TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

Khrismawan PENDAHULUAN Informasi keturunan diletakkan dalam urutan basa dari molekul-molekul DNA. Fragmen-fragmen DNA yang informasinya diubah menjadi molekul-molekul yang fungsional, dikenal sebagai gen. Urutan dari salah satu rantai DNA akan diterjemahkan melalui suatu proses transkripsi menjadi suatu urutan RNA yang komplementer. Molekul RNA yang terbentuk, berfungsi sebagai matriks untuk sintesa protein (mRNA) atau menerima fungsi tersendiri (rRNA, tRNA atau snRNA). Pada eukariot, hanya fragmenfragmen gen tertentu yang yang mengandung sandi genetik. Fragmen-fragmen ini disebut ekson. Diantara fragmen-fragmen ini terdapat fragmen yang tidak mengandung sandi genetik, yaitu intron. Setelah transkripsi, intron akan dipisahkan dari hnRNA yang pertama-tama terbentuk. Hal ini terjadi selama proses pematangan RNA yang memodifikasi kedua ujung RNA. RNA yang matang akan meninggalkan inti sel dan di dalam sitoplasma terikat dengan ribosom. Ditempat ini urutan RNA akan diterjemahkan kedalam urutan asam amino (protein) yang sesuai melalui proses translasi. Pada proses ini berperan tRNA yang mengenali urutan RNA tertentu. Sebelumnya, tRNA diberi muatan asam amino yang sesuai melalui proses aktivasi asam amino.1, 2 Pada pembelahan sel, informasi genetik akan diteruskan ke sel-sel anak, yaitu dengan cara membuat salinan dari keseluruhan DNA melalui proses replikasi. Jadi sel-sel anak mengandung molekul DNA yang identik dengan sel induk.1, 2 KROMATIN Didalam inti sel eukariotik, DNA berhubungan dengan protein-protein dan molekul-molekul RNA. Kompleks nukleoprotein ini dikenal sebagai kromatin. Hanya selama mitosis, kromatin berkondensasi menjadi kromosom yang terlihat dibawah mikroskop cahaya. Selama interfase, kondensasi kromatin tersebut melonggar secara menyeluruh. Secara morfologik dapat dibedakan eukromatin yang terbungkus rapat dan

heterokromatin yang terbungkus kurang rapat. Heterokromatin adalah tempat proses transkripsi berlangsung sangat aktif. 1, 3 Protein kromatin terdiri atas protein histon dan bukan histon. Histon merupakan suatu kelompok protein kecil yang bersifat basa kuat. Urutan asam amino histon pada semua sel eukariotik adalah sangat serupa. Histon berhubungan langsung dengan DNA. Protein ini turut membantu organisasi struktural kromatin. Selain itu, asam amino histon yang bersifat asam dan memungkinkan pengemasan yang rapat dari DNA didalam inti sel. Jadi 46 molekul DNA genom manusia yang diploid dapat ditempatkan di dalam inti sel menjadi molekul dengan diameter hanya 10 m. 1, 3 Setiap dua molekul histon dengan tipe H2A, H2B, H3 dan H4 membentuk suatu kompleks oktamer yang dibalut oleh 146 pasangan basa DNA dalam kurang lebih 13/4 putaran. Partikel-parikel dengan diameter 7 nm semacam ini dikenal sebagai nukleosom. DNA yang tidak langsung berhubungan dengan oktamer histon disebut DNA penghubung. Pada DNA-linker berikatan suatu histon lain yaitu H1. Histon H1 mendukung pembentukan struktur yang berbentuk seperti serabut-serabut dengan diameter 30 nm, yang dikenal sebagai kumparan. Kumparan sekali lagi membentuk pita dengan panjang kira-kira 200 nm. Ujung akhir setiap pita semacam ini terikat pada suatu struktur kerangka protein yang dikenal sebagai kerangka inti.1 Protein bukan histon sangat heterogen.Yang termasuk kelompok ini adalah protein struktural, begitu juga enzim dan faktor transkripsi. 1 REPLIKASI A. Cara kerja dari Polimerase DNA Untuk meneruskan informasi genetika pada perbanyakan sel, sebelum pembelahan sel harus dibuat satu salinan dari genom. Replikasi DNA dikatalisis terutama oleh enzim polimerase DNA yang tergantung pada DNA . Enzim ini memerlukan satu DNA untai tunggal yang disebut sebagai untai cetakan (matrixstrand) dan mensintesis untuai kedua yang komplementer, sehingga kembali dihasilkan suatu DNA heliks ganda yang lengkap. Substrat dari polimerase DNA adalah keempat deoksinukleosida trifosfat yaitu dATP, dGTP, dCTP, dan dTTP. Setiap basa pada untai cetakan akan berikatan dengan nukleotida yang komplementer

