TILA VERLANE SOARES

Deteco e caracterizao de substncias antioxidantes no endocarpo dos frutos de Persea americana (Lauraceae)

Monografia apresentada ao Departamento de Qumica Orgnica do Instituto de Qumica da Universidade Estadual Paulista UNESP, para obteno do ttulo de Licenciado em Qumica, com atribuies de Bacharel em Qumica.

Orientadora: Prof. Dr. Mrcia Nasser Lopes

Araraquara

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2009
tila Verlane Soares
Monografia apresentada ao Departamento de Qumica Orgnica do Instituto de Qumica da Universidade Estadual Paulista UNESP, para obteno do ttulo de Licenciado em Qumica, com atribuies de Bacharel em Qumica. Araraquara, 09 de dezembro de 2009

Banca examinadora:

Prof. Dr. Mrcia Nasser Lopes (orientadora) Instituto de Qumica UNESP, Araraquara

Prof. Dr. Dulce Helena Siqueira Silva Instituto de Qumica UNESP, Araraquara

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Prof. Dr. Vanderlan da Silva Bolzani Instituto de Qumica UNESP, Araraquara

DADOS CURRICULARES
Dados Pessoais: tila Verlane Soares Endereo eletrnico: atysoares@yahoo.com.br Lattes: http://lattes.cnpq.br/5471530276740427

Formao Acadmica: 03/2004 12/2009 Graduao em Qumica Licenciatura: Universidade Estadual Paulista Jlio de Mesquita Filho, UNESP, Araraquara SP. Ttulo da Monografia: Deteco e caracterizao de substncias antioxidantes no endocarpo dos frutos de Persea americana (Lauraceae). Orientadora: Prof. Dr. Mrcia Nasser Lopes Bolsista: Pibic/CNPq - Proex/UNESP

Experincia Acadmica: Integrante do NuBBE Ncleo de Bioensaios, Biossntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais, do Departamento de Qumica Orgnica do Instituto de Qumica da UNESP (15h semanais), 02/2008 12/2009.

Laboratrio de Enzimologia do Departamento de Bioqumica do Instituto de Qumica da UNESP (12h semanais), 03/2006 11/2007.

Projeto Universia-Proex/UNESP Confeco e publicao de textos jornalsticos de divulgao cientfica (12h semanais), 05/2005 11/2007.

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Trabalhos apresentados em congressos: SOARES, tila Verlane; Zanon, Dulcimeire A. V.; Primani, Lucas; Lima, Dimitri C. A Importncia da Experimentao em Sala de Aula para o Ensino de Jovens e Adultos. In: VII EVEQ, Araraquara, 2009.

SOARES, tila Verlane; Lopes, M. N.; Bolzani, V. S. Deteco e caracterizao de substncias antioxidantes no endocarpo dos frutos de Persea americana (Lauraceae). In: XXI CIC-UNESP, S. J. Rio Preto, 2009. SOARES, tila Verlane; Lopes, M. N.; GAMBOA, I. C. Desenvolvimento de metodologias analticas para a deteco de substncias antioxidantes em Persea americana (Lauraceae) utilizando abordagens in silico e tcnicas hifenadas (CLAE/DAD-EMAR). In: 16 SIICUSP, So Paulo, 2008.

SOARES, tila Verlane; Jornalismo Cientfico aplicado ao processo de aprendizagem. In: 13 ENEQ, Campinas, 2006.

SOARES, tila Verlane; Divulgao Cientfica e Acadmica do IQ como parte do processo de ensino e aprendizagem. In: IV EVEQ, Araraquara, 2006.

Participao em eventos: VII Evento de Educao em Qumica. 2009.

XXI Congresso de Iniciao Cientfica da UNESP. 2009.

II Comemorao do Dia do Qumico. 2008.

XVI Simpsio de Iniciao Cientfica da USP. 2008.

I Quimiarte. 2008.

XIII Encontro Nacional de Ensino de Qumica. 2006.

IV Evento de Educao em Qumica. 2006.

XXXVI Semana da Qumica. 2006.

I Comemorao do Dia do Qumico. 2006.

III Evento de Educao em Qumica. 2005.

III Semana da Qumica do Oeste Paulista. 2005.

XXXV Semana da Qumica. 2005.

Organizao de eventos: SOARES, tila Verlane; V Evento de Educao em Qumica "Ensino de Qumica: Perspectivas e Aplicaes". 2007.

SOARES, tila Verlane; I Workshop de Cursinhos Pr-Vestibulares da UNESP. 2006.

SOARES, tila Verlane; I Workshop de Ps-Graduao em Qumica: Formao de Recursos Humanos e Transferncia de Tecnologia. 2006.

SOARES, tila Verlane; I Workshop Ps-Graduao em Qumica da SBQ Regional Interior Paulista Waldemar Saffioti "Estratgias para maior entrosamento e fortalecimento dos cursos de ps-graduao em qumica do interior paulista". 2006.

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Dedico este trabalho aos meus pais e minha namorada Ia.

DISCURSO DE AGRADECIMENTO
Os ltimos seis anos mudaram a minha vida de uma maneira to arrebatadora que eu no me reconheceria se voltasse no tempo. O ingresso na Universidade foi, sem dvida, o estopim desta reviravolta; mas foram as pessoas, as excepcionais e inestimveis pessoas com quem tive a honra de dividir o tempo e o afeto, as verdadeiras responsveis pela concluso deste divisor de guas que a

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vida Universitria. A elas sim devo toda gratido por esta conquista, de maneira que seria injusto, tamanha a parcela de contribuio, omitir os nomes dos co-autores deste texto que, ademais, encerra traos e vieses de cada personalidade. Como no comear pela minha famlia? Agradeo de corao minha me que, em sua simplicidade e cumplicidade, soube dosar apoio, carinho e advertncias carregadas de boas intenes. Obrigado mame! Com o mesmo penhor, agradeo tambm a meu pai, que no teve reservas de ateno e de esforos para assegurar a minha estadia em Araraquara. Obrigado papai! E agradeo ainda ao meu irmo Paulinho, minha irm Fabula e minha sobrinha Laiz, pelo apoio nas horas de dificuldade, pelas dicas e conversas e pelos agradveis momentos em famlia. Muito da minha sanidade, nesta atribulada vida de universitrio, se deve ao carinho da minha namorada Iara e de sua filhinha Yasmin que, entre muitas outras graas, tm o dom de me fazer sentir importante, querido e vido por novos desafios. Sempre que volto Passrgada vivo inigualveis momentos de felicidade que no poderia pagar, seno com muito amor. Obrigado pelo carinho princesas. Aos tios e tias que me acolheram com orientaes e abrigo em minha primeira migrao (Minas - So Paulo) e que, em maior ou menor grau, influenciaram a minha escolha pela vida universitria, registro minha gratido. Em particular minha tia N, pelo carinho e as constantes assistncias financeiras aos meus pais e pelo financiamento do meu computador porttil, sem o qual seria invivel a concluso desta monografia no prazo estabelecido. Agradeo distintamente minha orientadora, Professora Mrcia Nasser Lopes, que no hesitou em abraar um projeto audacioso, mas sem perspectiva de

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financiamento pelas grandes agncias. Obrigado pela amizade, orientao, oportunidade de amadurecimento profissional e acadmico, pela compreenso e pelo apoio em todos os momentos. Igual importncia teve o Professor Ian CastroGamboa, pela concepo da idia do projeto e pela orientao nos meus primeiros passos como integrante do NuBBE. Agradeo a sua pacincia, ateno e empenho. Alm de gratido, cabe aqui um pedido de desculpas minha primeira orientadora, Professora Olga Maria Mascarenhas de Faria Oliveira. Um de nossos dois projetos no chegou a ser concludo, mas em nada isto diminui a relevncia e produtividade dos nossos trs anos de parceria. O Jornal RadioAtivo e o Portal Universia que o digam. No tivemos trabalhos em comum, alm das respectivas disciplinas, mas por transcenderem a funo de Professores Universitrios com laos de amizade e uma acessibilidade incomum, agradeo aos professores Miguel Ruiz, ngela Regina Arajo, Maysa Furlan, Maria Del Pilar Taboada Sotomayor e Fernando Luis Fertonani. Com vocs aprendi muito mais que qumica. Encerrando a seqncia docente, no poderia deixar de lembrar e agradecer a dois professores: ao Professor Homero Marques Gomes, da FCT UNESP de Presidente Prudente, pelas orientaes e o apoio na ocasio da minha transferncia e ao professor Mrlon Heberth Flora Barbosa Soares, da Universidade Federal de Gois por desvendar e ensinar o lado ldico da qumica. Ambos influenciaram profundamente o meu trajeto acadmico. As atividades no NuBBE I teriam sido ainda mais penosas, qui impossveis, sem a ajuda do Fernando, da Vnia, da Sara, da Scheila, do Albertinho, do Nivaldo e da Luciana Polese. Um laboratrio de qumica orgnica no parece to assustador quando se tem colaboradores especiais como vocs. Valeu pessoal!

A vida de universitrio desafiadora. O cumprimento de metas, prazos e notas, as disciplinas extenuantes e a convivncia com personalidades e culturas to dspares quanto enriquecedoras exigem pacincia, versatilidade e comprometimento acima da mdia. Isto especialmente vlido para quem vive na Moradia Estudantil da UNESP, j que a dificuldade financeira representa um obstculo parte. De sorte, no um desafio solitrio. Amigos e parceiros transformam limites em estmulo, dvidas em metas, monotonia em festa. Estes personagens to necessrios merecem muito mais do que a minha gratido. Perdoem a impossibilidade de citar todos, mas h aqueles que, por sua maior parcela de culpa pelos bons momentos, no poderiam ser omitidos. Comeo pelos mais antigos. Ningum teve maior influncia na minha escolha pelo curso de Qumica do que a minha amiga Dbora. Ainda no cursinho ela era a animao em pessoa, pau pra toda obra. Corremos, malhamos, danamos, pedimos carona, estudamos e passamos juntos no vestibular. Obrigado pelos bons e velhos tempos, D. No d pra falar da Dbora sem lembrar a Dina, o Danilo, o Gerson, a Edilene, o Sidney, o Gil, a Celinha, a Bete, a Adriana, as Trigmeas e a Renata. Valeu gente! Sem vocs eu no teria chegado at aqui. Alm da D, duas pessoas marcaram a minha passagem pela UNESP de Presidente Prudente. Lgia e Luclia reformularam o meu conceito de amizade. 2004 foi um ano inesquecvel e a responsabilidade por isto , em grande parte, destas fadas. Obrigado pela amizade verdadeira meninas. Em Araraquara um amigo se destaca. O economista Bruno no tem precedentes. Dono de uma inteligncia sagaz, de um interminvel repertrio de sacadas e da imaginao mais frtil que eu j vi, ele consegue despertar o que h de melhor nas pessoas atravs do seu bom humor e da capacidade de conversar

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sobre qualquer coisa. Muito obrigado pela sua amizade, meu caro. Alm do Bruno, morei com outras nove pessoas que tambm incentivaram e torceram pelo meu sucesso. Minha gratido sincera ao meu amigo e companheiro de quarto Adalberto pela boa convivncia, Slvia (ou Jlia, para os amigos) pelos momentos de descontrao, ao Weverton, Tiago e Daniel pela amizade e apoio, ao Cleto e Rafael pela troca de experincias. Minha formao em Araraquara no se limitou academia. As atividades esportivas estiveram to presentes que, no raro, algum perguntava por que escolhi Qumica em vez de Educao Fsica. Neste contexto, o vlei e a dana de salo revelaram notvel evidncia. Das muitas disputas nas areias da Faculdade de Cincias e Letras (FCLAr) eu fui, sem modstia, o maior vencedor, j que por prmio tive as amizades de Andr, Iara, Anderson, Jorge, Breno, Dabana, Alexandre e Eduardo Kuninari. Obrigado pelas nossas peladas galera! Para aliviar o estresse das provas e seminrios, o forr universitrio do SESC era parada certa. Com as Caris: Baroni, Dentini e de Simone, alm de Lara e Elisa no salo, era impossvel pensar na ressonncia dos aromticos ou na famigerada equao de Walter Nernst. Agradeo a honra desta dana, meninas! O tango tambm rendeu boas amizades, alm de trs festivais no Teatro Municipal de Araraquara, e apresentaes em So Carlos, Ja, Mato, no Clube Nutico, na FCLAr e na Faici. Minha professora, Dona Elza Pimentel e a minha parceira predileta, Simone Okama, sero sem dvida, bons motivos de retorno a esta amistosa e ctrica cidade. No h como no sentir-se grato por tanta estima. Ao som do bandonen, outras pessoas ganharam minha afeio e respeito. Agradeo Michele, Aninha e Tereza, pela parceria, Baby Soares e ao Luciano, pelas caronas aos bailes, Aline e ao Marcel pelos passos novos e a todo o grupo,

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agradeo pela amizade sincera, pelos momentos de distrao e por aquele inexplicvel prazer que s a dana proporciona. De volta ao mbito acadmico, sinto que faltaria com a honestidade se no creditasse tambm o meu muito obrigado, queles personagens, sob certo ponto de vista, cotidianos, mas que tiveram inegvel participao e contribuio no bom andamento do curso. Agradeo s secretrias Cintia, Shirley, Rose e Sueli pela ateno e pela prestimosa ajuda na poca do jornalzinho; agradeo ao Ivan e Geni, da STA pela disposio e eficincia nos assuntos relacionados bolsa BAAE; agradeo ao tcnico Valdenir e ps-graduanda (agora doutora) Ktia, pelos treinamentos no laboratrio de bioqumica e finalmente agradeo s bibliotecrias: Marilda, Valria, Ctia, Rita, Bel, Cristina e Alice pelo atendimento de qualidade, pelo sorriso fcil e pela eficincia em tornar vida dos alunos mais dinmica neste ambiente de freqncia constante. Obrigado ainda Pr-Reitoria de Extenso PROEX, pela bolsa concedida.

