do 7 para o 15 dia. No 7. dia, o grupo II apresentou contrao da ferida de forma estatisticamente maior, se comparado ao grupo I (ANOVA- Bonferroni). O grupo II apresentou maior grau de neo-vascularizao que o grupo I (Kruskal-Wallis). No 15 dia, os dois grupos (I e II) apresentaram re-epitelizao completa, entretanto, o grupo II apresentou completa regenerao muscular e alta proliferao de anexos cutneos. Concluiu-se que a terapia bio-oxidativa com gs oznio apresentou efeito bio-estimulador, aumentando a reparao e regenerao tecidual em pele de ratos.

Palavras-chave: ozonioterapia; terapia bio-oxidativa; oznio; ratos; reparao tecidual; pele de ratos.

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ABSTRACT Karam, A. M. Ozone therapy in the healing of wounds induced in rat skin [Dissertao de Mestrado]. Barretos: Curso de Mestrado em Cincias Odontolgicas do UNIFEB; 2012. Literature has emphasized oxygen-ozone therapy as adjuvant treatment in medical situations of ischemic, septic and avascular necrosis. The literature review hasnt found any study about the sistemic effects of this therapy in tecidual reparation yet. The object of this inedited study was evaluate the effects of bio-oxidative therapy with ozone gas in cutaneous wounds made in rat skin. Therefore, 30 male Wistar rats were subjected to tissue injury (1.0 cm) in the dorsum skin (baseline). Immediately after wound induction, animals were randomly divided into two groups of 15, group I consisting of those which received sham application of ozone gas (control) and the group II consisting of rats that were treated with ozone gas. The animals were euthanized at 7 and 15 days after baseline, samples of the injured area were removed, fixed in formalin and submitted to macroscopic, histologic and histometric analysis.The results of this randomized trial showed that the group treated with ozone (group II) showed mixed inflammation at 7 days, moving to absence of inflammation at day 15, while the control group (group I) exhibited acute inflammation on day 7, moving to chronic inflammation that significantly increased from 7th to 15th day. On the 7th day, group II had statistically higher wound contraction when compared to group I (ANOVABonferroni). Group II had a higher neo-vascularization degree than group I (Kruskal-Wallis). On day 15, the two groups (I and II) showed complete reepithelialization, however, group II showed complete muscle regeneration and higher proliferation of skin appendages. The study concluded that bio-oxidation treatment with ozone gas provided bio-stimulator effect, enhancing tissue repair and regeneration in rat skin. Key-words: ozonetherapy, bio-oxidative therapy, ozone, rats, tissue repair, rats skin.

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PREFCIO O presente estudo parte de um projeto inserido na linha de pesquisa Teraputica da Doena Periodontal, a qual objetiva o desenvolvimento e/ou avaliao de modalidades teraputicas empregadas no tratamento da doena periodontal ou peri-implantar. Dessa forma, estudos preliminares, incluindo estudo das tcnicas, dosagens e efeito reparador tecidual do gs oznio so imprescindveis para possibilitar a aplicao desta terapia na odontologia, particularmente na periodontia e implantodontia, em cujas temticas esto inseridas no programa de mestrado do UNIFEB.

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1 INTRODUO A Oxignio-ozonioterapia uma terapia bio-oxidativa que tem como base a utilizao da mistura gasosa de oxignio e oznio medicinais (Bocci, 2006). Dentre os seus efeitos teraputicos, tem sido associado com melhora do metabolismo e da oxigenao tecidual perifrica (Bocci, 2006). Sua primeira aplicao em medicina, que se tem notcia, foi a utilizao do oznio gasoso para tratamento de gangrena ps-traumtica em soldados alemes, durante a primeira grande guerra mundial (Bocci 2004). A aplicao do oznio foi reconhecida como modalidade teraputica no tratamento de patologias oculares, ortopdicas, dermatolgicas, pulmonares, renais, hematolgicas (Bocci, 2004; Baysan, Lynch, 2005) e no tratamento de infeces virais (Emerson et al., 1982; Wells et al., 1991), fngicas (Shargawi et al., 1999; Lpez et al., 2003) e bacterianas agudas e crnicas (Velano et al., 2001; Estrela et al., 2006; Cardoso et al., 2008). Estudos (Guerra et al., 1997; Bocci, 2006) relatam algumas vias de administrao do oznio, tais como auto-hemoterapia, insuflao retal, bolsa hermtica de oznio (bagging) e aplicaes tpicas por meio de gua e do leo ozonizados. A ozonioterapia, realizada por meio de insuflao retal de mistura gasosa de oxignio-oznio, diferentemente do que acontece com a mucosa respiratria, que possui uma fina camada de fluidos ricos em cidos graxos

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poliinsaturados, encontra na mucosa intestinal o glicoclix e uma espessa cobertura de gua contendo mucoprotenas e outras secrees com alta capacidade anti-oxidante. Alm desta mucosa, h uma grande variedade de contedo fecal que pode minimizar a atividade oxidante do oznio (Bocci, 2006). Existem duas vias de metabolizao do oznio, a primeira consiste na reduo do oznio pelos sistemas anti-oxidantes do organismo (cido ascrbico, catalase, glutationa peroxidase, vitaminas A e E) levando produo de espcies reativas de oxignio (ROS), as quais desencadeiam vias metablicas no sangue (Bocci, Aldinucci, 2006). Na segunda via, os compostos hidrofbicos presentes no sangue (cido aracdnico, quilomcrons) reagem com o oznio, produzindo produtos de oxidao lipdica (LOPS), os quais desencadearo reaes em cascata, ativando fatores angiognicos, imunolgicos, sanguneos e neurolgicos (Bocci, Aldinucci, 2006). ROS e LOPS levam o plasma a evento de pico de estresse oxidativo, ocasionando dissociao da oxi-hemoglobina e aumentando a distribuio de oxignio para os tecidos isqumicos (Bocci, 2006), provavelmente pelo aumento da expresso do 2,3-DPG (2,3 difosfoglicetaro) ou por efeito Bohr, alm de acelerar eventos de gliclise, com aumento da biodisponibilidade de ATPs no organismo. Algumas teorias sugerem que a oxidao do gs sobre as cadeias cidolipdicas da parede bacteriana leva morte dos microrganismos (Dahnhardt et al., 2006). Aps sua difuso no interior da clula, o gs oznio oxida aminocidos e cidos nuclicos (Velano et al., 2001), impedindo replicao

