Manual de Laboratorio de Micologia

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE QUMICO FARMACUTICO BILOGO.
Laboratorio de Micologa.
Alumna:
Ana Lizeth Carbajal Capitaine
Catedrtico:
Pablo Becerra Lara.
Manual de Laboratorio de Micologa.
Xalapa de Enrquez, Ver; a 16 DE NOVIEMBRE DEL 2012
NDICE.
LABORATORIO DE MICOLOGIA. UNIVERSIAD VERACRUZANA FACULTAD DE Q.F.B.
Prctica 1. Examen en fresco 3 Prctica 2. Tincin de hongos 20 Prctica 3. Mtodo Burri.32 Prctica 4. Cultivo hongos.40 de de
Prctica 5. Microcultivo 57 Prctica 6. Cndida.65 Gnero
Prctica 7. Gnero Aspergillus 77 Prctica Dermatofitos...85 Prctica 9. Micolgica.93 8.
Inmunologa
Prctica 10. Micosis Profundas 108 Historia 110 Clnica
PABLO BECERRA LARA.
PRACTICA 1. EXAMEN EN FRESCO.

OBJETIVO: Que el alumno realice tinciones comunes de hongos y se entere de los mtodos especiales que existen para tinciones de los mismos. GENERALIDADES: Existen sobre la tierra, aproximadamente, 2 millones de seres vivos, y entre 80, 000 y 100, 000 constituyen el grupo formado por los hongos. La mayora de ellos son tan pequeos que pasan inadvertidos, pero poseen una capacidad extraordinaria de vivir a expensas de los otros seres; en algunos casos forman verdaderas simbiosis y en otros los parasitan definitivamente. El hombre no est excluido del ataque de los hongos. Estos lo perjudican directamente cuando le causan una enfermedad e indirectamente cuando atacan plantas tiles o cultivos, objetos o artefactos costosos, arruinndolos definitivamente en muchos casos. La agricultura se ve seriamente comprometida si no se combaten las micosis de las plantas, como el tizn del trigo y las papas, o no se impide la proliferacin de diferentes tipos de hongos en sitios de almacenamiento por ejemplo silos trigueros, etc. Muchos productos manufacturados, tales como telas, cueros, muebles y productos alimenticios, son atacados por los hongos que proliferan rpidamente, inutilizndolos parcial o totalmente. No existen productos biolgicos y a veces minerales que no sean invadidos por los hongos. Quin no ha observado soluciones salinas en los laboratorios que han sido invadidas por mohos? Especialmente las soluciones cidas presentan crecimientos fngicos en su superficie, no as las alcalinas.
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La ganadera tambin tiene problemas de micosis que pueden ser superficiales como las tias o profundas como la histoplasmosis. Tambin los animales faenados presentan buen sustrato para los hongos; ya que existe un extenso captulo en la literatura micolgica dedicado a las micosis de las carnes. El hombre se ve afectado por los hongos cuando estos le provocan enfermedades que pueden ser leves como las dermatomicosis o graves como las paracoccidioidomicosis. Hasta ahora hemos considerado el aspecto negativo de la actividad fngica respecto del hombre, pero este tambin sabe utilizarla para su provecho como en la industria de los medicamentos y ciertos alimentos. Quin no conoce el extraordinario aporte a la medicina con el advenimiento de los antibiticos? Quin no gusta de un buen vino o cerveza o un sabroso queso Roquefort o Camemebert? Caractersticas Generales de los Hongos Todos son hetertrofos (quimioorganotrficos) por lo que tienen que alimentarse de materia orgnica preformada que utilizan como fuente de energa y de carbono. Son eucariotas, es decir, presentan un ncleo diferenciado con membrana bien organizada. Tiene una pared celular formada por quitina; esta pared es rgida, por lo que no pueden fagocitar alimentos sino que absorben nutrientes simples y solubles que obtienen al desintegrar polmeros mediante enzimas extracelulares llamadas despolimerasas. La estructura fngica consta de un complejo llamado talo o micelio (fig.1), que a su vez est constituido por mltiples filamentos o hifas (hyphomycetes o mohos) o, menos a menudo, por estructuras unicelulares o levaduras (blastomycetes); estas ltimas se reproducen por gemacin (Saccharomyces cerevisiae) y muy rara vez por fisin binaria ( Schizosaccharomyces pombe), tambin son una excepcin los Chytriomycetes, formados por clulas redondas grandes con rizoides, y los mohos mucilaginosos, que carecen de pared celular y pueden alimentarse por fagocitosis (Fig. 1).
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Fig 1. Estructura del talo o micelio de mohos y levaduras y de dos formas poco frecuentes. Talo Est constituido por dos partes: a) talo vegetativo que asegura el desarrollo, nutricin, fijacin y edificacin de la parte reproductora y b) talo reproductor donde se forman los rganos de reproduccin. Puede estar representado por hifas, levaduras o pseudohifas (blastosporas que no se separan) (fig. 2). Fig. 2. Fase micelial y de levadura con talo reproductor y vegetativo. Si el talo est disociado, se producen colonias de levaduras de crecimiento rpido, consistencia cremosa y que se resiembra como las bacterias en puntos o estras. Si el talo es filamentoso da lugar a colonias de mohos de crecimiento centrfugo, con filamentos areos entremezclados, mas o menos largos, o agrupados de manera compacta, con superficie glabra recubierta de vello fino, el crecimiento es lento salvo en hongos oportunistas.
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Los hongos que tienen una fase parasitaria levaduriforme y una saproftica micelial, y que en respuesta a cambios ambientales pasan de una fase de 20 a 25C a la fase de levadura a 37C o viceversa, se llaman dimorfos (fig. 1). Modificaciones del Talo Los hongos presentan diferencia en su forma y constitucin, importantes para diferenciarlos: dilataciones o vesculas; rganos de resistencia o clamidosporas; rganos de fijacin como rizoides y apressorium, hifas en espiral o tirabuzn; rganos nodulares formados por hifas torcidas en forma de nudo; hifas en raqueta, con un ensanchamiento en un extremo; candelabros fvicos (hifas en cuerno o asta) que estan dados por varias ramificaciones al final de una hifa; hifas pectinadas o en forma de peine; hifas peridiales, que son ensanchadas y multiseptadas con terminacin en espiral (fig. 3) y acumulacin de muchas hifas (esclerotre o esclerocio), cuyo objetivo es almacenar sustancias de reserva. Otras agregaciones miceliales son los coremios y sinemas (con rganos de fructificacin y sin ellos, respectivamente) o estromas redondeados frtiles y asexuados como los picnidios, o sexuados como el apotecio (aspecto de copa), peritecio y cleistotecio (con ostiolo y sin l respectivamente.)
Fig. 3. Modificaciones microscpicas del talo Biologa Para comprender los mecanismos biolgicos de adaptacin y de invasin de los hongos cuando producen una enfermedad al hombre, es necesario describir someramente los fundamentos de la biologa de los mismos. PABLO BECERRA LARA. 6
A los hongos se les considera como plantas por que poseen membrana celulsica pero carecen de la funcin cloroflica que es la condicin fundamental para ser incluidas dentro de los vegetales. Su nutricin es parecida a la de los animales, siendo heterotrficos como ellos, se reproducen mediante esporos y por eso se parecen a ciertos vegetales autotrficos como los helechos. Por lo tanto, participan de las caractersticas de los vegetales y de los animales. Por su carcter de heterotrficos se ven obligados a alimentarse de sustancias orgnicas preformadas, viviendo muchos de ellos como saprofitos en el suelo, sobre las plantas, en aguas, etc., son los principales mineralizadores de sustancias orgnicas. Otros son parsitos de plantas y animales, entre ellos el hombre; su adaptacin al parasitismo obligatorio es la causa de muchas enfermedades leves o graves de dichos seres. Algunos pueden vivir como parsitos y como saprofitos; entre ellos estn algunos hongos que causan enfermedades al hombre por ejemplo los Dermatofitos, que han sido aislados del suelo en todas partes del mundo. Desarrollo Un esporo o un trozo de micelio germina y origina una prolongacin que va creciendo apicalmente y forma ramificaciones. Este crecimiento se denomina micelio o cuerpo del hongo. Cada clula de micelio consta de una pared, que encierra protoplasma y uno o varios ncleos (fig. 4). Dicho micelio mide algunos micrones, de 5 a 20 de dimetro. En cada una de las clulas que constituyen el micelio se producen enzimas que difunden hacia el medio externo simplificando el sustrato sobre el cual se encuentra el hongo y estas sustancias simplificadas difunden hacia al anterior de la clula donde participan en los procesos metablicos del hongo.
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Fig. 4. Esquema estructural de los hongos La clula fngica tiene las caractersticas tpicas de las eucariotas: un ncleo con cromosoma, una membrana nuclear y organelos citoplasmticos, como las mitocondrias y el retculo endoplsmico (fig. 4). Normalmente, los hongos se encuentran en estado haploide aunque pueden formarse ncleos diploides por fusin nuclear, durante el proceso de la reproduccin sexual. La estructura de la clula consiste en la pared celular (rgida) y la membrana citoplsmica, en la que predomina el ergosterol. Por el contrario, en las membranas de los mamferos el esteroide predominante es el colesterol. La estructura qumica y antignica de la pared celular es muy distinta a la de las clulas bacterianas ya que no contiene pptidoglucano ni cidos teicoicos derivados del glicerol ni del ribitol, ni tampoco lipopolisacridos. En su lugar se encuentra pptidomanano, glucano y quitina, asociados, muy estrechamente entre s y a las protenas estructurales.
Reproduccin Existen hongos unicelulares como las levaduras y pluricelulares como la gran mayora, por ejemplo el moho del pan. A partir de este micelio o talo que es el cuerpo del hongo (que puede ser uni o pluricelular) se producen los rganos reproductivos que pueden ser muy rudimentarios o ms complejos segn la especie. Lgicamente un hongo unicelular se reproducir mediante mecanismos simples, tales como la divisin directa por brotacin o esquizogonia, mientras un Mucor (pluricelular) originar un aparato reproductor especializado denominado esporangio en el cual se formarn los esporos asexuados.
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Esporas internas y externas y sus clulas productoras
Micelio continuo y fructificacin asexuada de Phycomycotes con esporangiforos, esporangios y esporangiosporos
ESQUEMAS DE REPRODUCCIN SEXUADA
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Reproduccin sexuada de una levadura perfecta con formacin de un asco con ascosporos en su interior. A, levaduras de polaridad opuesta. B, emisin de mameln copulativo. C, formacin del tubo copulativo. D, plasmogamia y cariogamia. E, mitosis y formacin de dos ncleos sexuados. F, formacin de cuatro ncleos. G, formacin de cuatro ascosporos.
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Existen hongos que en determinado momento de su ciclo biolgico se reproducen sexuadamente mediante la conjuncin de micelios de distinta polaridad (plus + y minus -) o mediante verdaderos gametos diferenciados, tales como el anteridio y el oogonio, dando lugar a la formacin de huevos o cigotos o esporos asexuados. Como se ha enunciado anteriormente, la actividad biolgica y la morfologa que caracteriza a un hongo a lo largo de su ciclo biolgico, son las bases sobre las cuales se asienta el reconocimiento o identificacin de la especie. REACTIVOS: Solucin aclarante : a. KOH (del 10 al 30%) b. NaOH (del 10 al 30%) Funcin: Con la utilizacin de la solucin aclarante las protenas, grasas y muchos polisacridos del sustrato son solubilizados (hidrolizados) y los tejidos aparecen ptimamente claros. Las paredes celulares de la mayor parte de los hongos permanecen intactas a causa de la resistencia a los lcalis de los glucanos. Material Portaobjetos Cubreobjetos Asa de platino o micromel Porta asa Equipo Mechero bunsen Microscopio Muestra biolgica Cualquier alimento u objeto que tenga hongos
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TCNICA: 1. Flamear y enfriar el asa 2. Poner una gota de solucin aclarante sobre un portaobjetos 3. Tomar una asada de su muestra biolgica y depositarla sobre la gota de solucin aclarante 4. Cubrir la preparacin con un cubreobjetos 5. Flamear el asa 6. Observar al microscopio la preparacin con seco dbil y seco fuerte 7. Anotar sus observaciones macroscpicas y microscpicas 8. De la misma forma montar las preparaciones necesarias hasta tener 50 observaciones. NOTA. No olvide limpiar su mesa de trabajo antes y despus de la prctica, as como tambin su microscopio y no depositar la basura en los lavabos.
OBSERVACIONES GENERALES:
Fruta y verdura contaminada con hongos Toma de muestra con asa recta de la fruta con hongo en cubre objetos con un gota de KOH
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Fusarium encontrado en tomate Alternara 40 40x x
Talo vegetativo encontrado en moho de tomate con esporas
Hifas de moho de pepino
CONCLUSIN: En la realizacin de los exmenes en fresco de los hongos presentes en las frutas y verduras, se observaron especies como fusaruim un hongo filamentoso, presentaba macroconidios hialinos, septados con tres tabiques en un muestra de tomate contaminado tambin se pudo observar en la misma muestra del tomate el hongo alternara causante de la mayora de las alergias por hongos presentes en nuestro hogar. Como se aprecia en las imgenes se encontraron talos vegetativos e hifas de los hongos esto ocasionado por romper el hongo al momento de tomarlo para su exanimacin. La contaminacin por hongos en frutas nos permite darnos cuenta de la gran diversidad y variedad de hongos presentes en nuestro ambiente, no es necesario estar en un laboratorio para tener contacto directo con ellos, basta con una simple contaminacin en una fruta, en un alimento o incluso en la pared de nuestras viviendas, dejndonos una enseanza de prevencin para evitar patologas o alergias causadas por estar tanto tiempo expuestos con ellos.
GLOSARIO DE FIGURAS:
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Talo unicelular: levaduras, candida, etc.
Talo plurcelular: conjunto de filamentos o hifas que se desarrolla a partir de un esporo y que constituye el cuerpo del hongo. Puede ser filamento continuo o tabicado.
Hifa: cada filamento que constituye el talo pluricelular o micelio Micelio: sinnimo de talo Pseudomicelio: crecimiento que caracteriza a ciertas especies de hongos levaduriformes cuando se desarrollan en condiciones determinadas.
Esporos: rganos de reproduccin del hongo: pieden der sexuados o asexuados.
Endoesporos: cuando se originan reproduccin, ejemplo: esporangio.
dentro
de
un
rgano
de
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Esporangio: cuerpo de fructificacin del micelio reproductivo de los Phycomycetes en el cual se originan esporos asexuados internos: endosporos.
Exoesporos: rganos de reproduccin llamados tambin conidias, que se originan fuera de los cuerpos de fructificacin o directamente en el micelio con o sin conidiforos.
Conidiforos. Parte del micelio de reproduccin especializado para producir u originar las conidias. Conidias: exoesporos Microconidias: exoesporos pequeos de 3 a 6 micras, de forma variada. Macroconidias: exoesporos grandes tabicados de 50 a 80 micras. Tamao comparativo entre macro y microconidias
Micelio en espiral o espirales: hifas enrolladas como si fuera un resorte.
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Macroconidia: desarrollo fngico que se realiza para estudiar el aspecto morfolgico macroscpico y tambin para observar la posible produccin de un pigmento. Ascosporos: esporos sexuados que se originan en un cuerpo de fructificain denominado asco que caracteriza a los Ascomycetes.
Blastosporos: gemacin.
esporos
asexuados
originados
por
brotacin
Artrosporos: esporos asexuados originados por fragmentos de un talo o una hifa.
Clamidosporos: formas de resistencia que caracterizan a ciertos hongos entre los cuales figura Candida albicans.
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BIBLIOGRAFA:
Micologa Mdica, R. Arenas; Ed. Interamericana Mc Graw Hill. Diagnstico Micolgico, Amadeo DAlessandro; Ed. Panamericana Microbiologa Mdica; J. C. Sherris; Ed. Doyma. Tratado de Micologa, B. D. Davis, R. Bulbecco, H. N. Eisen, H. S. Ginisberg; Ed. Salvat.
Xalapa, Ver., a
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Vo. Bo.
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PRACTICA 2. TINCIN DE HONGOS.