Nossos conhecimentos fizeram-nos pessoas cticas, desumanas e cruis. Pensamos muito e sentimos cada vez menos. Mais do que

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tecnologias, precisamos de humanidade, mais do que inteligncia, de afeio e respeito. (Charles Chaplin)

A imaginao mais importante que o conhecimento. (Albert Einstein)

RESUMO
Metablitos secundrios so substncias que protegem o vegetal de agentes agressivos externos. Tais componentes possuem potencial ao biolgica que pode ser aproveitada para fins teraputicos. Lauraceae encontra-se amplamente distribuda nos principais ecossistemas brasileiros e possui espcies ricas em metablitos secundrios, tais como terpenides, antocianidinas, flavonides e outros derivados fenlicos, com reconhecida importncia econmica e teraputica. Aniba riparia, por exemplo, tem ao antibitica e Persea gratssima, ao antineoplsica. Apesar de sua ampla utilizao na medicina popular, poucos estudos qumicos do

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gnero Persea tm sido relatados. Este trabalho descreve o estudo fitoqumico e avaliao do potencial antioxidante dos extratos do endocarpo de Persea americana Mill. As fraes polares (A1 e B1) foram submetidas a vrias tcnicas cromatogrficas (CCDC, coluna XAD-4, HPLC-UV) que resultaram no isolamento de quatro substncias, sitosterol, triacilglicerdeo, um glicosdeo de sete carbonos (C7) e um glicosdeo dimrico. A elucidao/identificao estrutural foi realizada atravs das anlises espectroscpicas uni e bidimensionais de RMN de 1H e 13C. Foi verificada intensa atividade antioxidante nas fraes F4A e F11B, entretanto, no se obteve massa suficiente para elucidao estrutural da(s) substncia(s) ativa(s). Palavras-chave: Lauraceae, Persea americana, endocarpo, antioxidantes,

metablitos secundrios.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Principais rotas biossintticas do metabolismo secundrio (PERES, 2009, PLAZA, 2007; SIMES et al., 1999).......................................................................xxv Figura 2: Diferentes classes de flavonides (MUSCHIETTI; MARTINO, 2007)...............................xxviii Figura 3: Caractersticas estruturais requeridas para a atividade antioxidante (MUSCHIETTI & MARTINO, 2007). ...............................................................................xxix

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Figura 4: Representao da estrutura qumica do caroteno. Note-se a extensa conjugao..................xxxii Figura 5: Estruturas qumicas dos alcalides: nicotina e cocana..................................................................xxxiii Figura 6: Produo de oxirradicais a partir de oxignio singlete seguida de ao antioxidante enzimtica (peroxidase) (FERNANDES, 2006)............................xxxiv Figura 7: Mecanismo de ao antioxidante de flavonides por seqestro de radicais (PLAZA, 2007). .............................................................................xxxvi Figura 8: Fontes de espcies reativas e mecanismos de defesa (PLAZA, 2007)............................................xxxvii Figura 9: Antineoplsicos de origem natural (CRAGG & NEWMAN, 2007)......................................................xlviii Figura 10: Importantes fitoterpicos de origem natural (CRAGG & NEWMAN, 2007)............................................l Figura 11: Novas substncias no combate ao vrus HIV (CRAGG & NEWMAN, 2007). .........................................li Figura 12: Correlao entre o nmero de espcies em cada gnero e o total de espcies de Lauraceae (MARQUES, 2001).......................................................liii Figura 13: Nmero de espcies medicinais em cada gnero, comparado ao total de espcies (MARQUES, 2001).........................................................................liv Figura 14: Polinizao da flor do abacateiro (esq.) e seu fruto, o abacate (Arquivo pessoal)..............................lvi Figura 15-a: Estruturas de metablitos secundrios encontrados em abacate...........................................lviii Figura 16: Mecanismo de ao antioxidante sobre o radical DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazila)..................lxvi Figura 17: Seqncia de reao para a formao dos esteris a partir do cicloartenol (SILVA, 2007)..........lxxiii

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Figura 18: Comparao entre as estruturas de sitosterol e estigmasterol.....................................lxxiv Figura 19: Espectro de RMN de 1H produzido pelo sitosterol.............................................................lxxiv Figura 20: Espectro de RMN de 13C produzido pelo sitosterol..............................................................lxxv Figura 21: Estrutura do triacilglicerdeo simtrico.. .lxxvii Figura 22: Espectro de RMN de 1H produzido pelo triacilglicerdeo.....................................................lxxviii Figura 23: Espectro de RMN de 13C produzido pelo triacilglicerdeo.....................................................lxxviii Figura 24: Estrutura da D-manno-heptulose (C7)......lxxix Figura 25: Espectro de RMN 1H da heptulose (C7).....lxxx Figura 26: Espectro de RMN 13C produzido pela heptulose................................................................lxxx Figura 27: Espectro de RMN 1H do glicosdeo dimrico (C14)......................................................................lxxxi Figura 28: Espectro de RMN 13C do glicosdeo dimrico (C7).......................................................................lxxxii Figura 29: Espectro de RMN de 1H da frao F4A....lxxxiii Figura 30: Placa de CCDC da frao F4A, diluda em 1:5, 1:10, 1:25 e 1:50, revelada com DPPH....................lxxxiv Figura 31: Percentual de seqestro do radical DPPH das fraes F4A e FS3, em vrias concentraes, obtido por avaliao espectrofotomtrica em placa de 96 poos. ............................................................................lxxxiv

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LISTA DE TABELAS E FLUXOGRAMAS

Tabelas:

Tabela 1: Principais terpenides encontrados nas plantas (PERES, 2009). ............................................xxxi Tabela 2: Principais compostos funcionais investigados pela cincia (SBAF)....................................................xlii Tabela 3: Efeitos adversos que podem ocorrer devido ao uso de plantas medicinais (Adapt. VEIGA Jr, 2005)......xlv Tabela 4: Etapas envolvidas na produo de fitoterpicos (DAVID et al. 2004)...............................xlix Tabela 5: Atribuies dos valores de deslocamento qumico ( ) para cada carbono da molcula de sitosterol..............................................................lxxv

Fluxogramas:

Fluxograma 1: Preparao do extrato bruto do endocarpo dos frutos de Persea americana................lxix Fluxograma 2: Processo de isolamento do sitosterol e do triacilglicerdeo.....................................................lxx

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Fluxograma 3: Processo de isolamento do glicosdeo (C7) e do acar dimrico (C14)........................................lxxi

LISTA DE ABREVIATURAS

ABA AcOEt ABTS aq. C18 CCDC CDCl3 CLAE COSY DAD DCM dd DMPD DMPO DMSO-d6 DPPH ERN ERO EtOH FRAP FrX grad. IC50 m/z MeOH MHz/Hz min. NuBBE 1 O2 O2.p. pH prep. Rf

cido Abscsico Acetato de Etila cido 2,2-azino-bis(3- etilbenzotiazolin)-6sulfnico Aquosa Slica Gel de Fase Reversa (octadecilsilano) Cromatografia em Camada Delgada Comparativa Clorofrmio deuterado Cromatografia Lquida de Alta Eficincia Correlated spectroscopy Detector em Arranjo de Diodos Diclorometano Duplo dubleto Dicloridrato de N,N-dimetil-p-fenilendiamina 5,5-dimetil-1-pirroline-n-oxido Dimetilsulfxido deuterado Difenil-picril-hidrazila Espcie reativa de nitrognio Espcie reativa de oxignio lcool etlico Poder antioxidante de reduo frrica Extrato bruto do endocarpo Gradiente Concentrao inibitria de 50% Relao massa/carga Metanol Megahertz/Hertz Minuto Ncleo de Bioensaios, Biossntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais Oxignio singlete Radical superxido Pgina Potencial Hidrogeninico Preparativo(a) Fator de Reteno

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RMN 13C RMN 1H S t TMS Tr UV-Vis

Ressonncia Magntica Nuclear de Carbono 13 Ressonncia Magntica Nuclear de Hidrognio Singleto Tripleto Tetrametilsilano Tempo de Reteno Ultra Violeta - Visvel

SUMRIO
INTRODUO.............................................................xxi
METABOLISMO DAS PLANTAS.......................................................xxiii COMPOSTOS FENLICOS..............................................................xxvi 1.2.1 FLAVONIDES.................................................................................xxvii TERPENOS..................................................................................xxxi ALCALIDES..............................................................................xxxiii RADICAIS LIVRES.......................................................................xxxiv ANTIOXIDANTES........................................................................xxxvi 1.6.1ANTIOXIDANTES NOS ALIMENTOS.....................................................xxxvii 1.6.2DETERMINAO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE................................xxxix ALIMENTOS FUNCIONAIS................................................................xli PLANTAS MEDICINAIS...................................................................xliii FITOTERPICOS...........................................................................xlvi ESPCIE EM ESTUDO........................................................................li 1.10.1 CONSIDERAES DA FAMLIA LAURACEAE.........................................lii 1.10.2 Persea americana MILL.....................................................................lv

OBJETIVOS..................................................................lx MATERIAIS E MTODOS..............................................lxii

3.1. 3.2. SOLVENTES E REAGENTES.................................................lxii CONCENTRAO DAS AMOSTRAS .....................................lxiii

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3.3. 3.4. 3.5. 3.6. 3.7.

CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD) .................lxiii CROMATOGRAFIA EM COLUNA ..........................................lxiii CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA.................lxiv RESSONNCIA MAGNTICA NUCLEAR.................................lxiv LEITOR DE MICROPLACAS..................................................lxv

3.8. AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE POR DESCORAMENTO DE CAROTENO ............................................................................lxv 3.9. AVALIAO ESPECTROFOTOMTRICA DA ATIVIDADE SEQUESTRADORA DE RADICAL LIVRE POR REDUO DO RADICAL 2,2DIFENIL-1-PICRILHIDRAZILA (DPPH). ..............................................lxv 3.10. 3.10.1 3.10.2 3.10.3 3.11. 3.12. 3.13. 3.14. METODOLOGIA DE PREPARO DE AMOSTRAS ....................lxvi ANLISES VIA CCDC: ..................................................................lxvii ANLISES VIA CLAE: ..................................................................lxvii ANLISES VIA RMN: ...................................................................lxvii COLETA DO MATERIAL VEGETAL....................................lxviii PREPARAO DO EXTRATO BRUTO................................lxviii FRACIONAMENTO DO PRECIPITADO (A)..........................lxviii FRACIONAMENTO DO SOBRENADANTE (B)........................lxx

RESULTADOS E DISCUSSES.....................................lxxii
4.1. ESTERIDES........................................................................lxxiii 4.1.1 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.3. SITOSTEROL..................................................................................lxxiii TRIACILGLICERDEO......................................................................lxxvi HEPTULOSE (C7).........................................................................lxxviii DMERO (C14)................................................................................ lxxx ANLISE DA FRAO F4A...............................................lxxxii 4.2. GLICDIOS E CIDOS GRAXOS: METABOLISMO PRIMRIO........lxxvi

CONCLUSES.......................................................lxxxvi REFERNCIAS.......................................................lxxxvii

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INTRODUO

utilizao de insumos da natureza como fonte de agentes medicinais

remonta aos primrdios da humanidade (CRAGG & NEUMAN, 2007). Os primeiros registros datam de 2100 a.C. e descrevem o uso de leos e extratos de cedro (Cedrus), cipestre comum (Cupressus semprevirens), alcauz (Glicyrrhiza glabra), mirra (Commiphora species) e suco de papoula (Papaver somniferum), sob forma de comprimidos de argila em cuneiforme. Todas estas espcies, ainda em nossos dias, tm aplicaes medicinais no tratamento de distrbios dos mais diversos, desde

