FITOKIMIA Mempelajari tentang senyawa kimia yang ada dialam atau disekitar kita.

Senyawa senyawa kimia yang terdapat dalam jaringan /mahluk hidup dapat berupa hasil metabolism primer maupun metabolit skunder. Metabolit primer : senyawa-senyawa yang mempunyai peranan penting didalam kehidupan . - Karbohidrat - Lemak - Asam Amino - Protein Senyawa-senyawa tersebut memegang peranan penting dalam proses metabolism utama yang mencirikan : - Apakah mahluk hidup tersebut masih mengadakan metabolism atau tidak? - Senyawa kimia tersebut dapat membantu proses primer dari mahluk hidup. Proses Primer : Pembentukan energy, pertukaran energy, pencernakan dan proses pembuangan. Metabolit skunder. - Terpenoid/steroid - Minyak atsiri - Fenil Propanoid - Flavonoid - Alkaloid Fungsi dari senyawa-senyawa tersebut belum jelas.

Apakah untuk kelestarian hidup/penangkis serangan dari mahluk hidup lainnya. Karena itu terjadi perkembanga penyelidikan. Untuk menyelidiki senyawa kimia yang ada didalam suatu jaringan mahluk hidup maka : 1. Surve Fitokimia - Mencari mahluk hidup/tumbuh2 an yang dapat digunakan untuk penelitian a. Survei hutan primer yaitu pencarian tumbuhan asli dari hutan yang belum terjamah manusia. b. Surve hutan skunder dilakukan didalam hutan yang sudah terjamah oleh manusia. 1. Bisa tanaman asli/ timggi 2. Tanaman obat 3. Getah batang 4. Bunga yang sangat bagus 5. Buah yang aneh 6. Akar yang memperlihatkan keanehan 7. Daun yang mempunyai bau yang spesifik. Seteleh diperoleh bahan maka dilakukan penelitian berdasarkan : - Skrining fitokimia - Berdasarkan informasi skunder/skrining etnopharmaceutical - Berdasarkan kemudahan pengambilan. - Kemotaksonomi Determinasi Tanaman. Setelah ditentukan tumbuhan yang akan diselidiki maka perlu di determinasi.

Tanaman perlu di determinasi oleh ahli taksonomi dan Herbarium (lembaga penyimpanan spesies tumbuhan baik kering maupun basah) - Untuk membantu kita dalam mengumpulkan informasi. Determinasi akan lebih mudah jika dilakukan terhadap keseluruhan tanaman. Setelah tahu tanaman yang akan diteliti, maka langsung menginjak ke tuntunan isolasi. Untuk mengetahui adanya kandungan metabolit skunder didalam suatu organisme maka dilakukan identifikasi pendahuluan. I.Uji skrining fitokimia (uji golongan) - Pemeriksanan kandungan metabolit skunder dari suatu tanaman /organism hidup antara lain. a. terpenaid/steroid b. Senyawa fenolik c. Saponin d. Tanin e. Kuinon f. Flavonoid g. Alkaloid Prosedur : 1. 4 gr sampel segar/potong halus 100 ml Erlenmeyer dan maserasi

dengan 25 ml etanol panas (diatas penangas air) kira-kira 15 menit. 2. Saring panas-panas dan biarkan seluruh etanol menguap kering.

3. Tambahkan kloroform + air (1:1)

masing-masing 5 ml, kocok dan

pindahkan ke dalam tabung reaksi ( biarkan sampai terbentuk 2 lapisan (Kloroform : Air). 4. Lapisan klorofor terpenoid, steroid. Lapisan air Flavonoid, saponin, senyawa fenolik. Uji fenolik. Sebagian lap. Air plat tetes + pereaksi FeCl3. Jika terbentuk warna biru/ungu maka senyawa fenolik (+). Uji Flavonoid/sianidin 1. Sebagian lap. Air

tabung reaksi

2. Masukkan 1 -2 butir logam Mg + beberapa tetes HCl (p) warna orange merah maka flavonoid (+). Kecuali untuk isoflavon. Uji Saponin. Sebagian lap. Air tabung reaksi kocok kuat-kuat terbentuk busa yang permanen (15 mnt), maka saponin (+). Uji triterpenoid / steroid. 1. Lapisan kloroform (norit). 2. pipet

Erlenmeyer / tabung reaksi yang sudah diberi arang

filtratnya

masukkan ke plate tetes (3 lubang) dan biarkan

sampai kering. 3. Setiap lubang + setetes asam asetat anhidrat dan asam sulfat (p). 4. Terbentuk warna biru/ungu steroid Terbentuk warna merah terpenoid

