Ferreira LM e col

ARTIGO ORIGINAL

8. Modelos experimentais em pesquisa1 Experimental models in research1

Lydia Masako Ferreira2, Bernardo Hochman3, Marcus Vincius Jardini Barbosa4
1. Trabalho desenvolvido no Programa de Ps-Graduao em Cirurgia Plstica da Universidade Federal de So Paulo Escola Paulista de Medicina (UNIFESP EPM). 2. Professora Titular da Disciplina de Cirurgia Plstica e Coordenadora do Programa de Ps-Graduao em Cirurgia Plstica da UNIFESP EPM 3. Mestre em Medicina e ps-graduando em nvel de doutorado pelo Programa de Ps-Graduao em Cirurgia Plstica da UNIFESP EPM. 4. Mestre em Medicina pelo Programa de Ps-Graduao em Cirurgia Plstica da UNIFESP EPM.

RESUMO O objetivo deste estudo compilar as principais classificaes dos modelos experimentais utilizados em pesquisas e suas possveis aplicaes em pesquisa experimental. Realizou-se a reviso da literatura a partir dos principais bancos de dados disponveis na Internet (Pubmed, Medline, Scielo, Lilacs, Cochrane), assim como em um levantamento dos estudos experimentais realizados no Programa de Ps-Graduao em Cirurgia Plstica da Universidade Federal de So Paulo Escola Paulista de Medicina. Destacou-se uma distribuio dos modelos animais em status sanitrio, genotpico e como modelo experimental. A compreenso das principais classificaes dos modelos experimentais em pesquisa fundamental para o aperfeioamento e comprovao de tcnicas e procedimentos j existentes, assim como para o desenvolvimento de outros. Descritores: Modelos Animais. Modelos Animais de Doenas. Cultura de Tecido. Cadaver. Pesquisa Biomdica.

ABSTRACT The purpose of this study is to collect the main classifications of experimental research models and their possible applications in experimental research. Literature search was done using the most important data bank available on the internet (PUBMED, MEDLINE, SCIELO, LILACS, COCHRANE). A compilation of the experimental studies developed at the Plastic Surgery Post Graduate Program of the Federal University of So Paulo/ Paulista School of Medicine was also done. Animals models were classified regarding sanitary and genotipical status. The understanding of the main classifications of the research experimental models is essential to improve and confirm procedures and techniques already described as well as the development of new ones. Key words: Models, Animal. Disease Models, Animal. Tissue Culture. Cadaver. Biomedical Research.

Introduo Modelos experimentais em pesquisa podem ser definidos como a materializao de uma parte da realidade, por meio da representao simples de uma ocorrncia recente ou antiga. Para tanto, deve apresentar uma preciso adequada, por meio de comprovao prvia e tambm pela demonstrao das limitaes em relao realidade que ir representar.1 O desenvolvimento de modelos experimentais torna-se importante na medida em que estes auxiliam na compreenso dos fenmenos naturais. Na cincia mdica permitem o melhor conhecimento da fisiologia, da etiopatogenia das doenas, da ao de medicamentos ou dos efeitos das intervenes cirrgicas. Sua maior importncia est relacionada ao respeito barreira tica de no interveno primria experimental em anima nobile. Nesse sentido, o modelo experimental deve ser, funcionalmente, o mais semelhante possvel ao que se objetiva estudar.2 Existem diversos modelos experimentais descritos. Em pesquisas clnico-cirrgicas os modelos
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experimentais mais utilizados so as culturas de clulas e tecidos (pesquisa in vitro), os animais de laboratrio (pesquisa in vivo) e os estudos anatmicos, geralmente em cadveres de seres humanos. Outros modelos experimentais utilizados em pesquisas das reas bsicas da sade tambm podem ser encontrados na Biblioteca Virtual da Sade (BVS).3 Modelos animais Os modelos animais podem ser utilizados em todos os campos da pesquisa biolgica. Tratando-se de modelos experimentais, torna-se importante a conceituao de doena animal, que aquela cujos mecanismos patolgicos so suficientemente similares queles de uma doena humana, atuando assim como modelo. Esse modelo animal, obrigatoriamente, deve permitir a avaliao de fenmenos biolgicos naturais, induzidos ou comportamentais, que possam ser comparados aos fenmenos humanos em questo. 1 Anteriormente a era moderna, os animais de laboratrio