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resfriados e tosses a infeces parasitrias e inflamaes diversas (BORCHARDT, 2002; CRAGG & NEUMAN, 2007). Hoje se sabe que o potencial de aplicao da biodiversidade como fonte de novos quimiotipos e farmacofros gigantesco. Apenas 5 - 15% das cerca de 250.000 espcies de plantas superiores foram sistematicamente investigadas e menos de 5% das espcies de fungos e 1% das espcies de bactrias so conhecidas, o que sugere possibilidades aparentemente ilimitadas para estas novas fontes microbianas, notadamente aquelas encontradas em ambientes extremos (YUNES e CECHINEL FILHO, 2007, CRAGG & NEUMAN, 2007). Mudanas importantes vm sendo observadas na rea da pesquisa de novos frmacos devido aos avanos da biologia molecular, mapeamento gentico, bioensaios automatizados e quimiogenmica. Esses eventos tm levado a indstria farmacutica a redirecionar seus investimentos na busca por frmacos de origem natural (NEWMAN et al., 2003). Perto de 70% dos agentes antitumorais e antibiticos disponveis no mercado ou em estgios de avaliao clnica so de origem natural ou derivados de substncias naturais (PINTO et al., 2002). Estima-se que os fitoterpicos representem 6,5% dos produtos farmacuticos comercializados por ano no mundo, movimentando mais de 20 bilhes de dlares em um total de US$ 320 bilhes/ano (MLLER e MACEDO, 2005). Um problema grave na comercializao ou possibilidade de exportao de fitoterpicos no Brasil a falta do status de medicamento tico que lhe garanta eficcia, segurana e qualidade, padres estes mensurados em bases cientficas que garantem confiabilidade ao usurio. Muitas espcies de plantas medicinais da biota brasileira tm potencial para uma maior projeo econmica, entretanto, a maioria das plantas medicinais comercializadas no Brasil j popular no cenrio mundial. De maneira que plantas medicinais endmicas ainda so pouco conhecidas e se constituem num fascinante assunto de pesquisa acadmica e de desenvolvimento (PINTO et al., 2002). A avaliao do potencial teraputico de plantas medicinais e de alguns de seus constituintes, tais como flavonides, alcalides, triterpenos, sesquiterpenos, taninos, lignanas, etc., tem sido objeto de incessantes estudos, visando comprovao de suas aes farmacolgicas atravs de testes pr-clnicos. Muitas destas substncias tm grandes possibilidades de

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futuramente virem a ser aproveitadas como agentes medicinais (CHECHINEL FILHO E YUNES, 1998). Neste contexto de diversidade de espcies com aplicaes teraputicas potenciais e comprovadas, Persea americana tem sido apontada como uma promissora matriz de estudo, por ser rica em vitaminas A, E e do complexo B, alm de potentes antioxidantes que atuam na proteo dos tecidos do corpo contra a ao dos radicais livres (TERASAWA et al., 2006; SALGADO, 2005; SOONG E BARLOW, 2004; NOSE E FUJINO, 1982; GEISSMAN E DITTMAR, 1965). Estas observaes motivaram e nortearam as atividades experimentais que resultaram na compilao do presente texto o qual descreve a caracterizao qualitativa dos componentes majoritrios presentes no endocarpo da semente desta espcie, alm da avaliao de sua atividade antioxidante.

METABOLISMO DAS PLANTAS

Nas clulas de organismos vivos ocorre um complexo conjunto de reaes qumicas, denominado metabolismo, que nos vegetais pode ser dividido em primrio e secundrio, de acordo com a sua funo. Metabolismo primrio o conjunto de processos associados s funes essenciais, como a fotossntese, a respirao e o

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transporte de solutos. Compostos como os aminocidos, nucleotdeos, lipdios, carboidratos e a clorofila esto envolvidos no metabolismo primrio e possuem uma distribuio universal nas plantas (PERES, 2009; PLAZA, 2007). No metabolismo secundrio so sintetizadas substncias que a princpio, no possuem funo essencial. Tais substncias, contudo, so responsveis pela proteo do vegetal de diversos agentes agressivos, representando a interface qumica entre a planta e o meio externo. Desta forma, o metabolismo secundrio exerce um papel importante na interao entre as plantas e seu ambiente circundante e, no raro, influenciado e mesmo modificado por este ambiente (PERES, 2009; GOBBO-NETO & LOPES, 2007; DI STASI, 1996). Dentre os fatores ambientais que influenciam o contedo dos metablitos secundrios pode-se citar: sazonalidade, ciclo circadiano, desenvolvimento da planta, temperatura, disponibilidade hdrica, radiao ultravioleta, nutrientes (macro e micronutrientes), altitude, poluio atmosfrica e induo por estmulos mecnicos ou ataque de patgenos. Assim sendo, as concentraes de metablitos secundrios podem variar muito numa mesma espcie. Em plantas medicinais, outros fatores como condies de coleta, estabilizao e estocagem tambm podem ter grande influncia (GOBBO-NETO & LOPES, 2007; CSEKE et al., 2006). Existem trs grandes grupos de metablitos secundrios: terpenos, compostos fenlicos e alcalides. Os terpenos so sintetizados a partir cido mevalnico (no citoplasma) ou do piruvato e 3-fosfoglicerato (no cloroplasto), os compostos fenlicos, a partir do cido chiqumico e os alcalides so derivados de aminocidos aromticos (triptofano, tirosina), tambm oriundos do cido chiqumico ou de aminocidos alifticos (PERES, 2009). A figura 1 esquematiza as principais rotas biossintticas destes compostos.

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Figura 1: Principais rotas biossintticas do metabolismo secundrio (PERES, 2009, PLAZA, 2007; SIMES et al., 1999).

Embora uma planta possa conter centenas de metablitos secundrios, apenas os compostos presentes em maior concentrao so geralmente isolados e estudados pela fitoqumica clssica. A anlise de substncias ativas muito mais complexa e longa, j que geralmente os compostos presentes em menor proporo na planta so os que apresentam melhores efeitos biolgicos. Por isto a necessidade de um trabalho em colaborao mais ampla entre qumicos e farmaclogos para a anlise de extratos, fraes e finalmente, os compostos puros. Neste sentido, torna-se indispensvel a anlise do potencial das fraes e das substncias puras em relao sua concentrao. Esta avaliao permite predizer se o principal componente qumico responsvel pela atividade biolgica foi realmente determinado. Desta forma, para se obter substncias puras dotadas de efeitos biolgicos, requerido, alm da dedicao e da determinao dos pesquisadores, um contexto multidisciplinar de trabalho (CHECHINEL FILHO E YUNES, 1998).

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COMPOSTOS FENLICOS

Os compostos fenlicos constituem uma classe de substncias derivadas principalmente do cido chiqumico que so responsveis pelo sabor, odor e colorao de diversos vegetais. Alm disso, eles protegem as plantas contra a ao dos raios ultravioleta, e tambm de insetos, fungos, vrus e bactrias, evitando, em alguns casos, o crescimento de plantas competidoras (ao aleloptica). A proteo contra a fotodestruio proporcionada por esses compostos devida s suas propriedades de absorver ou dissipar a energia solar, principalmente devido sua extensa conjugao. Quimicamente, so substncias que possuem pelo menos um anel aromtico no qual ao menos um hidrognio substitudo por um grupamento hidroxila (PERES, 2009; GOBBONETO & LOPES, 2007). A biossntese dos compostos fenlicos ocorre com a combinao de uma unidade de cido chiqumico e uma ou mais unidades de acetato ou derivados. O cido chiqumico formado pela condensao aldlica de dois metablitos derivados da glicose, o fosfoenol-piruvato e a eritrose 4-fosfato (SIMES et al, 1999). H vrios relatos na literatura apontando estes compostos como substncias potencialmente ativas frente a testes qumicos e biolgicos indicando que essa classe de substncias merece ateno especial nas pesquisas direcionadas descoberta de novos frmacos (PERES, 2009; YUNES e CECHINEL FILHO, 2007; MUSCHIETTI & MARTINO, 2007; BALASUNDRAM, 2006; CSEKE et al., 2006; ZHOU, 2006; LIMA, 2002). Em sua composio, o vinho tinto, por exemplo, possui misturas de polifenis, principalmente antocianinas e flavan-3-is, alm de outros fenlicos como o resveratrol e o cido glico. Corder e colaboradores (2006) identificaram as procianidinas, que so taninos condensados, como o principal polifenol vasoativo presente nos vinhos tintos (25-50% do total de fenlicos constituintes), atravs da avaliao da dilatao dos vasos sanguneos e a conseqente supresso da sntese da endotelina-1, um peptdeo capaz de constringir os vasos sanguneos.

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Flavonides, taninos, antocianinas e outros constituintes fenlicos possuem potencial antioxidante, impedindo o efeito danoso dos radicais livres. Visando a melhoria e sustentao da sade, de vital importncia o consumo dessas fontes naturais de substncias para organismo humano, pois os fenlicos contribuem para a manuteno do equilbrio pr e antioxidante de sistemas biolgicos, desempenhando funo essencial na preveno de doenas (CSEKE et al., 2006).

1.2.1

FLAVONIDES

Os flavonides so o maior e mais diversificado grupo de compostos fenlicos do reino vegetal somando cerca de oito mil molculas de ocorrncia natural. Eles foram descobertos em 1930, pelo prmio Nobel Szent-Gyrgy, que extraiu a citrina da casca do limo. (BALASUNDRAM et al, 2005; HEIM et al, 2002, MUSCHIETTI & MARTINO, 2007). Esta classe de compostos participa na fase dependente de luz da fotossntese, durante a qual catalisam o transporte de eltrons. Ela desempenha um papel fundamental no organismo humano atuando na proteo contra agentes oxidantes como, por exemplo, os raios ultravioleta, a poluio ambiental, substncias qumicas presentes nos alimentos, entre outros, agindo ainda como agentes teraputicos contra diversas patologias (SILVA, 2007). Nas plantas, so responsveis por diversas funes biolgicas como: (i) proteo dos tecidos vegetais contra danos fotossintticos; uma vez que so capazes de atuarem como filtros de radiao ultravioleta por absorverem radiao eletromagntica na regio de 280 a 315 nm; (ii) proteo contra insetos, fungos e bactrias; (iii) atrao de insetos polinizadores; (iv) atividade antioxidante; (v) controle da ao de hormnios vegetais; (vi) agentes alelopticos; e (vii) inibio enzimtica (PERES, 2009; HEIM et al, 2002; HARBORNE e WILLIAMS, 2000). Eles so importantes constituintes da dieta humana, apesar de no serem considerados nutrientes, e esto presentes em uma grande variedade de vegetais, bebidas como o ch e vinho, e em frutas, especialmente as ctricas. Calcula-se que a ingesto diria de flavonides aportados pela dieta de entre 50-800 mg/dia

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(PIETTA, 2000), ainda que alguns autores manifestem que possa ser at de 1g dirio (MUSCHIETTI & MARTINO, 2007). Uma xcara de ch verde ou um copo de vinho tinto podem proporcionar at 200 mg de flavonides totais; uma cebola, 40 mg/100g; uma salada verde, 1 mg/; 100g, uma ma, 6-10 mg; um pssego, 1-2mg e uma laranja 10 mg. O fato de que estejam presentes na dieta e que se atribua a eles uma grande variedade de atividades biolgicas faz supor que estes polifenis poderiam cumprir uma funo protetora diante das enfermidades cardiovasculares e contra certas formas de cncer. Existem alguns estudos clnicos que sustentam esta hiptese (MUSCHIETTI & MARTINO, 2007; PIETTA, 2000). Podem ser encontrados em diferentes formas estruturais, contudo, nas frutas e em certos vegetais, a estrutura qumica recorrente consiste em dois anis benznicos (A e B) ligados a um anel heterocclico central de seis membros contendo um tomo de oxignio (C) (compostos tricclicos). A grande diversidade estrutural dos flavonides (figura 2) explicada pela sua reatividade frente hidroxilao, metilao, glicosilao, entre outras, o que possibilita a ocorrncia de grupos hidrofenlicos livres (agliconas), metilados ou ligados a acares (glicosdeos) (KOES et al, 1994).

B A C

Figura 2: Diferentes classes de flavonides (MUSCHIETTI; MARTINO, 2007).

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Os flavonides esto divididos em dois grandes grupos: antocianinas e antoxantinas. As antoxantinas podem ser incolores ou apresentarem colorao amarela plida (LIMA et al, 2002) e esto subdividas em cinco grandes subclasses, flavanas, flavonas, flavonis, isoflavonas e flavanonas, cada qual apresentando caractersticas peculiares quanto sua estrutura e ao efeito bioativo que exercem (LE GALL et al, 2003). Considera-se que sejam compostos pouco txicos. Assim, por exemplo, a DL50 do etilrutosdeo, um derivado semi-sinttico da rutina, maior que 30 g/kg (MUSCHIETTI & MARTINO, 2007). Em relao aos efeitos benficos sade humana, destaca-se a atividade antioxidante, explicada pela presena de grupos doadores de hidrognio (hidroxilas fenlicas), pela deslocalizao eletrnica estvel nos anis aromticos e heterocclicos (conjugao) e tambm pela presena de certos grupos estruturais capazes de formar complexos quelantes de metais de transio que podem regular a produo de radicais livres (MUSCHIETTI & MARTINO, 2007; BALASUNDRAM et al, 2006; ZHOU e YU, 2006; MONTORO et al, 2005; PAREJO et al, 2005; WANG et al, 2005; AMI et al, 2003; LIMA et al, 2002), como ilustra a figura 3.

B A C

Figura 3: Caractersticas estruturais requeridas para a atividade antioxidante (MUSCHIETTI & MARTINO, 2007).