OBJETIVO: Que el alumno realice tinciones comunes de hongos y se entere de los mtodos especiales que existen para tinciones de los mismos. GENERALIDADES: PABLO BECERRA LARA. 18
COLORANTES. Los colorantes han sido utilizados desde los tiempos ms remotos, emplendose como tales diversas materias coloreadas procedentes de los reinos vegetal y animal, as como distintos minerales; pero desde mediados del siglo XIX, se han obtenido colorantes derivados del alquitrn de hulla, habiendo desplazado casi totalmente a las materias colorantes naturales. El uso de los colorantes ha contribuido notablemente al progreso de la investigacin y las tcnicas de coloracin se han ido perfeccionando a tal grado que hoy en da, adems del estudio meramente morfolgico de las estructuras biolgicas, permite un examen ms til de la composicin qumica de las mismas, as como el anlisis de algunos importantes procesos funcionales de las clulas; todo esto ha sido posible gracias al conocimiento de la estructura qumica de las sustancias colorantes y de la afinidad de estas con determinados sustratos. El estudio morfolgico, microscpico, de los tejidos naturales y de las clulas que los constituyen, necesita casi siempre de la coloracin, pues la observacin de las imgenes por difraccin que dan las preparaciones incoloras, sobre todo cuando, como ocurre en aquellas, que tienen sus partes constitutivas el mismo ndice de refraccin. Sea por unin de grupos atmicos de afinidad qumica manifiesta, sea por transposicin de ciertos tomos que originan transformaciones tautmeras, el hecho es que una coloracin se verifica cuando la sustancia en cuestin absorbe tal intensidad, que no se decolora ya luego por un lavado con el disolvente que sirvi para preparar el reactivo tintreo. A veces acta el colorante directamente, otras, frecuentemente, precisan en cambio la accin previa o simultnea de otra sustancia llamada mordiente, que facilita la tincin de la materia en cuestin, formando con el colorante una combinacin estable que se llama laca. Hay partidarios de una teora qumica de la coloracin, para los cuales se produce una verdadera sal por combinacin del colorante con las sustancias que se tien; otros, creen en una teora fsica, y no admiten en el proceso ms que una fijacin mecnica de las molculas del colorante, como consecuencia de una serie de fenmenos de adsorcin. Y, entre ambas concepciones, extremas y radicales, va tomando cuerpo una opinin, ya sustentada por UIT, y razonada por los investigadores de Vant Hoff, en la que se admite que en el proceso de una coloracin existe una seleccin slida entre las sustancia por teir y la materia colorante, es decir, que el color y las propiedades tintreas estn relacionadas con la presencia, en la
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molcula, de dos agrupaciones caractersticas llamadas cromforo y auxcromo. Los primeros confieren a la molcula de la sustancia que los contienen, llamada cromgeno, la capacidad real o potencial de mostrarse coloreada, pues la presencia de un cromgeno provoca un efecto batocromo que no conduce siempre a la aparicin de un color. El cromforo aunque sea coloreado, no es capaz de teir; adquiere esta propiedad cuando se introducen en la molcula los grupos auxcromos. Por si solos los auxcromos no estn coloreados, pero cuando se hallan en presencia de cromforos provocan efecto batocrmico que convierten a la sustancia coloreada en colorante. Modernamente se ha podido comprobar que la adsorcin de la luz de un determinado color por parte de un compuesto qumico, y la cuanta de esta absorcin, estn ntimamente ligadas con el estado en que se encuentran los electrones que alcanzan entre s los tomos que componen las molculas. Los grupos cromforos poseen la capacidad de absorber la luz visible y los auxcromos son capaces de acentuar el color. De acuerdo con esta exposicin, se puede considerar como cromforos a grupos que por s solos resultan incoloros, la nica condicin es que su absorcin de luz se desplace hacia el visible mediante la adicin de un grupo intensificador conveniente. Los colorantes atendiendo a su afinidad en la funcin tintrea pueden clasificar en bsicos, cidos, neutros e indiferentes, como se muestra en la tabla #1, que contiene los principales colorantes usados en las tcnicas microscpicas. Los colorantes bsicos pueden clasificarse como sales cuya base posee color y el cido es incoloro; en los colorantes cidos ocurre al contrario, es la parte cida la coloreada. Los colorantes bsicos poseen afinidad por el ncleo de las clulas, y por eso fueron llamados tambin nucleares. Los colorantes cidos, en cambio, se llaman citoplsmicos y se fijan preferentemente sobre el citoplasma. En nmero menor, existen unos colorantes llamados neutros, en los cuales la base y el cido son coloreados; estos colorantes, tienen gran importancia en hematologa y entran en la categora de los colorantes compuestos. Finalmente se ha constituido el grupo de los colorantes indiferentes, que no son cidos ni bases ni poseen grupos capaces de
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formar sales; son insolubles en agua y hay que usarlos en solucin alcohlica o etrea. Tabla #1. Clasificacin de los colorantes en base a su funcin tintrea. Tionina. Cristal violeta. Violeta de genciana. Violeta de cresil. Violeta de metilo. Azul de toluidina. Azul de metileno. Azur de metileno. Bsicos. Verde brillante. Verde de metileno. Verde malaquita. Azul Nilo. Azul de cresil. Fascina bsica. Safranina. Rojo neutro. Vesubina (Pardo bismarck) cido pcrico. Amarillo victoria. cidos. Amarillo naftol. Amarillo martines. Eosina. Fascina cida. Neutros. Picrato azul de metileno. Eosinato de azul de metileno. Eosinato de azur de metileno. Picrato de verde de metilo. Verde Diazina. Indiferentes. Sudn III Rojo escarlata. Por lo que respecta a procedimientos de tincin, tenemos tinciones simples, negativas y diferenciales. En la tcnica de tincin simple, el teido de las bacterias se lleva a cabo aplicando exclusivamente una solucin colorante. Los colorantes ms comnmente usados son la fucsina fenicada, azul de metileno, violeta de genciana o cristal violeta y la safranina. La tincin en negativo es otro procedimiento que permite observar las clulas, no coloreadas destacndose bien perceptibles sobre el fondo de la extensin bien teida en negro. La ventaja que
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presenta este procedimiento para el estudio de la morfologa es que las clulas no reciben tratamiento fsico o qumico enrgico. Es muy apropiado para los organismos capsulados. Los procedimientos de coloracin que ponen de manifiesto diferencias entre las clulas bacterianas o entre partes de una misma clula, se denominan tcnicas de tincin diferencial. Son algo ms complicadas que las de tincin simple por cuanto se expone la preparacin a ms de una solucin colorante, o se emplean ciertos reactivos complementarios para la tincin. Las dos coloraciones ms importantes son la de Gram y la de grmenes cido resistentes. La tincin de Gram se basa en los constituyentes y permeabilidad de las paredes celulares de las bacterias para retener o no el cristal violeta, clasificndolas en gram negativas y gram positivas. Se inicia con la aplicacin de un colorante bsico, posteriormente se aplica una solucin de lugol. En este momento, todas las bacterias se tien de morado. A continuacin, se trata con un agente decolorante (alcohol-acetona) y por ltimo con el colorante de contraste; las clulas gram positivas retienen el colorante cristal violeta-yodo, permaneciendo color morado; por otra parte, las clulas gram negativas previamente decoloradas toman el colorante de contraste; esto se basa en el elevado contenido graso de las paredes celulares de los organismo gram negativos. Las muestras experimentales muestran que, durante la prctica del procedimiento, el tratamiento alcohlico extrae las grasas aumentando la permeabilidad o la porosidad de la pared celular de los microbios gram negativos. El complejo cristal violeta-yodo se extrae as por el organismo gram negativo se decolora. Las paredes celulares de las bacterias gram positivas, a causa de su diferente composicin, se deshidratan por el alcohol, el tamao de los poros disminuye, se reduce la permeabilidad y el complejo cristal violetayodo no se extrae. Existen muchos mtodos para teir los hongos, algunos de los cuales son:
Hematoxilina. La hematoxilina tie prcticamente todos los hongos; pero en muchos casos, el contraste en los cortes no es muy satisfactorio. Tincin de Gram.
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Antes del descubrimiento de otros mtodos, el de Gram era el ms difundido. Los cuerpos centrales de los hongos encapsulados como Criptococos y blastomices son fuertemente gram positivos. Las cpsulas de casi todos los hongos son gram positivos, pero pierden fcilmente su color si se utiliza acetona. El mtodo de Gram permite encontrar casi todos los hongos en los tejidos (cndida, aspergilio, criptococos, histoplasmas, blastomices, actinomices.) Los micelios son gram positivos; las esporas son gram negativas y tambin gram negativos es Actinobacillus, Actinomycetem Comitans, que los acompaan con frecuencia. Tincin de Giemsa. La solucin de Giemsa es excelente para Histoplasma capsulatum, y tambin puede emplearse para Criptococcus. Tincin de Ziehl-Neelsen. Tie algunas especies de Nocardia y microorganismos acidorresistentes, como N. Asteroides y N. Brasillensis. El micelio de A. Israel no es cido resistente, pero las esporas resisten a la decoloracin con cido al 1% hasta durante 30 segundos en la tcnica de ziehl-Neelsen. Metacromasia de las cpsulas. Las cpsulas de Criptococcus Neoformans y de los Blastomices muestran tinciones metacromticas (de rosa a violeta) con azul de toluidina (o tionina.) Tinciones especiales. Las cpsulas y las paredes de los hongos son ricas en polisacridos, lo que permite aplicar varios mtodos muy elegantes. Tcnica PAS de Hotchkiss-McManus. Es utilizada para cortes y frotis, por ejemplo de raspado de piel. Se puede emplear como colorante de contraste hematoxilina de Harris o PTAH de Mallory, durante 30 segundos a un minuto. N. B. Actinomyces y Nocardia se tien mal o no se tien con las tcnicas de PAS, de Gridley y de Grocott; es preferible estudiarlos por el mtodo de Gram. Tcnica de Bauer-Feulgen.
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La gran cantidad de grupos aldehdo en las paredes de quitina celulosa de los hongos permite aplicarles cido crmico que destruye grupos aldehidgenos de muchos otros elementos de manera que disminuye la intensidad de fondo al aplicar la tincin de Schiff. Azul anciano. El azul anciano tiene gran afinidad por los carbohidratos cidos, y se puede aprovechar para teir las cpsulas de las bacterias y hongos; tambin puede combinarse con la tcnica de PAS. Tincin de Gridley para los hongos. Es una modificacin del mtodo del cido crmico-Schiff; en realidad constituye una combinacin del mtodo de Bauer-Schiff, que tie los conidios y esporas y del aldehdo-fucsina de Gomori, que tie las hifas. Es excelente para estudiar las paredes del hongo. S pueden emplear cortes en parafina de cualquier tejido bien fijado. TCNICAS, TINCIONES Y FRMULAS. I. Reactivos: 1.- KOH al 10%: KOH 10 grs. Agua destilada 90 ml. Uso: como solucin aclarante para exmenes directos. Se puede preparar al 20%. 2.- KOH glicerinado: KOH 10 grs. Glicerina 10 ml, agua destilada 80 ml. Uso como solucin aclarante para exmenes directos; la ventaja de esta solucin radica en que se evapora en menor proporcin. 3.- NaOH-AzurParker: NaOH al 10% 90 ml. Tinta azul de Parker 10 ml. Uso: Como colorante para exmenes directos de pitiriasis versicolor e infecciones por Pytirosporum sp. 4.- Lugol: KI 1 gr. Cristales de yodo (1) 1.5 grs. Agua 100 ml. Uso: solucin de contraste, para exmenes en fresco de exudados y secreciones. Colorantes: 5.- Azul algodn actico: Azul de algodn 0.5 grs. cido actico 3 ml. Agua destilada 97 ml. Uso: Como colorante de microcultivos. 6.- Azul de lacto-fenol: Azul de algodn (de anilina) 0.05 grs. Glicerol 40 ml. Fenol (cristales) 20 grs. cido lctico 20 ml. Agua destilada 20 ml. REACTIVOS Y COLORANTES.
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Preparacin: Disolver el fenol en cido lctico, posteriormente se agrega agua y glicerol, calentando ligeramente; por ltimo se adiciona el azul de algodn. Uso: Para exmenes directos de las cepas. 7.- Azul de metileno: Azul de metileno 0.3 grs. Alcohol etlico (95%) 30 ml. Agua destilada 70 ml. Uso: como colorante de contraste en tinciones de AAR, o para exmenes directos de cepas. 8.- Azul de tripano: azul de tripano 1 g. Agua destilada 100 ml. Uso: colorante de microcultivos. 9.- Alcohol cido (modificado Ziehl-Neelsen): cido sulfrico 0.5 ml. Agua destilada 99.5 ml. Uso: para tincin de cido alcohol resistencia de actinomicetes (Nocardia) 10.- Solucin de cristal violeta: Solucin A :Cristal violeta 2 g. Alcohol etlico 95% 20 ml. Solucin B: oxalato de amonio 0.9 g. Agua destilada 80 ml. Preparacin: mezclar solucin A y B y dejar reposar por 24 horas; filtrar Uso: Colorante de Gram. 11.- Eritrocina: eritrosina 1 g. Alcohol etlico 1 ml. Agua destilada 98 ml. Preparacin: disolver el colorante en alcohol etlico, posteriormente agregar el agua destilada. Uso: como colorante de microcultivos. 12.- Fucsina bsica o carbn fucsina: Solucin A: solucin bsica 4 g. Alcohol etlico 20 ml. Solucin B: fenol (cristales) 8 ml. Agua destilada 100 ml. Preparacin: obtenga solucin A, deje reposar 24 horas, posteriormente agregue solucin B y filtre en papel. Uso: para tincin de AAR de microbacterias y Nocardia. 13.- Solucin de Giemsa: Giemsa 1 g. Glicerol 66 ml. Metanol absoluto 66 ml. Preparacin: disolver el colorante en glicerol, calentar durante una hora a 60C, posteriormente agregar el metanol y filtrar. Uso: para diversas tinciones. 14.- Safranina: Solucin A: safranina 0.25 g. Etanol 100 ml. Solucin B: 10 ml de solucin A. Agua destilada 90 ml. Uso: como colorante de Gram. 15. - Colorante de Wright: colorante de Wright 0.30 g. Glicerol 3 ml. Metanol absoluto 97 ml. Preparacin: mezclar el colorante en glicerol, y posteriormente agregar el metanol. Uso: para tinciones diversas.
II TCNICAS Y TINCIONES.
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1.- Examen directo con cinta adhesiva o Scotch

Esterilizar a la flama el asa micolgica y dejar enfriar. Pegar al asa micolgica un fragmento de cinta adhesiva transparente. Introducir el asa con la cinta en tubos y cajas Petri, hasta tocar la colonia a investigar por la parte adhesiva de la cinta. Desprender el fragmento de la cinta adhesiva, con la ayuda de una aguja de diseccin, sobre un portaobjetos con una gota de colorante (azul de lactofeno o lugol) Colocar una gota del mismo colorante sobre la cinta y posteriormente poner un cubreobjetos. Si se quiere sellar la preparacin, se coloca alrededor del cubreobjetos barniz de uas.
2.- Siembra de microcultivos. Material: cajas Petri estriles con 2 portaobjetos y tringulo de vidrio cada uno; medio de cultivo en caja Petri (Saboraud. PZ o papa dextrosa agar) Fragmentar con la ayuda de un bistur el medio de cultivo en cuadros de aproximadamente 1.5 X 1.5 cm. Colocar 1 o 2 cubos del medio fragmentado sobre uno de los portaobjetos. Sembrar el hongo a estudiar por los cuatro lados del medio de cultivo. Colocar el segundo portaobjetos sobre el medio de cultivo. Agregar a la caja Petri de 10 a 15 ml de agua glicerinada estril (5%). Sellar la caja Petri con cinta adhesiva. Incubar dependiendo el hongo a estudiar. Realizar tincin especial para el microcultivo. 3.- Tincin de microcultivos con azul de algodn actico.