Uji Alkaloid. 1. Potong kecil 2-4 gr sampel segar, haluskan dalam lumpang + 10 ml kloroform. 2. Haluskan + 10 ml kloroform + amoniak 0,05 N, diaduk/digerus lagi 3. Saring tabung reaksi 4. Tambahkan 10 tetes as. Sulfat 2 N dan kocok perlahan-lahan biarkan dan terbentuk 2 lapisan (asam dan kloroform) 5. Pisahkan lap. Asam (3 tabung reaksi) + setetes pereaksi Meyer/

Dragendrof/ Wagner. 6. Positif alkaloid jika : a. Pereaksi Meyer kabut putih/endapan putih. b. Pereaksi Dragendrof endapan coklat c. Perekasi Wagner larutan coklat. II.Skrining etnopharmaceutical. Menggunakan informasi yang sudah dikumpulkan dan diturunkan dari generasi kegenerasi tentang kasiat atau sifat-sifat racun dari suatu bahan alam. Selanjutnya diteruskan secara tradisional dari mulut ke mulut, kemudian bahan alam tersebut dikenal sebagai herbal atau bahan obat (material medika) Peneliti etnofarmakologi terdiri dari seorang botani, ahli kimia bahan alam dan seorang farmakologis masing-massing bertanggung jawab atas keahliannya dan layak tidaknya tanaman obat dikembangkan lebih lanjut.

III. Kemotaksonomi. Suatu tanaman obat mempunyai klasifikasi secara taksonomi : Devisi, subdevisi, klas, ordo, family, genus dan spesies. Dari suatu tanaman yang mempunyai family yang sama, kemungkinan besar kandungan kimianya akan sama, hanya prosentasenya yang berbeda. IV. Bioassay atau uji aktivitas Deteksi Bioassay baik secara in vitro maupun in vivo merupakan penentu akan hasil yang diinginkan. Metode ini berkembang dengan pesat sekali setelah memanfaatkan perkembangan biologi molekuler dan makin banyak digunakan teknik bioassay dalam penelitian dan eksplorasi bahan alam. Teknik yang digunakan ada 2 : a. Skrining primer (umum/pendahuluan) b. Skrining sekunder (khusus). Skrining primer mempunyai cirri analisis yang cepat, mudah, dapat dipercaya, murah, peka, memerlukan bahan yang sedikit dan mampu mewakili berbagai aktivitas yang lebar Brine Schrimp Letality Test (BSLT) Skining Sekunder atau spesifik terfokus pada aktivitas tertentu, sedangkan penanganan lebih sulit dan biayanya lebih mahal. Skrining ini lebih diarahkan langsung pada target tertentu contohnya : Anti HIV dengan menggunakan virus HIV anti TBC dengan menggunakan microbacterium TB yang patogen.

Uji Pendahuluan Banyak digunakan untuk analisis : 1. Residu pestisida 2. Mikrotoksin 3. Polutan pada air sungai 4. AnastetikToksin dll. Uji BSLT. Bahan dan Alat. 1. Telur udang (Artemia salina Leach) 2. Garam laut (garam krosok) 3. Tangki kecil (akuarium) dibagi 2 bagian dengan pembatas berlubang diberi tutup 4. Mikropipet / syringe 0,01 ml, 0,05 ml, 0,1 ml, 0,5 ml, 5 ml. 5. Botol-botol kecil (10 ml) Cara : 1. Buatlah air laut buatan 3,8 gr garam krosok/lt air saring 2. Masukkan air laut dalam tengki yang berlubang, selanjutnya masukkan telur udang pada bagian yang gelap dan tutup, sedangkan bagian satunya diberi penerangan untuk menarik udang yang sudah menetas (2 hari). 3. Udang dibiarkan berumur 2 hari. 4. Siapkan botol-botol pengujian. 5. Uji aktivitas pada konsentrasi 1000, 100 dan 10 ppm (L/ml) dan setiap perlakuan 3 x pengulangan

6. Sediakan blangko 7. Masing-masing botol yang sudah berisi sampel dengan konsentrasi tertentu + 10 ekor larva udang 8. Setelah 24 jam dihitung larva yang masih hidup. 9. Tentukan LC50 dengan analisis probit. 10. Jika sampel sangat toksik perlu diencerkan lagi dibawah 10 ppm. LC50 : konsentrasi yang dapat mematikan 50% dari jumlah hewan uji yang diberi perlakuan ekstrak dalam periode waktu tertentu. Harga LC50 dapat ditentukan aktivitasnya berdasarkan penelitian Meyer LC50 : 0 30 ppm ekstrak sitotoksik 31-100 ppm cukup sitotoksik 100 2000 ppm kurang sitotoksik. Ada juga pengujian toksisitas langsung dengan ikan yang tahan hidup ditempat yang kotor (cetol atau Guppy) % Kematian : A B/C x 100 % LC50 : (50 Y1)(X2-X1)/ Y2-Y1 + X1.

