MTODOS DE ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE BACTRIAS ANAERBIAS Prof. Dr. Mario Julio Avila-Campos Homepage: p g www.icb.usp.br/bmm/mariojac p j
ISOLAMENTO DE ANAERBIOS
9 Para que isolar anaerbios? - Conhecer os diferentes tipos microbianos - Informao microbiolgica g completa p e rpida - Identificao dos organismos - Susceptibilidade a antimicrobianos
Isolamento de Anaerbios - Espcimes a serem pesquisados - Leses associadas ao trato gastrointestinal ou genital feminino. - Septicemia. - Infeces crnicas do trato respiratrio superior (sinusites, otite mdia). - Leso supurativa (pneumonia). (pneumonia) do trato respiratrio inferior
- Meningites associadas com infeces crnicas do trato respiratrio superior (fluido crebro crebro-espinal) espinal). - Abscessos superficiais e profundos (cerebral). - Infeces dentais. dentais - Leses por queimaduras e mordidas.
DIFICULDADES NO ESTUDO DA MICROBIOTA ANAERBIA 9 Tcnicas de coleta, transporte e processamento 9 Volume do espcime 9 Diluente e homogeneizao do espcime 9 Meios seletivos e no seletivos, suplementados 9 Microbiota associada mucosa 9 Variaes da dieta, e variao dia a dia da amostragem 9 Interferncia de Antimicrobianos Antimicrobianos.
Indcios bacteriolgicos de infeco por anaerbios Morfologia singular na colorao de Gram Nenhum crescimento em cultura rotineira Vestgio de crescimento em aerobiose Crescimento em 100 g/ml de canamicina ou neomicina, ou 7,5 g/ml de vancomicina. Cultura C com produo de gs e/ou / odor ptrido Colnias fluorescentes sob UV (P. melaninogenica, F. nucleatum
sondagem
coleta
Soluo Ringer-PRAS
MTODOS DE OBTENO DE ANAEROBIOSE 1. SUBSTNCIAS REDUTORAS - Placas de Brewer - Jarras com catalizadores de H2 - Paladium (Gaspak) - Absoro pelo Pirogalol 2. CONSUMO BIOLGICO DO OXIGNIO LIVRE - Tcnica de Fortner 3. PROCESSO MECNICO DE MISTURA DE GASES - 90% N2 + 10% CO2; 5% H2 + 85% N2 + 10% CO2 4. ESTUFAS E CMARAS DE ANAEROBIOSE
Processo mecnico de obteno bt de d anaerobiose por mistura gasosa g (90% N2 /10% CO2)
Jarra de Anaerobiose
Cmara de Anaerobiose
Isolamento e Identificao
G Gram
Tioglicolato
Anaerobiose
Colnia caracterstica Meio no seletivo Cultura pura Teste respiratrio Estocagem Testes presuntivos
Bioqumica Susceptibilidade a antimicrobianos Imunolgicos Testes definitivos Biologia molecular: sondas, PCR... Cromatografia gasosa
Gram
C A R A C T E R I.
Gram
Omata-Disraely
BBE
7-14 dias
3-5 dias
3-5 dias
1 hora
3 horas
72 horas
Testes definitivos
TESTES PRESUNTIVOS
9 Colorao de Gram: morfologia celular 9 Morfologia colonial 9 Pigmentao natural ou luz UV
B. fragilis
F. nucleatum
TESTES DEFINITIVOS
9 Aspectos bioqumicos e Fisiolgicos 9 Imunolgicos 9 Cromatografia gasosa 9 Biologia molecular: sondas, PCR, sequenciamento 9 Susceptibilidade a drogas antimicrobianas
Cromatgrafo gasoso
CARACTERIZAO MICROBIANA
Caractersticas fenotpicas
CARACTERIZAO MOLECULAR
9 REA: anlise com enzima de restrio 9 Hibridizao usando sondas de DNA ou RNA 9 RFLP: polimorfismo tamanho fragmentos restrio 9 PFGE: PFGE eletroforese l t f gel l em campo pulsado l d 9 Polymerase Chain Reaction (PCR) 9 Sequenciamento
Mtodos Moleculares
9 Especificidade e sensibilidade 9 Rapidez e facilidade 9 Deteco e identificao simultneas 9 Custo 9 rea fsica
CARACTERIZAO MOLECULAR
Reao em cadeia da polimerase (PCR) (Dcada de 80)
9 Permite amplificao de pouco DNA para gerar grandes quantidades q antidades do mesmo;
similaridade fenotpica e genotpica; 9 Detecta organismos difceis de distinguir por cultivo tradicional ou no cultivveis.
B. fragilis
C. difficile
P gingivalis P. i i li
Colunas 1, 2, 3 e 5: cepas P13C, P60A, P60C e P60F (bft1 e bft3); coluna 4, cepa B. distasonis; colunas 6 e 7: cepa GAI 97124 e ATCC 43858 (bft2 e bft3); coluna 8: 50 bp. Multiplex-PCR.
H ainda muito que estudar no que se refere estrutura genmica de bactrias anaerbias, e certamente as tcnicas moleculares l l incluindo i l i d a clonagem l e sequenciamento devero contribuir para o esclarecimento das dvidas, ainda existentes nesse grupo microbiano
Consideraes finais
9 Grupo importante e predominante em ecossistemas humanos, animais e ambientais; 9 Propicia equilbrio e manuteno de ecossistemas: versatilidade tilid d metablica t bli e adaptabilidade d t bilid d fisiolgica; fi i l i 9 Participa p de infeces mistas de natureza endgena; g ; 9 No recebe a importncia clnica necessria; 9 Poucos so os grupos que estudam esses organismos: aspectos t fenotpicos f t i e genotpicos. t i