UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIS ESCOLA DE VETERINRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIA ANIMAL

Disciplina: SEMINRIOS APLICADOS

APLICAES DAS TCNICAS DE CROMATOGRAFIA NO DIAGNSTICO TOXICOLGICO

Daniel Silva Goulart Orientador: Maria Clorinda Soares Fioravanti

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DANIEL SILVA GOULART

APLICAES DAS TCNICAS DE CROMATOGRAFIA NO DIAGNSTICO TOXICOLGICO

Seminrio apresentado junto Disciplina Seminrios Aplicados do Programa de PsGraduao em Cincia Animal da Escola de Veterinria e Zootecnia da Universidade Federal de Gois. Nvel: Doutorado

rea de concentrao: Patologia Clnica e Cirurgia Animal

Linha de Pesquisa: Alteraes clnicas, metablicas e toxmicas dos animais e meios auxiliares de diagnstico

Orientador: Prof. Dr. Maria Clorinda Soares Fioravanti - UFG Comit de Orientao: Prof. Dr. Emmanuel Arnhold - UFG Prof. Dr. Franklin Riet-Correa Amaral - UFCG

GOINIA 2012

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LISTA DE ABREVIATURAS

CCD CG CG-MS HPLC HPLC-FI

cromatografia em camada delgada cromatografia gasosa cromatografia gasosa acoplada a espectrofotometria de massa cromatografia lquida de alta eficincia cromatografia lquida de alta eficincia com deteco de fluorescncia

HPLC-IR

cromatografia liquida de alta eficincia acoplada a espectrofotometria de infravermelho

HPLC-MS

cromatografia liquida de alta eficincia acoplada a espectrofotometria de massa

LC-MS LC-MS/MS

cromatografia liquida acoplada a espectrofotometria de massa cromatografia liquida acoplada a espectrofotometria de massa acoplada a espectrofotometria de massa

MF U-HPLC U-HPLC-MS/MS

monofluoroacetato de sdio cromatografia lquida de ultra eficincia cromatografia liquida de alta eficincia acoplada a espectrofotometria de massa acoplada a espectrofotometria de massa

UV WADA

ultravioleta Word Anti-Doping Agency

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SUMRIO

1 INTRODUO .................................................................................................... 1 2 REVISO DE LITERATURA ............................................................................... 3 2.1 Breve histrico.................................................................................................. 3 2.2 Principais tipos de cromatografia ..................................................................... 4 2.2.1 Cromatografia em papel ................................................................................ 4 2.2.2 Cromatografia em camada delgada .............................................................. 5 2.2.3 Cromatografia gasosa ................................................................................... 5 2.2.4 Cromatografia lquida de alta eficincia......................................................... 6 2.2.5 Cromatografia multidimensional .................................................................... 7 2.3 Principais usos da cromatografia ..................................................................... 8 2.4 Uso da cromatografia na toxicologia ................................................................ 9 2.4.1 A cromatografia na toxicologia forense ......................................................... 9 2.4.2 A cromatografia na toxicologia veterinria ................................................... 13 2.4.3 A cromatografia para identificao de substncias nocivas em alimentos .. 19 3 CONSIDERAES FINAIS .............................................................................. 23 REFERNCIAS .................................................................................................... 24

1 INTRODUO

A cromatografia uma tcnica relatada cientificamente h pouco mais de cem anos e baseia-se na migrao de componentes de uma mistura entre duas fases: a fase estacionria que retm elementos e a fase mvel que conduz a mistura por meio de um soluto atravs da fase estacionria. uma tcnica que pode ser utilizada para purificao de substncias, na deteco de substncias ou auxiliar a separao de substncias indesejveis. As tcnicas cromatogrficas podem ser divididas principalmente em cromatografia em papel, cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia gasosa (CG), cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC), e mais atualmente a cromatografia lquida de ultra-eficincia (U-HPLC). Os mtodos cromatogrficos podem ser utilizados separadamente ou em conjunto dependendo dos componentes a serem separados ou identificados. A cromatografia tem sido desenvolvida e utilizada em diversos meios da cincia. A qumica a rea mais atuante no desenvolvimento de mtodos cromatogrficos, mas outras reas da cincia tambm utilizam dessas tcnicas, sendo elas muito difundidas na rea farmacutica e mdica. Devido alta preciso e confiabilidade dessas tcnicas, elas so muito utilizadas na deteco ou separao de substncias que esto em pequenas quantidades em uma mistura. Assim, na rea mdica a cromatografia tem grande utilizao na toxicologia, seja para monitorar o uso de medicamento ou para o seu uso na cincia forense, dosando drogas de abuso e auxiliando a elucidar crimes. Da mesma forma que ocorre na medicina, na medicina veterinria as tcnicas cromatogrficas podem ser empregadas no diagnstico de doenas e em estudos de farmacocintica, mas na toxicologia que a tcnica ganha maior destaque. O estudo toxicolgico envolve a identificao de substncias, seja aps a intoxicao ou em estudos experimentais quando essa identificao pode ser realizada previamente, certificando que a quantidade de princpio ativo a ser utilizada esteja correta. Outro grande interesse para o uso das tcnicas cromatogrficas na medicina veterinria na identificao de resduos de drogas em produtos de origem animal. Sabe-se que esses resduos podem prejudicar o consumidor final,

e causar descrdito cadeia produtiva, assim o monitoramento destes produtos torna-se de fundamental importncia. Diante da versatilidade do uso da cromatografia e do potencial de sua utilizao na toxicologia, essa reviso teve o intuito de relatar as diferentes aplicaes de mtodos cromatogrficos no diagnstico toxicolgico, bem como esclarecer seus usos na toxicologia veterinria.

2 REVISO DE LITERATURA

2.1 Breve histrico

A cromatografia foi relatada pela primeira vez h pouco mais de 100 anos por Mikhail Semenovich Tswett (1872-1919). No perodo de 1899 1901 Tswett trabalhou em sua primeira pesquisa com a estrutura fsico-qumica da clorofila das plantas, sendo que no ano de 1903 relatou uma nova categoria de anlise adsortiva (ETTRE, 2000). O trabalho de Tswett foi apresentado em forma de tratado para a Sociedade de Cincias de Varsvia, no qual descreveu os resultados preliminares de suas pesquisas com extrato de folhas, utilizando uma coluna de vidro recheada com carbonato de clcio, separando os constituintes do extrato pela passagem de ter dietlico (COLLINS, 2006). No entanto, as denominaes de cromatografia e cromatograma somente surgiram no segundo trabalho de Tswett, publicado em 1906. A palavra cromatografia designava o processo de separao, tendo sua origem do grego chroma, com o significado de cor, e tambm do grego graphe, significando escrever. J a palavra cromatograma refere-se s bandas separadas na coluna (COLLINS, 2006; NOGUEIRA, 2006). Durante os cem anos que se seguiram da publicao de Tswett a cromatografia passou por grande evoluo. Em decorrncia da tcnica ser baseada em duas fases (mvel e estacionria) e da possibilidade de utilizao de diferentes componentes nestas fases, a cromatografia demonstrou sua grande flexibilidade. O controle do fluxo da fase mvel por gravidade, presso, ao capilar, eletro-osmose, aliado ao fato de o processo poder ser realizado em diferentes temperaturas, permitiu que a tcnica de separao pudesse ser aplicada desde pequenos tomos a grandes quantidades de substncias (ETTRE, 2000). Assim, a evoluo da tcnica iniciou-se na cromatografia lquida de adsoro seguida pela cromatografia de partio. Posteriormente surgiu a anlise de gases e amostras vaporizadas, seguida pelas trocas inicas, separao por tamanho molecular e eletrocromatografia (ETTRE, 2000).

Mais recentemente a cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) tem sido a tcnica analtica mais desenvolvida, difundida e utilizada nos laboratrios de anlises qumicas e farmacuticas. Desta forma, nos ltimos 40 anos muitos avanos em relao a esta tcnica foram alcanados, impulsionados pelo desenvolvimento contnuo de novas partculas de fase estacionria, capazes de gerar colunas mais seletivas, eficientes e qumica e mecanicamente estveis (MALDANER & JARDIM, 2009). A expanso da HPLC tem sido direcionada ao desenvolvimento de anlises mais rpidas, sem o comprometimento do desempenho cromatogrfico. Assim com a reduo do tamanho das partculas da fase estacionria e das colunas, com partculas menores que 2 m, surgiu a cromatografia lquida de ultra eficincia (U-HPLC), sendo esta uma das mais recentes evolues da tcnica cromatogrfica (MALDANER & JARDIM, 2009).

2.2 Principais tipos de cromatografia

2.2.1 Cromatografia em papel A cromatografia em papel uma tcnica de partio lquido lquido, estando um deles fixado a um suporte slido. Baseia-se na diferena de solubilidade das substncias entre duas fases imiscveis (DEGANI et al. 1998; ETTRE, 2000). A cromatografia em papel uma das tcnicas mais simples e que requer menos instrumentos para sua realizao, sendo muito til para a separao de compostos polares (PERES, 2002). O papel composto por molculas de celulose que possuem afinidade pela gua, mas muito pouca afinidade pela fase orgnica, atuando como suporte inerte contendo a fase estacionria aquosa (polar). medida que o solvente contendo o soluto flui ao longo do papel, uma partio deste composto ocorre entre a fase mvel (pouco polar) e a fase estacionria. Com o fluxo contnuo de solvente, o efeito desta partio entre as fases mvel e estacionria possibilita a transferncia do soluto do seu ponto de aplicao no papel para outro ponto

localizado a alguma distncia do local de aplicao no sentido do fluxo de solvente (PERES, 2002).

