I. PENDAHULUAN Senyawa fenol alam 2% Karbon tumbuhan diubah jadi flavonoid atau 1 milyar ton pertahun Warna bunga dan buah, flavin (kuning, jingga), antosian (merah, biru, ungu) Tumbuhan: pigmen, pertumbuh-an, pertahanan, tabir surya, berkomunikasi Manusia :antioksidan, antiinflamasi, immunostimulan, antikanker, antivirus dan antimikroba.
Kerangka dasar
Kerangka dasar 15 atom C, dua cincin benzen,
terikat pada rantai propana, susunan C6C3C6 susunan yaitu : 1,3diarilpropana (flavonoid) 1,2diarilpropana (isoflavonoid) dan 1,1 diaril propana (neoflavonoid)
C3 C3 C1 C2 C1 C2
C3 C1 C2
FLAVONOID
ISOFLAVONOID
NEOFLAVONOID
contoh
1. Flavonoid
OH HO O O OH
O O OH
OCH3 O
FLAVON 2. Isoflavonoid
HO O
KUERSETIN
KRANJIN
O OH HO OCH3
FEREIRIN
O H3CO O O O OH O CH2 O OCH3 OCH3 O O
PTEROKARPIN 3. Neoflavonoid
H3CO O O O O OH HO
ROTENON
O H3CO O O
DALBERGIN
BRAZILIN
KALOFILOID
Cincin benzen dihubungkan satuan tiga karbon dapat atau tidak dapat membentuk cincin ketiga. Untuk memudahkan maka cincin pertama benzen diberi indeks A, cincin benzen kedua indeks B dan cincin yang dapat terbentuk cincin C
3' 2' 8 7 6 9 1 O 4' 2 HO 4' 5' 6' O 3' 2' OH 1 3 OH 4 5
B
2 1' 6' 3 4
5'
B
6
A
5 10
C
O
Whats a phenolic compound? A secondary product that contains a phenol group - a hydroxyl functional group on an aromatic ring.
OH
Phenolics are a chemically diverse group: many different properties and functions.
Shikimic acid pathway is most common in plants. Converts simple carbohydrates into aromatic amino acids. Not present in animals.
Biosynthesis of phenolics
Most plant phenolics are derived from cinnamic acid formed from phenylalanine by phenylalanine ammonia lyase (PAL) enzyme.
PAL activity is inducible: fungal infection, low nutrient levels, high light
PAL
HO
O HO OH
OH
O OH O
KHALKON
OH
OH
Flavanon
Khalkon
OH HO O
b
+
OH HO +OHO OH OH O [O]
Ha
a H
OH
+
O
a b
-H
Flavanonol
-H+ OH
H OH
HO
HO
O CH
HO OH
O OH OH O
OH
OH
Flavon
Auron
Flavonol
H HO O O OH O H OH O OH HO O
Flavanonol -H2O
H+ O O OH O OH OH O OH OH
2[H]
O OH
H+
OH H+ HO O OH OH O O OH OH OH
+
OH
H+
H+
H+ OH OH HO O HO OH OH OH OH OH O OH O
HO
O OH OH OH
Katekin
Antosianidin
Lanjutan
Pemilihan pelarut tidak hanya tergantung pada kepolaran, tetapi juga tempat substansi berada. Bila pada vakuola sel, bersifat hidrofilik, penyarian dengan air atau pelarut alkoholik. Jika dalam kloroplas pelarut nonpolar sebelum alkoholik. Ekstraksi flavonoid tidak cocok untuk antosianin atau flavonoid kepolaran rendah. Antosian, daun segar atau bunga segera digerus dengan NaOH yang mengandung 1% HCl pekat. Ekstraksi terjadi ditandai adanya perubahan warna larutan, kromatografi atau analisis spektroskopi ekstrak segera dilakukan untuk mencegah hidrolsisi glikosida. Untuk simplisia yang mengandung flavonoid dengan kepolaran yang lebih rendah lagi langsung diisolasi dengan heksana atau eter beberapa menit, ingat ekstrak yang diperoleh mengandung lemak dan lilin.
