LA TINCION DE GRAM

1. INTRODUCCIN

El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea. El modo ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes. La tincin de Gram es uno de los mtodos de mayor importancia y relevancia que se emplean en el laboratorio de Microbiologa. Esta tincin constituye un tipo de tincin diferencial puesto que clasifica las bacterias en dos grandes grupos: gram positivas y gram negativas en virtud a la coloracin que estas desarrollen y la coloracin depender de la diferencia constitutiva en la estructura de la pared celular de las bacterias.

El dans Christian Gram en el ao de 1884 dej una huella indeleble e imperecedera para la humanidad, al emplear y estudiar esta tincin.

El objetivo primordial del presente trabajo es buscar, recabar y documentar informacin sobre esta tincin que a la fecha no ha perdido vigencia ni notoriedad y sigue siendo la piedra angular en el campo de microbiologa.

2. OBJETIVO Reconocer la tincin adoptada por la pared bacteriana del Gram (+) y el Gram (-) Explicar o fundamentar la coloracin del Gram

3. MARCO TERICO

1.1. QU ES LA TINCIN DE GRAM?

La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el laboratorio bacteriolgico y con el que el lector debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad prctica es indiscutible y en el trabajo microscpico de rutina del Laboratorio de Microbiologa las referencias a la morfologa celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc.) se basan justamente en la tincin de GRAM. 1.2. RESEA HISTRORICA

Hablar de la Tincin de Gram es remontarse a los ao de 1882, con el famoso cientfico dans Christian Hans Gram quien desarroll la tincin ms importante en microbiologa que a la fecha lleva su nombre. Para el ao de 1884, Gram presenta sus trabajos a la sociedad cientfica de su poca y publica todas sus experiencias y conocimientos en lo relativo a su Tincin.

Para 1923, posterior a la poca dorada de Gram, se inician las modificaciones a la Tincin original, as nace la llamada modificacin de Hucker; donde la violeta cristal se disuelve con alcohol etanol y se prepara con una solucin de oxalato de amonio. La solucin se emplea por un perodo no mayor de 30 segundos. Luego se aplica una solucin Idica de Gram (lugol + bicarbonato sdico diluido). El alcohol-acetona ser la solucin decoloradora y no tomar ms de 5 segundos en su aplicacin. La safranina o fuscina bsica al 0.1 a 0.2 % ser el contra tinte o tinte de contraste y su periodo de tincin no pasar los 30 segundos."315'

Posteriormente, el cientfico Kopeloff efectu modificaciones a la tincin de Hucker para microorganismos que no se vean bien y presentaban dificultades en la coloracin, tal es el caso de los anaerobios; estas bacterias slo se tien ligeramente y eran muy fciles de decolorar por consiguiente no se observaban apropiadamente al microscopio. La modificacin de Kopeloff emplea los mismos colorantes que Hucker

pero se cambia la concentracin de los tintes unos a mayor concentracin y otros a menor. El de-colorante es alcohol - acetona en proporcin (7:3). Adems, los tiempos de tincin varan ampliamente lo cual facilita la observacin de estos grmenes.

En 1978. El cientfico Gregersen determin que las bacterias Gram negativas se diferenciaban de las Gram positivas en virtud a la composicin de la pared celular al entrar en contacto con una solucin alcalina diluida. Una suspensin de microorganismos en KOH al 3% toman un aspecto viscoso debido a la liberacin de los lipopolisacridos y DNA cuando se trabaja con bacterias Gram negativas. Mientras que las Gram positivas no presentan dicha viscosidad en virtud a la estructura de su pared celular.

1.3. PRINCIPIOS DE LA TINCION DE GRAM

Las bacterias presentan caractersticas determinantes y constitutivas en la

pared celular, la cual le confiere propiedades determinantes a cada microorganismo. As la pared celular no tan slo le sirve para dar forma, rigidez y tamao a la clula, sino que soporta altas presiones osmticas que pueden llevarla a una muerte segura por lisis osmtica.