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celular e levando desnaturao e morte do microrganismo (Emerson et al., 1981; Wells et al., 1991). Estudos tm mostrado que a terapia bio-oxidativa com gs oznio biocompatvel, atua no processo de metabolismo mediado por oxignio, no processo de clcio, fsforo e metabolismo frreo (Bocci, 1999; Baysan et al, 2000; Vannucchi et al., 2005), alm de apresentar ao germicida, analgsica (Agrillo et al., 2007) e reparativa (Huth et al., 2006; Agrillo et al., 2007). Adicionalmente, estudos (Agrillo et al., 2006; Agrillo et al., 2007) tem demonstrado a utilizao de ozonioterapia em associao com procedimentos cirrgicos em pacientes que fazem uso de bifosfonatos, com intuito de prevenir e/ ou evitar o surgimento de osteonecrose. Alm disso, a ozonioterapia tem sido indicada para tratamento de osteorradionecrose (Stubinger et al., 2006) e reparao de defeitos sseos (Agrillo et al., 2006). Estudos tm demonstrado que o oznio veiculado atravs do azeite de oliva possui propriedades reparadoras (Kim et al., 2009), com aumento de expresso de mediadores inflamatrios, tais como fator de crescimendo derivado de plaquetas (PDGF), fator transformador de crescimento beta (TGF-) e fator de crescimento vascular (GVF). Outros estudos, realizados in vitro, atravs de exposies de culturas de clulas epiteliais demonstraram que exposies curtas e repetidas ao estresse oxidativo com oznio melhoram a plasticidade celular atravs da induo de vias anti-apoptticas como resposta adaptativa celular ao estresse sofrido (Brink et al., 2008).

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Apesar de Oliveira (2007), em uma reviso sistemtica sobre a utilizao teraputica do gs oznio em feridas concluir que no h na literatura estudos controlados e randomizados de qualidade sobre o assunto, todos os estudos analisados apontaram resultados favorveis utilizao do gs oznio em feridas. Dessa forma, acredita-se que a terapia bio-oxidativa com gs oznio pode favorecer e acelerar o processo de angiognese e de reparao tecidual. Este trabalho inicial indito foi realizado com o objetivo principal de avaliar os efeitos da terapia com oznio, por insuflao retal, portanto com o uso do gs para efeitos sistmicos sobre o processo de reparao tecidual.

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2 OBJETIVO O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos da terapia biooxidativa com gs oznio, na reparao tecidual de ferida induzida em pele de ratos.

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3 METODOLOGIA O presente estudo foi desenvolvido no laboratrio experimental do Departamento de Mestrado em Cincias Odontolgicas rea de Periodontia e Implantodontia do Centro Universitrio da Fundao Educacional de Barretos UNIFEB, aps aprovao da Comisso de tica no Uso de Animal (CEUA) da Faculdade de Odontologia de Araatuba UNESP (02048/2011) Anexo 1.

3.1 Animais No presente trabalho foram utilizados 24 ratos Wistar machos, pesando entre 250 e 275g. Os animais foram mantidos em gaiolas plsticas, separados de acordo com o grupo experimental, contendo cinco ratos em cada caixa, em sala com temperatura ambiente controlada entre 20-22C, e com umidade relativa entre 50-52%, com ciclos de luz-escuro de 12 horas e, alimentados com rao normal de origem industrial (Purina Labina) e gua ad libitum.

3.2. Desenho experimental Os ratos foram divididos aleatoriamente em dois grupos com 12 animais cada: I Simulao da ozonioterapia (Grupo Controle) e II Tratamento com ozonioterapia (Grupo Teste). Cada grupo sofreu no dia zero (baseline) do estudo, uma inciso circular de 1,0cm de dimetro no dorso do animal, por meio de utilizao do punch metlico cortante. Os animais do grupo II iniciaram o

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processo de terapia bio-oxidativa com oznio, imediatamente aps a leso da pele. Para o grupo I foram realizadas simulaes dos procedimentos necessrios aplicao do oznio. Durante os demais perodos do experimento, nas semanas subseqentes, foi mantida a terapia bio-oxidativa, sempre realizada 2 vezes por semana. Seis animais de cada grupo foram sacrificados por meio de eutansia nos perodos experimentais de 7 e 15 dias. Logo aps a eutansia, foi realizada anlise macroscpica do tamanho e caractersticas clnicas da ferida. Posteriormente, a pele dos animais foi removida, as quais foram fixadas em formol tamponado a 4%, para posterior anlise histolgica dos espcimes de cada animal.

3.3. Induo da ferida Os animais tiveram a rao suspensa por quatro horas antes dos procedimentos cirrgicos, porm permaneceram com acesso gua ad libitum. Os procedimentos anestsicos foram realizados em todos os animais da mesma forma, colocando-os em campnula de plstico fechada com algodo hidrfilo umedecido com ter etlico, at atingir o nvel de anestesia, com nenhum movimento da cabea, extremidades ou tronco, desaparecimento dos reflexos palpebrais e ritmo respiratrio constante. Aps anestesiados, todos submeteram-se ao mesmo procedimento operatrio que consistiu inicialmente na epilao por trao manual dos plos do dorso com extenso de 6cm no comprimento e 4cm na largura, caudalmente a uma linha imaginria que passasse na borda inferior das orelhas. A seguir foi realizada inciso circular de 1cm de dimetro no centro da

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rea epilada, com um punch metlico cortante, restringindo-se derme e epiderme (Figura 1).

3.4. Ozonioterapia A dose de oznio utilizada foi representada pela concentrao de O3 (expressada por mg/L) pelo volume(L) de gs (O2-O3), sendo considerada a concentrao de 3%. Dessa forma, uma mistura gasosa O2-O3 na concentrao de 50g de oznio, foi obtida de gerador de oznio medicinal Philozon, que produz oznio apartir de oxignio medicinal, com fluxo constante de 1L/min. A concentrao do oznio foi medida com preciso por meio de um espectofotmetro com 254nm. Imediatamente aps obteno da mistura gasosa, que foi colhida por intermdio de seringa plstica tipo Luer siliconizada, esta foi administrada por insuflao retal, por meio de utilizao de catter de Nelaton n 8, o qual foi inserido 6,0cm no reto do animal, seguindo a metodologia de Fernndez et al (2008). O protocolo com Ozonioterapia foi constitudo de insuflao retal de uma mistura gasosa de O2-O3 na concentrao de 50g/mL, totalizando o volume de 4,0-5,0mL por sesso (Figura 2).