melalui pemasangan basa yang spesifik. Kemudian gugus 3-OH dari nukleotida terakhir pada untai DNA yang sedang terbentuk bereaksi secara nukleofilik dengan residu -fosfat dari nukleotida baru ditambahkan. Reaksi ini menghasilkan suatu ikatan diester asam fosfat yang baru melalui pelepasan difosfat. Setelah enzim polimerase DNA bergeser ke basa berikutnya pada untai DNA cetakan, maka langkah-langkah tersebut akan terulang kembali. Mekanisme yang diterangkan ini mengungkapkan dengan sendirinya bahwa untai DNA cetakan dibaca dengan arah 3 5.1, 4 Sebagian besar sel mengandung lebih dari satu polimerase DNA. Selain enzim yang mengkatalisis replikasi sesungguhnya, terdapat polimerase yang berperan pada proses reparasi atau pada proses replikasi DNA mitokondria pada eukariot.1, 4 B. Replikasi pada E. Coli Saat ini telah diketahui gambaran yang tepat mengenai proses replikasi pada prokariot, sementara pada eukariot masih banyak rincian yang belum jelas. Akan tetapi sudah dapat dipastikan bahwa pada prinsipnya berlangsungnya proses replikasi pada sebagian besar sel adalah serupa. Disini ditunjukkan suatu skema yang disederhanakan untuk bakteri Escherichia coli. 1 Pada bakteri, replikasi dimulai pada suatu tempat tertentu dari DNA yang berbentuk cincin yaitu awal-mula replikasi dan dilanjutkan kedua arah. Hasilnya terbentuk garpu replikasi yang berjalan berpencaran. Pada garpu replikasi, kedua untaian direplikasikan secara bersamaan. DNA yang merupakan cetakan diberi warna biru sedangkan untai yang baru terbentuk berwarna merah atau jingga. 1 Setiap garpu mengandung sedikitnya dua molekul polimerase DNA III dan serangkaian enzim pembantu. Yang termask enzim pembantu adalah topoisomerase DNA yang mengendurkan jalinan untaian ganda DNA yang erat, helikase yang memisahkan untaian ganda DNA menjadi dua untaian tunggal dan protein-protein yang terikat pada untai tunggal. Karena untai cetakan selalu dibaca dengan arah 3 5 maka hanya satu dari kedua untaian tunggal tersebut yang dapat direplikasi secara tak terputus (biru tua/merah). Untuk untaian yang kedua (biru muda), arah pembacaan berlawanan dengan arah pergerakan garpu. Pada untai cetakan tersebut,

pertama-tama dibentuk untai yang baru dalam bentuk potongan DNA yang terpisah, yang kemudian disebut berdasarkan nama dari penemunya yaitu fragmen Okazaki (hijau/jingga). Setiap fragmen mulai dengan suatu urutan awal yang pendek ( primer) dari RNA (hijau) yang diperlukan agar polimerase DNA dapat berfungsi. Primer RNA disintesis oleh suatu suatu polimerase RNA yang khusus (primase). Kemudian primer tersebut akan diperpanjang sekitar 1000 2000 komponen deoksinukleotida oleh enzim polimerase DNA III (jingga). Selanjutnya sntesis fragen Okazaki berhenti dan akan dimulai sntesis statu fragen Okazaki baru pada statu primer RNA lanilla yang sementara itu telah dibentuk tidak saling berhubungan satu dengan lainnya dan masih mengandung RNA pada ujung 5. Setelah garpu replikasi berjalan dengan jarak tertentu, baru dimulai kerja enzim polimerase DNA I yaitu menggantikan primer RNA dengan DNA. Akhirnya celah yang tertinggal di antara dua fragmen Okazaki ditutup oleh suatu enzim ligase DNA. Pada statu heliks ganda DNA yang terbentuk dengan cara tersebut, hanya satu untaian DNA yang disintesis baru, artinya replikasi bersifat semikonservatif.1 TRANSKRIPSI Agar informasi genetik yang disimpan di dalam DNA dapat digunakan, maka harus disalin ulang dalam bentuk RNA (ditranskripsikan). Dalam hal ini DNA hanya berfungsi sebagai pola, artinya DNA tidak akan mengalami perubahan melalui proses transkripsi. Fragmen DNA yang dapat ditranskripsikan ialah yang mengandung sandi genetik untuk suatu produk tertentu. Fragmen DNA tersebut dinamai gen. Diduga, genom mamalia mengandung 20.000 hingga 50.000 gen, yang keseluruhannya kurang dari 10% DNA pada mamalia. Kegunaan fragmen DNA yang bukan gen masih belum jelas.1, 2 A. Transkripsi dan pematangan RNA Transkripsi dikatalisis oleh enzim polimerase RNA yang tergantung pada DNA. Enzim ini bekerja serupa dengan polimerase DNA, akan tetapi yang ditambahkan kedalam untaian yang baru disintesis adalah ribonukleotida bukan deoksiribonukeotida. Sel eukariotik sekurang-kurangnya mengandung tiga polimerase RNA. Polimerase RNA I mensintesis suatu RNA dengan koefisien sedimentasi

sebesar 45 S, yang berfungsi sebagai prekursor untuk tiga RNA ribosom. Produk polimerase RNA II adalah hnRNA yang kemudian menjadi mRNA, dan juga prekursor snRNA. Yang terakhir adalah polimerase RNA III, mentranskripsi gen yang mengandung sandi genetik untuk tRNA, 5S-rRNA dan snRNA tertentu. Dari prekursor-prekursor ini kemudian melalui proses pematangan RNA terbentuk molekul RNA yang dapat berfungsi. Polimerase II dan III dapat dihambat oleh -Amanitin, suatu racun jamur. 1

Gambar 1. Mekanisme transkripsi Dikutip dari Kopp2 B. Organisasi gen -Globin Organisasi gen eukariotik diterangkan dengan contoh gen yang mengandung sandi genetik untuk rantai hemoglobin (146 asam amino). Gen tersebut mencakup hampir 2000 pasangan basa (pb), akan tetapi hanya sekitar 450 pb yang membawa informasi untuk urutan protein. Tiga daerah yang mengandung sandi genetik atau ekson (E1-E3, biru tua) dipisahkan satu sama lainnya oleh dua segmen yang tidak mengandung sandi genetik (intron). Pada ujung 5 gen terdapat daerah promotor 5

