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EFECTOS DEL CASTRADO Y DEL ESTRADIOL EN RATAS Dalmasso David Leonel.

Libson Lucas Martin Ctedra de Fisiologa Animal, FCEFyN. Noviembre 2012. RESUMEN Los estrgenos, secretados por los ovarios, poseen una actividad predominante (frente a la progesterona) en la preparacin para la cpula y la fecundacin (controlan el ciclo sexual de las hembras, inducen el estro). Para demostrar los efectos del estradiol se utilizaron ratas ya que su ciclo sexual dura entre 4 a 5 das. Se utilizaron 4 ratas; dos fueron tomadas como control, otra se la ovariectomiz y recibi una dosis diaria de estradiol 0,1 ml durante los siguientes 6 das, la otra tambin fue castrada pero no recibi estradiol en ningn momento. Tambin se observo la conducta sexual de las hembras utilizando el mtodo llamado preferencia de compaero sexual. Al finalizar se sacrificaron las 4 ratas y se compararon sus teros. Los objetivos del trabajo son evidenciar los efectos de la castracin y de la aplicacin exgena de estradiol en ratas castradas, el comportamiento sexual y/o copulatorio, desarrollo y morfologa del tero. Los resultados indicaron que el estradiol induce el estro en ratas y que en esta etapa existe una preferencia hacia machos activos sexualmente de parte de las ratas problemas. Igualmente se observaron diferencias morfolgicas en teros de ratas con dosificacin de estrgenos exgenos, con hipertrofias o de mayor tamao. INTRODUCCION El estradiol (E2 o 17-estradiol, como tambin oestradiol) es una hormona esteroide sexual femenina. El estradiol es abreviado E2 ya que tiene dos grupos hidroxilos en su estructura molecular. La estrona tiene 1 (E1) y el estriol tiene 3 (E3). El estradiol es alrededor de 10 veces ms potente que la estrona y alrededor de 80 veces ms potente que el estriol en sus efectos estrognicos. A excepcin de la fase temprana folicular del ciclo menstrual, sus niveles sanguneos son algo ms altos que los de la estrona durante los aos reproductivos de la mujer. Por lo tanto, el estradiol es el estrgeno predominante durante los aos reproductivos tanto en los niveles sricos absolutos como tambin en la actividad estrognica. Durante los aos reproductivos, la mayora del estradiol en las mujeres es producido por las clulas granulosas de losovarios por la aromatizacin de la androstenediona (producida en las clulas foliculares tecales) a estrona, seguido por la conversin de estrona a estradiol por 17-beta hidroxiesteroide deshidrogenasa. Pequeas cantidades de estradiol tambin son producidas por la corteza suprarrenal, y (en hombres), por los testculos. El estradiol no es nicamente producido en las gnadas: En ambos sexos, las hormonas precursoras (especficamente la testosterona) son convertidas por aromatizacin a estradiol. En particular, el tejido adiposo es activo en convertir los precursores a estradiol, y continan hacindolo aun despus de la menopausia. El estradiol tambin es producido en el cerebro y en las paredes arteriales.