Modelos experimentais em pesquisa

eram utilizados como simples instrumentos de trabalho, auxiliando na investigao do diagnstico de diferentes pesquisas, sem levar em considerao sua condio sanitria e gentica. Com o avano da Cincia, essas condies tornaram-se exigncias, levando criao de uma autntica especialidade, a Cincia em animais de laboratrio.4 Atualmente, os pesquisadores exigem que esses animais renam condies ideais, e que sejam mantidos em ambiente controlado para que atendam os parmetros de qualidade sanitria e gentica, uma vez que so reagentes biolgicos, e os resultados dos experimentos podem ser afetados em razo das condies de cada espcie utilizada. Ainda, quanto maior a uniformidade dos animais em relao s variveis ambientais, genticas e experimentais, menor ser a quantidade amostral mnima de animais necessrios para a pesquisa ser realizada. Assim, os animais utilizados em experimentao podem ser classificados quanto ao status ou condio sanitria, genotpica e como modelo experimental. Status sanitrio ou ecolgico Status sanitrio ou ecolgico o resultado do estudo da relao dos animais com o seu particular e especfico ambiente de organismos associados. Os organismos associados, ou biota, inclui a flora externa (microorganismos superficiais e ectoparasitas) e a flora interna. Os animais experimentais so distribudos em comuns ou convencionais, com biota indefinida e ao acaso para a espcie, ou em definidos ou gnotobiticos (gnoto = conhecer; biota = vida), nos quais se sabe a biota associada por estarem submetidos a rigorosas barreiras sanitrias. Conceitualmente, os animais gnotobiticos, alm de possurem uma biota conhecida, tambm podem t-la conhecidamente no existente ou no detectvel. Subdistribuem-se em axnicos (germfree), livres de vida associada, ou com flora definida propriamente dita. Na prtica, por motivos tcnicos e operacionais, apenas camundongos e ratos so passveis de reproduo em ambiente axnico. A partir de animais axnicos so obtidos os animais com flora definida, pela contaminao proposital da rao com microorganismos especficos. Esses animais de flora definida so classificados conforme o nmero de espcies conhecidas da microbiota que o habita, sendo monoxnicos, dixnicos, e assim sucessivamente, at serem polixnicos; ou so classificados como heteroxnicos, conforme a(s) espcie(s) que sabidamente no o habita em sua biota, sendo denominados como Animais Livres de Germes Patognicos Especficos, ou mais conhecidos na literatura especfica como Specific Pathogen Free (SPF). Ainda, os animais heteroxnicos podem ser distribudos pela sabida ausncia sorolgica de uma carga antignica especfica, como os animais VAF (Virus Antibody Free) (Quadro 1).5 A obteno de animais axnicos tambm exige tecnologia especfica. Realiza-se a histerectomia estril na fmea prenha um dia antes de nascerem os filhotes. O tero com os fetos mantido em solues apropriadas, e so nutridos por meio de um sistema de barreira

placentria, constitudo de uma membrana semipermevel com restos placentrios. No momento oportuno, a cria retirada do tero, realiza-se uma reanimao cardiorrespiratria nos filhotes, e os mesmos so entregues aos cuidados e alimentao de uma amade-leite. Para que sejam aceitos por essa nova nutriz, os filhotes so levemente molhados com a urina da mesma.5

QUADRO 1 - Resumo do status sanitrio dos animais de laboratrio.