(merah muda) yaitu suatu fragmen sebesar Kira-kira 200 pb dan berfungsi dalam regulasi transkripsi. Transkripsi mulai pada ujung 3 daerah promotor dan dilanjutkan hingga melampaui urutan poliadenilat. Pada gen -globin transkrip primer yang terbentuk mempunyai panjang sekitar 1600 basa. Selama proses pematangan RNA, urutan-urutan intron yang tidak mengandung sandi genetik yang sesuai dilepaskan. Selain itu, kedua ujung hnRNA dimodifikasi. mRNA dari -globin masih mengandung sekitar 40% hnRNA dan sebagai tambahan juga mengandung urutan pada 3-terminal yang terdiri atas kira-kira 200 residu AMP.1 C. Jalannya transkripsi Seperti diketahui bahwa polimerase RNA II berikatan pada ujung 3 daerah promotor. Penting untuk pengikatan tersebut adalah suatu daerah promotor yang dikenal sebagai kotak TATA, yaitu suatu potongan rangkaian basa pendek yang kaya akan nukleotida A dan T. Kotak TATA bervariasi dari satu gen ke gen lainnya. Suatu urutan basa yang khas untuk kotak TATA (urutan konsensus) ahla ...TATAAA Untuk interaksi polimerase dengan daerah promotor tersebut mutlak diperlukan lebih dari satu protein, yang dikenal sebagai faktor transkripsi basal. Factor tambahan lainnya dapat menstimulasi atau menghambat proses (kontrol transkripsi). Setelah inisiasi, polimerase RNA bergerak memisahkan satu bagian pendek heliksganda DNA menjadi untaian tunggal. Nukleosida trifosfat yang komplementer akan berpasangan dengan basa pada untaian DNA yang kodogenik dan tahap demi tahap diikatkan pada RNA yang sedang terbentuk. Tak lama setelah proses perpanjangan dimulai, ujung 5 dari transkrip dilindungi dengan suatu topi penutup (cap). Setelah mencapai urutan poliadenilat (urutan basa yang khas : ..AATAAA), transkrip akan dilepaskan. Tidak lama kemudian polimerase mengakhiri proses transkripsi dan berdisosiasi dari DNA.1 PEMATANGAN RNA A. Kontrol transkripsi Walaupun setiap sel mengandung genom yang lengkap, Namur sel hanya menggunakan sebagian kecil dari infromasi genetik yang dikandungnya. Yang selalu

ditranskripsikan adalah gen-gen yang mengandung sandi genetik untuk molekul struktural atau untuk enzim pada metabolismo intermedier. Selain gen-gen yang dipakai zaher-hari tersebut, terdapat sejumlah besar gen lainnya yang hanya menjadi aktif pada beberapa tipe sel tertentu, pada situasi metabolisme tertentu atau selama diferensiasi. Gen-gen mana yang ditranskripsikan dan mana yang tidak, diatur oleh suatu sistem regulasi yang unsur-unsurnya baru dikenal secara garis besar saja.1 Pada kontrol transkripsi bekerja sama dua jenis struktur. Daerah promotor dari sebagian besar gen mengandung beberapa fragmen DNA yang pendek (elemen kontrol). Pada fragmen tersebut berikatan faktor transkripsi dan dengan demikian dapat mengatur transkripsi. 1 Karena elemen kontrol semacam ini hanya mempunyai pengaruh pada gengen yang berada bersama-sama dengan elemen kontrol dalam satu DNA, maka elemen tersebut dinamakan juga elemen cis-aktif. Faktor transkripsi adalah protein, dengan demikian merupakan produk dari gen yang berlainan dan independen. Karena itu dikenal juga sebagai faktor trans-aktif. 1 Transkripsi suatu gen hanya dapat berlangsung, bila selain enzim polimerase RNA tersedia juga protein-protein lainnya yaitu faktor transkripsi basal. Faktor transkripsi basal yang terpenting diberi tanda dengan huruf A-H. Pada eukariot, yang pertama-tama terikat adalah faktor TF-IID pada kotak TATA. Faktor-faktor basal lain dan juga polimerase RNA kemudian menempatkan dirinya pada kompleks tersebut. Faktor transkripsi lain yang tidak bersifat basal dapat mempengaruhi inisiasi transkripsi dengan cara mengikatkan diri dengan elemen kontrol yang terletak berdampingan dengan kompleks dan melalui interaksi dengan kompleks yang basal dapat mengaktifkan atau menghambat inisiasi kompleks transkripsi. Faktor yang mengaktifkan misalnya adalah kompleks hormon steroid dengan reseptornya. 1 B. Proses putus Sambung Setelah transkripsi, urutan-urutan hnRNA yang tidak mengandung sandi genetik (intron) dilepaskan. Proses ini dinamakan proses putus sambung RNA dan dikatalisis oleh kompleks RNA-protein yang dikenal sebagai small nuclear ribonucleoprotein particles (snRNA). Intron pada hnRNA mempunyai urutan-urutan