El pptidoglicano es la sustancia que le confiere la rigidez a la pared celular y le

brinda todo el soporte que esta necesita. La molcula de pptidoglicano est conformada principalmente por disacridos, constituidos por N-acetilglucosamina y N-acetilmurmico que se unen por enlaces de B (1>4) repitindose un nmero plural de veces y un enlace de tetra-pptido unido a la N-acetilglucosamina. Este compuesto se alterna con los aminocidos L y D de alanina. D-cido glutmico y usina o cido diaminopimlico. Las cadenas de estas molculas se unen entre si constituyendo una ultra estructura de enlaces peptdicos con los aminocidos que conforman una estructura rgida y continua que es la pared celular bacteriana. La estructura de estos puentes peptdicos vara entre las especies bacterianas. Los microorganismos presentan marcadas diferencias estructurales en la pared celular que son la base para clasificar las bacterias en dos grandes grupos: las Gram positivas y las Gram negativas. Las bacterias Gram positivas tienen una pared celular gruesa conformada de varias capas interconectadas de

pptidoglicano en niveles que van por el orden de 80 a 90 % de la estructura total.

 Tambin, poseen otras sustancias como: el cido teicoicos que son polmeros de hasta 30 unidades de glicerol-fosfato o ribitol-fosfato unidas entre s por enlaces fosfodister. Otro elemento importante que se encuentra en ciertas bacterias Gram positivas es el cido teicurnico que se sintetiza como respuesta a la falta de cido teicoico por limitacin de fosforo Por otro lado, las bacterias Gram negativas tienen una lnea capa de pptidoglicano que constituyen un 20% de la pared celular. Esta estructura se encuentra rodeada por una segunda membrana lipdica exterior que contiene lipopolisacridos y lipoprotenas que son de variada complejidad. La membrana externa se encuentra unida a la capa de pptidoglicano por medio de lipoprotenas.

El colorante bsico violeta cristal penetra en las clulas bacterianas tanto de microorganismos Gram positivos como de Gram negativos. Luego el lugol o Yodo de Gram entra en las clulas y constituye un complejo insoluble con la solucin acuosa de violeta crista La mezcla de alcohol-acetona tiene como funcin determinante la decoloracin ya que la misma es soluble al complejo que se ha formado violeta cristal -Yodo de Gram.

Las bacterias Gram positivas no se decoloran. Mientras que las Gram negativas se decoloran. Sin duda alguna esta caracterstica marca la gran diferencia entre esto dos tipos de clulas. Los microorganismos Gram negativos tienen espacios en la estructura de su pared celular y el alcohol-acetona es un solvente lipdico que acta sobre la membrana exterior de la pared de la clula y afecta la membrana citoplsmica donde se unen los pptidoglicano. Adems, la delgada capa de pptidoglicano no retiene el complejo violeta cristal yodo lo cual obliga a las clulas Gram negativas a decolorarse.

 Sin embargo las clulas Gram positivas debido a sus gruesas paredes de pptidoglicano y pocos lpidos no son permeables al decolorador puesto que este deshidrata la pared celular y cierra los poros, alterando y afectando el pequeo espacio entre las molculas. El complejo violeta cristal-yodo queda atrapado dentro de la pared celular tiendo a las bacterias Gram positivas de color azul. Finalmente, se adiciona la safranina que es un tinte de contraste y puede o no utilizarse ya que en algunos casos se sustituye por carbol-fuscina, cuya funcin es poner de manifiesto las bacterias que estaban decoloradas es decir le da color a las bacterias Gram negativas, tomando una tonalidad roja.

4. RESUMEN

La tincin de Gram es un procedimiento sencillo pero de gran utilidad, empleado por todos los laboratorios de microbiologa, lo cual le da un sentido de universalidad y su aplicacin cubre diversos campos de la ciencia. Esta tincin constituye un tipo de tincin diferencial ya que clasifica las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram negativas en virtud a la coloracin que estas desarrollen y la coloracin depender de la diferencia constitutiva en la estructura de la pared celular de las bacterias.

La tincin de Gram es un recurso barato y sencillo que bien utilizado puede brindar valiosa informacin; depender de nosotros darle el buen uso para obtener la mejor informacin posible.

5. CONCLUSIONES La tincin de Gram (+) se vuelve violeta y se mantiene de ese color porque el complejo CV-I continua dentro dela celula dndole la coloracio La tincin del Gram (-) se vuelve rosa pues al eliminarse las grasas de la paredes aumenta la porosidad y el complejo CV-I se separa de la celula

6. BIBLIOGRAFIA

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