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Figura 1. Ferida de pele induzida (1cm ou 10mm)

Figura 2. Tcnica de insuflao retal de uma mistura gasosa de O2-O3

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3.5. Eutansia Os perodos de eutansia dos animais foram de 7 e 15 dias aps o baseline, perodos estes em que 6 animais de cada grupo foram eutanasiados por meio de superdosagem anestsica (Tiopental 150 mg/Kg) (Cristalia, produtos qumicos Farmacuticos LTDA, Itapira, So Paulo, Brasil). 3.6. Avaliao macroscpica Aps a morte, os animais foram fixados prancha cirrgica, do mesmo modo que no ato operatrio, e tiveram as feridas examinadas com auxlio de lupa com 2,5 vezes de aumento para verificao de crostas, secrees, cicatrizes hipertrficas e o tamanho da ferida residual no maior eixo, medidas com sonda periodontal milimetrada (PCPN115BR, Hu-Friedy, Chicago, IL). Nesse tempo, os achados foram anotados em ficha e foi feito o registro fotogrfico com cmera digital com zoom de 1,3 de aproximao fixada em trip. A medida do maior dimetro foi determinada usando uma sonda periodontal milimetrada. Aps este procedimento, a rea da pesquisa foi retirada com margem de 1cm de pele em torno da leso. Todos os espcimes foram fixados em soluo de paraformaldedo a 4% por 48 horas e encaminhados para processamento laboratorial.

3.7. Avaliao histolgica Todos os espcimes foram fixados em soluo de paraformaldedo a 4% por 48 horas. Em seguida, os espcimes foram embebidos em parafina. A partir de ento, o bloco obtido foi cortado com intuito de obter vrios espcimes com 4 m em espessura. Os cortes histolgicos escolhidos foram da parte central e

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representativa da leso que foram corados com hematoxilina eosina (H.E.) e Tricmico de Masson (T.M.); este ltimo usado para colorao especfica de colgeno. Os espcimes foram destinados para anlise histolgica descritiva por meio de microscopia de luz convencional e anlise histomtrica. De cada ferida foram obtidas seis lminas que foram avaliadas quanto presena de vasos sanguneos na rea de cicatrizao, bem como, re-epitelizao, proliferao de colgeno, presena de fibroblastos, leuccitos mono e polimorfonucleares. A anlise histolgica foi realizada por dois examinados previamente treinados e calibrados, cegos para os grupos de estudo, em dois momentos distintos cada. Foi realizada anlise qualitativa e quantitativa segundo os escores descritos abaixo: Contrao da Ferida (CO): 0 ausente; 1 incio (1/3 do tamanho inicial); 2 metade (2/3 do tamanho inicial); 3 completa (3/3 do tamanho fechamento absoluto), considerando o fechamento da ferida pelo tecido conjuntivo. Re-epitelizao (RE): 0 ausente; 1 incio (1/3 do tamanho inicial); 2 metade (2/3 do tamanho inicial); 3 completa (3/3 do tamanho fechamento absoluto), considerando o fechamento da ferida pelo tecido epitelial. Inflamao Aguda (IA): 0 ausente; 1 leve; 2 moderada; 3 intensa, considerando o tipo celular predominante.

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Inflamao Crnica (IC): 0 ausente; 1 leve; 2 moderada; 3 intensa, considerando o tipo celular predominante. Inflamao Mista (IM): 0 ausente; 1 leve; 2 moderada; 3 intensa, considerando o tipo celular predominante. Edema (E): 0 ausente; 1 leve; 2 moderada; 3 intenso, considerando a presena de lquido eosinoflico entre as clulas. Hemorragia (H): 0 ausente; 1 pouca; 2 moderada; 3 intensa, considerando a presena de extravasamento sanguneo no tecido conjuntivo. Vasos (V): 0 ausente; 1 pouco; 2 moderado; 3 intenso, considerando o nmero de vasos. Membrana fibrino purulenta (MFP): 0 ausente; 1 fina; 2 mdia; 3 larga, considerando a espessura da membrana. Anexos Cutneos (AC): 0 ausente; 1 pouco; 2 moderado; 3 intenso, considerando o nmero de anexos, na regio superior e inferior do tecido conjuntivo.

3.8. Avaliao Histomtrica Esta anlise foi realizada com auxlio do programa Leica Application Suite 3.8.0 (Leica Microsystems LTD, Heerburg, Alemanha). As medidas foram realizadas na regio de tecido conjuntivo, considerando a rea de contrao da ferida. Para determinao desta rea de interesse, inicialmente foi estabelecido um traado linear estendendo-se do tecido epitelial ao tecido muscular, na direo das

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fibras musculares incisadas, por meio do punch. A partir desta delimitao foi realizada a mensurao das reas de contrao do tecido conjuntivo em direo ao centro da ferida. A mensurao das reas de contrao da ferida foi realizada em triplicata, com intervalo de uma semana de cada avaliao e por dois examinadores previamente treinados e cegos para o grupo de anlise (Figuras 3 e 4). Para obteno das imagens panormicas das leses, foram tiradas 4 a 8 fotos da amostra com aumento de 4x, sendo que cada foto apresentava em sua extremidade, reas coincidentes s imagens contguas. Utilizando um programa analisador de imagens foi possvel unir as imagens atravs de costura digital, por intermdio de sobreposio dos pixels coincidentes.

3.9. Anlise Estatstica A anlise estatstica foi desenvolvida por meio de um programa especfico (BioEstat 5.0, Sociedade Civil Mamirau / MCT CNPq, Belm, Brasil), considerando a hiptese nula baseada na ausncia de diferena entre as modalidades de tratamento ( = 5%). A unidade de anlise foi o animal. A anlise conjunta dos efeitos do dia (7 e 15) e do grupo (controle e teste) de varivel numrica (rea cirrgica) foi feita pelo teste de ANOVA, seguida pelo teste Bonferroni. As variveis da avaliao histolgica dos dados categricos foram analisadas pelo teste Kruskal-Wallis. O nvel de significncia, utilizado para se rejeitar a hiptese de nulidade foi de 5% (p<0,05).