yang khas pada kedua ujungnya. Pada proses putus-sambung, pertama-tama, dengan bantuan suatu snRNP, gugus OH residu adenosin di dalam ekson menyerbu ikatan diester asam fosfat pada ujung 5 daerah intron dan memutuskan ikatan tersebut. Bersamaan dengan itu terbentuk suatu ikatan baru didalam intron, sehingga intron menyerupai suatu bentuk lasso. Pada langkah kedua, gugus OH terminal ekson yang berada pada posisi 5 menyerbu ikatan pada ujung 3 intron. Dengan demikian kedua ekson tersebut diikatkan dan intron dilepaskan.1 Lima jenis snRNP yang berbeda (U1, U2, U4, U5, dan U6) berperan pada reaksi putus-sambung. Setiap jenis terdiri atas beberapa protein dan satu molekul snRNA. Selama proses putus-sambung, kompleks yang terdiri atas hnRNA dan snRNPs membentuk suatu spliceosom. Dianggap bahwa snRNAs didalam spliceosom berpasangan basa satu dengan yang lainnya dan juga dengan hnRNA, sehingga memfiksasi dan memberikan orientasi pada gugus yang bereaksi. Proses katalisis yang berlangsung dengan sendirinya ini berasal dari bagian RNA. Jenis RNAs yang bersifat katalisis ini dikenal sebagai ribozim.1 C. Modifikasi 5 dan 3 dari mRNA Tak lama setelah dimulainya transkripsi pada eukariot, ujung 5 RNA yang sedang terbentuk ditutup oleh suatu struktur yang disebut Topi penutup (cap). Pada mRNAs, topi penutup tersebut terdiri atas suatu residu 7-metil-GTP. Topi penutup ini melindungi RNA dari pemecahan oleh enzim 5-eksonuklease. Setelah berakhirnya transkripsi, pada ujung 3 hnRNA ditambahkan suatu ekor poliadenilat yang terbentuk dari kurang lebih 200 residu AMP. Setelah itu baru mRNA yang matang meninggalkan inti sel. 1 SANDI GENETIK, AKTIVASI ASAM AMINO A. Sandi genetik Sebagian besar informasi genetik yang terkandung di dalam DNA menyandikan urutan asam amino dari protein-protein yang fungsional. Pada ekspresi proteinprotein tersebut, suatu teks bahasa asam nukleat harus diterjemahkan ke dalam bahasa

protein. Atas dasar tersebut maka dikenal istilah tranlasi untuk biosintesis protein. Aturan yang berlaku untuk penerjemahan tersebut dinamai sandi genetik.1, 2 Karena terdapat 20 asam amino proteinogen, maka bahasa asam nukleat sekurangnya mengandung kata-kata (kodon) yang sama banyaknya. Didalam abjad asam nukleat hanya terdapat 4 huruf (A, G, C dan U atau T). Untuk dapat membentuk 20 kata-kata yang berlainan, maka setiap kata harus mempunyai sedikitnya tiga huruf. Pada kenyataannya kodon terdiri atas masing-masing tiga basa yang berurutan (triplet).1, 3

Gambar 2. Struktur untaian ganda DNA Dikutip dari Kopp2 Karena sandi untuk 20 asam amino tersedia dalam 43 = 64 kodon, maka untuk kebanyakan asam amino terdapat lebih dari satu kodon sinonim. Tiga triplet tidak mengandung sandi untuk asam amino melainkan memberi sinyal untuk berakhirnya translasi (kodon berhenti). Kodon khusus lainnya adalah kodon mulai yang menandai dimulainya penerjemahan. Sandi yang ditunjukkan berlaku hampir universal, hanya di dalam mitokondria dan pada beberapa mikroorganisme terdapat penyimpangan dari sandi standar.1

B.

RNA Transfer RNAs transfer (tRNAs) berfungsi sebagai anggota penghubung antara tingkat asam nukleat dan tingkat protein. tRNA adalah molekul RNA kecil, terdiri atas 70-90 basa dan mampu mengenali kodon mRNA tertentu melalui pemasangan pasangan basa. Bersamaan dengan itu tRNA pada ujung 3 (urutan: ..CCA) membawa asam amino tertentu yang berhubungan dengan kodon mRNA yang bersangkutan sesuai dengan sandi genetik. Penerjemahan yang sesungguhnya diurus oleh enzim-enzim yang secara selektif memberi tRNA muatan asam amino yang tepat.1 Urutan basa dan struktur tersier Phe-tRNA yang berasal dari ragi adalah khas untuk semua tRNA. Suatu bagian yang besar dari molekul tersebut mengandung basa yang tidak lazim terdapat dan mengalami modifikasi.1, 5

C.

Aktivasi Asam amino Kurang lebih 20 ligase asam amino-tRNA yang berbeda didalam sitoplasma menghubungkan masing-masing satu jenis asam amino dengan tRNA yang dimilikinya. Aktivasi asam amino berlangsung dalam dua langkah. Pertama, asam amino akan diikat dan direaksikan dengan ATP, membentuk suatu anhidrida asam yang kaya energi. Kemudian, gugus 3-OH terminal tRNA akan mengambil alih residu amino asil. Jadi pada amino asil-tRNA gugus karboksi asam amino membentuk ikatan ester dengan residu ribosa adenosin terminal.1, 5, 6 Ketepatan translasi terutama tergantung dari spesifisitas ligase asam amino tRNA. Residu asam amino yang salah dimasukkan, tidak dapat dikenali oleh ribosom. Karena itu, suatu mekanisme koreksi pembacaan didalam pusat aktif ligase mengatur agar residu amino asil yang salah dimasukkan segera dilepaskan kembali. 1, 6

RIBOSOM, INISIASI DARI TRANSLASI Seperti halnya aktivasi asam amino, biosintesis protein (translasi) berlangsung didalam sitoplasma. Proses translasi dikatalisis oleh partikel nukleoprotein yang kompleks, yaitu ribosom. Ribosom terdiri atas dua subunit dengan besar yang berlainan. Ribosom tersusun dari RNA ribosom (rRNA) dan banyak protein. Sebagai ganti berat molekul ribosom dan komponennya, biasanya digunakan koefisien sedimentasinya.