Retirar el exceso de agar con la ayuda de un bistur. Fijar la preparacin con metanol hasta evaporacin. Teir con azul de algodn cido por 15 min. Lavar ligeramente con agua destilada. Lavado con alcohol al 96%. Lavado con alcohol absoluto. Bao de xilol durante 5 minutos. Montar la laminilla con blsamo de Canad.
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4.- Tincin de microcultivos con eritrocina.

Retirar el exceso de agar con ayuda de un bistur. Fijar la preparacin con etanol hasta evaporacin. Teir con eritrosina durante 10 a 15 minutos en emisiones de bao de agua o por calentamiento directo a la flama. Retirar el exceso de colorante con etanol. Bao en acetona durante 10 minutos. Bao en xilol-acetona (1:2) durante 10 minutos. Bao en xilol durante 10 minutos. Montar la laminilla con blsamo de Canad.
5.- Tincin de Ziehl-Neelsen (para actinomicetos).

Fijar el frotis directamente a la llama Teir con fucsina bsica en vapores de agua durante 10 minutos Decolorar con alcohol cido modificado (formula 1-9) Lavar ligeramente con agua destilada Teir de contraste con azul de metileno durante 5 minutos Lavar ligeramente con agua y dejar secar
6.- Tincin de Gram. Fijar el frotis directamente a la llama Teir con cristal violeta durante 1 minuto Decolorar con alcohol-cetona Lavar ligeramente con agua destilada Cubrir la preparacin con lugol durante 1 minuto Lavar ligeramente con agua Teir de contraste con safranina durante 1 minuto Lavar ligeramente con agua y dejar secar 7.- Tincin de tinta china para Cryptococcus sp. Fijar el frotis directamente a la planta Teir con fucsina bsica durante un minuto Lavar ligeramente con agua destilada Hacer un frontis con tinta china o nigrosina (como frotis de sangre) Dejar secar COLORACIN DE HONGOS EN TEJIDOS.
Colocar la muestra extrada o biopsia o puncin, etc., en frasco con formol al 10.pasar a alcohol de 70 durante 24 horas (puede disminuirse en tiempo a 2 horas).
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Chocar a continuacin en alcohol de 95 durante 24 horas (puede dejarse 2 horas) La siguiente etapa consiste en sumergir la pieza anatmica en alcohol abs. Durante 24 hora (puede disminuirse el tiempo a 2 horas) Pasar luego la pieza por xilol durante 6 horas (si se sigui la tcnica de las dos horas se puede dejar de 6 a 7 minutos. Incluir luego en parafina (tacos) y realizar cortes histolgicos con microtomo. Pasar los cortes histolgicos obtenidos por xilol y luego por alcohol absoluto para eliminar este y por alcohol de 95 para hidratar En este omento los cortes estn listos para realizar las distintas coloraciones. Se fijan con albmina sobre un porta objetos limpio y se trata con alcohol de 95.
MTODO DE GRIDLEY

Oxidar con cido crmico al 4% durante 1 hora Lavar con agua corriente durante 5 minutos Colocar durante 15 minutos e siguiente colorante: Fucsina bsica 1g y agua destilada hirviente 200ml Enfriar y agregar 2 gramos de metabisulfito de potasio y 10 ml de HCl Dejar reposar 24 horas Agregar 0.5 g de carbn activado Agitar durante un minuto Filtrar con papel Colocar en solucin de: Metabisulfito de potasio al 10% 6 ml HCL 5ml Agua destilada c.b.p. 100ml Durante dos minutos cambiando la solucin 3 veces. Lavar con agua corriente durante 15 minutos Chocar los cortes en fucsina aldehdica de 15-20 minutos: Fucsina bsica 1g Alcohol de 70 200 ml Paraldehdo 2ml HCl A temperatura ambiente durante 3 das hasta que se vuelva azul oscuro Guardar el refrigerador Lavar con alcohol de 95 Lavar con agua corriente Contracolorear durante 2-5 minutos en:
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Amarillo de metano 0.25g Agua estilada 100ml. cido actico glacial 0.25ml Lavar con agua y pasar con xilol Montar con blsamo de Canad, colocando un cubre objetos y observar a microscopio
NOTA: Los hongos aparecen de una coloracin prpura, el tejido conectivo, adquiere una tonalidad amarilla, y el tejido elstico y la mucina color azul MTODO DE GOMORI Desparafinar los cortes y pasarlos con alcohol absoluto y luego alcohol de 95 Tratar con albmina y fijarlos con alcohol de 95 Sumergir os cortes en cido crmico al 5 % durante 1 hora Lavar con agua corriente durante 10 minutos Colocar en solucin de bisulfito de sodio 1% durante 1 minuto Lavar con agua corriente durante 5 minutos y pasar luego por agua destilada 3 veces. Es mejor sumergirlos en agua destilada durante horas Colocar os preparados en solucin argntica durante 2 horas, manteniendo la temperatura a 45-50C Solucin argntica Nitrato de plata 5% 5 ml Urotropina 3% 10 ml Agitar hasta disolucin del precipitado Conservar en el refrigerador Lavar con agua destilado 2 o 3 veces Sumergir en cloruro de oro al 0.1% durante 5-10 minutos Tratar con solucin de hiposulfito de sodio al 2% durante 2 minutos Lavar con agua rpidamente Deshidratar y montar con blamo de Canad, y observar al microscopio NOTA: Los hongos se observan teidos en negro sobre el fondo rojo
MTODO DE McMANUS-HOTCHKISS:

Desparafinar con xilol y pasar por alcohol abs. Y de 95 Colocar el corte en cido peridico al 1% durante 10min. Lavar con agua corriente Chocar el reactivo de Schiff 10 min Fucsina bsica 0.1 g
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Alcohol de 95 5 ml Agua 95ml Lavar con agua corriente Sumergir el portaobjetos en solucin de: Hidrosulfito de zinc 1gr cido tartrico 0.5gr Agua 100ml Durante 30 min. Lavar con agua corriente durante 1 minuto Diferenciar con cido pcrico en solucin acuosa saturada durante 2 minutos. Deshidratar y montar con blsamo de Canad y observar a microscopio
NOTA: Los hongos aparecen coloreados de un tono violceo. TCNICA: Realizar una tincin simple, una de Gram y una de ZiehlNeelsen, utilizando los colorantes y procedimientos adecuados.
Tincin con azul de metileno
Aspergilus niger teido con azul de metileno 40x
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Talo vegetativo teido con safranina 40x. Presente en pepino
CONCLUSIN: La tcnica de tincin desarrollada nos permiti evidenciar con alto contraste la diversidad estructural de los hongos contaminantes en nuestro alimento,
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BIBLIOGRAFA: Modificacin a mtodo de Tincin de Gram para la identificacin de tricomonas en Exudados Vaginales , Tesis de Avendao Moreno Consuelo; (1985) Diagnstico Micolgico, Panamericana Amadeo DAlessandro; edit.
Micologa Mdica Bsica; A. Bonifaz; edit. Mndez Cervantes. Mtodos de laboratorio, Lynch; et al; edit. Interamericana; Mxico 1965. Xalapa, Ver., a _____________________________________
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PRACTICA 3. MTODO DE BURRI.

OBJETIVO: Que el alumno aprenda a utilizar el mtodo de Burri, y lo utilice en el laboratorio en el diagnstico de Cryptococosis. GENERALIDADES: El Cryptococcus neoformans es un hongo tipo levadura que causa Cryptococosis. Se presenta como cuerpo en forma de levadura de 5 a 20 micras de dimetro, que muestran gemacin simple (ocasionalmente mltiple) y estn rodeadas de una cpsula ancha de material gelatinoso. Esta cpsula esta constituida por polisacridos como xilosa, manosa y cido glucornico, que determina su virulencia por medio de deterioro de la fagocitosis. En lquido cefalorraqudeo, estas estructuras no deben confundirse con glbulos rojos o linfocitos; no tienen el ndice de refraccin de los primeros, y se distinguen de los segundos por la presencia de yemas. La enfermedad se encuentra en el mundo entero y casi siempre ataca las meninges y el cerebro, aunque tambin se conocen lesiones del pulmn, la piel y los huesos. El microorganismo puede cultivarse del suelo, y se piensa que generalmente penetra al organismo por las vas respiratorias. La clasificacin clnica de la cryptococosis se divide como sigue: Pulmonar (25%) Diseminada (visceral) (15%) Del SNC (45%) sea (5%) Cutnea (10%)
Patogenia. La cryptococosis pulmonar se inicia por la inhalacin de las levaduras, estas llegan hasta los alvolos atravesando las vas respiratorias, generando as el primer contacto pulmonar, que la mayora de veces cursa de manera subclnica o asintomtico, no PABLO BECERRA LARA. 33
genera una respuesta inflamatoria tan intensa como lo hacen otros hongos o mico bacterias. C. neoformans, prolifera rpidamente si no existe una adecuada defensa celular, en especial clulas mononucleares (linfocitos, histiositos, etc.), esto explica porque los pacientes linfoma tozos son altamente susceptibles a la enfermedad. Si el proceso infeccioso no se detiene, los microorganismos fcilmente se diseminan por va linftica y hematgena; con gran predileccin hacia el SNC, en donde el LCR es adems deficiente en un factor fungicida denominado factor anticriptococsico; en este sistema las lesiones se desarrollan en las meninges y afectan los nervio craneales, tallo cerebral y cerebelo; el cuadro que provoca es generalmente de una meningitis crnica. A partir de este foco puede diseminarse hacia otros rganos como vsceras, piel y huesos. Las levaduras del C. neoformans pueden penetrar por va cutnea, dando una cryptococosis primaria cutnea, que se inicia por la formacin de un complejo primario similar al de la esporotricosis, es decir, se forma un chancro o lesin inicial, constituido por linfagitis y adenitis, ste puede involucrar por completo o formar una lesin granulo matosa, ulcerada o de aspecto acneiforme. Todos los criptococos producen ureasa, pero no es el caso de las especies de Cndida. Los medios que contienen actidiona (ciclo heximida) inhiben el criptococos, pero carecen de efecto sobre el desarrollo de la Cndida. Los criptococos no patgenos no crecen a 37C; un criptococo no patgeno frecuente, Rhodotorula, produce una colonia roja anaranjada plida. Los ratones son sensibles a la infeccin de C. neoformans; la inoculacin puede hacerse por va intraperitonal o cerebral. Frente a un caso sospechoso, siempre debe recurrirse a inoculacin al animal. Diagnstico de Laboratorio. Toma de muestra: Depender del tipo de tryptococosis, por lo que se puede manejar expectoracin, lavado bronquial, LCR, exudados, biopsias, etc. Examen directo: Es de poca utilidad, por que mediante esta tcnica no se hace evidente la cpsula; por lo tanto las levaduras fcilmente se confunden con Candida sp. u otros hongos levaduriformes.
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Frotis: A partir de las muestras LCR, esputo, etc., se realiza un frotis, se fija al calor y se agrega extendiendo una gota de tinta china o nigrosina. MTODO DE BURRI: Por refringencia con el microscopio se puede observar fcilmente el cuerpo de la levadura y el halo de la cpsula. En nuestra experiencia ponemos una gota de fucsina bsica (de Zielhl-Neelsen) por minuto y posteriormente teimos de contraste con tinta china; los resultados son buenos, obteniendo el cuerpo de la levadura de color rojo rosa, un halo blanco de la cpsula y el fondo de la preparacin negro. Algunos autores reportan excelentes resultados con tincin de mucicarmn de Mayer, este colorante tie la cpsula en fracciones. Cultivos: Los medios de cultivos ms tiles son Saboraud, extracto de levadura y BHI agar; nunca debe sembrarse en micosel, porque la ciclo eximida (actidione) inhibe a C. neoformans. El desarrollo se obtiene en dos a tres das a temperaturas ambiente de 0 a 37C. Las colonias son limitada, mucoides, convexas, de color blanco amarillento y dan un aspecto de leche condensada, raras veces toman un color rosa plido. Al microscopio se observan clulas levaduriformes de aproximadamente 4 a 8 micras de dimetro con blastosporas de la mitad de su tamao, ambas con todo y la cpsula llegan a medir hasta 20 micras de dimetro. Un medio de cultivo selectivo para C. neoformans, es a base de semillas de negro o alpiste negro, de donde genera colonias con pigmentos caf-marrn, que se distinguen de otros gneros y especies. TCNICA: Realizar una tincin simple, una de Gram y una de ZiehlNeelsen, utilizando los colorantes y procedimientos adecuados. Este mtodo se utiliza especialmente para la observacin en fresco de Cryptococcus capsulatum (neoformans).
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Emplear como medio de contraste tinta china que debe ser de muy buena calidad y no debe hallarse contaminada por hongos levaduriformes. 1. Colocar una gota de tinta china sobre el portaobjetos. 2. Agregar una gota de material por investigar, que generalmente es lquido cefalorraqudeo o esputo, y mezclas con el asa. 3. Colocar el cubreobjetos y observar. 4. Si el material fuera muy espeso, conviene diluir la tinta china con una gota de agua. REACTIVOS Tinta china Muestra biolgica Colonia de hongos Material Asa de platino o nicromel Mechero bunsen Porta y cubreobjetos Equipo Microscopio OBSERVACIONES GENERALES:
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CONCLUSIN:
BIBLIOGRAFA: Micologa Mdica Bsica, Bonifaz A.; 2 reimpresin; Edit. Mndez; Mxico 1994. Mtodos de Laboratorio, Lynch y col. Diagnstico Micolgico; Amadeo D Alessandro; Edit. Panamericana. Xalapa, Ver., a ______________________________________
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PRACTICA 4. CULTIVO DE HONGOS.