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Figura 3. Delimitao da rea de contrao do tecido conjuntivo das bordas da ferida, colorao T.M. (Foto panormica 4x)

Figura 4. Mensurao da rea de contrao do tecido conjuntivo, colorao T.M. (20x)

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4 RESULTADOS

4.1. Anlise Macroscpica Desconsiderando a presena de pelos, na anlise do tamanho da ferida residual, pode-se observar que os animais do grupo controle (I) apresentavam aos 7 dias de reparao, um tamanho mdio de 9 (0,5) mm, enquanto o grupo teste (II), o tamanho mdio foi de 7 (0,5) mm (Figuras 5 e 6). Analisando a ferida residual em 15 dias de reparao tecidual, pode-se observar que o grupo controle (I) apresentava tamanho mdio de 3 (0,5) mm e o grupo teste (II) apresentava completa reparao tecidual (Figuras 7 e 8). Nenhum dos grupos apresentou cicatrizes hipertrficas, nem secrees purulentas, entretanto, no 3. dia, os animais do grupo controle apresentaram ferida com aspecto cruento enquanto os animais do grupo teste, apresentaram crostas cicatriciais maiores se comparadas aos do grupo controle.

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Figura 5: Medio da ferida residual no dia 7 do grupo I

Figura 6: Medio da ferida residual no dia 7 do grupo II

Figura 7: Medio da ferida residual no dia 15 do grupo I

Figura 8: Medio da ferida residual no dia 15 do grupo II

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Figura 9: Corte histolgico da ferida aps 7 dias de reparao tecidual no grupo I (controle), colorao T.M. (Foto Panormica 4x)

Figura 10: Corte histolgico da ferida aps 15 dias de reparao tecidual no grupo I (controle), colorao T.M.

Figura 11: Corte histolgico da ferida aps 7 dias de reparao tecidual no grupo II (teste), colorao T.M.

Figura 12: Corte histolgico da ferida aps 15 dias de reparao tecidual no grupo II (teste), colorao T.M.

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Nos animais do grupo I (controle) no 7 dia de reparao da ferida, o tecido conjuntivo apresentava poucos vasos, pouca hemorragia e edema intersticial moderado. O processo inflamatrio apresentava carter agudo intenso na poro mais coronal da leso, com predomnio de neutrfilos, enquanto na poro inferior, apresentava caracterstica de inflamao mista moderada com predomnio de macrfagos e linfcitos. A membrana fibrino-purulenta apresentava-se com espessura larga e contaminada (Figuras 13, 14, 15 e 16). No 15. dia, o grupo I (controle) apresentava um processo inflamatrio misto na poro inferior do tecido em grau leve, com predomnio de linfcitos. (Figuras 17 e 18). No grupo II (teste) no 7. dia de cicatrizao, o tecido conjuntivo apresentava vasos em quantidade moderada, pouca hemorragia e edema intersticial moderado. O processo inflamatrio apresentava carter agudo moderado na poro mais coronal da leso, com predomnio de neutrfilos, enquanto na poro inferior, apresentava caracterstica de inflamao mista moderada com predomnio de macrfagos e linfcitos (Figuras 19, 20 e 21). No 15. dia, o grupo II (teste) apresentava ausncia de processo inflamatrio, regenerao muscular completa, intensa formao de folculos pilosos e tecido conjuntivo denso (Figuras 22, 23 e 24).

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Figura 13: Grupo I no 7. dia, interface do corte, membrana fibrino-purulenta espessa, colorao H.E. (4,0x)

Figura 14: Grupo I no 7. dia, infiltrado inflamatrio intenso, colorao H.E. (20x)

Figura 15: Grupo I no 7. dia, membrana fibrino-purulenta, intenso infiltrado de neutrfilos, colorao H.E. (40x)

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Figura 16: Grupo I no 7. dia, processo inflamatrio misto moderado, contendo macrfagos, linfcitos, vasos e edema, colorao H.E. (40x)

Figura 17: Grupo I no 15. dia, interface do corte, colorao H.E. (3,2x)

Figura 18: Grupo I no 15. dia, re-epitelizao completa, processo inflamatrio misto leve, colorao H.E. (20x)

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Figura 19: Grupo II no 7. dia, interface do corte, membrana fibrino-purulenta fina, colorao H.E. (3,2x)

Figura 20: Grupo II no 7. dia, processo inflamatrio misto moderado, contendo predomnio de macrfagos e linfcitos, colorao H.E. (20x)

Figura 21: Grupo II no 7. dia, processo inflamatrio misto moderado e novos vasos, colorao H.E. (40x)

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Figura 22: Grupo II no 15. dia, interface do corte, re-epitelizao completa, colorao H.E. (3,2x)

Figura 23: Grupo II no 15. dia, regenerao muscular completa, colorao H.E. (20x)

Figura 25: Grupo II no 15. dia, folculos pilosos formados, tecido conjuntivo denso, colorao H.E. (40x)

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Anlise Quantitativa Conforme os dados da tabela 1, ambos os grupos (I e II) apresentaram aumento significantemente dos escores de contrao da ferida (p<0,0001) e de reepitelizao (p=0,0001) com o passar do tempo (7 dias versus 15 dias). No perodo de 7 dias, a hemorragia no Grupo I foi significantemente maior, que no Grupo II (p=0,01), enquanto, o grupo II apresentou maior escore de vasos, em comparao com o grupo I (p=0,002). Com o passar do tempo de reparao tecidual (7 dias versus 15 dias), o grupo II apresentou aumento significante quanto regenerao muscular (p=0,0006) e quanto presena de folculos pilosos (p=0,0002). O grupo I (controle) apresentou reduo significante da inflamao aguda (p=0,01) e aumento significante da inflamao crnica (p=0,002) ao longo do perodo experimental (7 dias versus 15 dias). O grupo II apresentou inflamao significativamente mista no 7 dia que reduziu significantemente ao longo do perodo experimental (7 dias versus 15 dias) (p=0,01) para total ausncia de inflamao. A inflamao aguda no Grupo I foi estatisticamente maior que no Grupo II ao incio do perodo experimental (aos 7 dias) (p = 0,01). Ao final do perodo experimental (15 dias), a inflamao crnica foi significantemente maior no grupo I em comparao com o grupo II (p = 0,01). Nos perodos iniciais do processo de reparao tecidual (7 dias), o grupo I apresentou uma tendncia maior em apresentar membrana fibrinopurulenta mais espessa (escore 3), se comparada ao grupo II (Tabela 1).

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Tabela 1: Frequncia de escores nos grupos experimentais (n=6).