2.2.2 Cromatografia em camada delgada

A cromatografia em camada delgada uma tcnica de adsoro lquido-slido, na qual a separao se d pela diferena de afinidade dos componentes de uma mistura pela fase estacionria (DEGANI et al., 1998). A CCD est embasada na separao de substncias por meio das suas diferentes velocidades de migrao em razo da afinidade relativa com solventes, fixando-se numa fase slida (XAVIER et al., 2007). A CCD um mtodo simples, rpido e econmico, sendo a tcnica predominantemente escolhida para o

acompanhamento de reaes orgnicas (DEGANI et al., 1998). Neste mtodo a fase estacionria uma camada fina formada por um slido granulado (slica, alumina e poliamida) depositado sobre uma placa que deve atuar como suporte inerte. Na CCD gotas da soluo a ser separada so aplicadas em um ponto prximo ao extremo inferior da placa. Aps a secagem da placa, ela colocada em um recipiente contendo a fase mvel, de modo que somente sua base fique submersa. O solvente comea a molhar a fase estacionria e sobe por capilaridade. Aps o deslocamento da fase mvel deixase a placa secar, e posteriormente realizada a revelao da placa com reativos que dem cor as substncias de interesse (PERES, 2002). O parmetro de maior importncia na CCD o fator de reteno, que a razo entre a distncia percorrida pela substncia e a distncia percorrida pela fase mvel. Esse fator determinar se a substncia analisada confere com a substncia padro (DEGANI et al., 1998).

2.2.3 Cromatografia gasosa

A cromatografia gasosa (CG) uma tcnica com alto poder de resoluo, possibilitando a anlise de vrias substncias em uma mesma

amostra. Dependendo da substncia a ser analisada e do tipo de detector empregado pode-se detectar cerca de 10-12g do composto por mL-1, o que permite que pequenas quantidades da amostra sejam analisadas (PERES, 2002). Esta tcnica est baseada na partio dos componentes de uma amostra entre a fase mvel gasosa e a fase estacionria lquida ou slida, que propiciam a separao da mistura por meio de processos fsicos e qumicos (DEGANI et al., 1998; PERES, 2002). A grande limitao deste mtodo a necessidade de que a amostra seja voltil ou termicamente estvel (PERES, 2002).

2.2.4 Cromatografia lquida de alta eficincia

A cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) uma tcnica responsvel por grandes avanos na rea cromatogrfica. A HPLC utiliza suporte com partculas diminutas responsveis pela alta eficincia, sendo um mtodo adequado para separao de espcies inicas e macromolculas (DEGANI et al., 1998). Devido utilizao de colunas com grande capacidade de separao a realizao da HPLC requer a utilizao de equipamentos especficos, com o uso de bombas e colunas que suportem altas presses necessrias para eluio da fase mvel. Assim a realizao da HPLC necessita da utilizao de um cromatgrafo composto de bomba, coluna cromatogrfica, detector e registrador (DEGANI et al., 1998; PERES, 2002). Na HPLC a fase mvel deve ser um solvente que dissolva a amostra sem que qualquer interao qumica ocorra entre ambas. A fase estacionria dever ser compatvel com o detector, possuindo polaridade adequada para permitir a separao adequada dos componentes da amostra. J a coluna cromatogrfica deve ser confeccionada de material inerte e que resista a altas presses. Por fim os detectores devem apresentar ampla faixa de aplicao, sendo que os mais utilizados so os espectrais (PERES, 2002). Recentemente a evoluo das colunas e da fase estacionria permitiu o uso de partculas muito pequenas, desenvolvendo assim a cromatografia lquida de ultra eficincia (U-HPLC). A U-HPLC um mtodo cromatogrfico com

anlises mais rpidas, consumo menor de solventes e com eficincia muito mais elevada que a HPLC. No entanto, apesar de todas as vantagens da U-HPLC, o custo do equipamento e a manuteno requerida devido a utilizao de condies extremas de presso requer ainda maior desenvolvimento da tcnica

(MALDANER & JARDIM, 2009).

2.2.5 Cromatografia multidimensional

A cromatografia multidimensional a utilizao de tcnicas de separao associadas a tcnicas de deteco. Na cromatografia multidimensional comum a utilizao de hfen para associar as tcnicas utilizadas, assim comum o surgimento de diferentes siglas para denominar as tcnicas (MHLEN et al., 2006). A cromatografia multidimensional, tambm denominada de

cromatografia hifienizada em outros pases, combina tcnicas cromatogrficas e mtodos espectrais, de forma que as vantagens de ambos possam ser aproveitadas. A cromatografia produz fraes puras ou prximas da pureza de substncias qumicas. J a espectrofotometria pode produzir informaes seletivas para identificao destas substncias usando padres ou bibliotecas espectrais (PATEL et al., 2010). Desta forma a combinao dessas duas tcnicas tem melhorado substancialmente a anlise de substncias nas ltimas duas dcadas (CHINCHOLE et al., 2012). Diante do acoplamento da cromatografia a tcnicas espectrais vrias siglas surgiram, sendo as mais utilizadas listadas a seguir a: cromatografia lquida de alta eficincia acoplada a espectrofotmetro de massa (HPLC-MS), cromatografia lquida de alta eficincia acoplada a espectroscopia de

infravermelha (HPLC-IR), cromatografia gasosa acoplada a espectrofotometria de massas (GC-MS), entre inmeras outras que surgem a cada mtodo publicado (PATEL et al., 2010; CHINCHOLE et al., 2012).

2.3 Principais usos da cromatografia

cromatografia

tem

sido

utilizada

em

diferentes

reas

do

conhecimento. A grande sensibilidade de tcnicas cromatogrficas possibilitou o seu uso de forma rotineira em anlise de substncias em baixa concentrao, como no caso do doping, controle de alimentos e medicamentos, contaminao ambiental, na toxicologia entre muitas outras aplicaes (NAKASHIMA, 2005; ANVISA, 2012; CHINCHOLE et al., 2012; GILBERT-LPEZ et al., 2012; XU et al., 2012). A qumica a rea na qual as tcnicas cromatogrficas so mais utilizadas, sendo muitos os trabalhos publicados que a empregam. Pode ser utilizada para dosar compostos em alimentos (GILBERT-LPEZ et al. 2012; XU et al., 2012), no monitoramento de componentes txicos no meio ambiente (MARRIOTT et al., 2003) ou mesmo na indstria petroqumica (MHLEN et al., 2006). Dessa forma difcil definir em qual rea dentro dessa cincia que mais se utiliza das tcnicas cromatogrficas. Na rea farmacutica a cromatografia tambm tem vasto campo de utilizao. Pode ser empregada para dosar princpios ativos de drogas em medicamentos (ANVISA, 2012), isolar componentes medicinais de plantas (L et al., 2012), auxiliar em estudos de farmacocintica (AMORIM et al., 2008; GIORGI et al., 2009), validar tcnicas de identificao de agentes (AMORIM et al., 2008), entre inmeros outros usos. Na medicina a cromatografia utilizada para realizao de exames anti-doping (NAKASHIMA, 2005; CHINCHOLE et al., 2012), monitorar nveis de drogas em pacientes que estejam em tratamento (VERDIER et al., 2012), realizar diagnstico de enfermidades (JELLUM, 1988; JEONG et al., 2009), em estudos forenses e na toxicologia (NAKASHIMA, 2005; CHINCHOLE et al., 2012). Na medicina veterinria a cromatografia tem a possibilidade de ser utilizada em diversos meios, como em estudos de farmacocintica (AMORIM et al., 2008), para monitorar resduos de drogas em produtos de origem animal (CARDOSO et al., 1999; FELTRIN et al., 2007; ANVISA, 2009), na toxicologia (KAISER et al., 2010; OLIVEIRA-FILHO et al., 2010; LEE et al., 2012), entre outros.

