CITOQUIMICA: La citoqumica estudia la composicin qumica de la clula y permite detectar la localizacin topogrfica de algunos principios inmediatos, enzimas, metales

pesados y otras sustancias. Se considera como un nexo de unin entre la morfologa y la bioqumica. En una reaccin bioqumica hay tres pasos fundamentales: 1.- Fijacin: para preservar las estructuras y reactividad funcional celulares evitando fenmenos nocivos para las mismas e impidiendo tambin la difusin de componentes bioqumicos entre los diferentes compartimentos celulares as como al medio extracelular. Existen diversos fijadores: metanol, etanol, acetona, glutaraldehdo, formaldehdo, etc. 2.- Incubacin en el medio de reaccin: como consecuencia se liberar unos productos que bien por si mismos, o al combinarse con otra sustancia presente, dan lugar a un precipitado visible en el lugar de la reaccin. 3.- Contraste: para resaltar en lo posible el producto de reaccin y permitir una ptima visualizacin del ncleo y del citoplasma. Las reacciones deben tener 3 caractersticas: sensibilidad, especificidad y reproductibilidad. Las muestras a estudiar son extensiones de sangre perifrica y de mdula sea, improntas de tejidos y clulas impactadas mediante citocentrifugacin procedentes de diversos lquidos biolgicos. Las muestras deben ser recientes y a poder ser sin anticoagulantes. Para la correcta valoracin citoqumica hay que intercalar controles positivos y negativos.

PAS La reaccin de PAS o del cido perydico de Schiff se basa en la rotura de los enlaces -C-C- presentes en los carbohidratos por la accin del cido perydico, potente agente oxidante, liberndose grupos aldehdo que al combinarse con el reactivo de Schiff dan un compuesto de color rojo prpura intenso. La reaccin del PAS ha perdido utilidad en el diagnstico hematolgico despus de la aparicin de mejores marcadores. Sigue teniendo inters en la diferenciacin de diferentes tipos de leucemias linfoblsticas, en la eritroleucemia y en diversas mielodisplasias. PEROXIDASA La demostracin citoqumica de esta enzima se basa en la accin oxidante de la peroxidasa sobre el substrato, bencidina, en presencia de perxido de hidrgeno, apareciendo un precipitado amarillo ocre en el lugar del citoplasma en donde se ha producido la reaccin.

La mieloperoxidasa se sintetiza en el retculo endoplasmtico rugoso, de donde pasa a las cisternas del aparato de Golgi quedando localizada fundamentalmente en la granulacin 1 o azurfila. Dicha enzima se combina in vivo con perxido de hidrgeno transformndose en un potente agente bactericida, viricida y fungicida. La aplicacin fundamental de la mieloperoxidasa se refiere a la capacidad discriminatoria entre celularidad blstica mieloide y linfoide, ya que los mieloblastos muy precoces sin estigmas de diferenciacin mieloide ya pueden ser mieloperoxidasa positivos. Un dficit de mieloperoxidasa en los PMN maduros, excepto en el caso de que se trate de una deficiencia congnita, debe interpretarse como un signo disgranulopoytico. FOSFATASA ALCALINA La fosfatasa alcalina es una hidrolasa perteneciente al grupo de las fosfomonoesterasas; hidroliza monosteres del cido fosfrico, actuando a un pH de 9,1 a 9,6; ligeros de pH determinan una rpida inactivacin de la enzima. La demostracin citoqumica se basa en la hidrlisis de ciertos substratos, de los cuales se liberan unos productos intermedios que combinados con una sal diazoica dan un precipitado coloreado. La actividad de la FA granuloctica se manifiesta en forma de un precipitado pardo negruzco localizado en el citoplasma. Se encuentra actividad FA en algunas clulas maduras y semimaduras de la granulopoyesis neutrfila (bandas y segmentados). No todos los granulocitos presentan el mismo grado de positividad; en funcin de este dato se establece un ndice de actividad de FA. Se pueden distinguir tres tipos de reaccin: - grado 0: sin actividad enzimtica. - grado I: con cierta actividad enzimtica en forma granular nica o actividad dbil difusa en una parte del citoplasma, especialmente en la zona perinuclear. - grado II: intensa actividad granular o actividad difusa distribuida por todo el citoplasma granuloctico. Se realiza un recuento sobre 100 granulocitos asignando a cada uno un grado; y a cada grado se la asocia un valor: grado 0=0, grado I=1, grado II=2. Se suman los valores y el nmero obtenido es el ndice de FAG, que tiene un valor mnimo de 0 y mximo de 200. El ndice normal oscila entre 20 y 40. Su mximo inters se centra en el estudio de los sndromes mieloproliferativos, sobre todo para corroborar el diagnstico de LMC para la que se designan valores muy bajos o nulos. Su determinacin es muy til para establecer el diagnstico diferencial entre LMC y reacciones neutroflicas secundarias que cursan con valores elevadsimos. FOSFATASA ACIDA