Vrios trabalhos apontam os efeitos biolgicos destes compostos; indicando que o consumo de flavonides pode atuar contra alguns tipos de cnceres (ZHOU e YU, 2006; WANG et al, 2005; AMI et al, 2003; HEIM et al, 2002), exercer efeitos

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hepatoprotetores (HRYNTSEVICH e SHADYRO, 2005), apresentar propriedades anti-neurodegenerativas, como Parkinson e Alzheimer (ZHOU e YU, 2005; AMI et al, 2003), agir tambm contra doenas estomacais e intestinais (PAREJO et al, 2005), e atuar de maneira efetiva contra as doenas cardiovasculares e pulmonares (BALASUNDRAM et al, 2005; MONTORO et al, 2005; ZHOU e YU, 2005; AMI et al, 2003; HEIM et al, 2002). Alm dos efeitos citados, os flavonides tambm tm vasta ao biolgica, apresentando efeito antibacteriano, antiviral, antiinflamatrio e antialrgico (BALASUNDRAM et al, 2005; MONTORO et al, 2005; PAREJO et al, 2005). Estudos sugerem que a capacidade antioxidante total das frutas e vegetais no devida somente presena do cido ascrbico, mas tambm de outros compostos que teriam ao sinrgica no sistema, como os flavonides (KUSKOSKI et al, 2005; HEIM et al, 2002).

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TERPENOS

Terpenos compem uma classe de metablitos secundrios, semelhante aos polmeros, conhecida pelas suas importantes funes biolgicas e fisiolgicas e, por isso, muito utilizada na rea farmacutica. Um exemplo marcante desta aplicao o Taxol, um frmaco com ao antitumoral, isolado de Taxus brevifolia (Taxaceae) (SADE-GUIMARES & FARIA, 2007). Inicialmente eles eram conhecidos apenas como originados das plantas superiores atravs da via biossinttica do acetatomevalonato, com a ligao de unidades de isopreno, orientados em sentido inverso (cabea-cauda). No entanto, aps a descoberta de outra via que no depende do mevalonato, o conceito da biossntese desta classe de compostos passou por mudanas. A nova via no opera no citoplasma, como a convencional, mas no plastdio, sintetizando terpenides como a clorofila e os carotenides (PERES, 2009; NIERO & MALHEIROS, 2007). Como se pode observar na tabela 1, muitos compostos vegetais importantes so terpenos ou possuem derivados de terpenos em partes de sua molcula. Entre esses compostos encontram-se, inclusive, quatro, das seis principais classes de hormnios vegetais (PERES, 2009).

Tabela 1: Principais terpenides1 encontrados nas plantas (PERES, 2009).

Notar que os terpenides so precursores de quatro classes hormonais: as citocininas (CKs), o cido abscsico (ABA), as giberelinas (GAs), e os brassinoesterides (BR) (PERES, 2009).

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So conhecidos cerca de 30.000 terpenos que apresentam funes variadas nos vegetais. Os monoterpenos (C 10) so os principais constituintes dos leos volteis, atuando na atrao de polinizadores. Sesquiterepenos (C 15), em geral apresentam funes protetoras contra fungos e bactrias, enquanto muitos dos diterpenos (C20) originam os hormnios de crescimento vegetal. Os triterpenos (C 30) e seus derivados esteroidais constituem talvez o grupo mais importante dos terpenides por apresentarem diversas propriedades medicinais, destacando-se os efeitos antiinflamatrios, analgsicos, cardiovasculares e antitumorais, alm de uma gama de funes para a planta, como proteo contra herbvoros, germinao das sementes e inibio do crescimento da raiz (NIERO & MALHEIROS, 2007; NIERO et al., 1999). H tambm os tetraterpenos (C40) como o caroteno (figura 4) e o licopeno, antioxidantes naturais presentes em frutas e hortalias de cor vermelha e os poliisoprenos, dentre os quais est a borracha, um terpeno formado por 1.500 a 15.000 unidades de isopreno, encontrada no ltex de diversas plantas, sendo a seringueira (Evea brasiliensis) a de maior expresso econmica (PERES, 2009).

Figura 4: Representao da estrutura qumica do -caroteno. Note-se a extensa conjugao.

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ALCALIDES

Os alcalides so compostos orgnicos cclicos, sintetizados no retculo endoplasmtico, que possuem pelo menos um tomo de nitrognio no seu anel, o que, na maioria dos casos, confere um carter alcalino molcula. Essa classe de compostos do metabolismo secundrio possui substncias com acentuado efeito no sistema nervoso, sendo muitas delas largamente utilizadas como venenos ou alucingenos. J na antiguidade h referncia ao uso de alcalides sendo talvez o caso mais famoso a execuo do filsofo grego Scrates, condenado a ingerir cicuta, Conium maculatum, uma fonte do alcalide conina (PERES, 2009) Os alcalides tambm podem ser muito teis para a sociedade, a despeito de representantes pouco nobres (figura 5) como a nicotina, a cocana e o LSD. Talvez o exemplo mais representativo seja a descoberta de que os alcalides vincristina (Oncovin) e vimblastina (Velban) (figura 9), presentes em vinca, Vinca rosea, podem ser utilizados na cura de certos tipos de cncer. Alm disso, como os alcalides possuem um pronunciado efeito no sistema nervoso de mamferos, muitos remdios para distrbios emocionais so derivados deles (PERES, 2009).

Figura 5: Estruturas qumicas dos alcalides: nicotina e cocana.

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RADICAIS LIVRES

Radicais

livres

so

espcies

que

contm

um

ou

mais

eltrons

desemparelhados. O eltron livre que caracteriza o radical livre pode estar centrado em um tomo de hidrognio, oxignio, nitrognio, carbono, enxofre ou tomos de metais de transio. As espcies reativas mais comuns so as de oxignio (EROs) e de nitrognio (ERNs). Em condies fisiolgicas, de todo o oxignio molecular captado nas mitocndrias e processado na cadeia respiratria, s 1 a 5% escapam e formam oxirradicais. Vale notar que nem todas as EROs so radicais, o perxido de hidrognio e o oxignio singlete ( 1O2) no possuem eltrons desemparelhados, e sua reatividade atribuda ao fato de seus eltrons de valncia estarem situados em orbitais mais distantes do ncleo, o que leva o tomo a um estado qumico altamente reativo (FERNANDES, 2007; FERREIRA e MATSUBARA, 1997). Para se tornarem molculas estveis, os radicais livres devem doar ou receber eltrons de outra molcula, tornando esta ltima uma espcie tambm radicalar e a conseqncia disto a oxidao dos fosfolipdios de membranas celulares e subcelulares, do DNA, e das protenas. Normalmente a gerao de oxirradicais se d a partir da formao do radical superxido (O 2.-), que pode ser produzido por trs vias principais: reao fotoqumica, peroxidao lipdica e na exploso oxidativa de fagcitos (MATHY-HARTERT et al, 1998).

Figura 6: Produo de oxirradicais a partir de oxignio singlete seguida de ao antioxidante enzimtica (peroxidase) (FERNANDES, 2006).

O excesso de radicais livres no organismo, associado a avitaminoses A, C e E, ou a um nvel reduzido de enzimas antioxidantes, contribui com o estresse oxidativo, pois esses radicais podem potencializar o dano oxidativo que

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naturalmente ocorre em biomolculas como carboidratos, protenas, lipdios e DNA, acelerando o envelhecimento dos tecidos e de membranas lipdicas, e contribuindo para a induo de cncer, doenas cardiovasculares, inflamaes e doenas neurodegenerativas, incluindo mal de Parkinson e Alzheimer. Alimentos ricos em substncias antioxidantes exercem uma funo essencial na preveno destes quadros patolgicos associados ao de radicais livres e outras substncias oxidantes (BANERJEE; DASGUPTA, 2005).

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ANTIOXIDANTES

Antioxidantes podem ser definidos de maneira abrangente como substncias que, quando presentes em baixas concentraes, comparadas ao substrato oxidvel (que inclui vrias substncias encontradas em tecidos vivos, como protenas, lipdeos, carboidratos e cidos nuclicos), impedem ou previnem, significativamente, a oxidao desse substrato (VANNUCCHI, 1998).

Figura 7: Mecanismo de ao antioxidante de flavonides por seqestro de radicais 2 (PLAZA, 2007).

As espcies radicalares esto envolvidas nos mecanismos de reaes inflamatrias, mas tambm atuam como mensageiros para manuteno de diversas funes celulares. Assim, o equilbrio, entre a formao e a remoo de espcies radicalares no organismo, deve ser regulado de forma que as reaes e processos metablicos, dependentes destas espcies, possam ocorrer em um nvel adequado para a preservao da fisiologia das clulas. O desequilbrio entre a formao e a remoo dos radicais livres no organismo, decorrente da diminuio dos antioxidantes endgenos ou do aumento da gerao de espcies oxidantes, gera um estado pr-oxidante que favorece a ocorrncia de leses oxidativas em macromolculas e estruturas celulares, inclusive podendo resultar na morte celular (HALLIWELL, 1992). Este tipo de leso oxidativa definida como estresse oxidativo. A ingesto de substncias antioxidantes presentes em certos alimentos necessria para proteger o organismo contra o excesso de EROs, ou seja, contra o estresse oxidativo. H enzimas (antioxidantes enzimticos) especializadas no combate desses radicais. Os sistemas enzimticos envolvem as enzimas do ciclo redox da glutationa, particularmente a glutationa peroxidase, a superxido dismutase e a catalase, que convertem perxido de hidrognio em gua e oxignio molecular.
2

Espcies reativas de oxignio (EROs)

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A proteo no enzimtica executada por pequenas molculas, dentre as quais as mais requeridas so glutationa, ubiquinona, cido rico, bilirrubina, NADPH e NADH, flavonides, vitamina C, vitamina E, carotenides e licopeno (FERNANDES, 2006).

Figura 8: Fontes de espcies reativas e mecanismos de defesa (PLAZA, 2007).

No h registros especficos na literatura de estudos envolvendo a atividade antioxidante do epicarpo da semente (endocarpo) de Persea americana. Contudo, Terasawa e colaboradores (2006) relataram um percentual de seqestro de radical cerca de duas vezes superior ao cido ascrbico e ao tacoferol em extrato aquoso (quente) do epicarpo (externo) desta espcie, com picos correspondentes a (+)catequina e (-)-epicatequina, alm de outras duas substncias no identificadas pelo artigo (Terasawa et al., 2006).

1.6.1 ANTIOXIDANTES NOS ALIMENTOS

A profilaxia tem sido reconhecida como a maneira mais inteligente e eficaz de se controlar patologias. O consumo de frutas e vegetais um bom exemplo desta prtica, j que eles auxiliam na preveno de processos degenerativos, diminuindo a incidncia e as taxas de mortalidade por cncer e doenas cardiovasculares, por exemplo. Extratos de frutas, cereais e de diferentes vegetais, e seus produtos

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derivados, tm mostrado atividades antioxidantes efetivas em diferentes sistemasmodelo (SUN; HO, 2005), e os efeitos preventivos promovidos por estes alimentos tm sido atribudos ao dos antioxidantes neles contidos (FERNANDES, 2006; YEN et al, 2001). Devido ao potencial carcinognico de antioxidantes sintticos, antioxidantes naturais so alvos alternativos para minimizar ou retardar os processos de deteriorao oxidativa, assim, a crescente proeminncia dos alimentos funcionais, dos nutracuticos e da culinria orgnica nos hbitos alimentares da sociedade bastante positiva do ponto de vista da sade (FERNANDES, 2006; www.sbaf.org.br). A atividade antioxidante de compostos fenlicos presentes em alimentos deve-se, como j foi dito, s suas propriedades REDOX e estruturas qumicas, que possibilitam a estes compostos exercerem a funo de neutralizar radicais livres, quelar metais reativos e agirem como supressores de oxignio no estado singlete e triplete. Algumas caractersticas estruturais so responsveis por esta atividade, e incluem, na maioria dos casos, a presena de grupamentos fenlicos. Desta forma, flavonides, fenilpropanides e outros compostos aromticos so os principais alvos na procura por antioxidantes em alimentos (MUSCHIETTI & MARTINO, 2007; FERNANDES, 2006; VELLOSA, 2005). Segundo Kim e colaboradores (2002), o cido ascrbico o antioxidante de maior recorrncia na dieta humana. Os autores referem-se ao cido ascrbico como sendo um dos mais importantes antioxidantes hidrossolveis nas clulas, com alta biodisponibilidade, sendo capaz de proteger as biomembranas e as LDL dos danos da peroxidao. Gardner e colaboradores (2000) avaliaram a capacidade antioxidante de sucos de diversas frutas e verificaram que esta foi maior naqueles sucos com altas concentraes de vitamina C, sendo o cido ascrbico responsvel por 65 a 100% do total da capacidade antioxidante de sucos derivados de frutas ctricas. A acerola considerada por alguns pesquisadores como a fruta com o maior teor de vitamina C, seguida pela goiaba, que contm de 3 a 6 vezes mais cido ascrbico do que a laranja. O teor de vitamina C no abacate bastante reduzido, j que se trata de uma fruta de alto valor lipdico, que concentra preferencialmente molculas lipossolveis (TASCA, 2007, BIANCHI, 1999).