2.4 Uso da cromatografia na toxicologia

2.4.1 A cromatografia na toxicologia forense O termo cincia forense abrange profisses envolvidas na aplicao de cincias sociais e fsicas no sistema de justia criminal. O cientista forense precisa esclarecer, com mnimos detalhes, os fatos ocorridos no sistema criminal utilizando para isso tcnicas especializadas para se chegar a concluses (WOOD et al., 2006). Deste modo a anlise de traos de substncias exige mtodos que garantam um alto nvel de confiabilidade, pois os resultados finais exercem influncia direta sobre o destino de um determinado indivduo. Assim, o uso da cromatografia associada a tcnicas espectrais de grande importncia para a deteco de drogas de abuso, para anlises toxicolgicas sistemticas (WOOD et al., 2006; CHINCHOLE et al., 2012), para identificao de drogas utilizadas em doping (CHINCHOLE et al., 2012) e para identificar a causa mortis (MAURER, 1999). As metodologias para identificao do consumo de drogas ilcitas tm sido desenvolvidas com o auxilio da cromatografia associada a diferentes tcnicas espectrais, devido possibilidade da utilizao destas para identificao de pequenas quantidades de inmeras substncias em diferentes matrizes. Exemplos de matrizes que podem ser utilizadas na identificao de drogas de abuso so sangue, urina, fluidos orais, cabelo e o mecnio, utilizado para monitorao do uso de drogas durante a gravidez (CHINCHOLE et al., 2012). A urina a matriz biolgica mais comumente utilizada nas anlises toxicolgicas (ABRAHAM & LUTY, 2010). Assim, testes cromatogrficos podem determinar inmeras substncias nesta matriz. Em teste toxicolgico em urina humana, com o intuito de avaliar tcnicas cromatogrficas, pesquisadores identificaram simultaneamente oito diferentes drogas de abuso ou seus metablitos, entre elas estavam metanfetamina, anfetamina, morfina, cocana e seu principal metablito a bezoilecgonina (TATSUNO et al., 1996). Em um estudo mais recente foi possvel identificar simultaneamente 13 substncias de abuso e seus metablitos em amostras de urina humana. Os

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pesquisadores utilizaram a cromatografia lquida de alta eficincia acoplada ao espectrofotmetro de massa (HPLC-MS). Eles ainda ressaltaram a importncia da tcnica por eliminar a necessidade de testes de triagem e confirmatrios (DUXBURY et al., 2010). Apesar de a urina ser comumente utilizada, outra matriz biolgica muito utilizada na toxicologia forense o sangue. Pesquisadores estudaram a identificao das principais drogas de abuso utilizadas em festas Rave em amostras de sangue humano preparadas com princpios ativos e em amostras provenientes do Forensic Pathology Department ou do Medico-Legal Department of the North Branch of the National Institute of Legal Medicine. No estudo pde-se identificar por meio da cromatografia gasosa acoplada a espectrofotometria de massa a metadona, cetamina, buprenorfina, entre outras drogas de abuso (CASTRO et al., 2012). Em outra pesquisa utilizando a CG-MS, empregando amostras de sangue humano preparadas com os princpios ativos a serem estudados, os pesquisadores puderam identificar simultaneamente sete tipos de anfetaminas. Para comprovar a aplicao do teste na toxicologia forense, os pesquisadores utilizaram uma amostra de sangue obtida de um cadver humano que teve a urina positiva para a presena de anfetamina. Nessa amostra utilizou-se a mesma tcnica utilizada no experimento isolando simultaneamente duas anfetaminas, demonstrando a eficcia da tcnica (KUMAZAWA et al., 2012). No entanto, h testes que podem utilizar tanto o sangue como a urina, como ocorreu em estudo no qual se identificaram nove tipos de fentanila e 16 outros opioides nessas duas matrizes biolgicas de forma confivel em casos de morte, bitos que ocorrem durante a hospitalizao e em mortes sbitas em jovens (GERGOV et al., 2009). O cabelo tambm pode ser utilizado como matriz biolgica na pesquisa do uso de drogas de abuso. Em um trabalho foi relatado determinao quantitativa de 13 drogas de abuso e de seus metablitos em amostras de cabelo humano, por meio da HPLC-MS. Os pesquisadores enriqueceram as amostras de cabelo, provenientes de indivduos que no eram usurios de drogas, com os princpios ativos que seriam posteriormente pesquisados. Aps, as amostras foram extradas e as substncias alvo da pesquisa puderam ser identificadas.

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Apesar de as amostras de cabelo do estudo terem sido enriquecidas com os princpios ativos, os pesquisadores relataram que utilizam a mesma tcnica na rotina do laboratrio, obtendo eficcia semelhante atribuda no estudo (DI CORCIA et al., 2012). Em outro estudo envolvendo carabinoides, os quais so substncias que induzem efeitos semelhantes ao tetraidrocanabinol (principal substncia psicoativa encontrada nas plantas do gnero Cannabis), os pesquisadores conseguiram isolar 22 substncias dessa classe em cabelo humano. Foram utilizadas tanto amostras embebidas com substncias padro como amostras de usurios crnicos de substncias com carabinoides em sua composio. Nas amostras preparadas foi possvel isolar os 22 carabinoides envolvidos na pesquisa, e nas amostras dos usurios foi possvel tambm isolar carabinoides em todas as oito amostras testadas (HUTTER et al., 2012). Outra utilizao da cromatografia na toxicologia forense so os casos em que se utiliza drogas para a prtica de crimes. A vtima recebe determinada substncia que cause sonolncia, amnsia ou inconscincia e roubada ou at mesmo sofre abuso sexual. Assim, mtodos cromatogrficos acoplados a espectrofotometria de massa podem identificar simultaneamente 128 ou mais drogas. Em um estudo, pesquisadores conseguiram isolar de uma amostra de urina enriquecida com 128 padres das drogas utilizadas nestes crimes, entre elas estavam opioides, anfetaminas, barbitricos, alucingenos,

benzodiazepnicos, relaxantes musculares e outras drogas (ADAMOWICZ & KALA, 2010). Testes semelhantes ao descrito anteriormente podem tambm serem aplicados no sangue. Pesquisadores utilizaram da U-HPLC associada ao espectrmetro de massa para identificar 46 compostos utilizados na facilitao de crimes ou de drogas de abuso no sangue de vtimas de abuso sexual (BIRKLER et al., 2012). Apesar do uso de matrizes biolgicas como o sangue e a urina, algumas vezes no h a disponibilidade de tecidos em bom estado de conservao, como no caso de corpos que so encontrados em avanado estado de decomposio. Nestes casos, a deteco de substncias que possam estar envolvidas na causa da morte pode ser realizada em larvas de insetos (BEYER et

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al., 1980; GOSSELIN et al., 2010), que se alimentam dos tecidos em decomposio, a qual pode ser realizada por meio da cromatografia (BEYER et al., 1980). O primeiro trabalho que relatou o uso da cromatografia para identificao de compostos relacionados com a morte do indivduo em larvas de insetos, foi publicado em 1980. O trabalho descreveu um caso de um corpo que foi encontrado aproximadamente 14 dias aps a morte e estava em avanado estado de decomposio. Havia a suspeita de suicdio pelo consumo de uma alta dose de fenobarbital, no entanto no havia tecido humano para se realizar os testes toxicolgicos. Os pesquisadores coletaram larvas de insetos que se alimentavam do cadver, extraram a amostra e realizaram a CG e CCD, confirmando a overdose por fenobarbital (BEYER et al., 1980). Em outro trabalho semelhante os pesquisadores utilizaram de tecido cerebral de ratos e sunos e de larva de Lucilia sericata. Inicialmente eles administraram metilfenidato por via intravenosa nos ratos e posteriormente realizaram a eutansia, separando o crebro no qual foram colocadas as larvas de insetos. No tecido cerebral de sunos o metilfenidato foi adicionado diretamente, com posterior colocao das larvas. Nas larvas dos dois tipos de tecido testado foi possvel o isolamento do metilfenidato por cromatografia lquida associada ao espectrofotmetro de massa. Assim o mtodo mostrou-se como alternativa toxicolgica para o estudo do metilfenidato em larvas encontradas em corpos em decomposio (BUSHBY et al., 2012). No controle do doping em atletas o principal objetivo do emprego das tcnicas de cromatografia a monitorizao do uso ou do abuso de drogas que podem estimular o crescimento muscular, aumentar a resistncia em

competies, reduzir o peso corporal ou reduzir a dor causada por esforo excessivo. (MAURER, 1999; BRABANTER et al., 2011; THOMAS et al. 2011; DESHMUCK et al. 2012; THOMAS et al., 2012; WADA, 2012). O uso de desmopressina proibido entre atletas de elite, por mascarar a ao de drogas diurticas (WADA, 2011). Diante disto pesquisadores desenvolveram, por meio da cromatografia acoplada ao espectrofotmetro de massa, um teste para deteco de demospressina na urina humana, e

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consideraram a tcnica adequada para laboratrios que trabalham com o controle de doping (THOMAS et al., 2011). Alm da desmopressina inmeros outros compostos so proibidos para atletas de elite e esto listados na The 2012 Prohibited List da World Anti-Doping Agency (WADA, 2011). A WADA foi criada em 1999 como agncia independente, financiada pelo movimento desportivo de diferentes governos do mundo, e estabelece que muitos dos testes anti-doping utilizem da cromatografia acoplada a tcnicas espectromtricas. Ela tem como objetivo a pesquisa cientfica, desenvolvimento de mtodos de deteco de doping e acompanhamento do cdigo mundial anti-doping (WADA, 2012), demonstrando assim a importncia das tcnicas cromatogrficas neste tipo de exame.