El estradiol entra libremente a las clulas e interacta con el receptor celular. Despus de que el receptor estrognicose haya unido a su ligando, el estradiol puede entrar al ncleo celular de la clula objetivo, y regular la transcripcin gentica, que lleva a la formacin del ARN mensajero. El ARNm interacta con las ribosomas para producir protenasespecificas que expresan el efecto que el estradiol tiene sobre la clula objetivo. El estradiol se une bien a ambos receptores estrognicos, ER, y ER, a diferencia de ciertos otros estrgenos, en particular las medicaciones que actan en solo uno de estos receptores. Estas medicaciones son llamadas moduladores selectivos de los receptores estrognicos, o por el acrnimo en ingls SERMs. El estradiol es el estrgeno natural ms potente. Ciclo estral en la rata El ciclo estral de la rata dura entre 4 y 5 das y se puede dividir en cuatro fases que se caracterizan por marcadas diferencias en los niveles plasmticos de las hormonas reproductivas. Dado que las caractersticas de las clulas del epitelio vaginal son tpicas de cada fase del ciclo estral, un anlisis exhaustivo de este epitelio, a travs del mtodo de frotis o exudado vaginal, permite identificar estas fases, que describimos a continuacin: PROESTRO-dura aprox. 12 hs. Los folculos antrales en expansin secretan estrgenos, que promueven la proliferacin y el consecuente engrosamiento del epitelio vaginal, entre otros efectos. Al final de esta fase aumenta la frecuencia de los pulsos de GnRH y consecuentemente de FSH y LH, esta ltima desencadenar la ovulacin. En el frotis vaginal observamos clulas epiteliales nucleadas y redondas, simples o en capas y ausencia de leucocitos. ESTRO-dura aprox. 9-15 hs. En este perodo ocurre la ovulacin, aproximadamente a las 10 hs de comenzado el estro y la hembra se encuentra sexualmente activa. Durante esta fase, la hembra aumenta su atractividad, debido a la hinchazn de la vulva y la liberacin de feromonas, y despliega comportamientos proceptivos de bsqueda del macho, as como lordosis, postura dorsoarqueada en respuesta a la monta del macho, que permite la intromisin del pene en la vagina (esta postura se utiliza como ndice de receptividad sexual). La receptividad sexual dura alrededor de 13 hs y usualmente se liberan entre 10 y 20 vulos por ovulacin. Debido a la cada de los niveles de estrgenos, la capas ms externas del epitelio vaginal se queratinizan y descaman hacia el lumen. Por este motivo, el frotis vaginal se caracteriza por grandes cantidades de clulas cornificadas, chatas, irregulares y sin ncleo. METAESTRO-dura aprox. 21 hs. Durante esta fase, el efmero cuerpo lteo secreta progestgenos y pequeos folculos antrales comienzan su crecimiento. A travs del epitelio vaginal, delgado y con escasa actividad mittica, migran leucocitos hacia el lumen. Por este motivo, en el frotis vaginal se observa la presencia de abundantes leucocitos y algunas clulas cornificadas. DIESTRO-dura aprox. 56 hs. Durante esta fase continua el crecimiento folicular promovido por la FSH, con la consiguiente liberacin de concentraciones crecientes de estrgenos. Si bien el epitelio vaginal an es delgado, comienza su proliferacin, por lo que en el frotis vaginal se observan leucocitos y algunas clulas epiteliales nucleadas.

EXPERIMENTO Se realizo un extendido vaginal de las 4 ratas, con el objetivo de saber en que parte del ciclo se encontraban antes de empezar el experimento. Los resultados fueron los siguientes: Rata 1: Estro. Rata 2: Diesto. Rata 3: Diestro. Rata 4: Proestro. Castracin: 2 ratas fueron castradas (ovariectomizadas) y las otras 2 quedaron a modo de control. Se procedi a pesar las 2 ratas castradas, con el objeto de dosificar la cantidad de justa de hidrato de cloral 6%. Se utilizan 0,7 ml de hidrato de cloral cada 300 gramos de peso corporal. Una vez anesteciadas, se empez con la ciruga, siguiendo las instrucciones de la Jefa de TP. Una vez finalizada la ciruga, se puso a las 2 ratas castradas (OVX) en una caja y las 2 ratas control en otra caja. Administracin de Estradiol: Desde el dia de la castracin, y consecutivamente durante una semana, se le administro a la rata numero 2 0,1 ml de Estradiol, inyectado intraperitonialmente. Durante la semana que duro el experimento, se realizaron diaramente un extendido vaginal a las 4 ratas para verificar en que estado del ciclo mestrual se encontraban las mismas. Los extendidos expusieron los siguientes resultados: RATA 1234OVX OVX+E2 CONTROL CONTROL Miercoles Jueves Viernes Sabado Lunes Martes Miercoles E D D P E E P E M E M D E E D D M E M E M E E D M E D P

*E: Estro. *P: Proestro. *D: Diestro. *M: Metaestro.

Test de preferencia sexual: Durante 5 dias previos al test, se coloco a cada hembra durante 5 minutos por dia en el aparato de campo abierto para producir su habituacin y familiarizacin con el entorno, sin la presencia de los animales estimulos. El dia anterior al sacrificio, se procedi a la exposicin de las ratas experimentales (castradas) a la presencia de un macho activo sexualmente y una hembra en estro, confinados en sendas jaulas de alambre en los extremos de la arena. Se registro el comportamiento con una filmadora durante 5 minutos aproximadamente. El aparato de campo abierto tiene las siguientes divisiones, dependiendo en la cercana de que animal estimulo (o zona neutral) se encuentra la rata experimental. Cabe destacar, que se toma como patrn de invasin a cualquier zona que solo la cabeza de la rata experimental entre en dicha zona.