Es una enzima hidroltica perteneciente al grupo de las fosfomonoesterasas, que acta sobre los steres del cido fosfrico; su pH ptimo de actuacin oscila entre 4,7 y 5,5. Se trata de una enzima de ubicacin lisosmica. La demostracin citoqumica se basa en la hidrlisis del substrato naftol-AS-Bi-fosfato, liberndose unos productos intermedios que al combinarse con una sal diazoica dan un precipitado de color rojo anaranjado en

el citoplasma.

La aplicacin prctica del estudio de la FA se refiere sobre todo a los SLPC y LAL, dnde existe una buena correlacin entre el tipo de positividad y el fenotipo de membrana. El 90% de las LAL de origen T dan una reaccin + intensa de localizacin centrosmica; y las de tipo B o noT-no-B suelen ser -. La LLC-T y otros SLPC T suelen cursar con valores elevados de FA que es tartrato sensible. La LLC-B presenta muy escasa actividad al igual que ocurre con otras proliferaciones de linfocitos B. La tricoleucemia es un proceso linfoproliferativo en que el estudio de la FA ofrece un particular inters por cuanto la actividad enzimtica a pesar de ser una clula linfoide es difusa, intensa y tartrato resistente. De todas formas, con el advenimiento de los anticuerpos monoclonales, la tcnica citoqumica en el estudio de los sndromes linfoproliferativos crnicos ha perdido predicamento. ESTERASAS Son un grupo de enzimas capaces de hidrolizar steres en sus componentes cidos y alcoholes. Existen diferentes variedades segn el substrato empleado. Se utilizan 4 substratos: naftol-AS-C-cloroacetato, naftol-AS-D-acetato, a -naftil-acetato, a -naftil-butirato, los cuales al ser hidrolizados en presencia de una sal diazoica dan un precipitado insoluble en el lugar de la reaccin. Utilizando como substrato el naftol-AS-C-cloroacetato (CAE) se detecta una esterasa que es especfica de la granulopoyesis neutrfila en la que es + a partir del mieloblasto y se expresa en forma de un precipitado rojo anaranjado muy brillante. Su utilidad diagnstica se centra bsicamente en el reconocimiento de clulas blsticas mieloides, si bien su aparicin es ms tarda que la de la mieloperoxidasa aunque iguala a sta en especificidad. Utilizando como obtiene una intensa que, a diferencia de hematopoyticas, restrictiva es acetato o a -naftilmonoctica y sus manifiesta en forma citoplasma. HIERRO (Fe) substrato el naftol-AS-D-acetato, se positividad en la serie monoctica las restante clulas es fluoruro sensible. Dada su + ms preferente usar el substrato a -naftilbutirato para marcar la serie precursores, cuya + es intensa y se de un precipitado difuso por todo el