2.4.2 A cromatografia na toxicologia veterinria

Na medicina veterinria a cromatografia tem larga utilizao em estudos que trabalham com intoxicaes, seja para monitorar princpios ativos (LEE et al., 2012) ou para identificar substncias causadoras de intoxicaes em animais (KAISER et al., 2010; OLIVEIRA-FILHO et al., 2010; RIVERO et al., 2011). Nos casos das intoxicaes, de fundamental importncia identificar os princpios ativos envolvidos, com o intuito de evitar que novos episdios ocorram, que a teraputica a ser utilizada seja a mais adequada e indispensvel em situaes que envolvam litgio. Nas intoxicaes, os animais podem, muitas vezes, apresentar sinais agudos e morte rpida, sem que o agente causador seja identificado. No entanto, a identificao da droga ou veneno pode preservar a vida de outros animais (XAVIER et al., 2007). Em intoxicaes causadas intencionalmente a cromatografia pode auxiliar e at mesmo servir como prova da causa mortis. Em um estudo que envolveu 50 amostras do contedo gstrico de ces e gatos, que possuam como hiptese diagnstica a intoxicao exgena por aldicarb, foi realizada a cromatografia em camada delgada como teste qualitativo quanto presena desta substncia. O estudo envolveu ainda 50 amostras de alimentos que

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continham material sugestivo do agente txico, as quais tinham sido utilizadas como iscas para intoxicar animais. Todas as amostras testadas por CCD, tanto o contedo gstrico como os alimentos, foram positivas para a presena do aldicarb, que demonstrou a adequao da tcnica para o auxlio no diagnstico de intoxicaes (XAVIER et al., 2007). Em outro estudo, em amostrais estomacais de ces e gatos, envolvendo a intoxicao por pesticidas domsticos e raticidas, 68 amostras foram analisadas por meio da CCD para deteco de carbamatos, warfarina e estricnina, e por HPLC para deteco de diferentes carbamatos. As amostras eram provenientes do Laboratrio de Toxicologia da Universidade Federal de Santa Maria, e foram recebidas como casos fatais suspeitos de intoxicaes. No estudo foi possvel confirmar que em 54,4% das amostras havia substncias txicas, sendo 39,9% carbamato, 4,4% warfarina, 8,8% estricnina e 1,4% fluoroacetato de sdio (BULCO et al., 2010). Apesar de muitas vezes as intoxicaes em pequenos animais serem causadas intencionalmente (XAVIER et al., 2007; BULCO et al., 2010) muitas podem ocorrer ao acaso, sem causa aparente, de forma aguda, o que pode rapidamente causar a morte dos animais. Em um caso em que dois ces apresentaram sinais de intoxicao aguda, com morte de um dos animais poucas horas aps o aparecimento dos sintomas, foi diagnosticada a intoxicao por pentobarbital por meio da CG-MS. Neste caso aps a morte de um dos animais foi realizada a necropsia quando foi encontrando grande quantidade de carne crua e plos de cavalo, material o qual foi utilizado para o diagnstico toxicolgico. A urina do animal que sobreviveu e do que veio a bito foram submetidos a CG-MS, o que revelou a presena de pentobarbital. Ao investigar as proximidades da propriedade o proprietrio dos animais encontrou um equino parcialmente enterrado que tinha sido submetido a eutansia, dois anos antes, com grande quantidade do frmaco. Parte da carcaa do animal foi submetida a CG-MS quando foi encontrada concentrao de 4.000 ppm de pentobarbital no tecido muscular do animal. Alm do equino, outra carcaa de co foi encontrada em local prximo, da qual tambm foi detectada a presena de pentobarbital no contedo gstrico. Assim os autores concluram que a causa das intoxicaes dos

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animais foi pelo consumo da carne do animal que foi submetido a eutansia (KAISER et al., 2010). Alm dos pesticidas domsticos serem causas de intoxicaes em pequenos animais, outras causas seriam a ingesto de plantas que contm toxinas (MOUSER et al., 2007) ou quando atacam animais venenosos (SONNE et al., 2008). Os ces, principalmente, tm o histrico de atacarem sapos do gnero Bufo, que possuem toxinas que podem ocasionar o bito do animal (REEVES, 2004). Em um caso, um co foi encontrado morto pelo proprietrio e o corpo do animal foi encaminhado para o Setor de Patologia Veterinria da Universidade Federal do Rio Grande do Sul. No exame macroscpico e microscpico as alteraes foram inespecficas, achados comumente encontrados em diferentes tipos de intoxicaes. O contedo gstrico, estmago, fgado e rins foram coletados para a anlise toxicolgica. Para isso, foi utilizada a CCD e cromatografia gasosa com detector de ionizao de chama. As anlises foram negativas para a deteco de cumarnicos, arsnico, estricnina, organofosforados, carbamato, cianeto e nitritos. No entanto, no ambiente onde o animal habitava, foram encontrados sapos do gnero Bufo e por isso se desconfiou de um possvel envenenamento por toxinas expelidas pelo anfbio. Assim os pesquisadores realizaram a anlise toxicolgica por meio da utilizao do veneno retirado das glndulas do sapo como padro de referncia, confirmando o diagnstico pela CCD e pela CG (SONNE et al., 2008). Plantas txicas presente nos quintais, utilizadas como plantas ornamentais, como a Ricinis communis (mamona), podem estar envolvidas nas intoxicaes em pequenos animais (MOUSER et al., 2007). A R. communis considerada um das mais fortes plantas txicas e listada na categoria B de agente de bioterrorismo pela Center for Disease Control and Prevention (CDC, 2000). Em um relato envolvendo um co Mastiff de 12 semanas, que morreu aps ingerir sementes de R. communis, foi utilizado LC-MS para confirmar o diagnstico por meio de amostras do contedo estomacal na qual foi confirmada a presena de ricinina (MOUSER et al., 2007). Em animais de produo as intoxicaes geralmente ocorrem em forma de surtos e de grande interesse que a causa do surto seja esclarecida,

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nesses casos, o emprego da cromatografia pode ser muito til. Neste sentido a cromatografia tem sido utilizada para deteco dos agentes envolvidos nestes surtos. Os organofosforados so inseticidas que podem ser utilizados no combate a ectoparasitas, no entanto a no observncia da recomendao do fabricante pode causar intoxicaes em animais. Um relato de atendimento clnico a 26 animais pulverizados com uma sobredose de diazinon, no qual 11 animais vieram bito, obteve-se o diagnstico confirmado por meio da CCD. Apesar do histrico e dos sinais clnicos dos animais, durante a necropsia de dois bovinos adultos no foi possvel constatar nenhuma alterao nos exames macro e microscpicos que fossem dignos de nota. Mas os pesquisadores conseguiram detectar, por meio da CCD, o princpio ativo em amostras de fgado e crebro de um dos animais necropsiados (CASTRO et al., 2007). Em outro surto de intoxicao por organofosforados envolvendo 26 animais dos quais 20 vieram a bito, foi feito o uso da cromatografia em camada delgada como mtodo qualitativo e a cromatografia gasosa como mtodo quantitativo. Este surto ocorreu em uma propriedade vizinha de uma empresa de pulverizao agrcola. Devido aos sinais clnicos dos animais e ao histrico relatado pde-se realizar tcnicas cromatogrficas para confirmar a suspeita, aps isolamento de carbamato e organofosforado dos rgos dos animais. A anlise quantitativa por cromatografia gasosa para carbamato e organofosforados no contedo do abomaso de um animal detectou 0,93 g/g de mancozebe e 0,07g/g de forato (OLIVEIRA-FILHO et al., 2010). No Uruguai houve um surto de intoxicao por organoclorados (endosulfan) com a morte de 51 bovinos, o qual pde ser totalmente esclarecido por meio das tcnicas cromatogrficas. O surto ocorreu aps um avio de pulverizao agrcola ter perdido acidentalmente sua carga com soluo contendo o princpio. Na tarde do dia do incidente os animais foram liberados para o pasto contaminado com a soluo. Aps 24 horas, os animais apresentaram os sinais clnicos de intoxicao e os tcnicos do Laboratrio Regional Noroeste da Direo de Laboratrios Veterinrios do Ministrio de Agricultura e Pesca do Uruguai foi chamado para visitar a propriedade e colher amostras de gua, peixes mortos e de seis animais que foram necropsiados para determinao dos metablitos txicos. Nas amostras utilizou-se a tcnica de cromatografia gasosa,