Em relao fisiologia geral, os animais axnicos so, via de regra, semelhantes aos convencionais em relao ao crescimento, peso e temperatura corporal. Porm, nos axnicos a espessura das paredes vasculares e alveolares, assim como a velocidade da maturao sexual so menores. Em relao fisiologia digestiva, os animais axnicos tambm so, via de regra, semelhantes aos convencionais na estrutura histolgica e funcional do estmago e pncreas. Porm, nos axnicos a superfcie da mucosa do intestino delgado 30% menor e mais lisa, o trnsito intestinal mais lento, e a quantidade de clulas reticuloendoteliais, placas de Peyer e de plasmcitos menor. O pH no lume do intestino grosso mais alcalino pela depleo de cidos graxos, em virtude da ausncia de uma microflora. A escolha de modelos gnotobiticos ir depender do objetivo da pesquisa, da quantidade e da qualidade do microorganismo colonizador do animal. Esse tipo de modelo pode ser utilizado para a anlise da virulncia de um microorganismo, ou para o isolamento de um anticorpo especfico. Animais convencionais, quando submetidos a estresse, podem apresentar infeco provocada por um microorganismo latente de sua flora podendo comprometer o resultado do experimento, principalmente com relao a quantidade amostral. Pesquisas que envolvam modelos animais raros ou apresentem alto custo, podem se beneficiar do uso de animais gnotobiticos. Os objetivos da Gnotobiologia so a obteno de novas matrizes livres de patgenos, para a realizao de pesquisas experimentais multidisciplinares, assim como a elucidao do efeito barreira, ou seja, do fenmeno de como a microbiota de um organismo o protege de outros micro-organismos patognicos externos ou intermos, visando o entendimento da interActa Cirrgica Brasileira - Vol 20 (Supl. 2) 2005 - 29

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relao hospedeiroflora. Ainda, visa a eliminao da interferncia da flora microbiana para estudos de fenmenos biolgicos. A Gnotobiologia no Brasil iniciouse em 1961, com o pesquisador Enio Cardillo Vieira, da Universidade Federal de Minas Gerais, estudando o crescimento e a reproduo do caramujo Biomphalaria glabrata axnico.6 Status genotpico Animais heterognicos (no-consangneos, heterocruzados, heterogmicos, outbred) Os animais heterognicos so obtidos mediante cruzamentos ao acaso, existindo um ndice de 99% de heterozigose entre os genes alelos. Ainda, so os animais que fazem parte da maioria das pesquisas laboratoriais, como os camundongos (Mus musculus, Swiss Webster), ratos ( Rattus norvegicus - Wistar) e hamsters (Mesocricetus auratus). Esses animais constituem-se na fonte de origem dos consangneos e, a partir desses, obtm-se os hbridos e transgnicos. Os animais mutantes podem advir dos no-consangineos ou consangneos, embora na Cincia em animais de laboratrio prefira-se obt-los e mant-los a partir do segundo tipo gentico. Animais isognicos (consangneos, endocruzados, isogmicos, inbred) Os roedores conseguem suportar cruzamentos totalmente consangneos, permitindo acasalamentos entre irmos por vrias geraes. As linhagens so obtidas a partir do cruzamento de animais consangineos por 20 geraes consecutivas. Nesses animais isognicos existe um ndice de 99% de homozigose entre os genes alelos. 7 Esse fator permite a criao de populaes estveis e geneticamente homogneas. A ausncia de variveis genticas inter-animais torna menor o nmero amostral mnimo para um experimento, coexistindo apenas as variveis ambientais ou experimentais. Animais hbridos As linhagens de animais hbridos resultam do cruzamento entre linhagens de animais isognicos ( inbred ). Esses animais mantm respostas imunes similares aos animais das linhagens que lhe deram origem. Entretanto, os hbridos nascem em proles maiores, e possuem maior vigor fsico, taxa de crescimento e longevidade que os animais das linhagens ascendentes. Animais recombinantes consangneos (isognicos recombinantes, recombinantes inbred) Os animais chamados isognicos recombinantes so resultantes do cruzamento aleatrio, entre animais hbridos, durante 20 geraes consecutivas.