10

Ribosom eukariotik mempunyai koefisien sedimentasi kira-kira sebesar 80 Svedberg (80 S). Koefisien sedimentasi dari masing-masing subunit adalah 40 S dan 60 S (nilai S bukan merupakan penjumlahan).1, 6 Ribosom prokariotik terbentuk dengan cara yang serupa, tetapi sedikit lebih kecil (koefisien sedimentasi: 70 S untuk ribosom lengkap, 30 S dan 50 S untuk subunitsubunit). Ribosom mitokondria dan kloroplas dapat dibandingkan dengan ribosom prokariot.1, 6 PROSES PERPANJANGAN DAN PENGAKHIRAN Setelah inisiasi translasi, rantai peptida yang sedang terbentuk diperpanjang lebih lanjut dengan residu-residu asam amino (perpanjangan) hingga ribosom pada mRNA mencapai kodon berhenti dan proses dihentikan (pengakhiran).1 Perpanjangan dapat dibagi menjadi tiga fase. Pertama-tama tempat peptidil (P) ribosom diisi oleh statu tRNA yang pada ujung 3 membawa keseluruhan rantai peptida yang telah terbentuk sampai saat tersebut (kiri atas). Kemudian statu tRNA kedua, yang bermuatan asam amino yang sesuai (dalam contoh yang ditunjukkan disini adalah val-tRNAval) dengan antikodonnya yang bersifat komplementer, berikatan pada kodon mRNA (dalam hal ini GUG) yang terdapat dalam tempat akseptor.1

Gambar 3. Molekul Hexokinase. Suatu enzim utama penghasil energi sel, terdiri 6000 atom. Dikutip dari Kopp2

11

KERJA ANTIBIOTIKA Antibitika adalah zat-zat yang dibentuk oleh mikroorganisme dan menghambat pertumbuhan atau perbanyakan mikroorganisme lain. Diantara antibitika yang digunakan untuk terapi infeksi, terdapat substansi yang mempengaruhi transkripsi atau translasi penyebab penyakit bakterial.1, 7 Yang termasuk penghambat transkripsi misalnya rifampisin yang bekerja terhadap penyebab tuberculosis. Rifampicin merupakan suatu zat penghambat polimerase RNA yang tergantung pada DNA. Aktinomisin D dan Daunomisin terikat pada DNA sehingga mengganggu transkripsi. Antibiotika amino glikosida yaitu Streptomisin mempengaruhi translasi pada segala tahap. Tetrasiklin mengganggu ikatan tRNA pada ribosom, sementara kloramfenikol menghambat peptidiltransferase. Yang terakhir adalah Puromisin menyebabkan pengakhiran biosintesis protein pada tahap yang sangat dini.1, 7 MUTASI DAN REPARASI Informasi genetik diletakkan didalam urutan basa DNA. Karena itu perubahan basa DNA atau urutan-urutannya mempengaruhi secara genotip (bersifat mutagen). Banyak substansi mutagenik yang juga membahayakan kontrol pertumbuhan sel. Substansi-substansi tersebut adalah karsinogen. Perubahan gen (mutasi) merupakan salah satu faktor yang menentukan evolusi biologi. Disamping itu suatu sel yang mempunyai tingkat kemungkinan terjadinya mutasi yang tinggi diragukan kemampuan hidupnya. Karena itu sel-sel mempunyai mekanisme reparasi yang memusnahkan kembali sebagian besar perubahan-perubahan DNA yang terbentuk akibat mutasi.1 A. Bahan-bahan mutagenik Mutasi dapat terbentuk karena pengaruh fisik dan kimia, tetapi juga oleh kesalahan yang kebetulan terjadi pada replikasi atau rekombinan DNA.1 Diantara mutagen fisik, yang terutama perlu disebutkan adalah penyinaran ionisasi. Penyinaran ionisasi menghasilkan radikal bebas (molekul-molekul dengan elektron yang tidak berpasangan) didalam sel. Molekul-molekul tersebut mampu