2 Isolasi
Metode terbaik isolasi campuran flavonoid a.l kromatografi kertas (KKt) dan kromatografi lapis tipis (KLT). Metode KKt, kertas disarankan kertas Whatman 3MM (46 x 57 cm) atau setara. Ekstrak ditotolkan 8 cm dari tepi lipatan pertama dan 3 cm dari lipatan kedua dengan garis tengah 3 mm berpusat pada satu titik, keringkan bercak dengan pengering rambut. Ekstrak yang ditotolkan secara umum yaitu dari sejumlah ekstrak yang diperoleh dari 50 100 mg bahan tumbuhan kering. Elusi pertama dapat BAA (n-Butanol, Asam asetat, Air = BAW) 4:1:5 atau TBA (t-BuOH:HOAc:H2o) 3:1:1. Kertas diangkat, keringkan di lemari asam, bagian kromatogram yang dilipat (a) digunting. Eluen kedua menggunakan biasanya berupa larutan dalam air seperti asam asetat 15%. Untuk antosianin disarankan pengembang setara , biasanya BAA atau Bu/HCl dan kedua HCl 1%.
Flavonoid tidak nampak, kecuali antosian (bercak jingga sampai lembayung yang biru dengan uap ammonia), khalkon, auron dan 6-hidroksi flavanol kuning). Karena alasan tersebut, untuk mendeteksi bercak, kromatogram diperiksa dengan sinar UV (366 nm dan 254 nm) diperjelas dengan uap ammonia.
Lanjutan
Untuk isolasi flavonoid skala besar dapat dilakukan dengan kromatografi kolom. Dasarnya, cara ini meliputi penempatan campuran flavonoid (berupa larutan) di atas kolom berisi serbuk penjerap (seperti selulosa, silika, atau poliamida), lanjutkan dengan elusi beruntun setiap komponen memakai pelarut yang sesuai. Kolom hanya berupa tabung kaca yang dilengkapi dengan keran pada salah satu ujungnya dengan ukuran garis tengah berbanding panjang kolom 1:10 atau 1:30.
Mengemas kolom dengan hati-hati agar kolom homogen, Jika tidak ada kaca masir, dapat kaca wol atau kapas, sumbat ini direndam pengelusi tingginya 10 cm. Kemasan kolom dibuat bubur dengan pelarut sama, lalu dituang ke dalam kolom tanpa putus agar tidak terbentuk lapisan. Kemasan dibiarkan turun dan kelebihan pelarut dibiarkan turun. Jika fase diam poliamida yang digunakan maka dianjurkan untuk mengembangkan dulu satu jam. Selanjutnya larutan cuplikan ditempat di atas kemasan sedemikian rupa sehingga berupa satu pita, menggunakan pelarut sesedikit mungkin untuk hasil yang baik. Biarkan larutan cuplikan meresap ke dalam kemasan dengan membuka sedikit keran, tutup dan tambah perlahan-lahan cairan pengelusi dan dibiarkan kembali meresap ke dalam kemasan.
8 cm
3 cm
(a)
(b)
biarkan 5 cm
(c)
(d)
OH O O OH
-
OO
O-
O O
Adanya gugus fenol memberikan reaksi positif dengan pereaksi fenol, misalnya besi (III) klorida dan pereaksi asam sulfat memberi warna spesifik. Reaksi ini tidak spesifik, tidak dapat digunakan membedakan golongan dan harus diikuti oleh uji warna lainnya. Flavonoid dengan gugus hidroksil kedudukan orto berwarna kuning intensif jika bereaksi dengan asam borat dan larutan natrium asetat, seperti rekasi berikut:
Selain pada kedudukan orto, gugus hidroksil dengan kedudukan lain diduga dapat membentuk ikatan dengan campuran asam sitrat dan asam borat, pada pemanasan, pereaksi sitroborat, mekanisme reaksi yang terjadi belum dapat diketahui secara pasti. Warna fluoresensi yang terbentuk adalah kuning,kuning kehijauan dengan sinar UV 366 nm.
Pereaksi AlCl3 membentuk kompleks dengan flavonoid (gugus hidroksil berkedudukan orto) menimbulkan warna kuning, ini tidak stabil dengan HCl dan terurai kembali, jika gugus hidroksil yang berkedudukan dekat gugus karbonil akan stabil dengan penambahan HCl.