Animais transgnicos A Engenharia Gentica tem permitido o acrscimo de genes clonados ou fragmentos de DNA nos cromossomos de modelos animais de experimentao. Assim, criou-se um animal transgnico que adquiriu, de forma estvel, informaes genticas diversas de seus genitores. Atravs de uma micropipeta realiza-se a insero de um fragmento de DNA linear clonado, no interior de um dos proncleos da clula. Acredita-se que a integrao ocorra aleatoriamente, na maioria das vezes, durante a primeira diviso mittica. Assim sendo, todas as clulas possuem em seu genoma esse transgene. Em alguns casos, essa integrao se faz de maneira heterognea. Esses animais apresentam um genoma do tipo mosaico, pela presena tanto de clulas normais quanto de transgnicas. 8 provvel que o desenvolvimento de animais transgnicos seja a melhor forma de se estudar a oncognese. A Universidade Federal de So Paulo Escola Paulista de Medicina (UNIFESP-EPM), a partir do laboratrio de animais transgnicos do Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais em Medicina e Biologia (CEDEME) conseguiu desenvolver, no Brasil, o primeiro animal geneticamente modificado por meio da tcnica de microinjeo pronuclear. Mediante a duplicao do receptor B2 da bradicinina, relacionado aos processos inflamatrios e hipertenso, criou-se um modelo experimental (camundongo) para o estudo de doenas como hipertenso, cncer, diabetes, Alzheimer e AIDS.9 Deve-se estar atento aos cuidados com esses animais uma vez que, devido ao conhecimento incipiente de seu desenvolvimento natural, podero ocorrer algumas alteraes ainda desconhecidas, gerando condies que tornariam a sua utilizao um procedimento antitico. Animais mutantes As mutaes podem ocorrer ao acaso ou serem provocadas em laboratrio, gerando animais mutantes espontneos ou mutantes provocados, respectivamente, capazes de permitir o desenvolvimento de doenas. Quando so espontneas e autossmicas recessivas, preserva-se a mutao cruzando o mutante com um heterozigoto para esse gene. Animais mutantes espontneos Um dos modelos mais utilizados em pesquisa o mutante espontneo chamado camundongo atmico, tambm conhecido na literatura como nude mouse . O animal apresenta-se com ausncia de timo ou com timo rudimentar, sendo assim portador de deficincia de imunidade celular por linfcitos-T, tolerando a integrao de heterotransplantes. Trata-se de mutao de um gene recessico autossmico, situado no cromossomo 11. Nesse caso, o acasalamento se faz entre machos nu/nu X fmea Nu/nu (ou nu/+). As fmeas tm de ser heterozigotas, pois a ausncia de plos impede que mantenham os filhotes aquecidos e a produo de leite menor. Os animais so menores que os respectivos no mutantes,

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crescem mais lentamente, apresentam defeitos de ossificao, so menos frteis e apresentam maior mortalidade. A imunodeficincia torna esses animais vulnerveis e com alto grau de morbidade, sendo esse um fator limitante para alguns tipos de pesquisas. Os folculos pilosos so normais, mas a excessiva queratinizao da pele impede a sua erupo.7 O camundongo atmico tem sido mais utilizado em estudos de neoplasias e cicatrizes normais e patolgicas.10 Esse modelo possibilitou, historicamente, a descrio das clulas assassinas naturais ( Natural Killer ou clulas NK). 4,9 Devido a alta morbidade, a criao e manuteno desses animais necessitam de um biotrio estruturado, equipado com fluxo laminar, alm de alimentos e gua estreis e, portanto, com custo oneroso. 2 Animais mutantes provocados Em relao aos animais mutantes provocados, as mutaes podem ser induzidas por meio de agentes mutagnicos qumicos ou fsicos, dentro de um gene escolhido. Consegue-se manipular in vitro, ou seja, dentro das clulas embrionrias em cultura, uma seqncia de DNA normal por uma seqncia homloga mutada. At o presente momento, essa tcnica usada com sucesso para vrios tipos de expresses fenotpicas, unicamente nos camundongos, pois apenas nessa espcie existem clulas E.S. ( Embryonic Stem cells). 11 A tcnica de substituio in vitro de um segmento de DNA normal por uma seqncia alterada e de interesse experimental, chamada de gene knock-out. Permite, em teoria, inativar qualquer gene, desde que sua seqncia genmica seja conhecida. Por exemplo, podese nocautear a produo da interleucina-4 pelo animal, chamando-se o camundongo assim obtido de IL-4 knock out . Analogamente, pode-se ativar ou duplicar uma seqncia genmica, tcnica denominada de gene knock-in , ou simplesmente mudar uma seqncia (tcnica de substituio). O quadro 2 apresenta um resumo esquemtico do status genotpico dos modelos animais experimentais.