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identificando-se o endosulfan no tecido adiposo, fgado, contedo ruminal dos bovinos, nos peixes mortos e na gua de um riacho que tambm foi atingido (RIVERO et al., 2011). A cromatografia pode tambm ser utilizada em estudos experimentais na qual muitas vezes h a necessidade de dosar princpios ativos dos agentes envolvidos na pesquisa. Em estudo com Bacharis megapotamica var. weirii, em bfalos, os pesquisadores conseguiram induzir a intoxicao em todos os cinco animais do experimento, sendo que quatro morreram com 18-49 horas aps a ingesto da planta. Neste estudo uma subamostra de B. megapotamica var. weirii foi separada para dosagem de tricotecenos macrocclicos. Para tanto foi utilizada a U-HPLC com espectrometria de tempo-de-vo de alta resoluo e espectrometria de massa. Por esta tcnica foi possvel dosar 51 tricotecenos macrocclicos, e os pesquisadores chegaram concluso que a tcnica utilizada provou ser uma tcnica eficaz para dosagem desses compostos (OLIVEIRAFILHO et al., 2012). O consumo de plantas txicas responsvel por grande nmero de morte em animais (RIET-CORREA & MEDEIROS, 2001), e estudos so norteados na tentativa de esclarecer as causas da morte (KUPPER et al., 2010) ou os princpios envolvidos na intoxicao (MOUSER et al., 2007). Pesquisadores de Zurique, Sua, relataram um caso em que uma novilha apresentou sinais de intoxicao. O animal foi tratado com carvo vegetal e fluidoterapia intravenosa. Aps leve melhora a novilha foi a bito trs dias aps o incio dos sintomas. No histrico do animal sabia-se que o mesmo teve acesso a um pasto mido pertencente rea de conservao da propriedade, o qual tinha presena de Colchicum autumnale, uma planta txica da regio. Ao inspecionar a pastagem pde-se observar que essas plantas haviam sido pastejadas. Para confirmar o diagnstico a urina e sangue do animal foram colhidos, dois dias aps o incio dos sintomas, e submetidos a LC-MS/MS, quando foi confirmada a presena da principal toxina dessa planta, a colchicina (KUPPER et al., 2010). No Brasil vrias plantas so incriminadas de causar morte sbita nos animais. Dentre estas plantas encontram-se as Mascagnia rigida hoje nomeada de Amorimia rigida (CUNHA et al., 2012) e a Pallicourea marcgravii (BARBOSA et

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al., 2003). Muitos autores associam a morte sbita presena da substncia txica monofluoroacetato de sdio (MF) ou cido monufluoractico, o qual tem sido identificado em diversos estudos por meio de tcnicas cromatogrficas (CUNHA et al., 2012; LEE et al., 2012). Em estudo recente os pesquisadores conseguiram isolar o MF, por meio de HPLC acoplada a um espectrmetro de massa, com interface APCI (ionizao qumica presso atmosfrica), de amostras de folhas maduras P. marcgravii provenientes dos Estados de Gois e So Paulo, nas concentraes de 0,10 e 0,17% respectivamente. Neste mesmo estudo utilizando a mesma tcnica tambm foi possvel isolar o MF de algumas espcies Amorimia, no entanto em concentraes bem menores que a descrita para P. marcgravii. (LEE et al., 2012). Em outro estudo envolvendo A. rigida, amostras da planta foram colhidas no municpio de Cabeceira, Estado da Paraba. Neste tambm foram identificados o MF, no entanto, foi eles utilizada a CCD e a espectofotometria de infravermelho como tcnicas para avaliao da presena de MF (CUNHA et al., 2012). Alm das plantas que causam intoxicaes agudas nos animais (BARBOSA et al., 2003; CUNHA et al., 2012), h um outro grupo de plantas no Brasil que causam fotossensibilizao e intoxicaes crnicas nos animais (ALBERNAZ et al., 2010; SOUZA et al., 2010). Uma das teorias que a saponina, produzida por espcies de gramneas utilizadas em pastagens, esteja envolvida na patogenia da doena (BRUM et al., 2007). O Panicum dichotomiflorum uma das plantas, que contm saponinas, incriminadas de causarem fotossensibilizao hepatgena nos animais. Em um surto de fotossensibilizao em trs rebanhos de ovinos no municpio de Casa Nova, no Estado da Bahia, foi utilizada da HPLC acoplada a espectrofotometria para avaliarem a presena de saponinas no P. dichotomiflorum. No surto de 365 animais, que foram alocados na pastagem, 81 foram afetados pela

fotossensibilizao e 39 morreram. Foram colhidas duas amostras da pastagem e realizaram CCD e a HPLC acoplada a espectrofotmetro. Aps a anlise os autores puderam identificar a presena de protodioscina e metilprotodioscina, o que sugeriu que o surto de fotossensibilizao foi causado por estas saponinas (RIET-CORREA et al., 2009).

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O gnero Brachiaria tambm tem sido associado a casos de intoxicao crnica causando uma perda progressiva de peso nos animais ou casos de fotossensibilizao (SOUZA et al., 2010). Em uma pesquisa envolvendo a intoxicao por Brachiaria, em que foram avaliados dois surtos de intoxicao em um experimento com cordeiros em pastagem com a mesma gramnea, foi determinada a presena de saponinas por meio da CCD como meio qualitativo e HPLC acoplado a um detector de evaporao por disperso de luz como anlise quantitativa. Os pesquisadores encontraram valores de metilprotodioscina que variaram de 0,92 a 1,13%, e de protodioscina de 0,88 a 1,62% (ALBERNAZ et al., 2010). Alm dos casos em que a intoxicao por Brachiaria j esteja instalada, a cromatografia tem auxiliado pesquisas para que seja determinado os fatores envolvidos na produo de saponinas. Em estudo realizando a CCD como mtodo qualitativo e a espectrofometria como mtodo quantitativo, foi possvel estabelecer que, no perodo de 2002 a 2003, em canteiros plantados com B. brizantha e B. decumbens, os maiores nveis de saponinas ocorreram na fase mais madura da planta, sugerindo que os animais esto mais sujeitos a intoxicao durante esta fase (BRUM et al., 2009).

2.4.3 A cromatografia para identificao de substncias nocivas em alimentos

A ausncia de Boas Prticas Veterinrias na criao de animais de produo pode acarretar o uso indiscriminado de medicamentos sem a preocupao do resduo destes no produto final o que pode significar risco sade pblica (ANVISA, 2006; ANVISA, 2009). Esses riscos podem ser traduzidos pela ocorrncia de resistncia bacteriana (ANVISA, 2006; ANVISA, 2009), reaes alrgicas que podem ocasionar choque anafiltico (ANVISA, 2009), entre outros. Assim a utilizao da cromatografia tem auxiliado na deteco destas substncias em produtos de origem animal (CARDOSO et al., 1999; FELTRIN et al., 2007; ANVISA, 2009). Os resduos de antibiticos so quaisquer substncias, mistura de antibiticos, derivados especficos, metablitos ou produtos de reao dos

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antibiticos presentes nos alimentos para o homem ou para os animais, que possam ser considerados de importncia toxicolgica (MANJARREZ et al., 2012). No entanto, h relativamente poucos mtodos analticos capazes de medir as concentraes residuais de muitos antibiticos. A baixa solubilidade de alguns antibiticos em solventes orgnicos torna difcil o desenvolvimento de tcnicas para extrair seus resduos de matrizes biolgicas. Outros antibiticos so demasiadamente instveis termicamente ou insuficientemente volteis para serem processados por CG ou CG-MS. Dessa forma vrias tcnicas de deteco de resduos de antibiticos foram desenvolvidas utilizando HPLC. Apesar disso, muitas vezes somente a HPLC no suficiente para deteco de traos desses medicamentos, sendo necessrio associar a espectrofotometria de massas (KENNEDY et al., 1998). Assim, muitos pesquisadores tm publicado trabalhos que descrevem a deteco de antibiticos por tcnicas cromatogrficas (FELTRIN et al., 2007; PIETRN et al., 2011; MANJARREZ et al., 2012). Em um estudo que trabalhou com resduos de sulfadimetoxina, os pesquisadores detectaram resduos do referido medicamento por HPLC. No estudo as amostras de leite foram enriquecidas com soluo padro de sulfadimetoxina, posteriormente foi realizada a extrao com cartucho comercial especfico. Aps a extrao, as amostras foram submetidas a um cromatgrafo lquido de alta eficincia com detector ultravioleta (UV). Por meio dessa tcnica foi possvel recuperar entre 76 a 90% do padro comercial adicionado amostra (FELTRIN et al., 2007). Outro grupo de antibiticos muito utilizado em animais de produo so as penicilinas. Estima-se que 3 a 10% da populao sejam susceptveis a reaes alrgicas quando expostas alimentos contendo esse grupo de medicamentos (ANVISA, 2009). Deste modo a cromatografia tem sido utilizada como ferramenta de apoio na deteco de penicilinas em produtos de origem animal. Pesquisadores utilizaram amostras de leite e carne enriquecidas com penicilina G, oxacilina e cloxacilina. As amostras foram extradas e posteriormente submetidas a HPLC com detector UV. Os autores puderam concluir que os mtodos para determinao simultnea de penicilinas no leite e carne apresentaram resultados favorveis (KUKUSAMUDE et al., 2012).