Escore Diferena Valor p* significante 0 1 2 3 a I 6 7 dias b II 1 5 <0,0001 Contrao da ferida a I 6 15 dias b II 6 c I 6 7 dias d II 3 3 0,0001 Re-epitelizao c I 1 5 15 dias d II 6 I 2 4 7 dias II 3 3 ns Edema I 3 3 15 dias II 6 e I 3 3 7 dias e II 3 3 0,01 Hemorragia I 6 15 dias II 6 f I 3 3 7 dias f II 1 5 0,002 Vasos I 5 1 15 dias II 4 2 I 1 2 3 7 dias Membrana fibrinoII 3 2 1 ns purulenta I 4 2 15 dias II 6 I 1 4 1 7 dias Regenerao g II 4 2 0,0006 muscular I 1 5 15 dias g II 6 I 7 dias i II 0,0002 Folculos pilosos I 1 4 1 15 dias i II 6 j, k I 3 7 dias k II 0,01 Inflamao Aguda I 15 dias j II l I 7 dias II 0,01 Inflamao Crnica l I 6 15 dias II m I 7 dias m, n II 6 0,01 Inflamao Mista I 15 dias n II Escore 0 = ausente; Escore 1 = incio / leve; Escore 2 = metade/ moderado; Escore 3 = completo/ intenso/ forte. Letras idnticas representam diferena estatisticamente significante entre grupos (I e II). ns = No significante. * Teste Kruskal-Wallis (=5%). Parmetro Perodo Grupo

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4.3. Avaliao Histomtrica Como no perodo de 15 dias, o fechamento da ferida apresentava-se completo nos dois grupos (I e II), a mensurao das reas de contrao da ferida foi realizada somente no perodo de 7 dias de reparo tecidual. Neste contexto, pode-se observar que os animais do grupo II (teste) apresentavam mdia de rea de contrao do tecido conjuntivo, estatisticamente maior que o grupo I (controle) (Tabela 2).

Tabela 2: Mdia da rea de Contrao de Ferida no perodo de 7 dias Grupo I Mdia (DP) rea (m2) 3514,89 (1303,13) Grupo II Mdia (DP) 6558,93 (2413,3)* Valor de p 0,029

* Diferena estatsticamente significante entre grupos, pelo teste ANOVA (Bonferroni), para p0,05.

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5 DISCUSSO

A retirada de fragmento de pele induz a formao de soluo de continuidade que preenchida por fibrina, cogulo e exsudado inflamatrio, formando a crosta que recobre a ferida (Simes et al., 1985 Simes et al., 1986). Segundo Nitz et al. (2006), o processo de reparao de leses de pele por segunda inteno, em casos quando os bordos no esto perfeitamente coaptados e que a leso se encontra extensa e infectada, com grande destruio tecidual, inicia-se com a formao do cogulo, seguida de liberao de mediadores prinflamatrios, desenvolvendo reao inflamatria aguda (Kim et al., 2009). No incio da fase inflamatria do processo de cicatrizao h aumento da permeabilidade vascular, extravasamento de plasma, hemcias, plaquetas e leuccitos, destacando-se os neutrfilos, moncitos e macrfagos (Simes et al., 1986). No presente estudo apontamos diferenas interessantes em relao ao curso do processo reparativo. Enquanto que no grupo I (controle), ao 7o. dia, foi observado resposta inflamatria aguda intensa, tecido de coagulao necrtico e reas infectadas, no grupo II (teste), o processo inflamatrio encontrado caracterizou-se por estgio mais avanado (misto), sem infeco. Nossos achados esto em concordncia com os resultados de Rodrigues et al. (2004), os quais verificaram que as feridas em dorso de ratos tratadas com leo de girassol ozonizado, ao stimo dia, apresentavam tecido epitelial de granulao maduro e, comparado com o controle negativo (leo de girassol sem oznio), que ainda

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apresentavam reas de coagulao necrticas e infiltrado inflamatrio agudo e comparado tambm com o controle positivo (associao de clostebol e neomicina), que ainda possua intensa neovascularizao e processo inflamatrio ativo, com reas ulceradas. Adicionalmente est em concordncia com os achados de Valacchi et al. (2011), que constataram diminuio do tempo de cicatrizao ao utilizar leo de ssamo ozonizado sobre feridas induzidas em ratos ao stimo dia de avaliao. O aumento de fibras colgenas at o 7 dia promove diminuio do fluxo sanguneo, diminuindo consequentemente, os constituintes do tecido de granulao, fazendo com que este mude sua estrutura, passando a constituir um tecido conjuntivo tpico. Adicionalmente, neste perodo, os miofibroblastos por meio de capacidade contrctil, promovem a retrao da ferida, que pode chegar de 50 a 70% do tamanho inicial (Nitz et al, 2006). Fato este que justifica os achados macroscpicos e histomtricos do presente estudo. Entretanto, ressaltase que a contrao no grupo II (teste) mostrou-se mais evidente no perodo de 7 dias. Alguns estudos relatam que este fato seja devido a ozonioterapia estimular a neovascularizao tecidual e consequentemente, induzir a um aumento da oxigenao dos tecidos e estimular a diferenciao celular e funcional dos miofibroblastos, auxiliando, assim, a reparao tecidual (Clavo et al., 2003; Modarresi et al., 2010). Reforando, desta forma, a justificativa para a ocorrncia de completa regenerao muscular no 15 dia, observada no grupo tratado com ozonioterapia (teste).

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Considerando estudos com o uso do oznio, acredita-se que sob diferentes formas de aplicao, o oznio, tem possibilitado maior aumento da quantidade de leuccitos polimorfonucleares, maior sntese de protenas (Gracer, Bocci, 2005), maior liberao de fatores de crescimento para a construo da matriz extracelular, tais como, fator transformador de crescimento 1 (TGF1) (Bocci et al., 1994) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (Kwon et al., 2006), auxiliando no processo de reparao tecidual de feridas drmicas (Traina, 2008). Adicionalmente, o estudo de Bocci (2004) relata que o oznio atua na circulao sangunea, aumentando a concentrao de clulas vermelhas e as taxas de hemoglobina, melhorando a reologia tecidual, aumentando a circulao e oxigenao dos tecidos perifricos, aumentando tambm a diapedese e fagocitose. Tais fatos podem explicar a acelerao do processo de reparao tecidual observado no grupo II (teste), no perodo de 7 dias, caracterizado por maior contrao da ferida, infiltrado inflamatrio misto e intensa neovascularizao. Segundo Valacchi et al. (2011), os possveis mecanismos do leo ozonizado podem ser sumarizados em: (i) oxidao dos agentes infecciosos; (ii) citotoxicidade ocasionada pela atuao dos produtos derivados da peroxidao lipdica (LOPs); e (iii) liberao de fatores de crescimento e consequente ativao de sistemas imunomoduladores devido o estresse oxidativo, tais como, NFKappa-B. A justificativa para acesso via insuflao retal indicada por ser uma tcnica incua, sem qualquer efeito colateral ou dano ao animal ou ser humano,