Se procedi a contar el tiempo que la rata experimental permanecia en las 3 zonas definindose: A: vecindad del macho. B:vecindad de la hembra. C:zona neutra. Luego se calcula el porcentaje del tiempo que paso en cada zona: (Tiempo pasado en un area particular/tiempo total registrado)*100. Finalmente se calcularon los Puntajes de Preferencias, siendo este: Tiempo pasado en la vecindad del macho-Tiempo pasado en la vecindad de la hembra. Un Puntaje de Preferencia positivo indicara una preferencia por el macho.

Los resultados fueron los siguientes: Rata Numero 1 (OVX): Con hembra: 80 segundos. (21,97%) Zona neutral: 133 segundos. (36,53%) Con macho: 151 segundos.(41,48%) Rata Numero 2 (OVX+E2): Con hembra: 44 segundos.(14,66%) Zona neutral: 97 segundos.(32,33%) Con macho: 159 segundos.(53%) Rata Numero 3 (Control): Con hembra: 36 segundos.(12%) Zona neutral: 150 segundos.(50%) Con macho: 114 segundos.(38%) Luego, los puntajes de referencia resultaron: Rata 1: 151-80=71 segundos Preferencia por el macho. Rata 2: 159-44=115 segundosPreferencia por el macho. Rata 3: 114-36=78 segundosPreferencia por el macho. Con estos resultados, se afirma que la inyeccin de Estradiol promueve la preferencia sexual por un macho activo; y que la castracin sin la inyeccin la reduce.

Morfologia Uterina: Luego de sacrificar las 4 ratas, se le extirpo el utero para poder compararlos morfolgicamente. Los resultados fueron los siguientes:

*Rata 1: OVX *Rata 2: OVX+E2 *Rata 3: Control

Como se puede observar, en la rata numero 1 podemos apreciar una ligera disminucin del tamao (atrofia) y un color mas claro en relacin a las ratas 2 y 3. En la rata 2 hay una hipertrofia uterina y un color mas oscuro respecto a la rata control, que se encontraba en Diestro. Todo esto permite controlar que el tratamiento a largo plazo con estrgeno (estradiol) origina hipertrofia endometrial (Ganong) mayor a la normal, y por lo tanto podemos deducir que este utero estaba predispuesto a recibir el cigoto. En sntesis podemos decir que, respecto al tamao y la vascularizacin: Rata 1<Rata 3<Rata 2.

Test de Aprendizaje: Este test consiste en 3 etapas: La adquisicin: que es la exposicin del sujeto experimental al estimulo doloroso. La consolidacin: que es el tiempo que se deja al sujeto para que asimile y procese la informacin recibida en la adquisicin. (En este caso fue de 30 minutos.) La recuperacin: que consiste en el test en si, se vuelve a exponer al sujeto al estimulo y se observan los cambios. Este experimento lo realizamos introduciendo a las ratas en una caja que posee una plataforma libre de estimulo, y que el resto del suelo produce una descarga inofensiva, la cual seria el estimulo en si. Se tomo el tiempo en el que la rata se bajaba de la plataforma libre del estimulo, apoyando sus 4 patas sobre la zona agresiva. Los tiempos medidos fueron los siguientes: Aprendizaje Memoria 1,64s 13,02s Rata 1: OVX 1,25s 15,95s Rata 2: OVX+E2 9,74s 38,09s Rata 3: Control 3s 3,55s Rata 4: Control

Podemos concluir que la rata control manifiesta un claro desarrollo superior de la memoria en relacin a las ratas castradas. Esto podra deberse a que al no tener ovarios que produzcan las hormonas que deberan producir normalmente, no se completa el feedback natural que debera haber entre estas hormonas y el hipotlamo, afectando a la memoria.

CONCLUSION En animales, el ciclo estral es un parmetro de gran sensibilidad y es utilizado para brindar informacin acerca de la respuesta del rgano reproductivo y del entorno hormonal influyente. En concordancia con los efectos obtenidos el Estradiol parece ser fundamental en la preferencia sexual ya que seria necesaria para que la rata incie el Estro. Finalmente es evidente una accin trofica de esta hormona a nivel utero, que se ve incrementado al aumentar la concentracin o tiempo de permanencia de la misma.

BIBLIOGRAFIA Suarez, M. (2012) Fisiologa Animal. Gua de trabajos prcticos. Imprenta CEICIN.Cordoba.Argentina. Ganong,W.F. (18 edicin, 2006). Manual de Fisiologa Medica. Editorial: El Manual Moderno S.A. Mexico. http://es.wikipedia.org/wiki/estradiol