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Alm dos antibiticos, outras drogas podem ser utilizadas no tratamento dos animais de produo, como os antiinflamatrios e antihelmnticos, no entanto elas tambm podem deixar resduos nos produtos finais (SOUZA et al., 2003; LOBATO et al., 2006; GENTILI et al., 2012). Recentemente foi utilizado a cromatografia lquida acoplada ao espectofotmetro de massa, o que permitiu a deteco simultnea de 15 diferentes agentes antiinflamatrios no esteroidais, no leite e msculo de bovinos (GENTILI et al., 2012). J em relao aos antihelmnticos, pesquisadores utilizaram a HPLC ligada a detector de fluorescncia para dosar resduos de ivermectinas no fgado de bovinos. Os pesquisadores utilizaram fgado livre de resduos dessas drogas, separaram as amostras e posteriormente enriqueceram-nas com abamectina, doramectina e ivermectina. Aps a extrao das amostras, o extrato derivativo foi analisado por HPLC-FI. A taxa de recuperao para as amostras adicionadas de soluo padro foi de 101,1; 101,0 e 96,7%, com coeficientes de variao de 11,2; 9,2 e 12,5% para abamectina, doramectina e ivermectina, respectivamente (SOUZA et al., 2003). Em outro estudo pesquisadores colheram 168 amostras de leite que estavam sendo comercializadas em supermercados de Campinas SP e da regio metropolitana do Rio de Janeiro. Essas amostras foram analisadas por HPLC com detector por fluorescncia, e foi detectado que 17,8% das amostras eram positivas para ivermectinas, no entanto as amostras no continham resduos em quantidade superior aos estabelecidos pelo Ministrio da Agricultura Pecuria e Abastecimento (LOBATO et al., 2006). Outros agentes txicos comuns de alimentos de origem animal so as micotoxinas. Essas toxinas podem ser transmitidas para os alimentos aps o consumo de raes contaminadas. Devido a isso pesquisadores tm utilizado de mtodos cromatogrficos para deteco desses contaminantes (NETTO et al., 2002). Em um estudo realizado com 75 amostras de queijo foram detectadas, por meio de HPLC usando detector de fluorescncia, que 56 (74,7%) estavam contaminados com aflotoxina M1 (PRADO et al., 2000). Em outra pesquisa foi realizado teste para detectar as aflotoxinas no leite de bovinos. A HPLC foi utilizada e puderam constatar que 19 (52,8%) amostras estavam contaminadas, mas os nveis da aflotoxina M1 estavam dentro dos padres tolerados pela legislao brasileira (PEREIRA et al., 2005).

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Por fim, h drogas que por vezes so utilizadas, mas sem autorizao para seu emprego no Brasil. Dentre elas esto os esteroides anabolizantes, os quais tambm podem deixar resduos nos produtos de origem animal. Diante disto, mtodos cromatogrficos so importantes ferramentas para a anlise dessas drogas (DUARTE et al., 2002). Com auxlio da cromatografia lquida de ultra eficincia associada a espectrofotometria de massa pesquisadores puderam desenvolver metodologia para detectar simultaneamente 34 anabolizantes esteroides em msculo bovinos. No estudo, amostras de tecido muscular bovino, livres destas drogas foram enriquecidas com padres das mesmas,

posteriormente as amostras foram extradas e submetidas a U-HPLC-MS/MS, quando os esteroides anabolizantes foram identificados (VANHAECKE et al., 2012).

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3 CONSIDERAES FINAIS

O uso da cromatografia abrange muitas reas do conhecimento, e suas funcionabilidades so inumerveis. Os trabalhos envolvendo essas tcnicas multiplicam-se dia a dia, o que torna difcil acompanhar sua evoluo nas diferentes reas. Na medicina veterinria, apesar do uso estar relatado em diferentes reas, seu emprego est restrito a rea toxicolgica e na deteco de contaminantes de alimentos de origem animal. Mesmo na rea toxicolgica a quantidade de trabalhos que utilizam diretamente a cromatografia pouca, a grande parte utiliza-a como uma ferramenta muitas vezes apenas citada, descrevendo muito sucintamente qual mtodo cromatogrfico foi utilizado, o que torna difcil a repetibilidade da metodologia. Apesar da grande utilidade da cromatografia, os equipamentos empregados nas tcnicas mais modernas tm alto custo e demanda de pessoal especializado para oper-los. Assim o uso dessas tcnicas fica restrita e muitas vezes h a impossibilidade de realiz-las, e por vezes diagnsticos toxicolgicos no podem ser estabelecidos com preciso.

24

REFERNCIAS

1.

ABRAHAM, A.; LUTY, J. Testing for illicit drug use in mental health

services. Advances in psychiatric treatment, London, v. 16, p. 369-379, 2010. 2. ADAMOWICZ, P.; KALA, M. Simultaneous screening for and determination

of 128 date-rape drugs in urine by gas chromatography-electron ionization-mass spectrometry. Forensic Science International, Limerick, v. 198, p. 39-45, 2010. 3. AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA ANVISA, Programa

de Anlise de Resduos de Medicamentos Veterinrios em Alimentos de Origem Animal. PAMVET. RELATRIO 2006/2007 - Monitoramento de Resduos em Leite Exposto ao Consumo, Ministrio da Sade, 2009, 76 p. 4. AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA ANVISA. Consulta [online], 2012. Disponvel em:

pblica,

http://portal.anvisa.gov.br/wps/wcm/connect/042a338049f229df96d7bfaa19e2217c /Consulta+P%C3%BAblica+n%C2%B0+11+GGMED.pdf?MOD=AJPERES. Acesso em: 26/08/2012. 5. AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA ANVISA. Programa

de Anlise de Resduos de Medicamentos Veterinrios em Alimentos de Origem Animal PAMVET. Relatrio 2004/2005 Monitoramento de Resduos em Leite Exposto ao Consumo, Ministrio da Sade, 2006, 46 p. 6. ALBERNAZ, T. T.; SILVEIRA, J. A. S.; SILVA, N. S.; OLIVEIRA, C. H. S.;

REIS, A. S. B.; OLIVEIRA, C. M. C.; DUARTE, M. D.; BARBOSA, J. D. Fotossensibilizao em ovinos associada ingesto de Brachiaria brizantha no estado do Par. Pesquisa Veterinria Brasileira, Rio de Janeiro, v. 30, n. 9, p.741-748, 2010. 7. AMORIM, R.; GALHARDO, A.; VALADO, C. A. A.; PECCININI, R. G.

Determinao de cetamina em plasma por HPLC: aplicao em um estudo de farmacocintica de associao medicamentosa em ces. Revista de Cincias Farmacuticas Bsica e Aplicada, Araraquara, v. 29, n. 1, p. 69-75, 2008. 8. BARBOSA, J. D.; OLIVEIRA, C. M. C.; TOKARNIA, C. H.; RIET-CORREA,

F. Comparao da sensibilidade de bovinos e bfalos intoxicao por Palicourea marcgravii (Rubiaceae). Pesquisa Veterinria Brasileira, Rio de Janeiro, v. 23, n. 4, p. 167-172, 2003.

25

9.

BEYER, J. C.; ENOS, W. F.; STAJIC, M. Drug identification through

analysis of maggots. Journal of Forensic Sciences, Malden, v. 25, n.2, p. 411412, 1980. 10. BIRKLER, R. I. D.; TELVING, R.; INGEMANN-HANSEN, O.; CHARLES, A.

V.; JOHANNSEN, M.; ANDREASEN, M. F. Screening analysis for medicinal drugs and drugs of abuse in whole blood using ultra-performance liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry (UPLCTOF-MS)Toxicological findings in cases of alleged sexual assault. Forensic Science International, Limerick, (In press), 2012. 11. BRABANTER, N.; GANSBEKE, W. V.; GELDOF, L.; EENOO, P. V. An

improved gas chromatography screening method for doping substances using triple quadrupole mass spectrometry, with an emphasis on quality assurance. Biomedical Chromatography, Chichester, (In Press), 2011. 12. BRUM, K. B.; HARAGUCHI, M.; GARUTTI, M. B.; NOBREGA, F. N.;

ROSA, B.; FIORAVANTI, M. C. S. Steroidal saponin concentrations in Brachiaria decumbens and B. brizantha at different developmental stages. Cincia Rural, Santa Maria, v. 39, n. 1, p. 279-281, 2009. 13. BRUM, K. B.; HARAGUCHI, M.; LEMOS, R. A. A.; RIET-CORREA, F.;

FIORAVANTE, M. C. Crystal associated cholangiopathy in sheep grazing Brachiaria decumbens containng the saponin protodioscin. Pesquisa Veterinria Brasileira, Rio de Janeiro, v. 27, p. 39-42, 2007. 14. BULCO, R. P.; TONELLO, R.; PIV, S. J.; SCHMITT, G. C.; EMANUELLI,

T.; ALLEGRAVE, E.; GARCIA, S. C. Intoxicao em ces e gatos: diagnstico toxicolgico empregando cromatografia em camada delgada e cromatografia lquida de alta presso com deteco ultravioleta em amostras estomacais. Cincia Rural, Santa Maria, v.40, n.5, p.1109-1113, 2010. 15. BUSHBY, S. K.; THOMAS, N.; PRIEMEL, P. A.; COULTER, C. V.; RADES,

T.; KIESER, J. A. Determination of methylphenidate in Calliphorid larvae by liquidliquid extraction and liquid chromatography mass spectrometry Forensic entomotoxicology using an in vivo rat brain model. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Oxford, (In Press), 2012. 16. CARDOSO, O. M. C.; SILVA, T. J. P.; SANTOS, W. L. M.; PESQUERO, J.

L. Ocorrncia de resduos de dietilestilbestrol e zeranol em fgado de bovinos

26

abatidos no Brasil. Cincia e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v.19, n.3, 1999. 17. CASTRO, A. L.; TARELHO, S.; SILVESTRE, A.; TEIXEIRA, H. M.

Simultaneous analysis of some club drugs in whole blood using solid phase extraction and gas chromatography mass spectrometry. Journal of Forensic and Legal Medicine, Oxford, v. 19, p. 77-82, 2012. 18. CASTRO, M. B.; MOSCARDINI, A. R. C.; REIS JR, J. L.; NOVAES, E. P.