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comprovada pelos estudos de Bocci (1996); Lon et al. (1998); Batista et al. (2001); Eliakim et al. (2001); Calunga et al. (2005) e Fernndez et al. (2008). Segundo Bocci (1996) apesar da via retal para aplicao da mistrura de gs oznio ser emprica, considerada uma tcnica fcil, prtica, atxica e apresentando atuao no fgado via circulao porta. Lon et al. (1998), relataram qua a administrao da mistura de gs composto por oznio por via retal induz a tolerncia tecidual e do fgado, aos radicais livres liberados. Adicionalmente, Fernndez et al. (2008), relataram que doses de gs oznio por meio da tcnica de insuflao retal, promove um pr-condicionamento oxidativo rpido e transitrio, capaz de desenvolver um efeito protetor no fgado, preservando a funo mitocondrial das clulas, controlando a liberao de mediadores inflamatrios, impedindo danos celulares e teciduais maiores. Observou-se que o gs oznio, aplicado por insuflao retal em ratos, dentro do protocolo utilizado neste estudo, demonstrou ter propriedades imunomoduladoras, alterando a resposta inflamatria, bem como propriedades reparadoras e regenerativas, pois foi constatada maior contrao da ferida ao stimo dia de avaliao, sugerindo diminuio no tempo de reparo da leso de pele e maior qualidade tecidual com tecido conjuntivo denso e maduro, ao 15 dia, juntamente com completa regenerao do tecido muscular lesionado do grupo teste. Dessa forma, a realizao de um estudo bem delineado e de qualidade que avaliasse a utilizao do oznio como nica interveno no tratamento de feridas, sem a adio de vis, era imprescindvel para comprovar a hiptese de que a

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terapia bio-oxidativa com gs oznio oferece benefcios adicionais processos reparativos em tecido. Sugerindo indicao da aplicao clnica desta terapia como opo de tratamento a pacientes com problemas de imunidade, coagulao, reparo e cicatrizao, ocasionando resultados satisfatrios em menor tempo e menos gastos com medicaes e hospitalizaes.

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6 CONCLUSO Dentro do atual desenho Experimental a terapia bio-oxidativa com gs oznio mostrou possuir: Efeito imuno-modulador, pois alterou os padres celulares da resposta inflamatria; Efeito reparador, pois acelerou o processo de reparao; Efeito angiognico, pois aumentou o nmero de novos vasos formados; Efeito proliferativo, pois aumentou a expresso de anexos cutneos; Efeito regenerador, pois regenerou o tecido muscular lesionado;

Dessa forma, concluiu-se que a terapia bio-oxidativa com gs oznio apresentou efeito bio-estimulador, aumentando a reparao e regenerao tecidual em pele de ratos.

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7 REFERNCIAS1

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8 ANEXOS

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ANEXO 1. Comisso de tica no Uso de Animal (CEUA)

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ANEXO 2. Artigo de Reviso da Literatura aceito para publicao na Revista Cincia e Cultura. Publicao prevista para maio de 2012.

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Modulao do estresse oxidativo com ozonioterapia e suas implicaes em periodontopatias Modulation of oxidative stress with ozone-therapy and its implications in periodontal disease Ozonioterapia em periodontopatias rea de Conhecimento: Cincias da Sade Odontologia Alexandre Melo KARAM1; Teresinha Costa de SANTANA2; Elizangela Partata ZUZA3; Juliana Rico PIRES3*. 1. Aluno do Curso de Ps-Graduao, nvel Mestrado, em Cincias Odontolgicas do Centro Universitrio da Fundao Educacional de Barretos - UNIFEB, Barretos, SP 2. Professora Doutora Assistente do curso de graduao em odontologia da Universidade Estadual de Feira de Santana UEFS, Coordenadora do curso de especializao em periodontia do Centro Baiano de estudos OdontolgicosCEBEO, Salvador, BA. 3. Professora Doutora Assistente do Programa de Ps-Graduao em Cincias Odontolgicas do Centro Universitrio da Fundao Educacional de Barretos UNIFEB, Barretos, SP

* Correspondncia para: Prof. Dr. Juliana Rico Pires Centro Universitrio da Fundao Educacional de Barretos UNIFEB. Programa Mestrado em Cincias Odontolgicas. Avenida Professor Roberto Frade Monte, 389. CEP: 14080-530. Aeroporto, Barretos, So Paulo, Brasil Telefone: +55 17 3321-6468 e-mail: juricopires@yahoo.com.br

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RESUMO A doena periodontal, por seu carter intrnseco, uma enfermidade que produz estresse oxidativo crnico. capaz de influenciar o status oxidativo do plasma e sofrer interferncias do mesmo conforme o status oxidativo geral do organismo e sua capacidade antioxidante. A ozonioterapia uma terapia bio-oxidativa, como a oxigenao hiperbrica, que utiliza o oznio medicinal como princpio ativo, capaz de promover aumento dos nveis de enzimas antioxidantes como as glutationas, superxido dismutase e catalase. Estudos comprovam o efeito preventivo de danos celulares mediados por radicais livres de oxignio quando do advento do precondicionamento oxidativo com ozonioterapia. Procurou-se neste trabalho avaliar, atravs de uma reviso de literatura, os possveis benefcios da ozonioterapia aos portadores de doena periodontal. Concluiu-se que h plausibilidade nas conjecturas dos efeitos benficos da ozonioterapia em periodontia e que mais estudos so necessrios. Palavras-chave: Oznio; Estresse oxidativo; Periodontia. ABSTRACT Periodontal disease, for its intrinsic character, is an enfermity that produces chronic oxidative stress. It is capable to influence the oxidative status of the plasma and undergo interferences from it, according to the general oxidative status of the organism and its antioxidant capacity. The ozone-therapy is a biooxidative therapy, such as hyperbaric oxigenation, which uses medicinal ozone as active principle, capable of promoting the increase of the antioxidant enzimes' levels, such as glutathiones, dismutase superoxide and catalase. Studies prove the preventive effect of cellular damage mediated by free oxygen radicals when there is an oxidative pre-conditioning with ozone-therapy. In this work, we sought to evaluate the possible benefits of ozone-therapy to carriers of periodontal disease, through the review of the literature. The conclusion was that the conjectures regarding the beneficial effects of ozone-therapy in periodontal treatment are plausible, however further studies are necessary. Key-words: Ozone; Oxidative Stress; Periodontology. INTRODUO Estresse oxidativo definido como um desequilbrio na relao entre oxidantes e antioxidantes, em favor dos pr-oxidantes como o nion superxido, o radical hidroxil, o perxido de hidrognio, em detrimento das enzimas antioxidantes (BARREIROS e DAVID, 2006). As doenas periodontais tm sido implicadas no desenvolvimento de estresse oxidativo crnico. Vrios estudos (CANAKCI et al.,2007; SAWAMOTO et al.2005; AKALIN et al., 2007; PRADEEP et al., 2007; MOTOHIRA et al., 2007; TAMAKI et al., 2009; HAIXIANG et al., 2009)