OBJETIVO: Que el alumno aprenda a cultivar hongos de inters clnico. GENERALIDADES: EXTRACCIN DE MATERIALES DE LA LESIN. Los materiales necesarios son: pinzas, esptulas, tijeras, portaobjetos, cajas de Petri, etc. agujas, bistur,
Realizar siempre una limpieza previa de la lesin con alcohol (nunca con alcohol yodado), porque los pacientes generalmente llegan hasta el analista ya medicados con cremas, ungentos, etc. OBTENCIN DE MUESTRAS DE MICOSIS SUPERFICIALES.
Lesiones en piel (tia, pedis, cruris y corporis): se hace un raspado cuidadoso de la lesin con el fin de retirar el mayor nmero de escamas y recibirlas en una caja Petri; es importante que el raspado se haga con cierta presin pero sin llegar a sangrar, ya que esto interfiere con la calidad de la muestra. Lesiones en cabeza (tia capitis): se hace una toma similar a la anterior pero un poco ms persistente y enrgica con el fin de desprender suficiente escamas. Posteriormente se localizan los pelos parasitazos los cuales son cortos y estn rodeados de un material blanquecino; con la ayuda de las pinzas de depilar son arrancados y depositados en la caja Petri. Lesiones en ua (tia unguis): las uas aumentadas de volumen y deformadas tienen un aspecto blanquecino y pulverulento, por lo que la toma de este material es relativamente fcil, basta raspar con el bistur la parte inferior de la ua y colectar la escamas en la caja Petri.
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OBTENCIN DE MUESTRAS DE MICOSIS SUBCUTNEAS. Las enfermedades de este tipo incluyen la cromomicosis, micetoma o (maduromicosis), esporotricosis y rinosporodiosis, etc. Los especimenes mejor colectados de este grupo incluyen costras y sus provenientes de abscesos abiertos; del exudado de las lesiones; de fluidos aspirados de tractos sricos cerrados o abscesos por medio de jeringa; y tejido proveniente de la biopsia. El organismo Rhinosporidium seeberi que causa la rinosporidiosis, no ha podido ser cultivado hasta ahora; sin embargo los raspados provenientes de raspados o biopsias deben ser examinados directamente o fijados para el examen histolgico. El material de esta micosis debe ser puesto en tubo o en frascos estriles adicionados de penicilina y estreptomicina y enviados enseguida al laboratorio para ser examinados al microscopio y sembrados en medio de cultivo adecuados segn el tipo de micosis que se trate. OBTENCIN PROFUNDAS. DE MUESTRAS DE MICOSIS SISTEMTICAS
La micosis sistemtica o profunda puede diagnosticarse en el laboratorio a partir de un examen de la pus o del exudado; del fluido espinal; de la saliva; de la mdula sea o sangre; o del material proveniente de abscesos, biopsias o autopsias. El examen directo, los cultivos y en algunos casos la inoculacin animal deben hacerse a partir del material colectado. ROTULO DE LAS MUESTRAS. Todas las muestras que se obtienen para el diagnostico clnico deben contener la siguiente informacin: 1. 2. 3. 4. Nombre, edad y sexo del paciente. Nmero de identificacin asignado al paciente o espcimen. Nombre del mdico que manda a realizar el examen. Nombre de la institucin donde se obtiene la muestra, si la muestra se enva a otra. 5. Tipo de material presentado y colectado. 6. Enfermedad sospechada o alguna otra informacin pertinente. 7. Resultados de cualquier prueba serolgica o drmica hecha.
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PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS. En todos los casos se practicar un examen microscpico directo de los materiales extrados. Para ello, los pelos y escamas de piel o de uas se colocarn sobre un portaobjetos limpio con una gota de hidrxido de sodio o potasio al 20-30%, se cubrirn con un cubreobjetos y se calentarn sobre la llama suave de un mechero, apretando suavemente con el dedo, tratando de disgregar el material. Luego se mirar al microscopio con el objetivo de 10 dimetros de aumento y despus con el de 40. SIEMBRAS. Se utilizarn medios de cultivo de Sabouraud con y sin antibiticos. Se siembran los trozos de pelos o escamas de piel (lo ms pequeos posibles) y los medios de cultivos, utilizando para ellos dos tubos de Sabouraud glucosado con antibitico. Se esterilizar el gancho o asa, enfrindolo luego en el medio de cultivo, apoyndolo sobre la superficie del mismo. Luego se tocarn las escamas o pelos que, de esta manera quedarn adheridos. Se ubicarn estos trocitos sobre la superficie del agar, tratando de presionar suavemente con el asa para que penetren en el medio de cultivo. Se siembran de esta manera en la superficie del medio 5 o 6 trocitos del material quedando separados por un pequeo espacio. Se incubarn a 25C durante 20 a 30 das. Si no se dispone de una estufa graduada a esta temperatura, se puede ubicar sobre la de 37C, tapndolos con una caja de plstico o de vidrio para que pueda penetrar la luz ya que la pigmentacin de algunos hongos puede verse interferida en su ausencia. Todos los das se observar el posible desarrollo fngico. No debe informarse como negativo un cultivo antes de los 30 das. MEDIOS DE CULTIVO. Los medios de cultivo ms utilizados o clsicos son el medio glucosado de Sabouraud y el medio de Sabouraud con antibiticos. Los medios de cultivo pueden ser de tres tipos: naturales, semisintticos y sintticos. Los naturales estn elaborados con leche, huevo, granos de cereales, levadura de cerveza y otros compuestos. Los semisintticos, como el Sabouraud, aportan una fuente de carbono
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y nitrgeno. Los sintticos tienen una composicin qumica bien definida y se usan en investigacin, no son de uso sistemtico. Se preparan fcilmente, los ingredientes se disuelven por separado en agua y se mezclan en un matraz erlenmeyer, se calientan 15 minutos a bao Mara y 5 a 6 minutos en el mechero, la solucin se coloca en tubos y se procesa en autoclave a 110C durante 15 a 20 minutos al sacarlos se colocan en posicin inclinada para aumentar la superficie de cultivo. Pueden utilizarse cajas Petri, que deben llenarse despus de esterilizar el medio. Si se usa tapn de rosca no debe tapar hermticamente para facilitar la llegada de oxgeno o se pueden utilizar los tapones de algodn. Todas las manipulaciones han de realizarse en el rea esterilizada de la llama de un mechero Bunsen o en una campana de flujo laminar. USO Identificacin de C. neoformans. MEDIOS DE CULTIVO Medio de alpiste negro agar. Medio de agar dextrosa urea. Medio de Staib. Arroz agar. Agar para produccin ascosporas. Sabouraud caldo. Biggy agar. Medio de coco. Medio V8 agar. Medio Borelli. DTM agar. PZ + dextrosa al 1%.
Esporulacin de dermatofitos. Produccin de ascosporas (gnero de saccharomices). Transporte y revitalizacin. Medio selectivo de primoaislamiento para diversas levaduras Primoaislamiento, conservacin y produccin de pigmentos de dermatofitos. Para esporulacin de hongos dermaticeos. Investigacin de hidrlisis de Medio de casena (actinomicetes). casena en actinomicetos. Medio para hidrlisis de casena (Nocardia). Investigacin de carbohidratos. Medio para investigacin de carbohidratos (zimogramas) Primoaislamiento y conservacin Sabouraud caldo. de diversos hongos. Sabouraud dextrosa agar. Papa peptona agar. Infusin de cerebro corazn agar. (M. mycetomatis y A. madurae) Harina de maz agar. Extracto de levadura agar. Papa dextrosa agar. Medio de conservacin. PABLO BECERRA LARA. 41
Para estimulacin de pigmento de Medio de coco. A. pelletieri y T. violaceum. Investigacin de licuefaccin de Gelatina. gelatina. Esporulacin de diversos hongos. Harina de maz agar. Papa dextrosa agar. Papa zanahoria agar. Papa peptona agar. Formacin de pseudomiceliso y Harina de maz + Tween 80. clamidospora en el gnero Papa zanahoria + Bilis de buey. Candida. Medio de cereal. Agar para clamidosporas. Medio selectivo para hongos Micosel o micobiotic agar. patgenos. Medio kurung (en su forma parasitaria) Medio de produccin de pigmento PZ + dextroza al 1%. de T. Rubrum. Primoaislamiento de Tioglicolato caldo. actinomycetos anaerbicos y microaerfilos. Pruebas fisiolgicas de Medio para la investigacin de actinomycetos. xantina, hipoxantina y tirosina. Medio Bennett. Rehidratar cultivos desecados. Sabouraud caldo. Identificacin de Aspergillus y Medio Czapek. Penicillium. Para cultivar Pytirosporum. Medio de Sabouraud con aceite de oliva. Medio para Pytirosporum con bilis de buey. Medio con cido oleico y vitamina A. Estimula la fructificacin. Extracto de malta o cerveza. Para observar rganos Medio para penetracin de pelos perforadores presentes en T. in vitro. Mentagrophytes. Medio de agar dextrosa urea. Observar produccin de ureasa. Medio de agar dextrosa urea. Para el transporte de hongos. Medio de Stuarts. Identificacin de micobacterias y Medio de Lowestein-Jensen actinomadura. Para la obtencin de antgenos. Medio de Smith.
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Agar para Clamidosporas. Frmula. Sulfato de amonio g Fosfato monopotsico g Azul de trpano Polisacrido purificado Agar Biotina Agua destilada ml 1 1 0.1 g 1g 1g 1g 1000 Frmula Sabouraud glucosado cm3 Cloranfenicol mg Cicloheximida mg 1000 500 500 Uso: produccin de ascosporas (gnero saccharomyces). Agar Sabouraud cicloheximida.
Se suspenden 37 g del polvo deshidratado de la frmula en el agua destilada y se deja remojar durante 15 minutos, se hierve durante 1 minuto agitando frecuentemente; se distribuye en los tubos y se esteriliza a 121C durante 20 min. Uso: estimula clamidosporas en C. albicans. Agar para produccin de ascosporas. Frmula Acetato de potasio g Extracto de levadura g Dextrosa g Agar g Agua ml 10 2.5 1 20 1000
Disolver la cicloheximida o actidiona en 10 cm3 de acetona, el cloranfenicol en 10 cm3 de alcohol. Agregar el medio ya fundido y esterilizar a de atm durante 20 minutos. Uso: primoaislamiento y conservacin de diversos hongos Arroz agar. Frmula Arroz blanco molido g Agua destilada ml 8 25
Poner los ingredientes en matraz erlenmeyer y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Uso: para esporulacin dermatofitos. Biggy agar. de
Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos.
Frmula
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Citrato de bismuto 5 g Amoniaco sulfito de sodio 3 g Dextrosa 10 g Extracto de levadura 1 g Glicina 10 g Cloranfenicol 0.5 g Agar 10 g Agua destilada 1000 ml Hervir el medio 5 min y repartir en cajas Petri o tubos. No se debe esterilizar en autoclave. Uso: medio selectivoo de primoaislamiento para diversas levaduras. DTM agar (Dermatofite Test Medium). Frmula Fitona Dextrosa g Gentamicina Cloranfenicol Rojo de fenol ml Agar bacteriolgico g Agua destilada ml 10 g 10 0.1 g 0.1 g 4 20 980
Uso: primoaislamiento dermatofitos.
de
Preparacin del indicador: se mezcla rojo de fenol 0.5 g; NaOH (0.1N) 15 ml; agua destilada 100 ml. Extracto de levadura agar. Frmula Extracto de levadura g Agar bacteriolgico g Agua destilada ml Ph 1 20 1000 6
Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 min. Uso: primoaislamiento diversos hongos. de
Extracto de malta o cerveza. Frmula Harina de malta mg Agua destilada ml 200 1000
Los carbohidratos pueden ser: glucosa, maltosa, lactosa, sacarosa, galactosa, etc. Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos.
Se coloca a 45C luego se intenta elevar un C por minuto hasta 70C 10 min. Se verifica mediante coloracin con yodo si ha desaparecido el almidn. Es necesario 70C hasta que desaparezca todo el almidn. A continuacin se filtra la mezcla y se agrega clara de huevo (1 por 2 lt). Se esteriliza a 125C durante 45 min. Se afora a un lt y se esteriliza a 110C. Uso: estimula la fructificacin.
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Gelatina. Frmula Gelatina g Agua destilada ml 4 1000
Uso: para formacin de pseudomicelios y clamidosporas en el gnero Candida. Nota: se le puede adicionar 1 ml de azul de trpano al 1% Infusin de cerebro corazn agar (BHI). Frmula
Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 min. Uso: para investigacin de licuefaccin de gelatina en actinomycetos y hongos negros. Harina de maz agar (Corn meal agar) Frmula Harina de maz Agar bacteriolgico g Agua destilada 40 g 20 1000 ml
Esterilizar en autoclave a 121C de 10 a 15 min. Uso: medio de esporulacin y conservacin de diversos hongos Harina de maz + Tween 80. Frmula Medio de harina de maz ml Tween 80 ml 990 10
Infusin de cerebro de ternero 200 g Infusin de corazn de res 250 g Peptona 10 g Dextrosa 2 g Cloruro de sodio 5g Fosfato disdico 2.5 g Agar bacteriolgico 20 g Agua 1000 ml Ph 7.4 Esterilizar en autoclave a 121C 15 min. Uso: primoaislamiento de diversos hongos, en especial M. mycetomatis y A. madurae. Medio con cido oleico y vitamina A. Frmula Sabouraud simple g Tween 80 ml 6.5 1
Esterilizar en autoclave a 121C 15 min.
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cido oleico g Vitamina A Cloramfenicol g Agua destilada ml
10 10 gotas 0.5 100
Agar bacteriolgico g Agua destilada ml
20 1000
Uso: se usa para pytirosporum. Medio agar dextrosa urea. Frmula Dextrosa g Peptona Fosfato monopotsico g Urea Rojo fenol g Agua destilada ml 1 1g 2 20 g 0.012 1000
Remojar el alpiste negro en 1 lt de agua. Hervir 30 min.; posteriormente filtrar en gasa y papel filtro. Aforar a 1 lt de agua. Esterilizar en autoclave a 110C por 15 minutos. Uso: medio de identificacin de C. neoformans. *Semilla de Guizotia abyssinica. Medio de Bennet. Frmula Extracto de levadura g Extracto de carne g NZ amida A g Casena para digestin g Glucosa Gelosa Agua destilada ml Uso: se utiliza actinomycetos. 19 18 2 1 10 g 15 g 1000 para
Se disuelven. Filtran y esterilizan los ingredientes, se disuelven por separado 15 ml de agar en 900 ml de agua destilada y se esterilizan. Despus de enfriar se aade la solucin de urea. Uso: para observar la produccin de ureasa, por ejemplo en T. Mentagrophytes y C. neoformans. Medio de alpiste negro agar. Frmula *Alpiste negro pulverizado g Cloranfenicol o Nger 70 50 g
Medio de Borelli (lactrimel). Frmula Harina de trigo g Leche en polvo g Miel Agar g 14 14 7g 20
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Agua destilada ml
1000 *Producto comercial que contiene harina de maz, trigo, arroz, cebada, avena y extracto de malta. Uso: estimula clamidosporas en C. albicans. Medio de coco. Frmula
Esterilizar en autoclave a 110C por 10 minutos. Uso: primoaislamiento, conservacin y produccin de pigmentos de dermatofitos. Para esporulacin de hongos dematiceos. Medio de casena. Frmula Solucin A Dextrosa g Agar bacteriolgico g Agua destilada ml Solucin B Leche descremada g Agua destilada 1 2 50 1.5 50 ml
Agua de coco filtrada 100 ml Peptona 1g Agar bacteriolgico 2 g Ph 5 Esterilizar en autoclave a 121C 15 min. Uso: aislamiento de diversos hongos levduriformes. Medio para estimulacin de pigmento de A. pelletieri y T. violaceum. Medio de conservacin.
Esterilizar en autoclave por separado a 110C o 10 lb de presin por 10 min. Una vez estril se deben mezclar a una temperatura prxima a 45C, repartiendo en cajas Petri. Uso: investigacin de hidrlisis de casena en actinomicetos. Medio de cereal. Frmula *Cerelac g Agar g Agua destilada ml 14 10 1000
Frmula Peptona granulada g Agar agar g Agua destilada ml 30-40 20 1000
Uso: no contiene azcares; se utiliza para evitar e fenmeno de pleomorfismo. Es recomendable sobre todo en dermatofitos. Medio de Czapek. Frmula
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Nitrato de sodio g Sacarosa g Fosfato dipotsico g Cloruro de potasio Sulfato de magnesio g Sulfato de hierro g Agar g Agua destilada ml
3 30 1 0.5 g 0.5 0.01 15 1000
que aadir el volumen correcto de agua y esterilizar. Uso: para conservar patgenos en su parasitaria. hongos forma
Medio de LwensteinJensen. Frmula Fosfato monopotsico 2. 4 g Sulfato de magnesio 0.24 g Citrato de magnesio 0.6 g Asparagina 3.6 g Glicerina 12 ml Agua destilada 600 ml Fcula de papa 30 ml Huevos frescos 1000 ml Sol. verde de malaquita 20 ml Las sales se disuelven por calentamiento y esta solucin se distribuye en frascos que se esterilizan 30 min. a 110C. En un recipiente de 3 lt con perlas de vidrio se ponen los 30 g de fcula de papa que se esteriliz 30 min a 120C, y la solucin previamente preparada. Enseguida se coloca el recipiente a bao Mara a 100C y se agita continuamente hasta que el lquidose trona translcido en alrededor de 1520 min. Se deja 1 hr en alcohol de 90, a continuacin se rompe uno tras otro en un vaso de pp y se vierten en una probeta de 1 lt; se homogenizan con un agitador
Uso: sirve para estudiar Aspergillus y Penicillium. Medio de Kurung. Frmula Fcula de papa 1 g Agua destilada 100 ml Mezcla de huevo 150 ml El agua con la fcula de papa (patata) se calienta en el mechero de Bunsen hasta que la mezcla gelifica, entonces se esteriliza a 115C por 15 min. Se agita la mezcla de huevo (que contiene 100 ml de yemas y 40 ml de huevos enteros) en presencia de perlas de vidrio y se agrega bajo tcnica estril a la fcula de papa. El medio se reparte en tubos y se deja coagular inclinando a 90C 1 hr. Hoy se ha simplificado la preparacin de los medios de cultivo al utilizar medios deshidratados a los que hay
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mecnico o varilla de cidrio y se filtran en una gasa. Un litro de huevos se mezclan con un frasco de fcula y se le agregan 20 ml de verde de malaquita. La mezcla se deja en reposo una hora antes de distribuirse en los tubos o en las cajas de Legroux. El medio se coagula con un solo calentamiento de 40 min a 85C. Uso: se emplea para actinomycetos, micobacterias y Actinomadura. Medio de Sabouraud con aceite de oliva. El medio de Sabouraud con antibiticos se le agrega aceite de oliva al 10%. El aceite se esteriliza por separado y se le agrega al medio cuando se encuentra a 50C y se vierte en los tubos o las cajas Petri. Uso: para cultivar pityrosporum. Medio de Smith. Frmula Cloruro de amonio 7 g Asparagina 7g Fosfato dipotsico 1.31 g Citrato de sodio 0.90 g Sulfato de magnesio 1.50 g Citrato frrico 0.30 g Glucosa 10 g Glicerina 25 cm3 Agua 1000 cm3
Distribuir y esterilizar a de atm durante 20 min. Uso: para antgenos. la obtencin de
Medio de Staib. Frmula Guizotia Cafeico g glucosa g creatinina KH2PO4 Agar g abyssinica o c. 50 1 1g 1g 15
Se hierve el polvo de las semillas de G. Abyssinica (alpiste negro) en 1000 ml de agua destilada durante 30 min., se filtra, y se afora el volumen a 1 lt con agua destilada. Se aaden los otros componentes, se esteriliza a 120C por 20 min. El pH final debe ser de 5.5. Uso: sirve para identificar C. neoformans, ya que adquiere un color caf (marrn) oscuro en este medio. Medio de Stuart. Frmula Tioglicolato de sodio g Glicerofosfato de sodio g Cloruro de calcio mg Azul de metileno mg 1 10 100 0.02
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Agua destilada ml PH
1000 7.3
Medio para investigacin de carbohidratos(zimograma). Frmula
Uso: medio de transporte de hongos. Medio para hidrlisis de casena. Frmula 1 Leche entera en polvo g Agua destilada Sig. A Agar Agua destilada Sig. B 4 500 ml 20 g 1000 ml
Peptona NaCl NaOH 1N Carbohidrato Agua destilada ml Indicador
10 g 5g 1 ml 20 g 1000 1-2 gotas
Medio para investigacin de xantina, hipoxantina y tirosina Frmula Agar nutritivo Xantina o hipoxantina Agua destilada ml 23 g 4g 1000
Se esterilizan ambas preparaciones. En una caja Petri se mezclan dos tubos de agar con uno de leche, se deja solidificar y se siembra la colonia problema. Frmula 2 Dextrosa g Agar bacteriolgico g Agua destilada ml Sig. A Leche descremada g Agua destilada ml Sig. B 1 1.5 50
Se esteriliza en autoclave a 121C por 15 min. Uso: para investigacin pruebas fisiolgicas actinomicetos. de de
Nota: cuando se investiga tirosina se debe agregar 5 g de xantina o hipoxantina. Medio para penetracin de pelos in vitro. Frmula Agua destilada ml Extracto d levadura 10% ml 20 2-3
1.5 50
Se esterilizan por separado A y B a 10 libras por 10 min; se dejan enfriar a 45C, se vacan en cajas Petri y se mezclan.
En una caja Petri se colocan pelos rubios de nio prepber, de 1 cm de long. esterilizados;
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se agrega la solucin preparada, se inoculan las colonias para estudiar y se dejan transcurrir de 3-4 semanas. Uso: sirve para observar rganos perforadores, que estn presentes en T. mentagrophytes mas no en T. rubrum. Medio para pithyrosporum con bilis de buey (dixon modificado) Frmula Agar extracto de malta g Bilis de buey g Tween 40 ml Glicerina Agua destilada ml 50-60 20 10 2.5 ml 1000
Uso: medio de aislamiento e identificacin de levaduras. Micosel o micobiotic agar (Sabouraud + antibiticos) Frmula Medio de Sabouraud ml Actidione(cicloheximida) mg Cloranfenicol mg PH 100 400 500 6.5
Los antibiticos se adicionan de la siguiente manera: el actidione en 1 ml de acetona y el cloranfenicol en 1 ml de alcohol etlico, ambos se agregan cuando el medio ha hervido por 1-2 min. Se esterilizan en autoclave a 121C por 15 min. Uso: medio selectivo hongos patgenos. para
Se mezclan los componentes y se disuelven a bao Mara; se vierten en tubos y se esterilizan 20 min a 120C. Se pueden aadir antibiticos bacterianos. Medio V8 agar. Frmula
Nota: se le adiciona 10-15% de aceite de oliva o cido oleico, se puede utilizar para el primoaislamiento de hongos lipoflicos (P. ovale y P. orbiculare) Papa dextrosa agar(PDA).
Filtrado de jugo V8 Extracto de levadura g Agar bacteriolgico g Agua destilada ml
500 ml 10 20 500
Frmula Pulpa de papa g Dextosa Agar bacteriolgico g Agua destilada ml 20 20 g 20 1000
Se esterilizan en autoclave a 121C por 15 min.
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Se esterilizan en autoclave a 121C por 15 min. Uso: para primocultivo, conservacin y esporulacin de diversos hongos. Papa peptona agar. Frmula Pulpa de papa g Peptona Agar bacteriolgico g Agua destilada ml 20 10 g 20 1000
Uso: medio de conservacin y de esporulacin. Papa zanahoria bilis de buey. Al medio anterior se le agrega 15% de bilis de buey. Uso: estimula clamidosporas en Candida albicans. PZ + dextrosa al 1%. Frmula PZ Agar bacteriolgico g Dextrosa g PH 990 ml 20 10 5.6
Se esterilizan en autoclave a 121C por 15 min. Uso: medio de esporulacin y conservacin de diversos hongos. Papa zanahoria agar (P-Z agar). Frmula
Se esteriliza en autoclave a 121C por 15 min. Uso: medio de esporulacin y conservacin de dermatofitos. Medio de produccin de pigmento de T. rubrum. Saboraud dextrosa agar.
Pulpa de zanahoria g Pulpa de papa Agar bacteriolgico g Agua destilada
20 Frmula 20 g 20 1000 ml Dextrosa g Peptona Agar bacteriolgico g Agua destilada ml PH 20 10 g 20 1000 6.5
Las pulpas maceradas se hierven a fuego lento por 1 hr. Posteriormente se filtran en gasa y se le adiciona al filtrado la cantidad respectiva de agua para completar a 1 lt. Se esterilizan en autoclave a 121C durante 15 min.
Se esteriliza en autoclave a 121C durante 15 min.
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Uso: medio rutinario para el primoaislamiento y conservacin de diversos hongos. Sabouraud caldo. Frmula Dextrosa g Peptona Agua destilada ml PH 20 10 g 1000 6.5
Se esterilizan en autoclave a 121C durante 15 min. Uso: primoaislamiento, transporte y revitalizacin de diversas cepas. Tioglicolato caldo. Frmula Tripticase 20 g Cloruro de sodio 5g Fosfato monobsico de K 2 g Tioglicolato de sodio 1 g Agua destilada 1000 ml Se esteriliza en autoclave a 121C durante 15 min. Uso: para el primoaislamiento de actinomicetos anaerbicos y microaerfilos.
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UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE QFB LABORAORIO DE MICOLOGIA
REACTIVOS Solucin salina Solucin de KOH al 30% Muestra biolgica Colonia de hongos Material Asa de platino o nicromel Mechero bunsen Porta y cubreobjetos Equipo Microscopio TCNICA: Se ejemplifica en el siguiente diagrama: EXAMEN EN FRESCO MUESTRA POSITIVO NEGATIVO MUESTRA
SIEMBRA
MACROCOLONIA TINCIONES
RESIEMBRA EXAMEN EN FRESCO REPORTE
MACROCOLONIA
ZIMOGRAMA EXAMEN EN FRESCO
Nota: en algunas ocasiones se realizan pruebas especiales. OBSERVACIONES GENERALES:
Cepas asiladas de Aspergilus niger, Aspergilus flavur, etc.
Cepas resembradas de Aspergilus niger, Aspergilus flavur, etc.
Aspergilus niger en 40x
Aspergilus flavus
CONCLUSIN:
La siembra de las cepas de hongos se llevo a cabo en el medio de cultivo Sabouraud en tubos de ensaye de 13x 100mm con rosca y no en cajas petri ya que la contaminacin de esta ultima sucede con mayor frecuencia. La siembra se llevo acabo tomando con el asa recta una pequea porcin de la cepa, colocndola en el nuevo medio. Los tubos se dejaron en la incubadora a temperatura ambiente por una semana. Al paso de los 7 das las colonia presentaban un pequeo desarrollo a lo largo del tubo, teniendo caractersticas macroscpicas diferentes unos con otros. Los exmenes en fresco se realizaron un mes despus aproximadamente de su inoculacin, cuando los hongos ya tenan un aspecto y coloracin de hongos maduros. Como resultado se pudo observar dos tipos de esporangio; comparados con la literatura, se concluyo que se trataba del aspergilus niger, y del aspergulus flavus.
BIBLIOGRAFA: Diagnstico Micolgico; Amadeo D Alessandro; Edit. Panamericana. Micologa Mdica ilustrada, R. Arenas; Ed. Interamerica Mc Graw Hill. Micologa Mdica Bsica, Bonifaz A.; 2 reimpresin; Edit. Mndez. Laboratorio Clnico; Martha P. Daz Resendiz; IMSS Mxico 1978. Manual de Micologa Mdica; Cristina Gamboa Len; UV. Xalapa, Ver, 1988. Xalapa, Ver., a ____________________________________________ Vo. Bo.
PRACTICA 5. MICROCULTIVO.
OBJETIVO: Que el alumno aprenda a realizar microcultivos, y los sepa emplear en la diferenciacin de los hongos. GENERALIDADES: Las micosis son las enfermedades causadas por distintas especies de hongos. Estas afecciones pueden ser superficiales y profundas. Las micosis o dermatomicosis son procesos infectocontagiosos producidos por distintos agentes micticos que fundamentalmente invaden piel y/o sus anexos. No tienen carcter maligno y, en la mayora de los casos, solo afecta la esttica. Por lo general no hay repercusin sistmica y las lesiones aparecen como procesos inflamatorios superficiales ante los cuales el organismo puede responder, entre otras maneras, con la formacin de anticuerpos reagnicos o clulas especficamente sensibilizadas, revelables mediante reacciones de hipersensibilidad cutnea. Generalmente no se evidencian anticuerpos fijadores de complemento ni precipitinas o aglutininas. El grado de inflamacin va desde una reaccin nula, como en el caso de la pitiriasis versicolor, hasta reacciones graves como el querion. Las micosis profundas pueden localizarse en dermis, msculos, huesos, pulmones, hgado, cerebro, mucosas, etc. Se observan lesiones inflamatorias y destructivas con la consiguiente difusin de los parsito a travs del sistema hemtico o linftico o por continuidad. En este caso el organismo infectado responde a la agresin originando anticuerpos especficos, fijadores del complemento, precipitinas, aglutininas, etc. La mayora de las micosis profundas revisten de tal gravedad que en muchos casos llevan al paciente a la muerte. CLASIFICACIN DE LOS EUMYCETES. Diferentes autores han trabajado arduamente tratando de ordenar sistemticamente las distintas especies de hongos. A continuacin se
transcribir una clasificacin tentativa del ordenamiento lgico de los hongos. CLASES SUBCLASES RDENES GNEROS Phycomicetes Archimycetes Micelio continuo. Los unicelulares no Oomycetes se reproducen por brotacin. Esporos asexuados Zigomycetes en esporangios. Ascomycetes Hemiascomycetes Chytridiales Chytridium
Peronosporale Peronospora s Mucorales Mucor
Endomycetale Saccharomyce s s Eurotiales Aspergillus
Micelio tabicado. Los unicelulares se Euascomycetes reproducen por brotacin o esquizogonia. Esporos sexuados internos en ascos. Basidiomycetes Micelio tabicado. Esporos sexuados externos sobre bsides. DEUTEROMYCETE S Micelio tabicado. Los unicelulares se reproducen por brotacin o esquizogonia. No se conoce reproduccin sexuada. Heterobasidiomycet es Homobasidiomycete s Mycelia fructignea Mycelia sterilia
Ustilanginales Agaricales Moniliales Mycelia sterilia
Ustilago (carbn) Agaricus Fusarium Sclerotium
TERMINOLOGA DE LAS MICOSIS.
La denominacin de las micosis vara segn el criterio adoptado para clasificarlas: localizacin del proceso, hongo que se asla de la lesin y la designacin que utiliza la literatura mdica. De acuerdo con la localizacin del proceso, la enfermedad mictica puede denominarse: dermatomicosis, micosis pulmonares o neumomicosis, onicomicosis, otomicosis, etc. De acuerdo al nombre del hongo responsable de la lesin se denomina: aspergilosis, tricofitosis, coccidioidomicosis, candidiasis, etc., cuando los agentes son Aspergillus, Trichophyton, Coccidioides y Candidas, respetivamente. En el caso de la terminologa mdica se emplean las siguientes denominaciones: tias, pie de atleta, querion, piedras, etc. MICROCULTIVOS. Se realizan para estudiar los detalles de la estructura de los hongos que debido a las observaciones comunes se destrozan y desaparecen por accin de los ganchos y de las agujas. TCNICA: 1. Se preparan placas de Petri con un papel secante en su interior. 2. Se coloca un porta y un cubreobjetos y se esteriliza. 3. Se prepara una caja Petri con Sabouraud y una vez coagulado y fro se cortan pequeos trozos cuadrangulares que se colocan aspticamente sobre el portaobjetos dentro de la placa. 4. Se toma el hongo en estudio con un gancho y se siembra sobre el trocito de agar Sabouraud y tambin en los costados del mismo. 5. Se coloca el cubreobjetos con una pinza previamente flameada, sobre la superficie del agar. 6. Se humedece con agua estril el papel secante y se incuba a 28C. 7. Una vez desarrollado el hongo se saca el cubreobjetos que lleva adherido el crecimiento fngico, se coloca sobre un portaobjeto con una gota de colorante Gueguen o Lactofenol y se saca el trocito de Sabouraud con una pinza colocando luego una gota de colorante y un cubreobjeto nuevo, obteniendo as dos preparaciones listas para estudiar. Pueden bordearse con esmalte de uas, conservndose un largo tiempo. d b a
c a) b) c) d) Portaobjetos. Cubreobjetos. Zonas de siembra. Medio de cultivo.
A partir de un alimento que contenga hongos, realizar un microcultivo, despus de la observacin de crecimiento: Observar el microcultivo completo. Quitar el cubreobjetos y colocarlo sobre un porta limpio y observar, y c) Quitar el cuadrito de agar y sobre el portaobjetos colocar un cubreobjeto limpio y observar. LMINA 1. Tcnica de microcultivo. A. B. C. Uso de tubo de prueba estril para obtener bloques de agar para la tcnica de microcultivo. Preparacin de una cmara hmeda estril usando una placa de Petri que contiene agar simple al 2% sobre un portaobjetos estril. Mtodo alternativo de preparar un microcultivo. Se colocan discos de papel filtro en el fondo de la caja Petri y el portaobjetos se apoya en varillas de vidrio. Los discos de papel filtro se mantienen hmedos con agua estril durante el periodo de incubacin. Colocacin del bloque de agar en la preparacin de un microcultivo. Obsrvese que se han inoculado pequeas porciones del cultivo con un gancho en cuatro cuadrantes del bloque de agar. Inoculacin de la superficie de un bloque de agar en la preparacin de un microcultivo. Obsrvese que se han inoculado pequeas porciones del cultivo con un gancho en cuatro cuadrantes del bloque de agar. Colocacin de un portaobjetos estril sobre la superficie del bloque de agar inoculando antes de la incubacin. Aspecto de un microcultivo tpico luego del periodo de incubacin apropiado. Obsrvese el crecimiento micelial por debajo de la superficie de los cubreobjetos. a) b)
D.
E.
F. G.
H.
Colocacin del cubreobjetos recogido del bloque de agar microcultivado en un agota de lactofenol-azul de anilina en un portaobjetos para examen microscpico.
LMINA 1.
REACTIVOS Muestra biolgica Colonia de hongos Material Asa de platino o nicromel Mechero bunsen Porta y cubreobjetos Equipo Microscopio OBSERVACIONES GENERALES:
Microcultivo de la cepa Rhodotorula
Cepa aislada de Rhodotorula
Levaduras de Rhodotorula 40x vista en cubre objetos con KOH
Levaduras de Rhodotorula 40x con KOH
CONCLUSIN: La tcnica del microcultiv es una gran herramienta cuando se quiera conocer y observar las caractersticas de un hongo de inters personal sin destruir sus hifas al momento de tomar la muestra. Esta tcnica permite el desarrollo del hongo en una pequea porcin de medio Sabouraud inoculada en los cuatro puntos cardinales colocada en un portaobjetos y con un cubreobjetos encima del medio, dentro de la caja petri. Se dejo en la incubadora por 7 das a temperatura ambiente, transcurrido la semana el crecimiento del hongo inoculado se encontraba hacia dentro del medio y por las orillas del cubreobjetos. Al desprender el cubreobjetos el hongo que se encuentraba desarrollado en las orillas es el que se observo al microscopio ya que no sufri rompimiento alguno, encontrndose desde raz. Como se aprecia en las imgenes mi hongo inoculado se trato de una levadura, que no presentaba hifas que me permitieran observar a un hongo hiaino desde su raz.
BIBLIOGRAFA: Micologa Practicas de Laboratorio, Koneman Roberts; Edit. Mdica Panamericana. Diagnstico Micolgico, Amadeo D Alessandro; Edit. Panamericana.
Xalapa, Ver., a
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Vo. Bo.
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PRACTICA 6. GNERO CNDIDA.

