MICROSCPIO

O olho humano tem poder de resoluo de aproximadamente 0,1 mm ou 100 m. Isto significa que se voc olhar dois pontos separados por uma distncia menor que 100 m, esses pontos aparecero como um ponto nico. Para distinguir estruturas separadas uma das outras por menos de 100 m, h necessidade de instrumentos pticos que tenham poder de resoluo aumentada. importante salientar a diferena entre poder de resoluo e poder de aumento. Se voc ampliar vrias vezes uma mesma fotografia comum, a imagem aumenta, mas os pontos separados por menos de 100 m continuaro a aparecer como um ponto s,borrado. possvel, portanto, aumentar a ampliao, sem contudo melhorar a resoluo.Os microscpios permitiram ao homem observar estruturas com ampliao maior e maior resoluo. O limite de resoluo dos microscpios pticos, que so aqueles que utilizam a luz para iluminar o objeto que est sendo analisado, de cerca de 0,2 m (ou 200 nm ou 2 000 A ); melhor que o olho humano cerca de 500 vezes. No se consegue construir microscpios pticos com desempenho melhor que este, pois o fator limitante o comprimento de onda da luz. Com o advento do microscpio eletrnico, o poder de resoluo foi aumentado cerca de 1000 vezes em relao ao microscpio ptico. Para isso, em vez de feixes de luz, empregam-se feixes de eltrons para "iluminar" o,objeto a ser analisado. As reas do material que permitem melhor transmisso de eltrons (regies transparentes aos eltrons) aparecem como reas claras; as reas que absorvem ou defletem os eltrons (regies densas aos eltrons) aparecem como reas escuras. Os microscpios eletrnicos tm limite de resoluo prximo de 2 A, cerca de 500 000 vezes maior que o do olho humano.

O microscpio ptico (MO)

Os primeiros microscpios de luz ou microscpios pticos (MO) surgiram no sculo XVII, principalmente com o holands Anton van Leeuwenhoek (1632-1723) e o ingls Robert Hooke (1635-1703). Leeuwenhoek construia microscpios com uma nica lente, que chegavam a aumentos de mais de 200 vezes. Esses microscpios com uma lente s so chama os microscpios simples, e a imagem fornecida no boa. Hooke construiu seu microscpio com duas lentes: uma delas era a ocular e a outra, a objetiva. Esses microscpios so chamados microscpios compostos e a imagem fornecida melhor que a do microscpio composto.

Colorao
A maioria dos tecidos incolor, o que torna difcil sua observao ao microscpio ptico. Devido a isso foram introduzidos mtodos para a colorao dos tecidos, de modo a tornar seus componentes visveis e destacados uns dos outros. A colorao feita usando-se geralmente misturas de substncias qumicas denominadas corantes. A maioria dos corantes usados em histologia comportam-se como cidos ou bases e tendem a formar ligaes salinas com radicais ionizveis presentes nos tecidos.Os componentes dos tecidos que se coram facilmente com corantes bsicos so chamados basfilos, sendo chamados de acidfilos os que se ligam a corantes cidos.

O microscpio eletrnico (ME)

''... No inicio do sculo XIX estava definido o limite de resoluo do microscpio ptico. Segundo o fsico alemo Ernst Abbe (1840-1905), esse limite dependia principalmente do comprimento de onda (?) da luz com que se observa o objeto. O MO no pode ver pontos do objeto mais prximos do que 0,2 micrometros (1 m = 10-3 mm), ou seja, seu aumento mximo est em torno de mil vezes. (No muito mais do que Leeuwenhoek conseguia! ) O conhecimento dos fenmenos ondulatrios permite-nos saber que a imagem de um ponto luminoso obtida atrevs de uma lente formada por um circulo central luminoso cercado de anis claros, com intensidades decrescentes (difrao). Quando buscamos aumentos baixos, no observamos essa figura, mas ela que determina o limite de aumento para cada dimetro da limite e para cada cor da luz de

iluminao. Quanto maior ? mais critica a situao. Dai concluirmos que j atingimos o aumento mximo permitido pelo MO, pois as aberraes (distores) das lentes j foram suficientemente bem corrigidas, mas o nosso olho infelizmente no v a luz com ? menor que o violeta. ento que entramos com um novo universo que o ME pde proporcionar. No inicio do sculo XX, o fsico francs Louis De Broglie (1892-1987) props que partculas qunticas, como o eltron, tm associadas a si ondas cujos comprimentos variam com o inverso da velocidade. Para eltrons acelerados, por exemplo, por um potencial de 50 quilovolts (um kV = mil volts), ? aproximadamente dez mil vezes menor do que o da luz verde. Portanto, o efeito da difrao para eltrons seria extremamente menor do que para a luz. Esta a razo terica da capacidade de aumento do ME. (...) Na dcada de 1930, Ernst Ruska (1906-1988), na Alemanha, construiu o que foi considerado como o primeiro ME. Hoje em dia o ME pode chegar a aumentos acima de um milho de vezes (mil vezes mais que o MO), mas nas primeiras tentativas as imagens eram muito inferiores s do MO, em qualidade e aumento.