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apontam a presena de malonildialdedo e outros produtos de peroxidao lipdica, bem como produtos derivados de hidroxilao de bases de DNA em bolsas periodontais e fluido crevicular como consequncia de dano celular por radicais livres e estresse oxidativo crnico. O precondicionamento oxidativo com oznio vem sendo estudado e os seus efeitos benficos conseguem prevenir os danos celulares causados por radicais ativos de oxignio atravs da promoo de aumentos dos nveis de antioxidantes intracelulares como as glutationas, catalase (CAT), peroxidases, superxido dismutase (SOD) (HAIXIANG et al., 2009; LEN et al., 1998; FORMAN et al., 1998; AJAMIEH et al, 2004; BOCCI, 2004). Diante destes fatos, o objetivo deste estudo avaliar em uma reviso de literatura os possveis efeitos benficos do precondicionamento oxidativo com ozonioterapia sobre o curso da doena periodontal. REVISO DE LITERATURA Estresse oxidativo do plasma e em periodontopatias A doena periodontal uma enfermidade que gera estresse oxidativo crnico, podendo influenciar e ser influenciada pelo status oxidativo geral do plasma. O achado de 8-Hidroxi-2-deoxiguanosina (8-OHdG) nos fluidos corporais, especialmente em periodontite, no fluido crevicular, resultado de danos ao DNA, pelo estresse oxidativo que causa hidroxilao de bases de DNA (BARREIROS e DAVID, 2006; SAWAMOTO et al., 2005). Foi encontrada estreita relao entre 8-OHdG e agentes patgenos periodontais, ratificando o estresse oxidativo crnico existente em periodontopatias (SAWAMOTO et al.2005). Os nveis de malonildialdedo (MDA) e, portanto, de produtos de peroxidao lipdica, esto aumentados localmente no ambiente da bolsa periodontal em periodontites crnicas. O status oxidativo total, tanto sistmico quanto local, tambm est aumentado. Seus achados sugerem que aumentos dos produtos de peroxidao lipdica e do status oxidativo total do soro podem ter um importante papel na patologia da periodontite e estar estreitamente relacionados com o status clnico periodontal (AKALIN et al., 2007). Estudos mostram estreita relao entre a presena de neopterina no fluido crevicular gengival e periodontopatias. Seu aumento est relacionado com a progresso da doena periodontal, havendo sua diminuio quando do tratamento periodontal convencional por raspagem e alisamento radicular. Relatam tambm estreita relao da neopterina com situao de estresse oxidativo, por ser um fator ativador de moncito/macrfago, relacionados com a produo de espcies reativas de oxignio e nitrognio que, em sinergia, amplificam potenciais citotxicos diretamente contra periodontopatgenos e, indiretamente, favorecendo destruio periodontal (PRADEEP et al., 2007). Antioxidantes locais e sistmicos, bem como a total capacidade antioxidante do organismo so afetadas pela doena periodontal, ainda mais em

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adio condio de pr-eclmpsia. Estes achados poderiam limitar a ozonioterapia em gestantes (CANAKCI et al.,2007). FORMAN et al. (1998), num estudo controlado, avaliaram os efeitos de hipxia e reperfuso em crebros de ratos. Relataram que em isquemia e reperfuso h um aumento dos nveis de ROS nos hemisfrios cerebrais e que a produo de peroxinitrito dependente da disponibilidade de xido ntrico (NO). MOTOHIRA et al. (2007), relacionam hipxia e reoxigenao com trauma oclusal, tabagismo e periodontite, concluindo que em periodontopatias h hipxia tecidual favorecendo produo de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), IL-6 e IL-1, reconhecidos como fatores de reabsoro ssea alveolar. Quando acontece reoxigenao logo aps eventos de hipoxia, levaria a um aumento dos nveis de nion superxido e outras espcies ativas de oxignio, que por sua vez induzem a degradao do inibidor de NF-kB e sua ativao, que resultaria em concentraes desses mediadores a nveis mais elevados que em situao de hipoxia, acarretando em leso por reperfuso. Portanto a doena periodontal associada a outras condicionais como tabagismo e trauma oclusal, levam o tecido periodontal a eventos constantes de hipxia e reoxigenao, situao que hipoteticamente aumentaria a morbidade da patologia periodontal, em vista da gerao de mediadores pr-inflamatrios e estimuladores de reabsoro ssea alveolar, tais como a IL1-, IL6 e VEGF. Verifica-se, pois, que h uma produo muito mais acentuada destes mediadores em situao de reoxigenao que nos momentos de hipxia. Isto ocorre, provavelmente, devido ao aumento de radicais livres de oxignio em excesso produzidos pela reperfuso e pelo despreparo tecidual quanto ao teor de enzimas anti-oxidantes suficientes para combater o estresse oxidativo gerado. TAMAKI et al. (2008), alegam uma relao positiva entre condio periodontal e o status oxidativo do plasma, podendo este afetar a taxa de progresso da doena periodontal. TAMAKI et al. (2009) concluram que, em pacientes com periodontite crnica, os nveis de metablitos reativos de oxignio esto elevados, em comparao com indivduos sem periodontite e que o tratamento periodontal convencional no-cirrgico consegue, alm de melhorar os parmetros clnicos periodontais, reduzir os nveis de espcies reativas de oxignio (ROS) no plasma. HAIXIANG et al. (2009) relatam que h um aumento da capacidade total antioxidante da saliva em doentes com periodontopatias, podendo significar uma resposta adaptativa do organismo ao extresse oxidativo gerado pelas ROS produzidas nas periodontites, principalmente nas periodontites agressivas. Modulao do estresse oxidativo com ozonioterapia LEN et al. (1998), num estudo controlado randomizado com ratos, constataram que a administrao prvia controlada de oznio via retal consegue promover um precondicionamento oxidativo, prevenindo danos hepatocelulares mediados por radicais livres. ALVES et al. (2004), em trabalho experimental