OBJETIVO: Que el alumno se familiarice con las especies del gnero Cndida, comprenda a este gnero como Hongos Oportunistas y sea capaz de diagnosticar candidiasis en el laboratorio de anlisis clnicos. GENERALIDADES: HONGOS OPORTUNISTAS. Se denomina as a ciertos hongos saprfitos que en algunas oportunidades invaden el organismo humano o de otros animales, gracias a determinados factores predisponentes del husped. Los saprfitos que se aslan de ciertas enfermedades son: Mucor, Absidia, Rhizopus, Aspergillus, Cephalosporium, etc. Los que viven saprofiticamente y adems cohabitan en mucosas o piel como Candida, Cryptococcus, Geotrichum, son aislados, frecuentemente; en ciertos pacientes que ofrecen condiciones favorables para su proliferacin, tales como los tratados con drogas antineoplsicas, corticoides, antibiticos y los que presentan disproteinemia o debilidad orgnica generalizada. Para realizar un diagnstico correcto de una micosis producida por un hongo oportunista hay que extremar todos los cuidados posibles, pues podra tratarse de una contaminacin accidental de los materiales o muestras extradas y procesadas; por lo tanto deben tenerse muy en cuenta: a) b) c) d) e) Hallazgo del mismo tipo de parsito en muestras extradas con varios das de intervalo. Desarrollo del mismo hongo en todos los sembrados. Pruebas serolgicas positivas. Estudio de las causas predisponentes. Mejora o curacin con el tratamiento adecuado.
CANDIDOSIS. DEFINICIN Micosis primaria o secundaria ocasionada por levaduras endgenas y oportunistas del gnero Cndida, especialmente C. albicans. Las manifestaciones clnicas son localizadas, diseminadas o sistmicas; pueden afectar piel, mucosas, estructuras profundas y rganos internos. Las alteraciones histopatolgicas varan desde inflamacin mnima hasta supuracin o granuloma. La evolucin es aguda, subaguda o crnica. ETIOPATOGENIA Los agentes causales son las levaduras anascosporadas. Se han descrito 81 especies, de las cuales al menos siete causan enfermedades en seres humanos. El gnero Candida, en sentido amplio, es dimorfo. Las especies ms comunes son: Candida Candida Candida Candida Candida Candida Candida albicans. guilliermondii. parapsilosis. kruseii. tropicalis. pseudotropicalis. stellatoidea.
C. albicans se ha dividido en varios biotipos, y por sus caractersticas antignicas, en los grupos (serotipos) A y B. Estos hongos se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, pero C. albicans solo se encuentra como endosaprfito del tubo digestivo de mamferos y aves. En seres humanos son comensales de la cavidad bucal, tubo digestivo y mucosa vaginal. La mayor parte de las levaduras tambin s encuentran en la piel sana, excepto C. albicans y C. tropicalis, que se llegan a aislar de regin perianal, peribucal y dedos. Hay resistencia natural a la infeccin, pero no est bien definida, quizs depende de factores inhibidores, concentraciones sricas elevadas de hierro, potenciales de xido-reduccin y competencia entre levaduras por nutrimentos. Es probable que los neutrfilos sirvan como defensa primaria contra invasin y diseminacin. La infeccin ocurre a
partir de un foco endgeno y en pocas ocasiones, del medio externo. Los hongos actan como oportunistas y se convierten en patgenos cuando hay alteraciones de inmunidad celular, como inmunodeprimidos; a consecuencia de cambios fisiolgicos de la flora normal. La forma congnita puede ocurrir por invasin ascendente con afeccin de la membrana corioalantoidea. En la candidosis mucocutnea crnica los linfocitos T pierden su capacidad para reaccionar contra el estmulo antignico general o contra antgenos especficos de Candida. La candidosis puede ser enfermedad ocupacional o transmitirse por contacto sexual. Los factores predisponentes son mltiples y muchas veces combinarse.
FACTORES QUE PREDISPONEN A CANDIDOSIS. ESTADOS FISOLGICO. ENFERMEDADES DEBILITANTES Infancia y vejez. Neoplasias. Embarazo. Infecciones. Infeccin por VIH. FACTORES LOCALES. MEDICAMENTOS Y OTROS TRATAMIENTOS Humedad. Anticonceptivos. Oclusin cutnea. Antibiticos de amplio espectro. Prtesis. Glucocorticoides. Heridas y quemaduras. Inmunosupresores. Hemostasis. Citotxicos. Radioterapia. ENDOCRINOPATAS Y INTERVENCIONES QUIRRGICAS ENFERMEDADES METABLICAS Diabetes. Ciruga. Obesidad. Hiperalimentacin parenteral. Hiperuricemia. Cateterismo. Insuficiencia tiroidea. Traqueostoma. Deficiencia de hierro. Drogas por va IV. Poliendocrinopata.
La gravedad de la infeccin depende sobretodo de las alteraciones primarias del husped ms que de las propiedades patgenas del hongo. El microorganismo causal ms frecuente y virulento es C. albicans, son menos patgenas C. stellatoidea y C. tropicalis. En
pacientes con SIDA se encuentra con mayor frecuencia C. albicans serotipo B, pero al parecer no son cepas en particular virulentas. Candida es una levadura con la capacidad para producir filamentos. La fase de levadura est relacionada con la fase saproftica y con la iniciacin de lesiones clnicas; en cambio, la fase micelial se relaciona con la forma parasitaria e invasora , a la inversa de casi todos los hongos dimorfos. Las levaduras se adhieren, por medio de mananas, al epitelio antes de invadirlo; se ha encontrado en la pared celular una glicoprotena cida que es el componente antignico de mayor importancia; tambin se ha encontrado una candidotoxina que in vitro es txica para clulas animales e in vivo produce eritema. Las anormalidades de los linfocitos T se acompaan de deficiencia de linfocinas activadoras de macrfagos y por consiguiente, de fagocitosis inadecuada. En la patognesis de candidosis vaginal se ha sealado la posibilidad de mutaciones fenotpicas hacia sepas de mayor virulencia. Los factores de virulencia incluyen: mayor capacidad de adherencia, produccin de proteasas y formacin de tubos germinativos. CUADRO CLNICO Se desconoce el periodo de incubacin. En la boca (muguet o algodoncillo) puede ser difusa y limitarse a una sola regin y afectar el velo del paladar, carrillos y encas; hay enrojecimiento y placas mucosas blanquecinas y adherentes que dan el aspecto de natas de leche, son asintomticas o se acompaan de sensacin de quemadura, sequedad de boca y sabor metlico. La evolucin es aguda o crnica. Segn el aspecto, se han descrito diferentes formas clnicas: a) seudomembranosa; b) lengua negra vellosa; c) atrfica aguda o crnica; d) hiperplasia romboidal media; e) erosiva o dolorosa. La queilitis angular afecta las comisuras bucales, se manifiesta por un tringulo de base externa, constituido por eritema y fisuras, hay descamacin fina o grandes escamas blanquecinas de aspecto micceo.
En la vaginitis se presenta inflamacin, leucorrea blanquecina, espesa y grumosa; prurito intenso, sobre todo premenstrual y extensin de las lesiones a vulva y perin. La mucosa vaginal muestra placas blanquecinas, amarillentas o seudomembranosas. Los intertrigos son primarios o por extensin de una localizacin en mucosas; afectan pliegues, como los axilares, submamarios, inguinales, surco interglteo, espacios interdigitales de manos y pies. Se caracterizan por eritema, descamacin y piel macerada, bordes marcados por un collarete de escamas y lesiones satlite papulares, vesiculares o pustulosas, prurito y dolor. La forma neonatal se presenta como muguet o con lesiones vesiculares o pustulosas diseminadas que afectan sobre todo el tronco, aparecen desde el nacimiento y curan solas en una a cuatro semanas; en ocasiones persisten varios meses. En adictos a drogas predominan las lesiones foliculares en cabeza y cara; tambin hay formas secundarias grandes en quemados. La paroniquia es una inflamacin periungueal dolorosa, a veces con salida de pus a la presin; despus sobreviene la afeccin ungueal. Hay oniclisis, o engrosamiento y deformacin de la ua, presencia de estras transversales y cambios de color que van del blanco amarillento al verde, caf (marrn) o negro. La candidosis mucocutnea crnica se inicia en la lactancia o la niez; se relaciona con anormalidades genticas: agenesia o displasia del timo, con agammaglobulinemia o sin ella y la consecuente disfuncin linfocitaria, defectos de la funcin de leucocitos, endocrinopatas. Puede ser idioptica o acompaar a una deficiencia de zinc. Cuando se presenta en adultos afecta a mayores de 35 aos de edad y se relaciona con enfermedades malignas internas. Candida puede afectar cualquier tejido, incluso huesos y articulaciones. Las manifestaciones clnicas dependen del rgano afectado. La froma sistmica es grave y puede afectar aparato urinario y riones, endocardio, meninges e incluso produce queratitis. Las formas alrgicas no estn bien estudiadas; pueden ser canddides, que a veces son lesiones vesiculares en manos, o se manifiestan por urticaria, eccema, asma y gastritis.
CLASIFICACIN DE LAS CANDIDOSIS. Bucal. Digestiva. Vaginitis y balanitis. Bronquial y pulmonar. Intertrigos. Paroniquia y onicomicosis. Vesiculopustular y folicular. Candidosis mucocutnea crnica (CMCC) Diseminada y profunda Granuloma candidsico. Aparato genitourinario y riones. Endocarditis. Meningitis. Septicemia. Candidemia iantrgena. Canddides. Eccema. Asma. Gastritis.
Mucocutnea Localizada Cutnea
Sistmica
Alrgica
DIAGNSTICO MICOLGICO Materiales: El estudio se realiza sobre escamas de piel, uas, esputos, pus, flujo vaginal. Examen microscpico directo:
Entre porta y cubreobjeto se observan pus, esputo, flujo, etc. Pueden realizarse coloraciones como la de Gram, ya que las levaduras son gram positivas. Los raspados de piel y uas se colocan sobre el portaobjeto con una gota de NaOH al 30%, calentando suavemente al mechero para aclarar el material corneo de la piel. Se observarn las levaduras brotantes y, frecuentemente seudomicelio. Cultivo: Las siembras se realizarn en Sabouraud glucosado con y sin antibiticos. Las levaduras ya aparecen formando una colonia blanquecina y cremosa a las 24-48 horas de incubacin a 28 y 37C. Reconocimiento de las especies: La Candida es una levadura imperfecta que no produce ascosporos en el bloque de yeso; sembrada en agar harina de maz o medios especiales que se pueden adquirir en el comercio, origina seudomicelio, lo que no sucede con las levaduras perfectas. En este medio la C. albicans produce clamidosporas que son caractersticos de esta especie. Existen medios de cultivos diferenciales para las distintas especies de Candida. Incubando a 37C una suspensin de levaduras en estudio en 0.5 cm de suero humano inactivado, despus de 2 a 4 horas la C. albicans y la C. stellatoidea forman filamentos, mientras que las otras especies no lo hacen.
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Otra reaccin bioqumica es la reduccin de sales de trifeniltetrazolio, incorporadas al Sabouraud glucosado al 0.10% (previa esterilizacin a de atmsfera durante 20 minutos), sembrando por estras en el tubo e incubando 24 a 48 horas a 28C. La reduccin de estas sales por las distintas especies de Candida da colores que van desde el blanco ( C. albicans) hasta el rojo violceo (C. tropicalis). Se realiza tambin la prueba bioqumica azcares (zimograma). Se prepara un caldo base indicador (prpura de bromocresol en alcohol colocando campanitas de Durham invertidas en de fermentacin de con agregado de un al 1.6%) al 1000, el medio de cultivo.
Cuando se carecen de stas pueden utilizarse las tapitas de ampollas usadas que las suplen perfectamente y son mucho ms econmicas. Los azcares por utilizar son glucosa, sacarosa, maltosa y lactosa al 1%. Estos se agregan al medio de cultivo y se esterilizan a de atm durante 15 minutos. Tambin se pueden esterilizar previmente por filtracin o agregando cloroformo a la solucin del azcar (concentrada). Se agita y se deja reposar 24 horas. Luego se agrega aspticamente con pipeta estril a cada tubo el volumen de solucin madre de cada azcar que permita obtener una concentracin final de 1% en el medio. Se siembran las levaduras en estudio y se incuban a 37C durante 48-72 horas. La acidificacin del medio se revela por el viraje del indicador del violeta al amarillo, y la fermentacin, por el desprendimiento de gas que se acumula en las campanitas. CARACTERES BIOQUMICOS DE LAS ESPECIES DE CANDIDA.
ESPECIES SEUDO CLAMIDOS FILAMEN TETRA ZIMOGRAMA MICELIO PORAS TO EN ZOLIO GLU SACA MAL LAC SUERO COSA ROSA TOSA TOSA + + + Blanco AG A AG O + + + Rosado AG A AG O + + RojoAG AG AG O violce o + Rosado AG AG O AG + + + Rojo Blanco Blanco AG AG AG AG O O O O O O O O
C. ALBICANS
C. stellatoidea C. tropicalis C. pseudotropicalis C. guillier mondii C. kruseii C. parapsilosis
AG: cido y gas. A: cido. O: no hay acidificacin ni produccin de gas. Reaccin intradrmica: Se usa muy poco, ya que la gran mayora de las personas reaccionan positivamente a la intradermorreaccin de la Candida, aun
no estando enfermas. Por lo tanto, no debe utilizarse, pues no ofrece ninguna seguridad en cuanto al resultado. Puede ser til en procesos alrgicos aplicando el antgeno en forma decreciente para desensibilizar.
Tcnicas inmunolgicas: La aglutinacin tiene poco valor. La tcnica de fijacin del complemento es ms segura, pero presenta el inconveniente de dar reacciones cruzadas con antgenos de Histoplasma, Blastomyces dermatitidis y Coccidioides immitis. Las reacciones de inmunodifusin son las ms seguras y demuestran la presencia de precipitinas sricas en casos de candidiasis sistmicas. GLOSARIO
Agenesia: Desarrollo incompleto. Balanitis: Inflamacin del glande del pene o del cltoris. Comisuras: Regin en donde se unen estructuras tales como labios, prpados. Intertigios: Erupcin eritematosa de la piel por friccin de partes adyacentes. Onicolisis: Lento proceso de desprendimiento de ua del lecho ungueal, comenzando por el borde libre y progresando gradualmente hacia la raz. Periungueal: Alrededor de la ua. Quelitis: Inflamacin de los labios. Queratitis: Inflamacin de la crnea. Ungueal: Relativo a las uas.
Urticaria: Trastorno cutneo caracterizado por aparicin de ronchas con prurito intenso y centros elevados, por lo general blancos, con eritema.
TCNICA: Realizar un examen en fresco, tincin de Gram y prueba de filamento en suero a las cepas de las diferentes especies del gnero Candida que les proporcione el preparador, as como tambin resembrar dichas especies para conocer tiempos de crecimiento y caractersticas coloniales. Nota: si se tiene un paciente con posible Candidiasis, tomar la muestra y realizar un cultivo. REACTIVOS Muestra biolgica Flujo vaginal. Material Hisopo estril. Mechero bunsen Porta y cubreobjetos Equipo Microscopio OBSERVACIONES GENERALES: Candida en medio de agar Sabouraud
Esporas de cndida albicans 40x tomadas del cultivo en el Agar Sabouraud
Esporas de candida en 40x m toadas del cultivo de candida. 1.Saccharomyces cerevisiae, 2 C. saitoana, 3 C. pintolopesei, 4 C. albicans, 5 C. tropicalis, 6 C hrusei.
CONCLUSIN: Se realizo el cultivo de Candida albicans en Agar Sabouraud incubado A 37 C a 48- 72 horas
BIBLIOGRAFA: Micologa Mdica, R. Arenas; Ed. Interamericana; Pg. 223-232.
Xalapa, Ver., a
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PRACTICA 7. GNERO ASPERGILLUS.