12

bereaksi (reaktif) secara ekstrim dan dapat merusak DNA. Juga sinar ultraviolet (UV) gelombang pendek mempunyai pengaruh mutagenik yang terutama menyerang sel-sel kulit. Perubahan kimia yang paling sering terjadi akibat penyinaran UV adalah pembentukan dimer timin. Dua basa timin yang berdampingan saling berikatan secara kovalen membentuk anyaman seperti jala. Hal ini menyebabkan kesalahan dalam pembacaan DNA pada replikasi dan transkripsi.1 Dari kelompok besar mutagen kimia, diantaranya asam nitrit (HNO 2) dan hidroksilamin (NH2OH) mendesaminasi basa; keduanya mengubah misalnya sitosin didalam urasil dan adenin didalam inosin. Senyawa yang mengalkilasi membawa gugus yang reaktif, yang dapat membentuk senyawa kovalen dengan basa DNA. Metilnitrosamin membebaskan kation metil (CH3+) reaktif, yang memetilasi gugus OH- dan NH2- didalam DNA. Zat karsinogenik yang terkenal yaitu benzo(a)piren, suatu senyawa CH yang bersifat aromatik, pertama-tama didalam organisme akan diubah kedalam bentuk yang efektif. Melalui hidroksilasi salah satu cincin berulang kali terbentuk suatu epoksid reaktif, misalnya yang bereaksi dengan gugus amino guanin.1 B. Pengaruh Asam nitrit menyebabkan mutasi noktah. Bila misalnya C diubah menjadi U, maka pada replikasi selanjutnya nukleotida U tersebut akan berpasangan dengan A, bukan dengan G. Akibatnya perubahan tersebut akan bersifat permanen. Mutasi yang membuat nukleotida yang dibaca dalam kodon bukan 3 buah, melainkan bergeser sehingga melebihi (insersi) atau berkurang (delesi) dari jumlah tersebut, menyebabkan kesalahan pembacaan untuk seluruh bagian DNA, karena bingkai pembacaan kodon ikut bergeser (mutasi pergeseran bingkai). Penyisipan (insersi) nukleotida C ke dalam DNA mengakibatkan mRNA yang terbentuk diinterpretasikan berlainan sehingga dihasilkan suatu urutan protein yang benar-benar baru.1, 8 C. Mekanisme perbaikan Suatu mekanisme penting untuk melenyapkan kerusakan-kerusakan DNA adalah perbaikan secara eksisi (1). Pada proses ini suatu nuklease memotong

13

keseluruhan bagian yang mengalami kesalahan DNA pada kedua sisi. Dengan bantuan urutan dari untai yang berlawanan, bagian yang terpotong tersebut akan kembali diisi oleh suatu polimerase DNA. Ligase DNA kemudian menutup kembali celah pada kedua sisi. Dimer Timin dapat dilepaskan dengan cara reaktivasi cahaya (2). Suatu liase cahaya berikatan pada defek tersebut dan pada pemberian cahaya enzim tersebut dapat memotong dimer menjadi dua basa tunggal. Mekanisme ketiga ialah perbaikan melalui rekombinasi (3). Pada proses ini, ditempat terjadinya kesalahan, DNA tidak direplikasikan. Celah tersebut akan ditutup dengan cara menggeser segmen yang sesuai dari untaian DNA yang direplikasikan secara tepat. Celah baru yang terbentuk tersebut akan diisi oleh polimerase dan ligase. Akhirnya defek semula, dapat dihilangkan dengan cara eksisi.1 TEKNIK GEN A. Kloning gen Kemajuan pesat genetika molekuler sejak tahun 1970 terutama didasarkan atas perkembangan dan peningkatan mutu metode analisis dan manipulasi DNA. Terkenal sebagai Teknik Gen, mempunyai arti praktis pada berbagai bidang. Teknik tersebut misalnya menyediakan metode baru untuk diagnosis dan terapi penyakit, dan juga saat ini memungkinkan perubahan dari sifat-sifat tertentu yang diinginkan pada suatu organisme. Karena pada teknik semacam ini kemungkinan terjadinya risiko biologik tidak boleh diabaikan, maka penggunaannya memerlukan penanganan yang dilakukan dengan penuh tanggung jawab.1, 8 1. Endonuklease Restriksi Pada sebagian besar cara kerja teknik gen, fragmen-fragmen DNA tertentu harus diisolasi dan dikombinasikan dengan bagian DNA lainnya. Dalam hal ini digunakan enzim-enzim, yang juga memotong DNA di dalam sel dan menyatukannya kembali. Yang sangat penting adalah enzim nuklease restriksi, suatu kelompok enzim-enzim bakteri yang memotong untaian ganda DNA secara spesifik di urutan basa tertentu. Sejumlah besar enzim restriksi yang sudah dikenal, diberi nama dengan singkatan yang menunjukkan organisme asalnya.

14

Misalnya, sebagai contoh diamati disini EcoRI, suatu nuklease yang diisolasi dari bakteri Escherichia coli. Seperti endonuklease restriksi lainnya, EcoRI memutus DNA secara palindrom, artinya suatu potongan pendek untai ganda DNA yang kedua untaiannya mempunyai urutan yang sama, bila masing-masing untaian dibaca dengan arah 5 3, dalam hal ini adalah urutan 5-GAATTC-3. EcoRI adalah suatu protein homodimer yang memutus ikatan diester asam fosfat dari kedua rantai diantara G dan A. Akibatnya terbentuk ujung-ujung yang menjorok keluar (AATT) yang bersifat komplementer. Ujung-ujung tersebut masih dijaga keutuhannya dengan adanya pemasangan basa. Namun demikinan kedua untaian tersebut dapat dengan mudah dipisahkan, misalnya melalui pemanasan. Bila fragmen tersebut kemudian didinginkan, ujung-ujung yang menjorok keluar tersebut dapat kembali berhibridisasi dengan penyusunan yang tepat. Kemudian dengan bantuan suatu ligase DNA, tempat pemotongan tersebut dapat ditutup.1 2. Kloning DNA Sebagian besar fragmen DNA, misalnya gen, terdapat didalam sel hanya dalam jumlah yang sangat kecil. Agar dapat bekerja dengan fragmen-fragmen tersebut secara eksperimental, maka pertama-tama harus dibuat banyak salinansalinannya yang identik (klon). Metode klasik untuk kloning DNA didalm laboratorium, dengan menggunakan kemampuan bakteri untuk memasukkan dan memperbanyak fragmen DNA pendek yang berbentuk cincin. Fragmen tersebut dikenal sebagai plasmid. Pertama-tama fragmen yang akan di kloning dilepaskan dari DNA asalnya oleh endonuklease restriksi. (Untuk mempermudah, disini hanya ditunjukkan suatu pemotongan DNA hanya oleh EcoRI, namun pada prakteknya kebanyakan digunakan dua enzim yang berbeda). Sebagai vektor diperlukan suatu plasmid, yang hanya mengandung satu tempat pemotongan EcoRI. Cincin plasmid dibuka melalui pemotongan oleh EcoRI dan digabungkan dengan fragmen DNA yang telah diisolasi. Fragmen dan vektor mempunyai ujung menjorok keluar yang sama. Karena itu sebagian molekul berhibridisasi sehingga fragmen berintegrasi kedalam DNA vektor. Bila kemudian tempat pemotongan ditutup kembali oleh ligase DNA, maka terbentuk suatu plasmid dengan