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A busca por opes teraputicas para diferentes patologias faz da pesquisa de produtos naturais um campo frtil em opes de molculas com diferentes atividades biolgicas. Espcies de plantas comestveis apresentam, em seus metablitos secundrios, uma grande fonte de possveis frmacos, devido diversidade de molculas com as mais variadas estruturas e propriedades qumicas, com a vantagem de garantirem a ausncia de toxicidade. A relevncia da pesquisa de produtos naturais proporciona a descoberta de substncias que podem interagir com diferentes espcies oxidantes geradas em nosso organismo. Assim, institutos e laboratrios no mundo inteiro direcionam esforos para o aprimoramento dos processos de prospeco de EQNs, e elucidao destas estruturas, o que resulta em ndices crescentes de publicaes e produtos de alto valor agregado com origem natural (NEUMAN & CRAGG, 2007; FERNANDES, 2006; YUNES e CECHINEL FILHO, 2007; VELLOSA, 2005).

1.6.2 DETERMINAO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

Muitos protocolos so apresentados pela literatura para determinao da atividade antioxidante nas mais diversas classes de compostos. Na escolha pela metodologia ideal devem-se considerar as condies do microambiente do composto, bem como a possibilidade de interaes entre os compostos presentes, que podem produzir efeitos sinrgicos ou inibitrios, prprios dos sistemas in vivo (TASCA, 2007; KUSKOSKI et al, 2005). Os mtodos espectrofotomtricos so aplicados para estudar a capacidade antioxidante, in vitro, de alimentos e compostos qumicos, usando radicais estveis e agentes seqestrantes (KIM et al, 2002). Normalmente a determinao da atividade seqestrante avaliada frente formao de substncias cromforas de natureza radicalar. Uma vez que a perda da cor ocorre de forma proporcional concentrao, o equipamento capaz de quantificar a reduo na absorbncia e compar-la a um padro conhecido, fornecendo resultados bastante reprodutveis. (TASCA, 2007; HUANG et al, 2005; KUSKOSKI et al, 2005).

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So exemplos de substncias cromforas utilizadas: ABTS ( cido 2,2-azinobis(3etilbenzotiazolin)-6sulfnico), DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazila), DMPD (dicloridrato de N,N-dimetil-p-fenilendiamina), DMPO (5,5-dimetil-1-pirroline-n-oxido) e FRAP (poder antioxidante de reduo frrica ) (HUANG et al, 2005; KUSKOSKI et al, 2005). Os mais utilizados so ABTS (radical azul-verde) e DPPH (radical violeta) por apresentarem excelente estabilidade, terem alto nvel de sensibilidade, serem facilmente manipulveis e permitirem a anlise de um grande nmero de amostras ao mesmo tempo (TASCA, 2007; KIM et al, 2002; KUSKOSKI et al, 2005). H que se observar as condies para o uso de cada radical: O radical ABTS pode medir a atividade de compostos que apresentem natureza tanto hidroflica quanto lipoflica, mas precisa ser gerado no meio atravs de uma reao que pode ser qumica, enzimtica ou eletroqumica. O DPPH um radical livre que pode ser manipulado diretamente, sem a necessidade de uma preparao prvia, porm s pode ser dissolvido em meio orgnico. Um largo espectro de absorbncia pode ser obtido em meio alcolico com o uso do ABTS: 414, 654, 754 e 815 nm; enquanto o DPPH apresenta pico de absorbncia em torno de 515 nm (KUSKOSKI et al, 2005). O mtodo que faz uso do radical DPPH para avaliar a capacidade antioxidante dos compostos justifica-se pela rapidez, facilidade, aplicabilidade, sensibilidade e estabilidade apresentadas (TASCA, 2007; KUSKOSKI et al, 2005; HUANG et al, 2005; AMI, et al, 2003; KIM et al, 2002); a figura 16 (p. 65) ilustra o seqestro do radical DPPH em presena de antioxidante.

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ALIMENTOS FUNCIONAIS

A sociedade tem conscincia da importncia de estreitar a relao entre alimentao e sade, e no rejeita o fato de que consumo de frutas e hortalias , h muito tempo, associado manuteno da boa sade e preveno de doenas. Assim, recomenda-se que uma alimentao ideal deve conter doses balanceadas de protenas, carboidratos, lipdeos, fibras, vitaminas, minerais e gua. Entretanto, a urbanizao, a industrializao e a globalizao exercem inescapvel influncia sobre o estilo de vida das pessoas, de maneira que a dieta nem sempre priorizada e o estado nutricional desta populao fica comprometido (CARVALHO et al, 2006). Desde a dcada de 1980 o termo alimento funcional utilizado para designar certo alimento ou componente alimentar que proporciona benefcio sade, alm da nutrio bsica, embora nenhuma definio seja, ainda, universalmente aceita. Vale lembrar que nenhum alimento isolado deve ser ingerido em detrimento de outros para prevenir qualquer doena especfica, e que no se deve atribuir ao alimento funcional o status de frmaco (CARVALHO et al, 2006). A Sociedade Brasileira de Alimentos Funcionais (SBAF) aponta um crescimento expressivo do mercado de alimentos funcionais, que movimentou US$ 70 85 bilhes em 2005 e US$ 700 milhes no Brasil em 2006 (apenas 1% do mercado de alimentos) (ABIA, 2005). O Japo, primeiro pas a reconhecer a importncia dos alimentos funcionais, tambm foi pioneiro na formulao de processos reguladores para o mercado de alimentos funcionais, com investimentos no desenvolvimento dos alimentos para uso especfico em sade (FOSHU Foods for Specified Health Use). Os pases em desenvolvimento, embora no tenham nmeros to significativos quanto os europeus e norte-americanos, tambm apresentam insero crescente neste contexto (www.sbaf.org.br).

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Tabela 2: Principais compostos funcionais investigados pela cincia (SBAF).

A tabela 2 apresenta a classificao dos principais compostos funcionais investigados pela cincia segundo a SBAF. Embora no conste desta tabela, h

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referncias na literatura sobre a presena de -sitosterol, vitaminas, carotenides, fenlicos antioxidantes e acares de sete carbonos no abacate, alm de lipoprotenas de alta densidade (HDL) (TANGO et al., 2004; LIU et al. 2002) que, por auxiliarem na reduo dos nveis de colesterol e prevenirem a degenerao macular, conferem ao fruto o status de alimento funcional. A discusso envolvendo alimentos funcionais se justifica pela presena muito provvel, nestes alimentos, de substncias qumicas naturais com propriedades teraputicas. Contudo, apenas estudos detalhados e testes adequados para cada espcie ou produto iro assegurar e quantificar a eficcia e a segurana destas substncias (PLAZA, 2007).

PLANTAS MEDICINAIS

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A Organizao Mundial da Sade (OMS) define que plantas medicinais so aquelas que possuem histrico de uso tradicional como agente teraputico e recomenda a difuso mundial dos conhecimentos necessrios ao seu uso racional e aplicao como fitoterpicos. A Organizao reconhece que cerca de 80% da populao dos pases em desenvolvimento recorrem a prticas tradicionais nos cuidados bsicos de sade, sendo que destes, 85% utilizam plantas ou preparados. Diante deste quadro, uma estratgia global foi engendrada a fim de reforar o compromisso e o estmulo ao desenvolvimento de polticas pblicas que objetivem a insero da medicina complementar e alternativa no sistema oficial de sade dos 191 estados-membros da OMS (www.portal.saude.gov.br). Iniciativas semelhantes foram adotadas no Brasil, visto que estimativas governamentais dizem que 60% da populao brasileira no tm acesso a qualquer tipo de medicamento convencional. Pensando nisso, a Assemblia Legislativa do Estado de So Paulo criou o Programa Estadual de Fitoterpicos, Plantas Medicinais e Aromticas, com o objetivo de propor, elaborar e promover a implantao de diretrizes para o setor de fitoterpicos, e oferecer uma alternativa segura para a sade desta parcela da populao, uma vez que a diversidade gentica vegetal chega a 55 mil espcies catalogadas e o potencial de aplicao parece ser ilimitado (site do Ministrio da Sade, CRAGG & NEWMAN, 2007). Em outros estados, como Rio de Janeiro, Amap e Mato Grosso, tambm j existem programas de fitoterpicos, regulamentados pelo poder executivo, em plena atividade. O Brasil apresenta a mais rica biodiversidade do planeta, com mais de 20% do nmero total de espcies (considerando fauna e flora), figurando como o principal pas dentre os chamados pases megadiversos. As acentuadas diferenas climticas contribuem para a diversidade ecolgica formando zonas biogeogrficas distintas, com cinco principais biomas: a maior floresta tropical mida (Floresta Amaznica), com mais de 30 mil espcies vegetais, e a maior plancie inundvel do mundo (o Pantanal), alm do Cerrado (savanas e bosques), da Caatinga (florestas semiridas) e da Mata Atlntica (floresta tropical pluvial).

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Toda essa biodiversidade somada a uma costa marinha de 3,5 milhes km com uma variedade de ecossistemas que incluem recifes de corais, dunas, manguezais, lagoas, esturios e pntanos, confere ao pas uma situao privilegiada frente prospeco de Entidades Qumicas Novas, EQNs. Contudo, este grande potencial est longe de ser efetivamente contemplado pelos estudos cientficos, levando em conta que isso demanda integrao e sintonia entre as diversas reas do conhecimento para que o processo de identificao, classificao e agregao de valor, ocorra de maneira eficiente e sustentvel (www.mme.gov.br; GIORGETTI et al, 2007). Atualmente, grande parte da comercializao de plantas medicinais feita em farmcias e lojas de produtos naturais, que majoritariamente no possuem certificado de qualidade, com pouca ou nenhuma comprovao de suas propriedades farmacolgicas. Mais ateno deveria ser dispensada a este fato, pois a toxicidade de plantas medicinais um srio problema de sade pblica (tabela 3).

Tabela 3: Efeitos adversos que podem ocorrer devido ao uso de plantas medicinais (Adapt. VEIGA Jr, 2005)

Alm

disso,

imprudncias

como

identificao

errnea

da

planta,

possibilidades de adulterao, interaes entre plantas medicinais e medicamentos

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alopticos, reaes alrgicas ou txicas e superdosagens, podem remeter a efeitos absolutamente diversos do esperado (PLAZA, 2007; VEIGA JUNIOR & PINTO, 2005). Os estudos relacionados com a descoberta de EQNs se renem numa vertente cientfica chamada farmacognosia, que envolve interdisciplinarmente um amplo conjunto de fontes de produtos naturais, incluindo plantas, bactrias, fungos e organismos marinhos. Farmacognosia pode ser definida como parte da farmacologia que trata das drogas ou substncias medicinais antes de serem submetidas a qualquer manipulao (PLAZA, 2007; SIMES et al, 1999). Estas tcnicas tm sido aplicadas para a padronizao da medicina natural, principalmente para a elucidao analtica dos compostos. (PLAZA, 2007; SILVA, 2000). O campo de produtos naturais est produzindo ou envolvido em aproximadamente 50% de todas as EQNs entre os anos de 2000-2006, incluindo vacinas e substncias biolgicas (CRAGG & NEWMAN, 2007). Dada a importncia dos PNs e seu j citado potencial farmacolgico, o estudo extensivo e cuidadoso de plantas medicinais torna-se, no apenas necessrio, mas vital para a sustentabilidade das geraes futuras.

FITOTERPICOS

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A diferena entre planta medicinal e fitoterpico est na elaborao da planta para uma formulao especfica, o que caracteriza um fitoterpico (VEIGA JUNIOR & PINTO, 2005). Segundo a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA) fitoterpicos so medicamentos obtidos a partir de plantas medicinais. Eles so obtidos empregando-se exclusivamente derivados de droga vegetal (extrato, tintura, leo, cera, exsudado, suco, e outros). Assim como todos os medicamentos, os fitoterpicos devem ser submetidos a estudos farmacolgicos e toxicolgicos prclnicos e clnicos (PLAZA, 2007; RIBANI et al., 2004) Produtos naturais proporcionam um ponto de incio para novas substncias sintticas, com diversas estruturas e vrios estereocentros que podem ser trocados sinteticamente. Frmacos derivados de plantas medicinais podem servir no somente como novas drogas por si s, mas tambm como modelo para novas drogas aperfeioadas pela qumica medicinal e sinttica. Um exemplo clssico o do cido saliclico, que foi isolado de Filipendula ulmaria (salgueiro) em 1839 e posteriormente acetilado para amenizar os efeitos colaterais (problemas gstricos) do primeiro composto (OLIVEIRA, 2007). Segundo Cragg & Newman, (2007), as maiores reas que tm sido investigadas pela indstria farmacutica so as relacionadas com as doenas infecciosas, o cncer, anti-hipertensivos e antiinflamatrios. Na rea antibacteriana, a grande maioria das EQNs so de origem natural (10,2%), derivadas de produtos naturais (65,3%) e sintticas modeladas a partir de produtos naturais (1%), ou seja, 76,5% do total de frmacos. As drogas anticncer no-biolgicas seguem o mesmo padro, podendo ser divididas em produtos naturais (11,1%), derivados de produtos naturais (30,9%) e modeladas a partir de produtos naturais (35,8%), com apenas 22,2% de antineoplsicos de origem totalmente sinttica.