OBJETIVO: Que el alumno conozca las diferentes especies del gnero Aspergillus, sus colonias, sus estructuras y las micosis que pueden ocasionar para poder identificarlas en el laboratorio. GENERALIDADES: IDENTIFICACIN DE MOHOS HIALINOS DE CRECIMIENTO RPIDO. Incluyendo cuatro especies de Aspergillus, se tienen 14 especies de mohos hialinos que abarcan la mayora de este grupo de hongos que pueden encontrarse en el laboratorio clnico. Los saprfitos hialinos pueden dividirse en los siguientes subgrupos, basados en diferencias en el aspecto microscpico de sus elementos de fructificacin: SAPRFITOS HIALINOS TIPO DE SUBGRUPO AL QUE PERTENECEN Los conidiforos terminan en vesculas dilatadas; conidias sostenidos en cadenas (catenulados) acrgenamente desde las puntas de filides que cubren partes o toda la superficie de la vescula. Conidiforos libremente ramificados;
GNEROS. Aspergillus.
Penicillium.
Paecilomyces. Scopulariopsis.
Acremonium. Trichoderma. Gliocadium. Fusarium. Chrysosporium. Sepedonium. Scedosporium (Monosporium) Apiospermun (Pseudalles cheria boydii) El gnero Aspergillus que pertenece al subgrupo de los conidiforos que terminan en vesculas dilatadas es que trataremos a continuacin. Las especies de Aspergillus son los mohos de crecimiento rpido que se encuentran mas frecuentemente en laboratorios clnicos y deben considerarse en la identificacin diferencial de cualquier moho hialino de crecimiento rpido. Microscpicamente, el gnero se caracteriza por cadenas de conidios pequeas u ovales a esfricas sostenidas en cadenas en las puntas de las filides radialmente ubicadas sobre la superficie del pice dilatado del conidiforo denominado vescula. Algunas especies de Aspergillus, sobre todo A. glaucus y A. nidulans, pueden reproducirse sexualmente en medios de cultivos y pueden verse cleistotecios. Tambin rara vez se ven clulas de Hlle que son estructuras hialinas esfricas de origen desconocido. Afortunadamente el microbilogo slo necesita familiarizarse cabalmente con las caractersticas de tres especies que son clnicamente significativas: A. fumigatus, A. Nger y A. flavus. Una cuarta especie, A. terreus se est recuperando con frecuencia cada vez mayor de muestras clnicas, ya que basados en diferencias de pigmentacin de las colonias, tamao y longitud de las cadenas y otros criterios, Raper y Fenel, han clasificado a los Aspergillus en 18 grupos. Las especies de Aspergillus estn amplimente distribuidas en la naturaleza donde actan como saprfitos comunes en granos, hojas, suelos y desperdicios.
conidios que nacen desde los pices de anlidos o filides que nacen de mtulas que forman un penicilio. Conidiforos nicos; conidios sostenidos en cabezuelas, generalmente en la punta de conidiforos rectos o ensanchados. Conidiforos nicos, sosteniendo cada uno un conidio solitario.
Los conidios se dispersan y el hombre ms comnmente se infecta por inhalacin de esporas transportadas por el aire. Dentro de las patologas que causa su presencia, es comn su diseminacin a vsceras y particularmente al SNC de los enfermos de SIDA, as como la localizacin del mismo en ganglios linfticos, senos, corazn, tiroides y piel. A continuacin se da un resumen de las caractersticas de las 4 especies de Aspergillus de mayor importancia clnica.
ESPECIES .
A.fumigatu s.
CARACTERSTICA S MACROSCPICAS
Crece en 2-6 das en medio sin cicloheximida. La colonia crece con borde evidente, es vellosa y blanca durante el crecimiento precoz y luego se hace aterciopelada y granulosa. Color verde a gris por produccin de conidios pigmentados. El reverso de la colonia tienen un color verde a crema. Comienza como colonia blanca que se vuelve amarilla y desaroolla efecto pimienta negra en la superficie (se pueden vovlver negras con el tiempo).
CARACTERSTICA S MICROSCPICAS
Las hifas son hialinas y tabicadas. La longitud de los conidiforos es moderada y tiene una clula pie caracterstica en su base. Las vesculas tienen forma de cpula y la mitad est cubierta por filides desde las cuales salen cadenas de conidias globulosas equinuladas de 2-3 de dimetro. El cultivo tolera temperatura de 45C. Las hifas son tabicadas y los conidiforos son largos y lisos. Las vesculas son esfricas y dan origen a mtulas y filides que se oscurecen.
MATERIAL BIOLGIC O
PATOGNESIS
Depende del Causa infecciones tipo de la oportunistas en el lesin. hombre, incluyendo : enfermedades pulmonares granulomatosas, broncopulmonares alrgicas diseminadas. La forma diseminada se ve en pacientes inmunocomprometido s
A. nger.
Se obtiene de lesiones supurativas costrosas del odo de nadador.
Es una causa comn de las lesiones cavitarias en pulmones o senos paranasales. Se encuentra en alto porcentaje en casos de otomicosis.
A. flavus.
El reverso de la colonia es color gamuza o crema. Conidias negras y rugosas. Las colonias crecen en 5 das a 25C. Colonias habitualmente amarillas.
A. terreus.
La colonia crece en 5 das a 25C. Aparece de color canela-beige o marrn algodonosa con pliegues radiales o irregulares. Produce esporulacin y se hace granuloso.
Vesculas globosas y redondas. Filides solas o con mtulas. Conidias elpticas a esfricas amarillas con el tiempo de tornan equinuladas. Presencia de numerosos eosinfilos y cristales de Charcot-Leyden en esputo. Vesculas pequeas de 15 en forma de cpula y sostienen mtulas con una hilera de filides. Producen aleuriosporas nicas en hifas sumergidas. Sus conidias miden aproximadamente 23 de dimetro.
Se obtiene de esputo o de tapones mucosos bronquiales.
Es causa comn de Aspergilosis pulmonar alrgica. Causa enfermedad diseminada en huspedes inmunocomprometido s
Depende del Es agente causal de tipo de la casos de endocarditis lesin. y enfermedad broncopulmonar. Se ha informado de casos de osteomielitis y casusa infeccin poliponasal, ganglio linftico cervical, meninges y enfermedad diseminada. Causa oticomicosis en Japn y Formosa.
ESQUEMAS: a) b) c) Cabeza con frutos. Esporulacin de densos racimos de conidias oscuras en la superficie de la vescula (A. nger) . Cabeza con frutos, muestra mtulas y una hilera de filides con conidias en sus puntas (A. nger). Cabeza con frutos. Obsrvese la vescula claviforme, una sola hilera de filides con esporulacin limitada a la mitad de dos tercios superiores de la superficie de la vescula. ( A. fumigatus).
d)
Cabeza con frutos, muestra filides que se originasn en dos tercios superiores de la superficie de la vescula. ( A. fumigatus). Cabeza con frutos, muestra mtulas y una hilera de filides que produce conidias a partir de la circunferencia de la superficie de la vescula ( A. flavus). Cabezas con frutos y aleuriosporas clsicas de la especie A. terreus. Vescula y cleistotecio que muestra forma sexual y asexual de reproduccin de A. terreus. Clulas esfricas de Hlle producidas por A. terreus.
e)
f) g) h) TCNICA:
a) b)
Observar las colonias de las diferentes especies de Aspergillus que se proporcionen en el laboratorio. Realizar un examen en fresco a las especies de A spergillus que le proporcionen en el laboratorio.
REACTIVOS Muestra biolgica Exudado tico. Material Hisopo estril. Mechero bunsen Porta y cubreobjetos Equipo Microscopio
CONCLUSIN:
NOTA: Recuerde que el gnero Aspergillus esporula demasiado, MUCHO CUIDADO. BIBLIOGRAFA: Micologa Prctica de Laboratorio, Koneman Roberts; Ed. Mdica Panameriacana.
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PRACTICA 8. DERMATOFITOS.
OBJETIVO: Que el alumno identifique y asle un dermatofito, a partir de la muestra de un paciente del cual se sospeche de la presencia de una micosis superficial. GENERALIDADES: Las dermatofitosis o comnmente llamadas tias, son exclusivamente cutneas, que afectan tejidos con queratina (cabellos, uas, epidermis). Las dermatofitosis o tias se dividen dependiendo de la regin anatmica en donde se presentan: Tinea Tinea Tinea Tinea Tinea Tinea Tinea capitis pedis cruris unguium corporis barbae manun Tia de la cabeza. Tia de los pies. Tia de la ingle. Tia de las uas. Tia del cuerpo. Tia de la barba. Tia de las manos.
Los dermatofitos son un grupo de hongos que se reproducen asexualmente por macro y microconidios, y estn comprendidos en tres gneros. 1. Microsporum. Se presentan en pelo, piel y raramente en uas. 2. Epidermophyton. Se presenta en piel, raramente en uas y nunca en pelo. 3. Trichophyton. Se presenta en pelo, piel y uas. A continuacin se presentan dos tablas para identifica
HONGOS PRODUCTORES DE TIAS. Otras especies importantes:

GNERO ESPECIE. ASPECTO MACROSCPICO DE LAS COLONIAS. Colonia lanosa, algodonosa que crece sobre toda la superficie del medio y le transmite un color naranja. ASPECTO MICROSCPICO macroconidias microconidias hifas No tienen caracterst ica especial. Cabeza. Cara. Cuerpo. Pies. LOCALIZA CIN
Microsporu m
canis
En forma de No hay nave hasta con tres septos y nicas, abundantes, tpicas para su identificacin.
M. audounii. M. gypseum.
GNERO ESPECIE. ASPECTO MACROSCPICO DE LAS COLONIAS. Colonia radiada pegada al medio de color verde limn ASPECTO MICROSCPICO macroconidias microconidias hifas No tienen Ingles. caracterst Pies. ica especial. A veces en racimos de pltanos. LOCALIZA CIN
Ephydermophyton
Flocossum
Romas en su No hay extremidad rectal, con 1-2 septos y se presentan en racimos de 23 Son abundantes.
GNERO
ESPECIE.
Trichophyton
tonsurans
ASPECTO ASPECTO MICROSCPICO MACROSCPICO DE macroconidias microconidias hifas LAS COLONIAS. Colonia caf No hay. Piriformes que Se claro, aspecto crecen en forma bifurcan duro, correspondiente en acartonado y , una frente a ngulo cerebriforme. otra. recto al filament o principal y sobre estas estn las esporitas
LOCALIZA CIN
Cabeza. Cara. Cuerpo. Pies.
GNERO
ESPECIE.
Trichophyton
rubrum
ASPECTO MACROSCPICO DE LAS COLONIAS. Colonias algodonosas que crecen en todo el medio. Primero dan coloracin roja en extremos que despus se difunde al medio.
ASPECTO MICROSCPICO macroconidias Regularmente no hay, solo cuando son viejas existen en forma de salchicha. microconidias Piriformes y escasas, prcticamente el no encontrar nada es caracterstico de este hongo. hifas No tienen ninguna caracterst ica para identificarlas
LOCALIZA CIN
Cuerpo. Manos. Pies. Ingles.
GNERO
Trichophyton
ASPECTO MACROSCPICO DE LAS COLONIAS. Mentagro- Colonias phy blancas, tes aspecto pulverulento que crecen invadiendo todo el medio.
ESPECIE.
ASPECTO MICROSCPICO macroconidias Regularmente no hay, cuando son viejas existen escasas en forma de salchicha y lpiz. microconidias hifas
LOCALIZA CIN
Redondas, En forma pequeas, en de espiral, racimos y tpica para abundantes. la identificacin.
Cuerpo. Manos. Pies. Ingles.
TCNICA: c) d) e) Realizar una toma de muestra de un paciente que se sospeche de micosis superficial. Aislar el dermatofito e identificarlo. Realizar un examen en fresco.
REACTIVOS Muestra biolgica Uas, pelos, escamas parasitadas.
Material Mechero bunsen Porta y cubreobjetos Medio de cultivo: Sabouraud. KOH del 10-30%. Solucin salina. Equipo Microscopio OBSERVACIONES GENERALES:
Descanacion localizada entre los dedos con KOH entre los Hongo afectando el area localiza dedos y en la planta.
CONCLUSIN:
BIBLIOGRAFA: Micologa Mdica Bsica, A. Bonifaz; Mndez editores, S.A.; Mxico, D.F. Xalapa, Ver., a ___________________________________
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PRACTICA 9. INMUNOLOGA Y MICOSIS.