Cl OH OH HO O AlCl3 HCl O O HO O O Al O
Cl O Al O OH HO O AlCl3 O OH O Cl Al O Cl O Cl Al O Cl HCl HO O HO O OH OH
OH
Kompleks flavonoid dengan AlCl3 lewat gugus hidroksil yang berkedudukan orto dan yang berkedudukan dekat gugus karbonil, digunakan dasar penetapan adanya gugus hidroksil pada kedudukan tertentu dalam molekul flavonoid. Lazim identifikasi flavonoid diawali dengan reaksi warna menggunakan pereaksi-pereaksi, seperti natrium hidroksida, asam sulfat, besi (III) klorida, logam magnesium dan asam klorida. Kelarutan dari flavonoid menjadi dasar dalam ekstraksi dan pemisahan secara kromatografi, sifat-sifatnya dengan pereaksi-pereaksi tertentu menjadi dasar analisis spektrofotometri UVtampak.
Hidrolisis
Flavonoid terdapat pada semua bagian tumbuhan tinggi, seperti bunga, daun, ranting, buah, kayu, kulit, kayu dan akar. Flavanoid tertentu bisa terkonsentrasi pada satu jaringan, misal antosianidin zat warna bunga, buah dan daun.
Sebagian besar flavonoid alam dalam bentuk glikosida, adalah kombinasi antara gula dan alkohol saling berikatan melalui ikatan glikosida. Prinsip ikatan glikosida, gugus hidoksil dari alkohol beradisi ke gugus karbonil dari gula, sama seperti adisi alkohol ke aldehida yang dikatalis oleh adanya asam menghasilkan asetal.
OR' C
R'-OH H
+
R C H
+C
R
OR'
R' H
+
OR'
H2O
OH
Aldehida
Alkohol
Hemiasetal
Asetal
CH2OH OH OH OH OH O C H OH
CH2OH O OH H OH
+
Glukosida
Pada hidrolisis, glikosida terurai kembali atas komponennya menghasilkan gula dan alkohol, alkohol disebut aglikon. Biasanya, sisa gula dari glikosida flavonoid alam adalah glukosa, rhamnosa, galaktosa dan gentiobiosa, sehingga glikosida tersebut masing-masing disebut glukosida, rhamnosida, galaktosida dan gentiobiosida. Flavonoid dapat ditemukan sebagai mono, di atau tri-glikosida, dimana satu, dua atau tiga gugus hidroksil dalam molekul flavonoid terikat oleh gula. Poliglikosida larut dalam air dan hanya sedikit larut dalam pelarut organik seperti eter, benzen, kloroform dan aseton. Untuk membedakan aglikon dan gula yang terikat sebagai glikosida, perlu dilakukan hidrolisis dapat dengan asam, enzim atau basa.
Biasanya dengan HCl, ikatan O-glikosida atau Cglikosida. C-glikosida, sangat tahan asam, dibedakan waktu atau lama hidrolsis. Juga dipengaruhi posisi ikatan gula pada flavonoid. Gula posisi 3 lebih mudah dihidrolisis dibanding posisi 7, paling mudah posisi 5. Flavonol 3-rhamnofuranosida kurang stabil sehingga hidrolsis lebih cepat dibanding flavonol 3-rhamnopiranosida relatif lebih stabil. Cara baku hidrolisis O-glikosida: Larutan glikosida (1mg) hidrolisis 5 ml HCl 2N : MeOH (1:1) dalam labu alas bulat 25 ml, refluks 60 menit. Rotavapour, sisa larutkan dengan MeOH : H2O (1:1) sesedikit mungkin. KKt atau KLT-selulosa, 15% asam asetat, hasil : - jika terjadi hidrolsisi, Rf akan lebih kecil, suatu Oglikosida, kemungkinan kecil bisulfat atau C-glikosida ter-O-glikosida. - Jika tidak terjadi hidrolisis, adalah C-glikosida atau glukoronida - Jika hidrolisis sebagian, mungkin glukuronida
Berguna menentukan sifat ikatan antara gula dan flavonoid (yaitu atau ), khas hanya memutuskan monosakarida flavonoid O-glikosida. Selanjutnya dianalisis dengan KLT, atau KGC untuk mengetahui hasil hidrolosis, - -glukosidase (emulsin), menghidrolsisi -D-gluksoda dan xilosida, tidak menghidrolsisi antosianidin glikosida. - -galaktosidase, menghidrolsisi -D-galaktosida - -glikuronidase, menghidrolsisi -D-glukuronidase - Pektinase, menghidrolsis -D-poligalakturonida dan -L-rhamnosida - Antosianase, menghidrolsis sebagian besar antosiani din glikosida - Rhamnodiastase, memutuskan sebagian besar oligo sakarida secara utuh dari glikosida dalam Rhamnus frangula - Takadiastase, menghidrolsisi naringenin 7-O-neo hesperidosida.