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Figura 9: Antineoplsicos de origem natural (CRAGG & NEWMAN, 2007).

Nos ltimos anos foi observado um constante declnio na produo dos programas de PD&I da indstria farmacutica e do nmero de EQNs, que alcanaram 37 em 2001, o resultado mais baixo em 20 anos (CRAGG & NEWMAN, 2007). Recentemente, porm, houve relatos demonstrando interesse renovado na redescoberta de produtos naturais. Como declarado por uma autoridade, [sem investimento] ns no teramos a classe de frmacos no topo de vendas de hoje, nem as estatinas ou todo o campo dos antagonistas da angiotensina e inibidores da enzima conversora de angiotensina; nem a rea inteira dos imunossupressores; nem a maioria dos frmacos anticncer e antibacterianos. Imagine se todos esses frmacos no estivessem disponveis para mdicos ou pacientes hoje. Sendo assim, est bem claro que a natureza tem e continuar a ter um importante papel um papel no processo de descoberta de frmacos (CRAGG & NEWMAN, 2007). O processo de estudo de plantas medicinais (tabela 4) comea, tipicamente, com um botnico, etnobotnico, etnofarmacologista ou eclogo, que coleta e identifica a planta de interesse. A partir da, o fitoqumico prepara extratos dos

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materiais da planta e comea o processo de isolamento e caracterizao das substncias ativas, caracterizando uma rea de estudo multidisciplinar (PLAZA, 2007). O analgsico, morfina (figura 10) isolado em 1816 pelo farmacutico alemo, Serturner, do pio da papoula, Papaver somniferum, que foi a base para a qumica de alcalides e desenvolvimento de uma variedade de agentes analgsicos altamente eficientes, como a codena e a buprenorfina (CRAGG & NEWMAN, 2007).

Tabela 4: Etapas envolvidas na produo de fitoterpicos (DAVID et al. 2004).

Outros significantes desenvolvimentos de frmacos a partir da medicina tradicional incluem: o agente anti-hipertensivo, reserpina, isolada da Rauwolfia serpentina, (KAPOOR, 1990); efedrina, isolada em 1887 da Ephedra snica (Mahuang), uma planta comum na medicina tradicional chinesa e base para a sntese de agentes antiasmticos, salbutamol e salmetrol; e o relaxante muscular, tubocurarina, isolada de espcies de Chondrodendron e Curarea, utilizadas por grupos indgenas na Amaznia como base para o veneno da flecha, o curare (CRAGG & NEWMAN, 2007).

Figura 10: Importantes fitoterpicos de origem natural (CRAGG & NEWMAN, 2007).

Com o aparecimento da pandemia AIDS na dcada de 80, o NCI, junto com outras organizaes, tem promovido a explorao da natureza como fonte de potenciais agentes para o tratamento da doena e de infeces oportunistas associadas. Mais de 60.000 extratos de origem marinha e plantas foram testados in vitro contra clulas linfoblsticas infectadas com HIV-1. Vrios extratos de plantas demonstraram significativa atividade e os compostos ativos foram isolados. Destes, os calanoldeos (figura 11), isolados de espcies de Calophyllum, j esto em desenvolvimento clnico e pr-clnico, respectivamente (CRAGG & NEWMAN, 2007).

li

Figura 11: Novas substncias no combate ao vrus HIV (CRAGG & NEWMAN, 2007).

Apesar da grande importncia da bioprospeco, notadamente em pases em desenvolvimento e com grande potencial em termos de biodiversidade, a atual realidade legislativa e comercial levou a um novo enfoque na busca de produtos naturais bioativos por parte das grandes companhias farmacuticas. Este fato pode ser constatado pela desativao de grandes centros de bioprospeco como o da Abbott Pharmaceuthical e da Pfizer. Os grandes grupos multinacionais farmacuticos tm discutido a aplicao das tecnologias baseadas na genmica, onde o enfoque passa a ser macromolecular (peptdeos, protenas, etc.) ao invs de micromolecular (substncias naturais ou sintticas). O grande estmulo para esta mudana so os valores agregados a medicamentos ligados a doenas de origem gentica como Alzheimer, cncer, artrite entre outros. Por outro lado, doenas tropicais ou de fundo inflamatrio, entre outras, requerem ainda micromolculas. Contudo o alto custo das tecnologias de highthroughput screening (HTS) levou seleo de uma quantidade muito pequena de frmacos em relao s milhares de matrizes complexas (extratos vegetais ou de organismos marinhos) testadas, o que claramente no interessa s grande multinacionais (PINTO et al.2002).

ESPCIE EM ESTUDO

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A escolha de Persea americana como matriz de estudo no se deu ao acaso. Observaes empricas de diferenas nas velocidades de escurecimento da polpa e da semente, em presena ou ausncia do endocarpo, influenciaram a idia da possibilidade de metablitos secundrios com atividade antioxidante estarem presentes em concentraes apreciveis, nesta parte do fruto. Outra observao que corrobora o estudo est relacionada com a guacamole. Este prato tipicamente mexicano, feito base de polpa de abacate, normalmente servido com a semente do fruto a fim de retardar o escurecimento da iguaria.

1.10.1 CONSIDERAES DA FAMLIA LAURACEAE

As Lauraceae se aproximam morfologicamente das famlias Calycanthaceae, Idiospermaceae e Hernandiaceae, sendo consideradas o mais primitivo agupamento de espcies pertencentes diviso Magnoliophyta (MARQUES, 2001). A famlia, que se apresenta amplamente distribuda atravs das regies tropicais e subtropicais do planeta, formada por 50 gneros e 2.500 - 3.000 espcies (QUINET, 2002; BAITELLO, 2001; MARQUES, 2001), sendo Aniba, Cinnamomum, Ocotea, Nectandra e Persea os gneros que mais se destacam, como mostra a figura 12. No Brasil ocorrem 22 gneros e cerca de 400 espcies que habitam em sua maior parte as Florestas Pluviais e tambm as Restingas e os Cerrados (QUINET, 2002; BAITELLO, 2001). Os primeiros registros relativos utilizao das espcies desta famlia datam de 2.800 a.C, sendo originrios da Grcia antiga, fato que influenciou o nome de muitos gneros que fazem uma aluso quela poca. Laurus, por exemplo, vem do celta lauer que significa verde ou ainda laus que significa louvor e o gnero Phoebe, que tem o seu nome relacionado ao deus Apolo. (MARQUES, 2001).

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Figura 12: Correlao entre o nmero de espcies em cada gnero e o total de espcies de Lauraceae (MARQUES, 2001).

As Lauraceae destacam-se entre as demais famlias de sua classe, pela importncia econmica (FRANCISCO, 2005; QUINET, 2002; BAITELLO, 2001; MARQUES, 2001). O potencial econmico das espcies dessa famlia conhecido desde os tempos remotos, como atestam documentos chineses datados de 2800 a.C., onde era empregado o leo de Cinnamomum camphora e de outras espcies do gnero para fins medicinais. As folhas de Laurus nobilis, o loureiro, eram utilizadas pelos antigos gregos e romanos para confeccionar coroas, com as quais guerreiros e atletas vitoriosos eram homenageados, e hoje esto entre os condimentos mais conhecidos da culinria mundial (QUINET, 2002). Algumas espcies tm sido utilizadas pelas indstrias para a fabricao de diversos produtos, como essncias, leos, madeira e frmacos; porm, a maioria das espcies tem seu uso restrito s comunidades tradicionais que detm o conhecimento emprico da utilizao dessas plantas. O apelo econmico das Lauraceae tem motivado uma

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explorao crescente ao longo dos anos, aumentando sua vulnerabilidade e risco de extino. o caso de Nectandra megapotamica (Spreng.) extensivamente utilizada pela construo civil e indstria naval (MARQUES, 2001). Na medicina popular, as Lauraceae apresentam aplicaes variadas, desempenhando diferentes funes contra diversas doenas. Convm lembrar, entretanto, que o uso fitoterpico de plantas deve ser feito com critrio. Assim, esto aptas a serem utilizadas aquelas que tenham conhecida sua eficincia teraputica e toxicologia. (MARQUES, 2001; MARTINS & SANTOS, 1995). Como exemplo de aplicaes medicinais empricas de espcies de Lauraceae, podemos citar: O. aciphylla, utilizada como tnico, agente digestivo, antireumtico e depurativo; A. riparia, espcie tpica da regio amaznica que possui atividade antibitica comprovada contra Candida albicans, Bacillus cereus, Klebsiela pneumoniae e Staphylococcus aureus, e P. americana, empregada em casos de problemas renais e tambm como diurtico e calmante, normalmente atravs de chs e infuses feitos com suas folhas, cascas ou sementes (MARQUES, 2001). Um quadro comparativo entre os gneros com potencial fitoterpico mostrado na figura 13.

Figura 13: Nmero de espcies medicinais em cada gnero, comparado ao total de espcies (MARQUES, 2001).

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O extrato metanlico de P. gratissima apresentou ao antineoplsica em ratos inoculados com carcinoma de Lewis-lung, que apresenta uma difcil resposta maioria das drogas empregadas em clnica humana. Foi verificado que a droga produz uma destruio acentuada do tumor primrio, porm sem afetar as metstases. Gottlieb e Yoshida (1978) sugerem que a atividade seja devida a presena de neolignanas, precursores monomricos propenilbenzenos ou alilbenzenos, tambm encontradas nos gneros Nectandra, Licaria e Aniba. (MARQUES, 2001; GOTTLIEB & YOSHIDA, 1978).

1.10.2

Persea americana MILL

O abacateiro, originrio do Mxico e Amrica Central, pertence famlia Lauraceae, subgnero Persea compreendendo trs espcies: Persea americana var. americana; Persea nubigena var. guatemalensis e Persea americana var. drymifolia, as quais correspondem, respectivamente, s raas hortcolas conhecidas como antilhana, guatemalense e mexicana, normalmente descritas como tropical, subtropical e semitropical, baseado na sua resistncia ao frio e adaptao climtica. As variedades da raa Mexicana toleram melhor temperatura baixa; as da Antilhana so de clima tropical; e as Guatemalense, de clima subtropical, no toleram extremos de temperatura. (Campbell & Malo, 1976). Elas so espcies frutferas das mais produtivas por unidade de rea e esto presentes em quase todos os estados do Brasil (FRANCISCO, 2005; TANGO E TURATTI, 1992). O conhecimento da biologia floral do abacateiro de suma importncia para a obteno de uma boa produo do pomar devido caracterstica de suas flores serem hemafroditas. As suas flores se comportam de duas formas diferentes determinando a classificao de cultivares em dois grupos, A e B. O grupo A composto por variedades em que a primeira abertura da flor ocorre no perodo da manh pronta para receber o plen (feminina) reabrindo novamente tarde do dia seguinte, porm, soltando plen (masculino). As variedades do grupo B a primeira abertura da flor ocorre aps o meio dia (feminina), fechando-se ao entardecer e

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reabrindo ao amanhecer no estgio masculino. Assim, para ocorrer uma eficiente polinizao das flores (figura 14), os pomares devem ser formados com variedades pertencentes aos dois grupos para uma produo economicamente vivel (RAMALHO, 2008; FRANCISCO, 2005; TANGO E TURATTI, 1992).

Figura 14: Polinizao da flor do abacateiro (esq.) e seu fruto, o abacate (Arquivo pessoal).