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com eqinos, relatam atenuao nas leses de reperfuso do jejuno em animais submetidos obstruo vascular quando tratados pela ozonioterapia. AJAMIEH et al. (2004), num estudo experimental controlado com ratos, avaliaram o efeito do precondicionamento oxidativo com oznio sobre a gerao de xido ntrico e o balano de oxireduo celular. Foram mensuradas como parmetros as transaminases plasmticas (aspartato aminotransferase e alanina aminotransferase), como indicadoras de danos hepatocelulares; nitritos e nitratos, como indicadores da produo de xido ntrico; nveis de superxido dismutase, catalase e glutationa, como marcadores do sistema antioxidante endgeno; malonildialdedo, 4-hidroxialcenos e hidroperxidos totais, como indicadores de estresse oxidativo. Os resultados mostraram que o precondicionamento oxidativo com oznio protege o fgado contra a injria promovida pela isquemia e reperfuso atravs de mecanismos que promovem a regulao das concentraes de xido ntrico endgeno e a manuteno do equilbrio de oxireduo celular. BOCCI (2004), em experimento para avaliar a exposio de clulas mononucleares isoladas do sangue perifrico a concentraes de oznio na mistura gasosa de oxignio-oznio de 1,0 a 80g/ml (variao de 0,02mM a 1,68mM), relata que o status antioxidante total (TAS) do organismo humano, que varia normalmente de 1.3-1.8mM, diminui no mais que 20% nos primeiros 5 minutos e retorna a valores originais dentro de 30 minutos. Salienta tambm que baixas concentraes de oznio estimulam a produo de IFN- e TNF-; concentraes superiores a 40g/ml, por outro lado, inibem a produo de citocinas. MAJED et al. (2007), em estudo controlado sobre choque sptico quimicamente induzido atravs de inoculao de LPS de Eschecrichia coli em ratos, analisou as alteraes enzimticas que ocorrem em mitocndrias e lisossomos sobre lactato desidrogenase (LDH), succinato desidrogenase (SDH), adenosina trifosfatase (ATPase), fosfatase cida (AcPase) e -glucuronidase (BG) na intimidade tecidual do fgado, rins, pulmo e corao. Alguns animais receberam aplicao intraperitonial prvia da mistura gasosa de O2-O3. Os resultados demonstraram que a LPS suprimiu a atividade de todas as enzimas, excetuando LDH que aumentou quatro vezes sua atividade. A infuso intraperitonial de O2-O3 causou pelo menos uma normalizao parcial das reaes enzimticas. FERNNDEZ et al. (2008), avaliaram o efeito do precondicionamento oxidativo com oznio sobre danos ao fgado de ratos, em processos de isquemia e reperfuso, atravs da utilizao de um agonista e antagonista do receptor de adenosina subtipo A1, CCPA (2-cloro N6 ciclopentiladenosina) e DPCPX (8ciclopentil-1,3-dipropilxantina), respectivamente. Avaliaram a gerao de xido ntrico, a atividade de adenisina deaminase e a preservao do balano de oxireduo celular. Estabeleceram anlise imunohistoqumica do NF-B, TNF-, protena de choque trmico 70 (HSP-70). Obtiveram como resultados que o CCPA mostrou um efeito similar ao precondicionamento oxidativo com oznio e o DPCPX bloqueou o efeito protetor do mesmo. Constataram tambm que o

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precondicionamento oxidativo com oznio reduziu bastante a expresso do p65, diminuiu a produo de TNF- e promoveu uma reduo na imunoreatividade de HSP-70. DISCUSSO Uma vez que, atravs de pr-condicionamento oxidativo do plasma com oznio, consegue-se minimizar os danos provocados por radicais livres de oxignio em injrias hepticas em eventos de hipxia e reperfuso (LEN et al., 1998; ALVES et al., 2004; FERNNDEZ et al., 2008 ) e h evidncias que o status oxidativo do plasma e o status oxidativo da doena periodontal so mutuamente influenciados um pelo outro (PRADEEP et al., 2007; TAMAKI et al., 2008 ), levando-se tambm em considerao que o prprio organismo humano j busca uma regulao positiva da capacidade antioxidante da saliva frente s injrias das periodontopatias (HAIXIANG et al., 2009), bastante plausvel conjecturar que a modulao do status oxidativo do plasma e da sua capacidade antioxidante, atravs do pr-condicionamento oxidativo com oznio, possa exercer algum efeito sobre a progresso da doena periodontal. CONCLUSO O pr-condicionamento oxidativo com oznio, pode exercer efeito sobre a progresso da doena periodontal, uma vez que esta progresso se d, em parte, s custas da ao de mediadores inflamatrios gerados a partir da produo de radicais livres reativos de oxignio. Por meio de modulao do status oxidativo do plasma e da sua capacidade antioxidante atravs de estmulos repetitivos e controlados, pr-oxidantes com a ozonioterapia, em que se alcanam nveis melhorados do sistema antioxidante enzimtico intracelular, bastante plausvel que esta vertente seja bastante til em situaes de periodontite, onde os fatores imunolgicos do enfermo tm grande influncia sobre a progresso da doena. A literatura atual ainda bastante carente de pesquisas que utilizem ensais clnicos e laboratoriais controlados, necessitando que mais estudos sobre o tema sejam desenvolvidos. REFERNCIAS AJAMIEH, H. H.; MENNDEZ, S.; MARTNEZ-SNCHEZ, G.; CANDELARIO-JALIL, E.; RE, L.; GIULIANE, A.; FERNNDEZ, O. S. L. Effects of ozone oxidative preconditioning on nitric oxide generation and cellular redox balance in a rat model of hepatic ischaemia-reperfusion. Liver International, v. 24, p. 55-62, 2004. AKALN, F.A.; BALTACOGLU, E.; ALVER, A.; KARABULUT, E. Lipid peroxidation levels and total oxidant status in serum, saliva and gingival

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