15

kombinasi baru (rekombinan). Melalui penanganan awal pada sejumlah besar selsel inang, maka sebagian sel-sel tersebut dapat menerima dan memasukkan plasmid (proses ini dinamai transformasi). Pada kebanyakan sel, plasmid dapat bereplikasi bersama-sama dengan genomnya sendiri. Untuk memastikan, bahwa yang diperbanyak hanyalah bakteri inang yang mengandung plasmid, maka digunakan plasmid yang mempunyai resistensi terhadap suatu antibiotika tertentu. Bila bakteri diinkubasi dalam keadaan adanya antibiotika ini, maka yang dapat memperbanyak diri hanyalah sel-sel yang mengandung plasmid tersebut. Selanjutnya plasmid tersedbut diisolasi dari sel-sel inang dan setelah pemotongan dengan EcoRI menghasilkan fragmen DNA yang dikloning dalam jumlah yang besar.1 B. 1. Analisis urutan DNA Pustaka gen Pada teknik gen sering diperlukan isolasi fragmen DNA yang belum dikenal secara rinci, misalnya untuk menentukan urutan nukleotidanya.1 Untuk keperluan tersebut digunakan suatu Pustaka gen. Suatu pustaka DNA terdiri atas sejumlah besar molekul DNA vektor yang mengandung fragmen-fragmen yang berbeda dari DNA asing. Misalnya, seluruh molekul mRNA yang terdapat didalam suatu sel disalin ulang dalam bentuk DNA dan kemudian fragmen DNA tersebut ( diberi nama copy-DNA atau cDNA) dimasukkan kedalam molekul vektor. Suatu pustaka DNA genom dibuat dengan cara DNA total suatu sel dipotong-potong dengan bantuan endonuklease restriksi menjadi fragmen-fragmen DNA dan kemudian dimasukkan kedalam DNA vektor. Yang cocok untuk menjadi vektor bagi pustaka gen adalah bakteriofaga (secara singkat : faga). Faga adalah virus yang menyerang bakteri dan memperbanyak diri didalam bakteri.1 Teknik ini dimulai dengan cara mengencerkan sejumlah kecil pustaka DNA (105 hingga 106 faga) dan dicampur dengan bakteri inang, kemudian dicoretkan secara merata diatas lapisan agar yang mengandung zat-zat makanan. Bakteri tumbuh sebagai koloni-koloni yang dalam jumlah banyak saling

16

menempel sehingga membentuk suatu lapisan sel yang keruh. Bakteri yang diserang oleh faga, tumbuh kurang begitu cepat. Karena itu bakteri-bakteri tersebut membentuk zona bundar dan lebih jernih disekeliling koloninya, yang dikenal sebagai bercak. Sel-sel didalam bercak hanya mengandung keturunan dari suatu faga tersendiri yang berasal dari pustaka DNA asalnya. Kemudian dibuat cetakan dari lempeng agar tersebut dengan cara menempelkan suatu lapisan membran buatan diatas lempeng agar dan dipanaskan. Akibatnya DNA faga menempel pada membran. Selanjutnya membran tersebut diinkubasi dengan suatu fragmen DNA (suatu pelacak gen) yang dapatberhibridisasi dengan fragmen DNA yang dicari. Pelacak gen akan berikatan pada tempat-tempat tertentu dimana DNA yang diinginkan menempel pada membran. Ikatan pelacak gen dapat dibuktikan bila sebelumnya pelacak gen diberi tanda dengan radioaktif atau dengan cara lain. Selanjutnya dilakukan perbanyakan faga yang berasal dari bercak positif lempeng asalnya. Melalui pemotongan secara restriksi akhirnya diperoleh sejumlah besar DNA yang diinginkan.1 2. Analisis urutan DNA Saat ini penentuan urutan nukleotida DNA kebanyakan dilakukan menurut metode penghentian sintesis rantai. Pertama-tama dilakukan kloning fragmen DNA kedalam DNA faga M13. Darai faga M13 dapat dengan mudah diisolasi untaian tunggal DNA yang bersifat kodogenik berdasarkan sifat-sifat tertentu. DNA untai tunggal tersebut dihibridisasi dengan suatu fragmen DNA pendek yang disebut primer. Primer berikatan pada ujung 3 untaian tunggal DNA tersebut. Bertitik tolak dari hibrida semacam ini, kemudian untaian DNA kedua yang masih belum lengkap, dapat dilengkapi didalam tabung reaksi, dengan cara menambahkan deoksinukleosida trifosfat (dNTP, jadi maksudnya campuran dGTP, dATP, dTTP dan dCTP) dan polimerase DNA. Selain dNTP ditambahkan juga satu macam dideoksinukleosida trofosfat (ddNTP) dalam jumlah kecil. Pemasangan ddNTP kedalam rantai DNA yang sedang terbentuk mengakibatkan berhentinya sintesis untai DNA tersebut. Hal tersebut kemudian berulang