Acredita-se que a histria do abacate no Brasil tenha comeado em 1809, quando Lus de Abreu Vieira e Silva trouxe algumas mudas e sementes da Ilha da Frana (hoje Guiana Francesa) para o Rio de Janeiro, de onde se expandiram para todo o pas devido boa aclimao. Os cultivares mais utilizados no mercado interno so: Simmonds, Barbieri, Collinson, Quintal, Fortuna, Breda, Reis, Solano, Imperador, Ouro Verde e Campinas. No mercado externo e para a industrializao so mais empregados os cultivares: Tatu, Hass e Wagner. As variedades Hass e Fuerte vm sendo comercializadas no mercado nacional sob a denominao Avocado e por serem cultivares diferenciados tm sido mais valorizados. As variedades: Ouro Verde, Geada e Fortuna so mais comerciveis no exterior (FRANCISCO, 2005; TANGO & TURATTI, 1992). O maior produtor mundial o Mxico ficando o Brasil em quarto lugar no ranking, com uma produo, em 2004, de 173 mil toneladas em rea de 12 mil ha, frente a uma produo mundial de, aproximadamente, 3,2 milhes de toneladas

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cultivadas numa rea de 416 mil ha (FRANCISCO, 2005). O desenvolvimento da abacaticultura brasileira encontrou seu pice na dcada de 1970 devido aos incentivos fiscais concedidos pelo Governo Federal, dentro do programa de reflorestamento do Instituto Brasileiro de Desenvolvimento Florestal (IBDF), que financiou pomares com caractersticas comerciais a partir de mudas enxertadas (CAMPOS, 1984). A fruta fonte de muitos nutrientes, destacando-se as fibras e vitaminas. Esteris, alcois, tacoferis e carotenos tambm esto presentes. Mesmo no podendo ser considerado como fonte protica, o abacate contm quantidades muito superiores desse nutriente quando comparado s outras frutas (SALGADO, 2005). No Brasil, normalmente utilizado em pratos doces, seja fresco com acar ou creme, vitaminas ou sorvetes, mas tambm pode ser utilizado em pratos salgados como o guacamole. As qualidades organolpticas, o valor nutritivo e a riqueza em vitaminas do abacate justificam plenamente a expanso do seu consumo (TANGO & TURATTI, 1992). Comparando-se a composio mdia da polpa do abacate com a de outras frutas, constata-se que o abacate apresenta um extrato seco elevado, rivalizando-se ao da oliva em riqueza de leo; o teor de protenas de 1,14% permite classific-lo entre as frutas mais ricas; a taxa de glicdios fraca, pois o abacate uma fruta lipdica, o que lhe permite ter um valor calorfico duas vezes maior que aquele da banana, fruta de alto teor energtico. O abacate contm as vitaminas lipossolveis, que normalmente faltam s outras frutas. muito rico em vitaminas A e B; medianamente rico em vitaminas D e E e muito pobre em vitamina C (TANGO & TURATTI, 1992). A economia do abacate no se limita ao setor alimentcio. Alm de bastante requisitado pela indstria de cosmticos, pesquisas recentes visam transform-lo em matriz energtica para a promissora indstria de biocombustveis. De acordo com o professor Manoel Lima de Menezes, da Faculdade de Cincias da Universidade Estadual Paulista, campus de Bauru, possvel extrair leo da polpa e etanol da semente de abacate, dois requisitos bsicos para a produo de biocombustveis, o que representa uma vantagem sobre o biodiesel de soja, da qual no se pode extrair etanol. Outra vantagem sobre a oleaginosa o rendimento sete vezes maior por

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unidade de rea plantada, ficando atrs apenas da cana-de-acar (Jornal UNESP, 2009). Claro que neste caso h que se ponderar sobre as questes ticas relacionadas produo de fontes energticas a partir de alimentos. Estudos fitoqumicos das sementes do abacate identificaram diversas classes de produtos naturais, como o fitoesterois, triterpenos, cidos graxos com olefinas e ligaes acetilnicas, cidos furanlicos, dmeros de flavonides, antocianidinas oligomricas, glicdios e derivados do cido abscsico (LU et al.,2005; RAMOS et al., 2004), o que reafirma o potencial da espcie e justifica o presente trabalho. As figuras 15-a e 15-b apresentam as estruturas de algumas substncias do metabolismo secundrio presentes em Persea americana.

Figura 15-a: Estruturas de metablitos secundrios encontrados em abacate.

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Figura 15-b: Estruturas de metablitos secundrios encontrados em abacate.

lx

OBJETIVOS

Considerando a crescente demanda por frmacos de origem natural e as iniciativas nacionais de manuteno de ecossistemas sustentveis e multifacetados, so objetivos deste trabalho:

lxi

2.1

Apresentar os resultados do estudo qumico de Persea americana (Lauraceae), que trata da deteco e determinao estrutural das micromoluclas majoritrias de modo a prestar contribuio aos projetos Conservation and sustainable use of the plant diversity from Cerrado and Atlantic forest: chemical diversity and prospection for potential drugs phase II e Bioprospecting Brazilian Biodiversity: Searching for

antioxidant and antimalarial compounds from Plants of the Cerrado and the remaining Atlantic Forest.

2.2

Proceder anlise dos constituintes micromoleculares do epicarpo das sementes (endocarpo) de P. americana visando sua deteco e determinao estrutural.

2.3

Avaliar qualitativa e quantitativamente a atividade antioxidante do extrato bruto e das fraes obtidas a partir do endocarpo da espcie e realizar estudos da relao estrutura-atividade das molculas que possuam atividade frente ao ensaio in vitro de DPPH.

lxii

MATERIAIS E MTODOS

3.1.

SOLVENTES E REAGENTES

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Os solventes utilizados para CLAE foram de grau HPLC das marcas JT. Bakere e Mallinckrodt. Para outros fins, foram utilizados solventes Merck e Synth de qualidade p.a., aps prvio tratamento. Para experimentos de RMN, foram utilizados os solventes deuterados CDCl3 e DMSO-d6 produzidos por Merck, Aldrich ou Fluka. Para as revelaes das placas cromatogrficas foram utilizados reagentes das marcas Synth e Vetec.

3.2.

CONCENTRAO DAS AMOSTRAS

Os extratos foram concentrados em rotaevaporador da marca Bchi (modelo R-114 e banho B-480) e em centrfuga SpeedVac (modelo SPD 121P 115) acoplado a refrigerador (modelo RVT 4104 115) ambos da marca Thermo. Nos dois casos sob presso reduzida temperatura de 36C.

3.3.

CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)

Na anlise por cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC), foram utilizadas placas de silicagel 60 F254, espessura de camada de 0,2 mm (20x20 cm) da marca Riedel-de Hen AG. A visualizao das manchas foi realizada atravs de mtodos fsicos e/ou qumicos; como luz de ultravioleta 254-366 nm e reveladores especficos (p.e. soluo de anisaldedo, DPPH 0,02%).

3.4.

CROMATOGRAFIA EM COLUNA

lxiv

Foram utilizadas colunas de vidro de volumes, dimetros internos e comprimentos, compatveis com a massa das amostras. Como adsorvente (fase estacionria) foi utilizada Amberlite XAD (20-60 m, poros de 40; Sigma).

3.5.

CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA

Os cromatogramas foram obtidos por cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) em aparelhos: Varian Pro Star (Solvent Delivery Module 240 e Auto Sampler 410) acoplado ao detector Varian Pro Star Photodiode Array Ultra violet (PDA-UV) 330 e registrados em microcomputador de 500 MHz com processador Pentium II, utilizando o software Varian Star Cromatography Workstation verso 5.52 Modo analtico gradiente exploratrio. Varian Pro Star (Solvent Delivery Module 230) acoplado ao detector Varian Pro Star UV/Vis Detector 310 e registrados em microcomputador de 350 MHz com processador Pentium II, utilizando o software Varian Star Cromatography Workstation verso 5.52 Modo analtico gradiente exploratrio. Varian Pro Star (Solvent Delivery Systeme) acoplado ao detector Varian Pro Star UV/Vis Detector 320 e registrados em microcomputador de 350 MHz com processador Pentium II, utilizando o software Varian Star Cromatography Workstation verso 5.52 Modo preparativo gradiente.

3.6.

RESSONNCIA MAGNTICA NUCLEAR

lxv

Os espectros de Ressonncia magntica nuclear de 1H e de ncleo de 1H e 50 MHz para o ncleo de

13 13

13

C foram

registrados em espectrmetro Bruker AC 200-F 4.7 T, operando a 200 MHz para o C e em espectrmetro Varian Inova 500 11.7 T operando a 500 MHz para o ncleo de 1H e em 125 MHz para o ncleo de C. TMS foi utilizado como referncia interna.

3.7.

LEITOR DE MICROPLACAS

A leitura da absorbncia para a avaliao da atividade seqestradora de radical livre foi realizada no aparelho Synergy-HTS ( 517nm). Os valores de IC50 foram calculados atravs da regresso linear das curvas, obtidas pelo programa MicrocalTM OriginTM vrs 5,0.

3.8.

AVALIAO

DA ATIVIDADE

ANTIOXIDANTE

POR

DESCORAMENTO DE CAROTENO

A amostra a ser avaliada aplicada e desenvolvida em placas cromatogrficas, que so ento nebulizadas com soluo metanlica de -caroteno na concentrao de 0,02%. Aps a secagem da placa, ela posta sob iluminao natural at o descoramento do fundo. As substncias com propriedade antioxidante so evidenciadas em manchas amarelas.

3.9.

AVALIAO ESPECTROFOTOMTRICA DA ATIVIDADE

SEQUESTRADORA DE RADICAL LIVRE POR REDUO DO RADICAL 2,2-DIFENIL-1-PICRILHIDRAZILA (DPPH).

lxvi

Figura 16: Mecanismo de ao antioxidante sobre o radical DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazila).

200 L de uma soluo 0,004% de DPPH foi misturada com solues das fraes F4A e F11B em diversas concentraes, aguardou-se 30 minutos ao abrigo da luz e ento a leitura foi feita no leitor de microplacas Synergy-HTS (517nm). Como soluo padro foi utilizada rutina, nas mesmas concentraes. A porcentagem de seqestro do radical livre foi obtida utilizando a seguinte equao:

Os valores de IC50 foram calculados atravs da regresso linear das curvas, obtidas pelo programa MicrocalTM OriginTM vrs 5,0.

3.10.

METODOLOGIA DE PREPARO DE AMOSTRAS

Todas as amostras foram analisadas por CCDC e RMN de 1H, sendo que as amostras polares foram tambm avaliadas por CLAE e RMN massa suficiente. Os procedimentos esto descritos adiante.
13

C, quando havia

lxvii

3.10.1

ANLISES VIA CCDC:

As amostras so aplicadas nas cromatoplacas na forma de solues, em solventes bastante volteis (AcOEt, Hex, MeOH), que possam ser facilmente eliminados aps a aplicao e desenvolvidas em cubas cromatogrficas saturadas com a fase mvel escolhida.

3.10.2

ANLISES VIA CLAE:

Para eliminao de interferentes apolares (material graxo) a amostra foi submetida a pr-tratamento por Extrao em Fase Slida (EFS) em cartucho preenchido com slica de Fase Reversa (C18), utilizando-se MeOH/H 2O 95:5 (v/v) como eluente. Inicialmente o adsorvente foi ativado com MeOH puro (2-3 Vm) e posteriormente equilibrado com o eluente escolhido (2-3 Vm). A amostra foi solubilizada em 1mL de MeOH/H 2O 95:5 (v/v), aplicado no cartucho e eludo com 2 mL da fase mvel. A soluo recolhida foi filtrada em disco de membrana polimrica e armazenada em vial para anlise por CLAE. A limpeza do cartucho foi feita com MeOH puro e depois, quando necessrio, com DCM. Por se tratar de estudo qumico qualitativo, no foram feitos clculos de concentrao das amostras analisadas.

3.10.3

ANLISES VIA RMN:

As amostras foram diludas em 0,6 mL de solvente deuterado (CDCl3 ou DMSO-d6) e em seguida, as solues foram filtradas em esfera de algodo e armazenadas em tubo de vidro prprio para RMN.

lxviii

3.11.

COLETA DO MATERIAL VEGETAL

Cerca de 60 frutos de Persea americana MILL, em estgio intermedirio de maturao, foram coletados em jardim particular, na cidade de Araraquara SP.

3.12.

PREPARAO DO EXTRATO BRUTO

O endocarpo dos frutos foi separado manualmente da polpa e da semente, ao abrigo de luz. O material modo (aproximadamente 400g) foi submetido extrao exaustiva com etanol durante trs dias. O solvente foi ento evaporado sob presso reduzida temperatura de 36C, o que forneceu um extrato bruto etanlico de 18,6g configurando um rendimento de aproximadamente 4,5%. Por apresentar aspecto oleoso, o extrato bruto foi centrifugado baixa presso por 6 horas a 6000 RPM e temperatura de 36C, o que resultou em um precipitado (9,9g) e um sobrenadante viscoso (7,8g), posteriormente separados (fluxograma 1).

3.13.

FRACIONAMENTO DO PRECIPITADO (A)

A poro slida do extrato bruto (precipitado A) foi submetida extrao com hexano, resultando em um novo precipitado (slido A1) e um sobrenadante (lquido apolar A2). Aps anlise por CCDC revelada com DPPH e caroteno, verificou-se intensa atividade antioxidante em A1 e atividade baixa em A2. Por se tratar de material graxo, A2 foi descartado e a frao de mdia a alta polaridade (A1) foi desenvolvida em coluna cromatogrfica (25,7 cm de altura x 1,5 cm de dimetro) utilizando-se Amberlite - XAD como fase estacionria e os solventes H 2O, MeOH e AcOEt como fase mvel em ordem decrescente de polaridade. XAD foi escolhida

lxix

como fase estacionria devido presena de substncias altamente hidroxiladas (provavelmente acares), detectadas por RMN 1H, na amostra. Foram obtidas 19 fraes, das quais trs foram escolhidas para continuidade dos estudos, por terem massa suficiente e/ou apresentarem atividade antioxidante.

Fluxograma 1: Preparao do extrato bruto do endocarpo dos frutos de Persea americana.

A frao F4A apresentou intensa atividade antioxidante, evidenciada pelos ensaios qualitativos e quantitativos utilizando radical estvel DPPH (figuras 30 e 31, p.83). As fraes F14A e F15A resultaram no isolamento do sitosterol e do triacilglicerdeo, respectivamente (fluxograma 2).

lxx

Fluxograma 2: Processo de isolamento do sitosterol e do triacilglicerdeo.

3.14.