F.; BORGES, J. R. J. Intoxicao aguda por diazinon em bovinos. Cincia Rural, Santa Maria, v. 37, n. 5, p.1498-1501, 2007. 19. Centers for Disease Control and Prevention CDC. Biological and

chemical terrorism: strategic plan for preparedness and response. 2000, 14p. 20. CHINCHOLE, R.; HATRE, P. M.; DESAI, U.; CHAVAN, R. Recent

applications of hyphenated liquid chromatography techniques in forensic toxicology: a review. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, Bangalore, v. 14, n. 1, 2012. 21. COLLINS, C. H. Cem anos das palavras cromatografia e cromatograma.

Qumica Nova, So Paulo, v. 29, n. 4, 2006. 22. CUNHA, L. C.; PPOLE, F.; CARVALHO, L. R.; LAGO, J. H. G.; GORNIAK,

S. L. Isolation and characterization of sodium 2-fluoroacetate from Mascagnia rigida using chromatography and infrared spectroscopy. Toxicon, Oxford, v. 60, p. 329-332, 2012. 23. DEGANI, A. L.; CASE, Q. L.; VIERA, P. C. Cromatografia um breve ensaio.

Qumica nova na escola, So Paulo, n. 7, p. 21-25, 1998. 24. DESHMUCK, N. I. K.; BARKER, J.; PETROCZI, A.;NAUGHTON, D. P.

Detection of testosterone and epistestosterone in human hair using liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Oxford, v. 67, n. 68, p. 154-158, 2012. 25. DI CORCIA, D.; DURSO, GERACE, E.; SALOMONE, A.; VINCENTI, M.

Simultaneous determination in hair of multiclass drugs of abuse Iincluding THC) by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry.

Journal of Chromatography B, Amsterdan, v. 899, p. 154-159, 2012.

27

26.

DUARTE, K. M. R.; SILVA, F. M. S. M.; MEIRELLES, C. F. Resduos de

anabolizantes na produo animal: importncia e mtodos de deteco. Cincia Rural, Santa Maria, v. 32, n. 4, p. 731-737, 2002. 27. DUXBURY, K.; ROMAGNOLLI, C.; ANDERSON, M.; WATTS, R.; WAITE,

G. Development of a clinically relevant liquid chromatography tandem mass spectrometry assay for 13 drugs of abuse in urine, designed to meet the needs of the service users. Annals of Clinical Biochemistry, London, v. 47, p. 415-422, 2010. 28. ETTRE, L. S. Chromatography: the separation technique of the 20th

century. Chromatographia, Wiesbaden, v. 51, n. 1/2, 2000. 29. FELTRIN, C. W.; MELLO, A. M. S.; SANTOS, J. G. R.; MARQUES, M. V.;

SEIBEL, N. M.; FNTOURA, L. A. M. Quantificao de sulfadimetoxina em leite por cromatografia lquida de alta eficincia. Qumica Nova, So Paulo, v. 30, n. 1, p. 80-82, 2007. 30. GENTILI, A.; CARETTI, F.; BELLANTE, S.; ROCCA, L. M.; CURINI, R.; A. Development and validation of two multiresidue liquid

VENDITTI,

chromatography tandem mass spectrometry methods based on a versatile extraction procedure for isolating non-steroidal anti-inflammatory drugs from bovine milk and muscle tissue. Analytical and Bioanalytical Chemistry, Heidelberg, v. 404, n. 5, p. 1375-1388, 2012. 31. GERGOV, M.; NOKUA, P.; VUORI, E.; OJANPERA, I. Simultaneous chromatographytandem

screening and quantification of 25 opioid drugs in post-mortem blood and urine by liquid mass spectrometry. Forensic Science

International, Limerick, v. 186, p. 36-43, 2009. 32. GILBERT-LPEZ, B.; GARCIA-REYES, J. F.; MOLINA-DIAZ, A.

Determination of fungicide residues in baby food by liquid chromatography-ion trap tandem mass spectrometry. Food Chemistry, Barking, v. 135, p. 780-786, 2012. 33. GIORGI, M.; SACCOMANI, G.; LEBKOWSKA-WIERUSZEWSKA, B.;

KOWALSKI, C. Pharmacokinetic evaluation of tramadol and its major metabolites after single oral sustained tablet administration in the dog: a pilot study. The Veterinary Journal, London, v. 180, p. 253-255, 2009. 34. GOSSELIN, M.; FERNANDEZ, M. D. M. R.; WILLE, S. M. R.; SAMYN, N.;

BOECK, G. D.; BOUREL, B. Quantification of methadone and its metabolite 2-

28

ethylidene-1,5-dimethyl-3,3-diphenylpyrrolidine in third instar Larvae of Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) using liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Analytical Toxicology, Niles, v. 34, p. 374-380, 2010. 35. HUTTER, M.; KNEISEL, S.; AUWARTER, V.; NEUKAMM, M. A. of 22 synthetic cannabinoids in human hair by liquid

Determination

chromatographytandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B, Amsterdam, v. 903, p. 95-101, 2012. 36. JELLUM, E. Chromatography for diagnosis of metabolic diseases. Journal

of Chromatography, Amsterdan, v. 452, p. 435-441,1988. 37. JEONG, J. S.; SIM, H. J.; LEE, Y. M.; YOON, H. R.; LEE, D. H.; HONG, S.

P. Determination of phenylalanine in blood by high-performance anion-exchange chromatographypulsed amperometric detection to diagnose phenylketonuria. Journal of Chromatography A, Amsterdan, v. 1216, p. 5709-5714, 2009. 38. KAISER, A. M.; McFARLAND, W.; SIEMION, R. S.; RAISBECK, M. F.

Secondary pentobarbital poisoning in two dogs: a cautionary tale. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, Columbia, v. 22, p. 632-634, 2010. 39. KENNEDY, D. G.; McCRACKEN, R. J.; CANNAVAN, A.; HEWITT, S. A.

Use of liquid chromatography-mas spectrometry in the analysis of residues of antibiotics in meat and a milk. Journal of Chromatography A, Amsterdan, v. 812, n. 1-2, p. 77-98, 1998. 40. KUKUSAMUDE, C.; BURAKHAM, R.; CHAILAPAKUL, O.; SRIJARANAI, S.

High performance liquid chromatography for the simultaneous alalysis of penicillin residues in beef and milk using ion-paired extraction and binary water-acetonitrile mixture. Talanta, Amsterdan, v. 92, p. 39-44, 2012. 41. KUMAZAWA, T.; HASEGAWA, C.; HARA, K.; UCHIGASAKI, S.; LEE, X. P.;

SENO, H.; SUZUKI, O.; SATO, K. Molecularly imprinted solid-phase extraction for the selective determination of methamphetamine, amphetamine, and

methylenedioxyphenylalkylamine designer drugs in human whole blood by gas chromatographymass spectrometry. Journal of Separation Science, Weinheim, v. 35, p. 726-733, 2012. 42. KUPPER, J.; RENTSCH, K.; MITTELHOLZER, A.; ARTHO, R.; MEYER, S.;

KUPFERSCHMIDT, H.; NAEGELI, H. A fatal case of Autumm Crocs (Colchicum Autumnale) poisoning in a heifer: confirmation by mass-spectrometric colchicine

29

detection. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, Columbia, v. 22, p. 119-122, 2010. 43. LEE, S. T.; COOK, D.; RIET-CORREA, F.; PFISTER, J. A.; ANDERSON,

W. R.; LIMA, F. G.; GARDNER, D. R. Detection of monofluoroacetate in Palicourea and Amorimia species. Toxicon, Oxford, v. 60, p. 791-796, 2012. 44. LOBATO, V.; RATH, S.; REYES, F. G. R. Ocurrence of iverectin in bovine

milk from the Brazilian retail market. Food Additives and Contaminants, London, v. 23, n. 7, p. 668-673, 2006. 45. L, H. T.; LIU, J.; DENG, R.; SONG, J. Y. Preparative Isolation and

Purification of Indigo and Indirubin from Folium isatidis by High-speed Countercurrent Chromatography. Phytochemical Analysis, Chichester, (In press), 2012. 46. MALDANER, L.; JARDIM, I. C. S. F.; O estado da arte da cromatografia

lquida de ultra eficincia. Qumica Nova, So Paulo, v. 32, n. 1, p. 214-222, 2009. 47. MANJARREZ, J. L. A.; TELLEZ, S. A.; MARTINEZ, R. R.; HERNANDEZ, V.

O. F. Determination of rifaximin in milk of dairy cows using high pressure liquid chromatography (HPLC). Revista Cientfica, FCV-LUZ, Maracajbo, v. 22, n. 2, p. 112-119, 2012. 48. MARRIOTT, P. J.; HAGLUND, P.; ONG, R. C. Y. A review of environmental analysis by using multidimensional gas chromatography and

toxicant

comprehensive GC. Clinica Chimica Acta, Amsterdan, v. 328, p. 1-19, 2003. 49. MAURER, H. H. Systematic toxicological analysis procedures for acidic

drugs and/or metabolites relevant to clinical and forensic toxicology and/or doping control. Journal of Chromatography B, Amsterdan, v. 733, p. 3-25,1999. 50. MOUSER, P.; FILIGENZI, M. S.; PUSCHNER, B.; JOHNSON, B.; MILLER,

M. A.; HOOSER, S. B. Fatal ricin toxicosis in a puppy confirmed by liquid chromatography/mass spectrometry when using ricine as a market. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, Columbia, v. 19, p. 216-220, 2007. 51. MHLEN, C. V.; ZINI, C. A.; CARAMO, E. B.; MARRIOTT, P. J.