Status como modelo experimental Modelo induzido Trata-se de um modelo experimental no qual o animal submetido a um procedimento capaz de provocar uma morbidade, com a finalidade de se realizar um procedimento experimental. O procedimento pode ser de natureza clnica ou cirrgica, classificando os animais em modelo clnico induzido ou modelo cirrgico induzido, respectivamente. O modelo experimental induzido permite a livre escolha de espcies. Exemplo de modelo clnico induzido o uso do aloxano, substncia capaz de provocar hiperglicemia permanente em vrias espcies de roedores. Dessa forma, possvel desenvolver um estado diabtico que permite, por exemplo, o estudo das complicaes sistmicas do diabetes e possveis modalidades de tratamentos.12 Como exemplo de modelo cirrgico induzido podese citar o retalho cutneo isqumico randmico dorsal em ratos (rattus norvegicus, var. albinus). 13 Esse modelo tem sido utilizado em Cirurgia Plstica para o estudo da cicatrizao. Esse retalho apresenta uma rea de necrose em sua extremidade distal, podendo ser utilizado para avaliao experimental dos efeitos malficos da nicotina,14 aumentando a rea de necrose. Tambm possvel testar o efeito benfico de frmacos como a terazocina sobre a circulao desses retalhos.15 Esse modelo experimental tambm tem sido utilizado para a avaliao do efeito da Estimulao Eltrica Nervosa Transcutnea (TENS) sobre a viabilidade desse retalho cutneo randmico.16 Tambm existem pesquisas da utilizao desse modelo experimental no estudo de alteraes bioqumicas seqenciais do estresse oxidativo sobre o retalho.17,18 Modelo negativo Quase o oposto das situaes espontneas e induzidas so os modelos negativos, nos quais uma doena especfica no se desenvolve. Modelos negativos tambm incluem animais demonstrando falta de reatividade a um estmulo especfico. Sua principal aplicao reside em estudos sobre o mecanismo de resistncia para compreender melhor suas bases fisiolgicas. Pode-se induzir em modelos animais uma imunossupresso por meio de quimioterpicos, tornandoos modelos negativos em relao reatividade a um alotransplante. Assim, foi possvel transplantar um membro inferior inteiro entre ratos geneticamente distintos.19-23 Modelo rfo Um modelo rfo de doena descreve a condio que ocorre naturalmente em espcies no-humanas, mas no foi descrita ainda em humanos. Trata-se de um tipo de modelo experimental relativamente raro. Exemplo seria a encefalopatia espongiforme bovina (doena da vaca louca).

QUADRO 2 - Resumo do status genotpico dos animais de laboratrio.

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Modelo adotado Um modelo rfo torna-se adotado quando uma doena semelhante em humanos identificada posteriormente. Modelo com local de privilgio imunolgico artificial A procura de modelos com deficincia imunolgica para receber transplantes, para assim dispensar a utilizao de animais imunodeficientes com suas implicaes, e visando um nus operacional mais acessvel, tem-se desenvolvido locais de privilgio imunolgico (Immunlogically Privileged Sites).24 Um Local de Privilgio Imunolgico resultaria da ausncia, ou deficincia, de uma via anatmica aferente apropriada para drenar material antignico a uma estao linftica regional, cuja presena reconheceria o antgeno e iniciaria a resposta imune. Tem sido amplamente pesquisado em modelos experimentais locais de privilgio imunolgico na crnea, no cristalino ocular e na cmara anterior do olho de animais, principalmente em coelhos. Foram tambm desenvolvidos locais de privilgio imunolgico artificiais, como cmaras de difuso com Millipore, tecidos de cicatrizes e retalhos ilhados com pedculo vascular alinftico.25 Modelo com local de privilgio imunolgico natural Existe um animal experimental portador de um local de privilgio imunolgico natural. 26 O hamster sirio dourado (Mesocricetus auratus), mamfero roedor, possui em cada lado da cavidade oral uma bolsa. Essas bolsas jugais so divertculos ou invaginaes saculares bilaterais das mucosas jugais altamente distensveis que, sob a pele, se estendem da extremidade posterior da cavidade oral at aproximadamente o nvel das escpulas do hamster. A funo dessas bolsas o armazenamento de comida e, especificamente na fmea, serviria como um meio de transportar a ninhada em situaes de perigo (hamstern, do idioma alemo, significa apropriar-se). A parede da bolsa constituda por camadas de clulas epiteliais que se apiam em tecido conjuntivo areolar frouxo naturalmente imunodeficiente, aparentemente com ausncia de vasos linfticos. A estao linftica regional de drenagem seria o linfonodo regional cervical superficial. Os pesquisadores, principalmente entre as dcadas de 1950 e 1980, expressaram o entusiasmo da comunidade cientfica da poca, referindo-se propriedade de integrao de homo e heteroenxertos no subepitlio da bolsa jugal ou da bochecha do hamster, como um modelo til para o estudo de diversos tecidos, inclusive pele, cicatrizes e quelide, apresentando um custo pouco oneroso.2,26-28 Cultura de clulas, tecidos e rgos (Modelos in vitro)