O ME consiste basicamente em:

canho eletrnico com R fonte de eltrons (fio aquecido), que podem ser acelerados em potenciais em geral de 20 at 100 KV. sistema eltrico para suprir as tenses e correntes do aparelho. lentes magnticas, que so bobinas (fios enrolados) para produzir um campo magntico atuante sobre os eltrons, tendo um efeito semelhante ao de uma lente comum para a luz. sistema de bombas para produzir alto vcuo (presso de cerca de 10-6 atm) e permitir que os eltrons migrem pelo tubo do aparelho, alm de evitar a combusto do filamento pelo oxignio do ar. tela fluorescente para produzir uma imagem final visvel, quando atingida pelos eltrons. O microscpio acima descrito chamado microscpio eletrnico de transmisso (MET), pois o que se observa a projeo de uma fatia muito fina do material (como no MO, embora muito mais fina). Mais recentemente, na dcada de 1960, surgiu o chamado microscpio eletrnico de varredura (MEV), cuja aplicao est na observao da superfcie dos materiais. Nesse aparelho, a superfcie do material varrida ponto a ponto por um feixe de eltrons (...) O preparo de amostras, particularmente as biolgicas, fundamental para obteno de boas imagens. Para o MET, a amostra deve ser fixada com reagente especifico, lavada, desidratada (a gua substituida por acetona) e imersa numa resina epxi que endurece aps ficar 48 horas numa estufa a 60C. A ento ela cortada em fatias finssimas (espessura de 0,05 pm), corada com sais de metais pesados, como urnio e chumbo, e s depois disso observada no MET. No caso do MEU, como desejamos uma superfcie bem preservada e que produza uma boa correntede eltrons secundrios para obteno de uma boa imagem, o material fixado como na forma anterior, mas a desidratao feita por um mtodo (ponto critico do CO2 - dixido de carbono) que praticamente no deforma o material. Aps essa desidratao, a amostra coberta com fina camada de ouro, por mtodo especial (sputtering). Depois disso ela est pronta para observao no MEV. No Brasil temos algumas dezenas de MEs, muitos dedicados pesquisa biolgica. Uma rea que tem sido bastante auxiliada pelos MEs a protozoologia, especialmente no estudo de protozorios patognicos tanto para os animais quanto para as plantas (...) A microscopia eletrnica tem se desenvolvido muito nos ltimos anos, culminando com a criao do chamado microscpio de tunelamento quntico, cujos autores, Gerd Binning e Heinrich Roher, do Zurich Research Laboratory (IBM), dividiram com Ruska o Prmio Nobel de Fsica de 1986".

PRINCIPAIS CORANTES DA MICROSCOPIA PTICA

Quanto natureza qumica: CIDOS - Coram elementos acidfilos. Eosina, cido smico e P-A-S- (Periodic Acid Schifft) BSICOS - Tingem as estruturas basfilas. Hematoxilina, orcena, azul de metileno, lugol, Verde-janus B, violeta de genciana.

NEUTROS - Efeito tintorial sobre as estruturas que no revelam acidofilia nem basofilia. Vermelho neutro.

Quanto ao papel fisiolgico:

VITAIS - Coram a clula sem determinar sua morte. Verde-janus B, azul de metileno, azul brilhante de cresil, vermelho neutro, Sudan III. NO-VITAIS - Determinam a morte celular. Hematoxillna, eosina, cido smico, lugol, vermelho escarlate, violeta de genciana.

Quanto s propriedades tintoriais:

ORTOCROMTICOS - Conferem clula a mesma cor que apresentam in vtro. Azul de metileno, verdejanus B, vermelho neutro. METACROMTICOS - Do clula colorao diferente da que apresentam in vtro. Laranja de acridina, tionina, azul de toluidina.

Cromatofilia celular:
Membrana plasmtica - Tetrxido de smio (OsO4). Reticulo endoplasmtico - Tetrxido de smio. Ribossomos - Difenilamina, azul de toluidina. Matriz do hialoplasma - Reativo de Millon (reativo nitroso-mercrico). Ergastoplasma - Hematoxilina. (Ele considerado como a substncia basfila do citoplasma). Mitocndrias Verde-janus B, cido smico, hematoxilina frrica. Complexo de Golgi -Sais de prata. Centrossomo - Hematoxilina frrica. Vacolos - Vermelho neutro

Nuclolos:
Plasmossomos (nuclolos verdadeiros) - Verde de metil-pironina. (So Feulgen negativo). Cariossomos (falsos nuclolos) - Hematoxilina, fucsina bsica. (So Feulgen positivo). Cromossomos - Feulgen positivo, P-A-S- negativo, hematoxilina, orcena e demais corantes bsicos.

PRINCIPAIS CORANTES
Componente Celular
DNA RNA

Corante
Reao de Feulgen Reao de Galocianina

Protenas Totais Protenas Histnicas Lipidios Polissacardeos Amido Ncleo Citoplasma Golgissomo Mitocndrias Fonte: infonet.com.br

Fast Geen / pH = 2,7 Fast Geen / pH = 8,1 Suudan III ou Sudan IV Reao de PAS Logol / Iodo Hematoxina Eosina Nitrato de Prata Hematoxina Frrica