FRACIONAMENTO DO SOBRENADANTE (B)

A poro lquida do extrato bruto (sobrenadante B) tambm foi submetida extrao com hexano, resultando em um novo precipitado (slido B1) e um sobrenadante (lquido apolar B2). Por se tratar de material graxo, B2 foi descartado e a frao de mdia a alta polaridade (B1) foi desenvolvida em coluna cromatogrfica (26,1 cm de altura x 1,5 cm de dimetro) utilizando-se Amberlite XAD como fase estacionria e os solventes H 2O, MeOH como fase mvel em ordem decrescente de polaridade. Foram obtidas 23 fraes, das quais trs foram escolhidas para continuidade dos estudos, por terem massa suficiente e/ou apresentarem atividade antioxidante.

lxxi

Fluxograma 3: Processo de isolamento do glicosdeo (C7) e do acar dimrico (C14).

As fraes F2B, F6B e F11B foram submetidas precipitao com MeOH, resultando em seis novas fraes: FP1, FS1, FP2, FS2, FP3 e FS3, das quais as trs ltimas foram ativas frente ao ensaio qualitativo com DPPH. FS3 foi analisada pelo ensaio espectrofotomtrico quantitativo com o mesmo radical ( figura 31, p.83), como descrito no item 3.9., apresentando intensa atividade e baixo IC 50. As fraes FP3 e FS3 resultaram no isolamento de um acar de sete carbonos, e a frao FS2, no isolamento de um dissacardeo (C14), provavelmente formado por monmeros da heptulose. As substncias foram caracterizadas pela anlise dos espectros de RMN 1H e RMN 13C.

lxxii

RESULTADOS E DISCUSSES

lxxiii

4.1. ESTERIDES

Os esterides so triterpenides modificados contendo o sistema de anis tetracclico do lanosterol (fungos) ou cicloartenol (plantas), mas sem os grupos metlicos em C-4 e em C-14 (Figura 17).

Figura 17: Seqncia de reao para a formao dos esteris a partir do cicloartenol (SILVA, 2007)

Estudos recentes descrevem que os fitoesteris so capazes de reduzir as taxas de colesterol no plasma humano. Os principais esteris em plantas, fungos e algas so caracterizados por apresentar substituintes extras, com um ou dois carbonos, ligados ao carbono 24. Os esteris de plantas campesterol e sitosterol apresentam, respectivamente, uma metila e uma etila em C-24 na estrutura anloga ao colesterol (SILVA, 2007 apud DEWICK, 1997; CHEN, 2005).

4.1.1

SITOSTEROL

Os espectros de RMN de 1H (figura 19) de sitosterol apresentaram vrios sinais na regio diamagntica, entre 0,62 1,00, correspondentes aos vrios hidrognios de grupos metlicos. Observaram-se tambm sinais em 5,00; 5,20 e 5,35 referentes aos hidrognios olefnicos e em 3,68 referentes ao hidrognio ligado ao carbono da hidroxila.

lxxiv

Figura 18: Comparao entre as estruturas de sitosterol e estigmasterol.

Figura 19: Espectro de RMN de 1H produzido pelo sitosterol

O espectro de RMN de

13

C (figura 20) de sitosterol apresentou sinais entre

11,8 e 21,0 correspondentes aos carbonos metlicos. Os sinais em 121,7; 140,7 referentes aos carbonos olefnicos foram importantes para caracterizar a natureza esteroidal da substncia. Os demais valores de deslocamento qumico foram relacionados aos carbonos metlicos (tabela 5). Os sinais de em 129,2 e

lxxv

138,3 podem indicar a presena de pequena quantidade de estigmasterol (figura 18).

Figura 20: Espectro de RMN de 13C produzido pelo sitosterol.

Tabela 5: Atribuies dos valores de deslocamento qumico () para cada carbono da molcula de sitosterol.

lxxvi

4.2. GLICDIOS E CIDOS GRAXOS: METABOLISMO PRIMRIO

A grande importncia de vrios metablitos secundrios, particularmente para a rea farmacutica, torna essencial o estudo e conhecimento de sua biognese, uma vez que isto pode orientar a interferncia racional sobre o organismo de forma a direcionar sua produo. Embora algumas generalizaes distingam metablitos primrios e secundrios, a linha divisria entre eles no ntida. cidos graxos e acares, por exemplo, so em sua maioria, melhores descritos como metablitos primrios, mas existem alguns representantes que so extremamente raros e encontrados somente em algumas espcies. Assim, como os metabolismos primrio e secundrio se sobrepem, a diviso entre eles apenas uma convenincia (SILVA, 2007). Os blocos construtores para os metablitos secundrios se originam no metabolismo primrio, mais precisamente do metabolismo da glicose. Os mais importantes so derivados dos intermedirios acetilcoenzima A, cido chiqumico e cido mevalnico, utilizados, respectivamente, nas vias do acetato, chiquimato e mevalonato (SILVA apud DEWICK, 1997).

4.2.1

TRIACILGLICERDEO

lxxvii

Figura 21: Estrutura do triacilglicerdeo simtrico.

O espectro de RMN de 1H dessa frao (figura 22) mostrou um duplo dubleto em 4,12 (J=7,5 e 10,0 Hz) e outro em 4,28 (J=7,5 e 10,0 Hz), relativos aos hidrognios HA e HA. Um multipleto em 5,29, com integrao de 1H, foi atribudo ao HB, caracterizando a unidade glicerila de triacilglicerdeos simtricos. Alm desses foi observado um tripleto em 2,29 (J=8,0 Hz) atribudo aos hidrognios metilnicos carboxlicos confirmando a presena da unidade glicerila de um triacilglicerdeo simtrico. O espectro de RMN de
13

C (figura 23) apresentou sinais em 62,0 e

68,8 relativos aos carbonos A e B da unidade glicerila; sinais em 131,8 127,8 caractersticos de ligaes duplas e os sinais dos demais carbonos alifticos em 28,9 29,6 (MONTEIRO, 2006 apud MARCEL, JIE, LAM, 1995).

lxxviii

Figura 22: Espectro de RMN de 1H produzido pelo triacilglicerdeo.

Figura 23: Espectro de RMN de 13C produzido pelo triacilglicerdeo.

4.2.2

HEPTULOSE (C7)

lxxix

D-mano-heptulose (figura 24) foi o primeiro acar natural de sete carbonos relatado na literatura, isolado de plantas como alfafa ( Medicago sativa L.), figueira (Ficus officinalis L.), prmula (Primula officinalis Jacq.) e abacate e identificado em um grande nmero de espcies, incluindo 3 classes de gimnospermas, 21 famlias de dicotiledneas e 2 monocotiledneas. No entanto, por razes ainda desconhecidas, s no abacate so encontrados nveis extremamente elevados desse acar, muitas vezes representando mais de 10% do peso seco do tecido, incluindo a casca e a semente da fruta (LIU et al., 2002). Apesar da bvia importncia econmica do abacate, pouco se sabe sobre a sntese bioqumica ou metabolismo dos acares C7. O caminho bioqumico que produz cadeias de sete carbonos no conhecido, embora existam, pelo menos, trs reaes enzimticas conhecidas que geram um C7 (sedo-heptulose) como intermdirio (LIU et al., 2002).

Figura 24: Estrutura da D-manno-heptulose (C7).

Embora seja muito provvel que o acar isolado corresponda D-mannoheptulose, a confirmao s seria possvel se tivessem sido realizados ensaios estereoqumicos que revelassem a posio (equatorial ou axial) das hidroxilas. Assim, nos limitamos a identificar a substncia encontrada como uma heptulose cclica. Tal observao pode ser confirmada pela anlise do espectro de RMN de 1H (figura 25), que apresenta grande intensidade de sinais entre 3 e 4,5, caracterstica prpria de substncias altamente hidroxiladas, e tambm pelo

lxxx

espectro de RMN de

13

C (figura 26), que apresenta um deslocamento qumico em

97,8 referente ao carbono anomrico e outros seis sinais entre 62 e 74.

Figura 25: Espectro de RMN 1H da heptulose (C7).

Figura 26: Espectro de RMN 13C produzido pela heptulose.

4.2.3

DMERO (C14)

lxxxi

O espectro de RMN 1H (figura 27) da frao FP2 apresentou um perfil muito parecido com o da heptulose, com uma concentrao de sinais na regio intermediria da escala de ppm ( 3 e 4,5). Entretanto, a anlise do espectro de RMN
13

C (figura 28) da mesma frao indica a presena de 14 carbonos na

molcula, com dois deslocamentos referentes a carbonos desprotegidos ( 73,6 e 97,4) atribudos a carbonos anomricos, descartando a hiptese da presena deste acar. Embora sejam necessrios ensaios mais conclusivos (estereoqumicos) para que seja proposta uma estrutura qumica para a molcula, podemos concluir, pela anlise dos espectros, que se trata de um dmero (C14) de heptulose.

Figura 27: Espectro de RMN 1H do glicosdeo dimrico (C14).

lxxxii

Figura 28: Espectro de RMN 13C do glicosdeo dimrico (C7).

4.3.

ANLISE DA FRAO F4A

O espectro de RMN 1H da frao F4a (figura 29) apresenta sinais tpicos de substncias aromticas, entre 5,5 e 7,0. O duplo dubleto em 5,8 e o multipleto em 6.7 denotam deslocamentos prprios de substncias com potencial antioxidante, provavelmente responsvel (is) pela intensa atividade desta frao. O sinal em 4.6 atribudo aos hidrognios da gua, presente na amostra como impureza.

lxxxiii

Figura 29: Espectro de RMN de 1H da frao F4A.

Como a massa da amostra no foi suficiente para realizao do ensaio de RMN 13C, a estrutura do componente ativo de F4A no pde ser elucidada, contudo, dois ensaios utilizando o radical estvel DPPH foram realizados a fim de confirmar a validade do mtodo e o potencial antioxidante da frao. No primeiro, foram preparadas quatro solues diludas de F4A (1:5, 1:10, 1:25, 1:50) posteriormente aplicadas a uma placa cromatogrfica de camada delgada (figura 30). O sistema foi ento desenvolvido em cuba cromatogrfica utilizando metanol e acetato como fase mvel e em seguida, revelada com soluo metanlica de DPPH 0,02%. O experimento mostrou que mesmo em diluies extremas o efeito antioxidante se mantm.

Rf = 0.70 Fase mvel: MeOH: AcOEt

lxxxiv

Figura 30: Placa de CCDC da frao F4A, diluda em 1:5, 1:10, 1:25 e 1:50, revelada com DPPH.

Um segundo ensaio, mais quantitativo, foi realizado com a frao. Diversas concentraes da amostra foram analisadas em teste espectrofotomtrico utilizando DPPH, como descrito no item 3.9 (p. 65). A anlise resultou em um grfico de percentagem de seqestro de radical DPPH em funo da concentrao da amostra (figura 31).

Figura 31: Percentual de seqestro do radical DPPH das fraes F4A e FS3, em vrias concentraes, obtido por avaliao espectrofotomtrica em placa de 96 poos.

Como mostra a figura 31, mesmo em concentraes menores que 10 g/mL, pode ser verificada aprecivel atividade antioxidante, sendo que a partir de 30 g/mL o seqestro de radical prximo de 100%, apresentando um IC 50 em torno de 15g/mL. O mesmo teste foi realizado com a frao FS3, obtendo resultado semelhante. Dada a potencialidade desta frao, sugerimos a continuidade dos estudos com o objetivo de aperfeioar a metodologia de separao, minimizando a perda de

lxxxv

massa, a fim de identificar as micromolculas responsveis pela intensa atividade observada.

lxxxvi

CONCLUSES

Estudos multidisciplinares envolvendo botnicos, qumicos, farmaclogos e agrnomos so necessrios para que sejam ampliados os conhecimentos das plantas medicinais, como agem, quais so os seus efeitos txicos e colaterais, como seriam suas interaes com novos medicamentos alopatas e quais as estratgias mais adequadas para o controle de qualidade e produo de novos candidatos a frmacos potentes e seletivos que atendam s normas das agncias reguladoras, como as resolues da ANVISA.

lxxxvii

Tais premissas permearam o desenvolvimento do projeto cuja reviso bibliogrfica envolveu publicaes de diversas reas. Os resultados obtidos se somam
os relatos encontrados na literatura no que concerne a qumica desta espcie, envolvendo o isolamento de flavonides, carotenides e terpenides, entre outros. O estudo qumico e

biolgico do endocarpo dos frutos de Persea americana Mill, pertencente famlia Lauraceae, conduziu ao isolamento de 04 substncias e verificao da atividade antioxidante em duas fraes, proporcionando a ampliao o conhecimento da composio qumica dessa espcie frutfera presente em toda a extenso do territrio nacional. A composio qumica do endocarpo, at o momento, mostrou ser constituda de sitosterol, triacilglicerdeo, heptulose e um glicosdeo dimrico. A alta atividade antioxidante determinada no extrato bruto e nas fraes estudadas justifica a continuidade dos trabalhos com a incluso de tcnicas estereoqumicas, do uso de diferentes fases estacionrias nas colunas cromatogrficas e a anlise detalhada das fraes de menor massa. Este trabalho contribuiu para a investigao qumico-farmacolgica da Flora brasileira, ao estudar a composio qumica e avaliar a atividade antioxidante dos extratos, fraes e substncias isoladas da espcie Persea americana.Cumpriu tambm o seu objetivo enquanto trabalho de iniciao cientfica por proporcionar o aprendizado de diversas tcnicas cromatogrficas, mtodos de separao e mtodos espectromtricos de identificao e isolamento de compostos orgnicos.

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