permitido um aumento no uso desse tipo de modelo experimental. A aplicabilidade desse modelo experimental em Cirurgia Plstica, por meio da cultura de queratincitos, tem permitido a realizao de diversos estudos sobre a cicatrizao e seus distrbios. 29 O modelo de cultura de fibroblastos de quelides tem sido utilizado para anlise do comportamento bioqumico, e da ao de fatores de crescimento sobre estas leses, comparando-se com fibroblastos de derme normal.30,31 Culturas de clulas provenientes de neoplasias cutneas tambm vm sendo aplicadas no estudo do comportamento destes tumores. Cadveres como modelo experimental Os cadveres tm sido utilizados como modelos experimentais desde a antiguidade, sendo possvel encontrar desenhos anatmicos em pinturas rupestres na Austrlia. Posteriormente, descobriu-se estudos anatmicos em pinturas persas. 4 Esse modelo experimental tem sido utilizado em estudos dos mais variados tipos, como anlise de esfago curto, 32 comparaes de procedimentos cirrgicos entre modelos animais e humanos, 33 estudos biomecnicos em fechamentos de esternotomia, 34 operaes esofgicas,35 dentre outros. Na Cirurgia Plstica a maior aplicabilidade desse modelo reside nos estudos anatmicos de retalhos musculares e vascularizao de retalhos, proporcionando o aperfeioamento e a elaborao de novos retalhos (cutneos, fasciocutneos, msculo-cutneos e microcirrgicos).36-38 Outra aplicabilidade desse modelo experimental est no estudo da tenso dos componentes msculo-aponeurticos da parede abdominal anterior.39 Esse tipo de modelo experimental tem proporcionado a compreenso das tcnicas j descritas de descolamento msculo-aponeurtico seletivo para reconstruo da parede abdominal, 40 permitindo tambm o desenvolvimento de novas possibilidades tcnicas. Apesar da compatibilidade anatmica, trata-se de um modelo experimental ainda pouco explorado. Contexto dos modelos experimentais No contexto atual, a utilizao de modelos experimentais tem sido muito importante no somente para o aperfeioamento e comprovao de tcnicas e procedimentos j existentes, como tambm para o desenvolvimento de outros. A elaborao de protocolos de pesquisa e a submisso a comits de tica institucionais tm permitido a execuo de projetos envolvendo modelos no contemplados pela legislao vigente como, por exemplo, a utilizao de cadveres frescos em estudos especficos. A experimentao animal, assim como os estudos clnicos em humanos, tem permitido a compreenso dos diversos processos fisiolgicos e patolgicos que os acometem. Referncias

So modelos experimentais utilizados nos casos em que se deseja avaliar o comportamento molecular, bioqumico, celular e histoqumico de tecidos normais ou patolgicos. Os avanos em Biologia Celular tm
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Correspondncia: Lydia Masako Ferreira Disciplina de Cirurgia Plstica / Departamento de Cirurgia Universidade Federal de So Paulo (UNIFESP EPM) Rua Napoleo de Barros, 715 - 4 andar 04024-900 So Paulo - SP Brasil Tel: (5511) 5576-4118 lydia.dcir@epm.br

Como citar este artigo: Ferreira LM, Hochman B, Barbosa MVJ. Modelos experimentais em pesquisa. Acta Cir Bras [serial online] 2005;20 Suppl. 2:28-34. Disponvel em URL: http://www.scielo.br/acb.

34 - Acta Cirrgica Brasileira - Vol 20 (Supl. 2) 2005