El estudio de la hemosiderina mediante la reaccin de Perls, asociada a la valoracin conjunta del n de sideroblastos y del Fe de depsito de los macrfagos medulares, constituye un estudio imprescindible en la evaluacin de algunos sndromes anmicos de etiologa oscura. El Fe de depsito se encuentra en el interior de las clulas en forma de agregados o grnulos de hemosiderina detectables citoqumicamente mediante la reaccin de Perls. Esta reaccin se basa en la liberacin de los iones frricos de su unin con las protenas por la accin del cido clorhdrico; dichos iones frricos al reaccionar con el ferrocianuro potsico dan un precipitado azul verdoso de ferrocianuro frrico. Por esta reaccin se detecta el Fe hemosidernico, que es insoluble, pero no el Fe contenido en la ferritina que es hidrosoluble. Las partculas hemosidernicas se observan en el interior de los eritroblastos (sideroblastos), en algunos eritrocitos (siderocitos) y en los macrfagos medulares, del hgado y del bazo, dnde se acantonan constituyndose en Fe de depsito. En condiciones normales se observa de un 30 a un 60% de sideroblastos en cuyo interior aparecen de 1 a 4 grnulos distribuidos por la superficie del citoplasma. El aumento en el nmero de grnulos indica un acmulo excesivo de Fe y la existencia de una disfuncin en su metabolismo; esta disfuncin puede conducir a un depsito de Fe en el interior de las mitocondrias, fenmeno que pticamente se traduce por la disposicin de los grnulos hemosidernicos alrededor del ncleo en forma de collarete constituyendo los denominados sideroblastos en anillo, caractersticos y definitorios de la anemia refractaria sideroblstica, en la que deben hallarse en una proporcin superior al 15%. En el estudio del Fe medular hay que valorar conjuntamente 3 parmetros: n de sideroblastos, tipo de los mismos y Fe macrofgico. Bsicamente se presentas 3 patrones: 1.- n sideroblastos alto y Fe de depsito aumentado: es frecuente hallarlo en estados anmicos que cursan con sobrecarga frrica. 2.- n sideroblastos bajo y Fe de depsito disminuido o ausente: es el patrn caracterstico de la anemia ferropnica pura; de aparicin muy precoz en un balance frrico negativo. 3.- n sideroblastos bajo con acmulo de Fe en los macrfagos medulares. Este patrn disociado es propio de entidades que condicionan un bloqueo del Fe a nivel de los macrfagos, por lo que el Fe no puede ser cedido a los eritroblastos, suele observarse en anemias secundarias. El mximo inters de la tincin del Fe es en la primera situacin.

No quisiramos dejar de comentar 2 tinciones que son tan "citoqumicas" como las anteriores pero que dado se uso generalizado suelen ir descritas en otras apartados: 1.- Tincin panptica: de uso preferente en Europa es la tincin de May Grunwald-Giemsa. La solucin de May Grunwald contiene eosina y azul de metileno diluidos con metanol. La solucin de Giemsa es una solucin de metanol con azur, eosina y azul de metileno. La eosina tiene apetencia por las estructuras acidfilas tiindolas de rojo, y el azul de metileno por las basfilas colorendolas de azul.

2.- Tincin supravital para la visualizacin de reticulocitos: los reticulocitos son hemates jvenes que an poseen en su interior restos de mitocondrias, retculo endoplsmico rugoso y/o ribosomas. El colorante vital (azul de cresil brillante o azul de metileno) precipita estos restos de estructura celulares, lo que se traduce en la denominada sustancia granular reticulofilomentosa que define a este estadio madurativo de la serie roja. Por cuestiones de espacio no nos referiremos a otras tinciones citoqumicas que pueden tener su importancia en la prctica clnica diaria: lisozima o muramidasa srica, reduccin del nitroazul de tetrazolio, determinacin de Hb fetal etc. Tampoco, y por la razn antes expuesta, no hacemos hincapi en las tcnicas inmunocitoqumicas que a buen seguro tendrn cada vez mayor relevancia en el quehacer cotidiano de un laboratorio de diagnstico de morfologa sangunea. BIBLIOGRAFIA: 1.- F.J.H. Hayhoe, D. Quaglino: Haematological Cytochemistry. Churchill Livingstone, 2 Edicin, 1988, Nueva York. 2.- S. Woessner, R. Lafuente, L. Florensa: La citologa en el diagnstico hematolgico. Ed. Medici. 3 Edicin, 1991, Barcelona. 3.- S. Woessner: Tcnicas en citologa hematolgica. Ed. Medici, 1990, Barcelona.