Y1 : Batas bawah prosentase kematian hewan Y2 : Batas atas prosentase kematian hewan X1 : Batas bawah konsentrasi ekstrak X2 : Batas atas konsentrasi ekstrak

Untuk malakukan uji anti bakteri terlebih dahulu harus membuat : Persiapan Media bakteri :

- Setiap 1 lt NA (Nutrient Agar) mengandung 3 gr ekstrak daging, 3 gr pepton dan 15 gr agar. - Cara pembuatan media NA: 23 gr serbuk NA dilarutkan kedalam 1 lt aquades dan didihkan 1 menit larut. Sterilisasi dilakukan dengan autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit. - Setiap 1 lt NB (Nutrient Broth) mengandung 3 gr ekstrak daging dan 5 gr pepton. - Cara pembuatan media NB: 8 gr serbuk NB dilarutkan kedalam 1 lt aquades dan didihkan selama 1 menit larut. Sterilisasi dilakukan dengan autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit. Persiapan mikroba uji. - Setiap bakteri diinokulasikan dalam media pertumbuhan NA dan diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam. - Pada akhir periode inkubasi pada masing-masing bakteri uji dibaut suspensi persediaan dalam nutrient broth steril. selama

- Suspensi bakteri tersebut diukur kekeruhannya dengan spektrofotomater UV pada 580 nm dan transmitansinya diatur sehingga didapat T = 25 %. Dengan larutan NB sebagai Blangko.

1. Metode anti mikroba. a. Sampel (bag.tumbuhan yang terpilih) dilarutkan dalam pelarut yang sesuai. Ekstrak bisa dilakukan maserasi atau sokletasi, kemudian dipekatkan. b. Larutan stok dengan konsentrasi 1000 mg/ml (b/v) disiapkan. Selanjutnya akan diencerkan sesuai dengan kebutuhan peneliti. c. Kertas cakram dengan ukuran 1 cm dipersiapkan. d. Suspensi bakteri sebanyak 50 L dicampurkan kedalam 10 mL NA dicawan petri. e. Kertas cakram diletakkan pada media agar dan ditetesi ekstrak uji 10 % b/v sebanyak 10 L. Atau kertas cakram dicelupkan pada ekstrak uji. f. Prainkubasi dilakukan selama 30 menit pada suhu kamar, selanjutnya diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam. g. Diameter hambat pertumbuhan mikroba uji (zon bening) untuk tiap

ekstrak diukur dan pelarut sebagai pembanding. h. Zona bening (daerah yang mematikan/menghambat bakteri) dihitung KHM dan KBM. Daftar mikroba yang bisa digunakan untuk uji : Contoh : Gram + : 1. Staphylococcus aureus : 2. Bacillus cereus Gram : 1. Escericia coli : 2. Pseudomonas aeuginosa

Uji aktifitas anti mikroba dari ekstrak tumbuhan dapat dilakukan dengan 3 metode

1. Metode difusi 2. Metode pengenceran 3. Metode bioautogrfi Metode Pengenceran. 1. Sampel yang akan diuji dicampur dengan dengan medium yang cocok yang sebelumnya diinokulasi denggan mikroba uji. 2. Setelah diinkubasi pertumbuhan mikroba dapat ditentukan dengan cara visual atau perbandingan turbidimetri dari kultur uji dengan kultur control. 3. Jika tetap bening berarti tidak ada pertumbuhan kuman. Metode Bioautografi. 1. Untuk menentukan tempat atau posisi senyawa yang mempunyai aktivitas mikroba pada kromatogram dengan cara : 2. Memindahkan senyawa uji dari kromatogram KLT (kertas) ke medium agar yang sudah diinokulasi dengan mikroba uji. 3. Daerah zona dapat dilihat. a. Ekstrak yang menghambat pertumbuhan bakteri dikenal sebagai bakteriostatik. b. Sedangkan yang membunuh bakteri disebut bakteriosida. Suatu bahan /ekstrak dapat disebut bakteriostatik maupun bakteriosida tergantung pada dosisnya. 1. Dosis kecil menghambat 2. Dosis besar membunuh

3. Aktivitas bisa meningkat dari bakteriostatik menjadi bakteriosida bila konsentrasi dinaikkan melebihi konsentrasi hambat minimum. Mekanisme kerja dari Antibiotik. 1. Bekerja mengganggu metabolism kuman 2. Menghambat sintesis dari dinding sel yang mengakibatkan plasma sel dapat pecah, sehingga cairan sel dapat keluar dan kuman mati. 3. Merusak keutuhan dari membrane sel kuman 4. Menghambat sintesis protein dari sel kuman atau merusak asam nukleat dari sel kuman.