17

kembali, karena dNTP yang seharusnya dipasang kedalam rantai DNA digantikan oleh ddNTP yang sesuai. 1 C. 1. PCR, RFLP Reaksi Rantai Polimerase (PCR=Polymerase Chain Reaction) Reaksi rantai polimerase (PCR) memungkinkan perbanyakan (amplifikasi) fragmen DNA yang diinginkan tanpa menggunakan enzim restriksi, vektor dan sel inang. Untuk itu hanya diperlukan dua oligonukleotida (primer) yang masingmasing berhibridisasi dengan salah satu untaian DNA yang akan diamplifikasi pada sisi yang berbeda, dan juga keempat deoksinukleosida tifosfat dalam jumlah yang cukup serta suatu polimerase DNA khusus yang tahan panas. 1 Pertama-tama, untaian ganda DNA dipisahkan menjadi untaian tunggal melalui pemanasan. Kemudian dibiarkan agak sedikit dingin agar hibridisasi primer dapat terjadi. Bertitik tolak dari sini, selanjutnya disintesis untaian DNA komplementer dari awal dalam dua arah. Daur ini, akan diulangi 20-30 kali dengan campuran reaksi yang sama. Setelah daur yang ketiga akan terbentuk untaian berganda DNA yang mempunyai panjang yang sesuai dengan jarak antara kedua primer. Pada setiap daur, jumlah DNA untai ganda tersebut meningkat sebanyak kurang lebih dua kalinya, hingga akhirnya hampir seluruh fragmen yang baru disintesis mempunyai panjang yang diinginkan. Pamanasan dan pendinginan yang terus berulang secara siklik diatur oleh termostat dibawah pengawasan komputer.1 2. Analisis RFLP Endonuklease restriksi memotong DNA pada tempat-tempat yang sangat khas dan sebagian besar merupakan palindrom. Bila suatu basa didalam suatu tempat pengenalan semacam ini mengalami perubahan karena mutasi, maka enzim restriksi yang bersangkutan tidak lagi dapat memotong DNA pada tempat tersebut. Sebaliknya, melalui lutasi dapat terbentuk tempat restriksi yang baru. Fragmen DNA yang sebanding dari dua individu berbeda yang secara genetik tidak identik sering menghasilkan fragmen restriksi yang berbeda panjangnya.

18

Efek ini dikenal sebagai polimorfisme dari panjang fragmen restriksi (restriction fragment length polymorphism, RFLP).1 3. Ekspresi berlebihan dari protein Untuk terapi penyakit-penyakit tertentu diperlukan protein,misalnya proteohormon yang terdapat pada organisme hewan dalam jumlah yang sedemikian kecil sehingga sulit diisolasi. Protein semacam ini dapat dihasilkan melalui ekspresi berlebihan didalam bakteri atau sel-sel eukariotik. Untuk itu diisolasi gen yang bersangkutan dari DNA dan disisipkan kedalam suatu plasmid ekspresi. Plasmid tersebut harus mengandung, selain gen itu sendiri, juga potongan-potongan DNA lainnya yang dapat memungkinkan terjadi replikasi dan transkripsi gen tersebut bila plasmid berada didalam sel inang. Setelah transformasi dan perbanyakan sel inang yang cocok untuk plasmid tersebut, dilakukan suatu transkripsi gen yang efisien melalui induksi yang terarah. Yang terakhir, melalui translasi dari mRNA yang terbentuk dihasilkan protein yang diinginkan dalam jumlah besar.1

19

DAFTAR PUSTAKA [1] Koolman J, Rohm KH. Atlas Berwarna & Teks Biokimia. 1st ed. Stuttgart: Hipokrates 2001. [2] Kopp P. Genetics. Evidence-based Endocrinology. Second ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins:261-76. [3] Ganong WF. The Gonads:Development & Function of the Reproductive System. Review of Medical Physiology. 22 ed. San Francisco: McGraw Hill 2005:411-53. [4] Guyton CA, Hall JE. Textbook of medical physiology. Philadelphia: W.B. Saunders company 1996. [5] Ganong WF. Physiology of reproduction in women. In: DeChenney AH, Pernoll ML, eds. Curent obstetrics & Gynecologic. Connecticut: Appleton & Lange 1994:12445. [6] Schumm DE. Core Concepts in Clinical Molecular Biology. First ed. Philadelphia - New York: Lippincott - Raven 1997. [7] Speroff L, Glass RH, Kase NG. Clinical Gynecologic Endocrinology and infertility. 7 ed. Baltimore: Lippincott Williams & Wilkins 2005. [8] Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. Cellular and Molecular Immunology. 6th edition ed. Philadelphia: Saunders elsevier 2007.

20