Caracterizao de amostras petroqumicas e derivados utilizando cromatografia gasosa bidimensional abrangente (GCxGC). Qumica Nova, So Paulo, v. 29, n. 4, p. 765-775, 2006.

30

52.

NAKASHIMA, K. High-performance liquid chromatographic analysis of

drugs of abuse in biologic samples. Journal of Health Science, Tokio, v. 51, n. 3, p. 272-277, 2005. 53. NETTO, D. P.; ZANLUCHI, A. R.; SASSAHARA, M.; YANAKA, E. K.

Micotoxinas em alimentao animal no perodo de maio/1997 a maro/2001 no Laboratrio de Toxicologia Veterinria da Universidade Estadual de Londrina Londrina PR. Semina, Londrina, v. 23, n. 1, p. 63-69, 2002. 54. NOGUEIRA, J. M. F. Mikhail S. Tswett: Um legado para a cromatografia

moderna. Qumica, Lisboa, v. 100, 2006. 55. OLIVEIRA-FILHO, J. C.; CAMO, P M. S.; IVERSEN, A.; NIELSEN, K. F.;

BARROS, C. S. L. Experimental poisoning by Baccharis megapotamica var. weirii in buffalo. Pesquisa Veterinria Brasileira, Rio de Janeiro, v. 32, n. 5, p. 383390, 2012. 56. OLIVEIRA-FILHO, J. C.; CARMO, P. M. S.; PIEREZAN, F.; TOCHETTO,

C.; LUCENA, R. B.; RISSI, D. R.; BARROS, C. S. L. Intoxicao por organofosforados em bovinos no Rio Grande do Sul. Pesquisa Veterinria Brasileira, Rio de Janeiro, v. 30, n. 10, p. 803-806, 2010. 57. PATEL, K. M.; PATEL, J. K.; PATEL, M. P.; RAJPUT, G. C.; PATEL, H. A.

Introduction to hyphenated techniques and their application in pharmacy. Pharmaceutical Methods, Bangalore, v. 1, n. 1, 2010. 58. PEREIRA, M. M. G.; CARVALHO, E. P.; PEDRO, G.; ROSA, C. A. R.;

VELOSO, T.; SOUZA, L. A. F.; RIBEIRO, J. M. M. Aflatoxinas em alimentos destinados a bovinos e em amostras de leite da regio de Lavras, Minas Gerais Brasil. Cincia e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 29, n. 1, p. 106-122, 2005. 59. PERES, T. B. Noes bsicas de cromatografia. Biolgico, So Paulo, v.

64, n. 2, p. 227-229, 2002. 60. PIETRN, W.; CYBULSKI, W.; KOS, K.; MITURA, A. Analytical procedure for the determination of tylosin a in feedingstuff by liquid chromatography ultraviolet detection. The Bulletin of Veterinary Institute in Pulawy, Pulawy, v. 55, p. 725-729, 2011. 61. PRADO, G.; OLIVEIRA, M. S.; PEREIRA, M. L.; ABRANTES, F. M.; SANTOS, L. G.; VELOSO, T. Aflatosin M1 in samples of minas cheese

31

commercialized in the city of Belo Horizonte Minas Gerais/Brazil. Cincia e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 20, n. 3, 2000. 62. REEVES, M. P. A retrospective report of 90 dogs with suspected cane toad

(Bufo marinus) toxicity. Australian Veterinary Journal, Oxford, v. 82, n. 10, 608611, 2004. 63. RIET-COOREA, F.; HARAGUCHI, M.; DANTAS, A. F. M.; BURAKOVAS, R.

G.; YOKOSUKA, A.; MIMAKI, Y.; MEDEIROS, R. M. T.; MATOS, P. F. Sheep poisoning by Panicum dichotomiflorum in northeastern Brazil. Pesquisa Veterinria Brasileira, Rio de Janeiro, v. 29, n. 1, p. 94-98, 2009. 64. RIET-CORREA, F.; MEDEIROS, R. M. T. Intoxicaes por plantas em

ruminantes no Brasil e no Uruguai: importncia econmica, controle e riscos para a sade pblica. Pesquisa Veterinria Brasileira, Rio de Janeiro, v. 1, n. 1, p. 38-42, 2001. 65. RIVERO, R.; MATTO, C.; ADRIEN, M. L.; RAMPOLDI, O. Intoxicao por

organoclorados (endosulfan) em bovinos no Uruguai. Pesquisa Veterinria Brasileira, Rio de Janeiro, v. 31, n. 4, p. 277-280, 2011. 66. SONNE, L.; ROZZA, D. B.; WOLFFENBUTTEL, A. N.; MEIRELLES, A. E.

W.; PEDROSO, P. M. O.; OLIVEIRA, E. C.; DRIEMEIER, D. Intoxicao por veneno de sapo em um canino. Cincia Rural, Santa Maria, v. 38, n. 6, p. 17871789, 2008. 67. SOUZA, R. C.; RIET-CORREA, F.; BRUM, K. B.; FERNANDES, C. E.;

BARBOSA-FERREIA, M.; LEMOS, R. A. A. Intoxicao por Brachiaria spp. em bovinos no Mato Grosso do Sul. Pesquisa Veterinria Brasileira, Rio de Janeiro, v. 30, n. 12, p. 1036-1042, 2010. 68. SOUZA, S. V. C.; SILVA, G.; DINIZ, M. H. G. M.; SANTOS, E. V.; LIMA, J.

A.; TEODORO, J. C. Determinao de resduos de avermectinas em fgado bovino por cromatografia lquida de alta eficincia. Cincia e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 23, n. 1, p. 54-58, 2003. 69. TATSUNO, M.; NISHIKAWA, M.; KATAGI, M.; TSUCHIHASHI, H. determination of illicit drugs in human urine by liquid

Simultaneous

chromatography-mass spectrometry. Journal of Analytical Toxicology, Niles, v. 20, 1996.

32

70.

THOMAS,

A.;

SCHANZER,

W.;

DELAHOUT,

P.;

THEVIS,

M.

Immunoaffinity purification of peptide hormones prior to liquid chromatography mass spectrometry in doping controls. Methods, Monneapolis, v. 56, p. 230-235, 2012. 71. THOMAS, A.; SOLYMOS. E.; SCHANZER, W.; BAUME, N.; SAUGY, M.;

DELLANNA, F.; THEVIS, M. Determination of Vasopressin and Desmopressin in urine by means of liquid chromatography coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometry for doping control purposes. Amsterdan, v. 707, p. 107-113, 2011. 72. VANHAECKE, L.; VANDEN BUSSCHE, J.; WILLE, K.; BEKAERT, K.; DE Analytica Chimica Acta,

BRABANDER, H. F. Ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry in high-throughput confirmation and quantification of 34 anabolic steroids in bovine muscle. Analytica Chimica Acta, Amsterdan, v. 1, n. 2, p. 7077, 2012. 73. VERDIER, M. C.; TRIBUT, O.; TATTEVIN, P.; TULZO, Y. L.; MICHELET, C.; FERRER, D. B. Simultaneous Determination of 12 -Lactam Antibiotics in Human Plasma by High-Performance Liquid Chromatography with UV Detection: Application to Therapeutic Drug Monitoring. Chemotherapy, Washington, v. 55, n. 10, 2012. 74. WOOD, M.; LALOUP, M.; SAMYN, N.; FERNANDEZ, M. M. R.; BRUIJN, E. Antimicrobial Agents and

A.; MAES, R. A. A.; BOECK, G. Recent applications of liquid chromatographymass spectrometry in forensic science. Journal of Chromatography A, Amsterdan, v. 1130, p. 3-15, 2006. 75. WORLD ANTI-DOPING AGENCY WADA. The 2012 Prohibited List.

2011. 9 p. 76. WORLD ANTI-DOPING AGENCY. WADA Technical Document

TD2003IDCR. In: WORLD ANTI-DOPING AGENCY. 2012. [online]. Disponvel em: http://www.wada-ama.org. Acesso em: 25/08/2012. 77. XAVIER, F. G.; RIGHI, D. A.; FLRIO, J. C.; SPINOSA, H. S.

Cromatografia em camada delgada para o diagnstico da intoxicao por aldicarb (chumbinho) em ces e gatos. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinria e Zootecnia, Belo Horizonte, v. 59, n. 5, p. 1231-1235, 2007.

33

78.

XU, X. M.; YU, S.; LI, R.; FAN, J.; CHEN, S. H.; SHEN, H. T.; HAN, J. L.;

HUANG, B. F.; REN, Y. P. Distribution and migration study of pesticides between peel and pulp in grape by online gel permeation chromatography-gas chromatography/mass spectrometry. Food Chemistry, Barking, v. 135, p. 161169, 2012.