OBJETIVO:
Que el alumno adquiera conocimientos acerca de los procesos inmunolgicos que se presentan en una micosis. INTRODUCCIN: La informacin que se dispone sobre la respuesta inmunitaria sobre los hongos productores de micosis es muy limitada. Publicaciones recientes se concretan a decir que la inmunidad en las micosis es primordialmente mediada por clulas y que, aunque se detectan fcilmente anticuerpos IgM e IgG especficos, estos no tienen ningn papel protector. El factor husped desempea un papel principal en el desarrollo de la mayora de las infecciones fngicas. La existencia de un estado de inmunocompetencia es esencial para evitar o disminuir el impacto de la micosis. Se conoce la existencia de una inmunidad natural as como el desarrollo de una respuesta inmune especfica frente a los antgenos fngicos en la mayora de las micosis. GENERALIDADES: INMUNIDAD NATURAL O INNATA. La integridad cutneo mucosa constituye una primera barrera a la penetracin de hongos patgenos o inicialmente saprobios. La ruptura del manto cutneo o mucoso, como sucede en las heridas, quemaduras, etc., abren una va de entrada a los hongos ambientales, principalmente a los endosaprobios, como Candida albicans. Otros factores de inmunidad natural son la funcin normal de los granulocitos y macrfagos, as como de los linfocitos natural killer. El suero humano normal tienen una conocida actividad funguicida: la activacin de la va alternativa del complemento y los reactantes de fase aguda tambin son mecanismos defensivos de la infeccin fngica. La respuesta inmediata a una agresin microbiana es la inflamacin aguda, que es consecuencia de alteraciones vasculares con atraccin de leucocitos. Los reactantes de fase aguda comprenden la ferritina y los componenetes del complemento, la falta de antitripsina, el fibringeno y la haptoglobina, as como la PCR; esta PCR junto con el
complemento son las protenas de fase aguda que se relacionan directamente con la eliminacin de los microorganismos. Los mecanismos de inmunidad natural o innnata son eficaces para proteger frente algunos hongos dbilmente patgenos, tales como los cigomicetos, especies de Aspergillus, etc. Los leucocitos neutrfilos humanos intervienen activamente para eliminar los hongos patgenos primarios y tambin diversos oportunistas. La actividad de stos leucocitos slo es posible si se asocia a otros factores defensivos del husped como son los factores defensivos del husped como son los factores sricos o reactantes de fase aguda. Los linfocitos natural killers, han demostrado tener efectos funguicidas sobre algunos hongos como el Criptococos y las Candidas. PAPEL DE LOS LEUCOCITOS POLIMORFONUCLEARES. El mecanismo mediante el cual los hongos fagocitados por los PMN llegan a ser destruidos acta a travs de la va de la mieloperoxidasa que proporciona la mayor actividad funguicida. Otros mecanismos son las protenas cotinicas y la lisozima. En la C. albicans los PMN pueden fagocitar y destruir las levaduras pero no tienen la misma habilidad en el caso de las pseudohifas difcilmente fagocitables si estn muy desarrolladas. Se han observado rosetas de PMN y de monocitos alrededor de levaduras con gruesa cpsula. INMUNIDAD HUMORAL EN LAS MICOSIS. Los hongos y sus productos extracelulares constituyen una importante fuente de antgenos capaces de despertar una respuesta inmunohumoral. Se ha podido demostrar en numerosas micosis primarias y oportunistas la presencia de anticuerpos especficos de clase IgG, IgM, IgE e incluso IgA El predominio de una u otra clase de inmunoglobulinas depende del antgeno, el estado del husped, la forma clnica y fase evolutiva de la micosis. Sin embargo, no se ha podido demostrar su papel como efectores de una proteccin frente a la infeccin.
Las inmunoglobulinas y el complemento parecen desempear un papel protector pero ste no sera directo ni primordial, sino asociado a la actividad celular de PMN y macrfagos. La existencia de complejos inmunes es comn en algunas formas clnicas de micosis cono en la Candidosis mucocutnea crnica. Los factores bloqueantes (unin anticuerpos-mananos) podran ser los responsables de una disminucin la blastognesis de los linfocitos. Los anticuerpos del tipo IgE se encuentran muy relacionados con las reacciones de hipersensibilidad inmediata a los hongos. INMUNIDAD CELULAR EN LAS MICOSIS. Una de las primeras observaciones sobre la inmunidad en las micosis fue la existencia de pruebas cutneas de tipo retardado (tuberculina) como consecuencia de la inoculacin intradrmica de extractos de micelio o del medio de cultivo de diversos hongos, tricofitina, candidina, etc. Este tipo de respuesta cutnea corresponde a una respuesta inmune de mediacin celular, la cual se acenta o desaparece en los casos de diseminacin de la micosis o bien de estados terminales. Se acepta que el papel de la inmunidad celular desempea un papel importante en los mecanismos de proteccin frente a la infeccin mictica. La anergia cutnea en las micosis es especfica y reversible, y puede ser explicada por uno o ms de los siguientes mecanismos; linfocitaria (inmunocomplejos linfoquinas de los linfocitos T supresores); aumento de los linfocitos T supresores o bien de una alteracin en la circulacin de los linfocitos. Se ha demostrado la importancia de ciertos factores raciales y genticos en el desarrollo y evolucin de las micosis; las coccidioidomicosis es un ejemplo de factores genticos e inmunolgicos relacionados con la evolucin de la infeccin. INMUNOTERAPIA ESPECFICA EN LAS MICOSIS. El desarrollo de vacunas y su empleo con la finalidad protectora, se conoce experimentalmente en diversas micosis, en particular, en las dermatofitosis, candidosis, etc. En la prctica slo se preparan vacunas
con hongos levaduriformes.
blastosporados
generalmente
Candida
otros
La aplicacin de estos tratamientos en el hombre no ha demostrado ser eficaz, excepto en el caso de algunas alergias respiratorias. PREPARACIN DE ALERGENOS MICTICOS. Para la obtencin de alergenos atmosfricos se debe realizar lo siguiente: 1. 2. 3. 4. provenientes de hongos
Aislar el hongo del medio ambiente y clasificarlos. Sembrar en el caldo Sabouraud las especies aisladas. Incubar a 28C hasta que le crecimiento del hongo forme una pelcula en la superficie. Desecar en un desecador de cloruro de calcio. Pulverizar.
Existen distintas soluciones extractoras que pueden ser utilizadas: SOLUCIN DE COCA. Cloruro de sodio Fenol Bicarbonato de sodio Agua destilada 0.5 g 0.4 g 0.275 g 100 cm3
Debe hacerse burbujear anhdrido carbnico hasta que no haya viraje a rojo, utilizando solucin de fenolftalena. SOLUCIN DE STIER-HOLLISTER. Glicerina pura Cloruro de sodio Agua destilada c.s.p. 4.6 g 0.4 g 100 cm3
Hacer una extraccin cualquiera de las soluciones extractoras utilizando el hongo pulverizada a razn de 5 g de polvo para 100 cm 3 de solucin extractora. Realizar la extraccin durante 4-6 das. Pasar luego por filtro Seitz.
Deber valorarse el extracto alergnico dosado el nitrgeno. La solucin para pruebas intradrmicas deber contener 0.01 mg de nitrgeno/cm3. Cuando son soluciones para el tratamiento de sensibilizantes debern hacerse soluciones del alrgeno 1000 en solucin fisiolgica. SUSPENSIONES DE HONGOS PARA PRUEBAS INTRADRMICAS. Levadurina, blastomicetina. 1. Cultivar los hongos en agar Saboraud. 2. Realizar una suspensin homognea en solucin fisiolgica (turbidez comparada con los tubos 3 o 4 de la escala de Mc Farland) 3. Dejar reposar en la heladera para separar los grumos ms gruesos. 4. Calentar a 60C durante una hora. 5. Repetir la operacin durante 3 das. 6. Agregar mertiolate al 10000. 7. Controlar la esterilidad. 8. Distribuir en ampolletas. Esporotriquina. 1. 2. 3. 4. Utilizar varias cepas de Sporotrichum schenckii. Emplear el medio de Saboraud glucosado con cistina 50 mg. Cultivar en estufa a 37C durante 10 das. Suspender el cultivo en solucin fisiolgica y operar de acuerdo con la tcnica descrita anteriormente. 5. Verificar la dilucin ms conveniente para enfermos de esporotricosis. Paracoccidioidina II. 1. Cultivar varias cepas de P. brasillensis en agar sangre a 37C durante 15 das. 2. Realizar una suspensin en una solucin fisiolgica fenolada al 0.5%, agitando peridicamente el recipiente que contiene perlas de vidrio. 3. Calentar luego la suspensin a 80C durante media hora por 3 das sucesivos. 4. La suspensin madre debe diluirse al 5% en solucin fisiolgica fenolada para poder ser utilizada en la prueba intradrmica.
FILTRADOS. Histoplasmina, Coccidioidina, Paracoccidioidina, etc. 1. Cultivar las cepas de los distintos hongos en el medio de Smith, sin pepetona durante 2-3 meses, mantenidas a temperatura ambiente. Se aconseja utilizar balones o erlenmeyer que ofrezcan una superficie amplia. 2. Filtrar por Seitz. 3. Agregar mertiolate al 10000. 4. Deber verificarse el poder del antgenno en un lote de cobayos infectados con el hongo cuyo filtrado se estudia y, basndose en esto se realizar la dilucin conveniente. 5. Tambin se ensayar el filtrado en enfermos portadores de la micosis correspondiente. 6. Deber recordarse que son reacciones tardas y que la lectura se realizar a las 24 y 48 horas. Tricofitina. 1. Preparar el caldo de Saboraud glucosado al 2% con 1% de peptona y 0.5% de extracto de levadura. 2. Distribuir en frascos que ofrezcan una superficie amplia. 3. Esterilizar a de atm durante 20 minutos. 4. Sembrar los dermatofitos (M. canis, T. mentagrophytes, T. rubrum, E. floccosum, etc.) en la superficie del lquido. 5. Cultivar a temperatura ambiente durante 1-2 meses. 6. Filtrar. 7. concentrar al dcimo al vaco a temperatura 40C. 8. Dializar. 9. Agregar cido fenlico al 0.2%. Para preparar las pruebas intradrmicas se utiliza el antgeno diluido al 1%. Para emplearlo como agente teraputico o desensibilizante usarlo diluido al 1%. ANTGENO POLISACRIDO DEL P. BRASILLENSIS (PARA REACCIN DE FIJACIN DEL COMPLEMENTO).
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
Sembrar el P. brasillensis en agar Sabouraud enriquecido con vitaminas, extracto de carne y extracto de levadura. Cultivar el preparado a 37C durante 2 meses. Suspender el crecimiento fngico en solucin fisiolgica. Centrifugar la suspensin. Lavar 3 veces con acetona y 3 veces con ter. Realizar una suspensin de las clulas en solucin de Veronal (pH 7.3-7.4) al 15% aproximadamente. La solucin sobrenadante es el antgeno. Realizar prueba de esterilidad. Distribuir y mantener en heladera. Se aconseja conservar el antgeno en frasco tipo penicilina.
PREPARACIN DE VACUNAS. 1. Aislar E Identificar bien las muestras de los hongos blastosporados (generalmente Candida). 2. Sembrar en agar Sabouraud glucosado e incubar a temperatura ambiente a 37C. 3. Suspender el crecimiento fngico en solucin fisiolgica estril en un frasco que contenga perlas de vidrio, previamente esterilizado. 4. Agregar para disgregar los posibles grumos que existan. 5. Agregar 5 gotas de lugol doble para cada 10 cm 3 de suspensin. 6. Dejar actuar una hora. 7. Decolorar luego con solucin de hiposulfito de sodio al 10% (bastan algunas gotas). 8. Diluir la suspensin hasta que sea comparable al tubo 2 o 3 de la escala de Mc Farland, utilizando solucin fisiolgica. 9. Realizar controles de esterilidad para hongos, bacterias aerobias y anaerobias. 10. Agregar mertiolate cuya concentracin final sea de 20000, o tricresol al 0.3%. 11. Distribuir en frascos con tapn de goma. Se aconseja preparar un frasco de vacuna a partir de la vacuna original diluyendo 1 cm3 de esta en 9 cm3 de solucin fisiolgica para ser usada en primer trmino al iniciar la serie vacunante, pues en algunos casos no se puede usar la vacuna original porque produce reacciones violentas. 12. Rotular el frasco No. 1 (dilucin 10) y el nmero 2 (vacuna que origina una turbidez parecida a los tubos 2 y 3 de la escala de Mc Farland).
13. Iniciar la serie con el frasco 1 inyectando 0.10 cm 3por vez hasta llegar a 1 0.5 cm3. Proseguir con esta medida hasta terminar el frasco 1 (tambin se puede llegar a 1 cm 3). Se sigue de la misma manera con el frasco 2. 14. La frecuencia de las inyecciones es de 2 por semana. TCNICAS SEROLGICAS. REACCIONES DE PRECIPITACIN. Son de mucha utilidad en algunas afecciones micticas pues facilitan la evaluacin del curso de la enfermedad, permitiendo con su ayuda confirmar las mismas y pronosticar con cierta seguridad, en algunos casos la evolucin de la enfermedad. En todas las tcnicas usadas los materiales son: sueros de los enfermos y antgenos de los agentes patgenos que se investigan. Los sueros en todos los casos debern ser frescos, recin extrados o conservados en el refrigerador, congelados. Las diluciones de los mismos se harn siempre en el momento de ser empleadas. PREPARACIN DE LOS ANTGENOS. Los antgenos pueden ser dos tipos: 1. Antgenos somticos (celulares): Provienen de la trituracin de los micelios o levaduras. Estas se obtienen cultivando el hongo en medios lquidos por agitacin, incubando a temperatura ambiente. La duracin de la incubacin es de 10 das para A. fumigatus y 48 horas para Candida. En el caso de Histoplasma, Paracoccidioides, etc., la duracin de la incubacin vara pues depende del crecimiento del hongo ya que aquellos tardan ms tiempo en desarrollarse. Luego se rompen las clulas mediante procedimientos que dependen de las disponibilidades del laboratorista. Se usan recipientes estriles con perlas de vidrio agitando mecnicamente o a mano por periodos si no se dispone de un agitador. Lo mejor sera emplear aparato ultrasnicos. Se centrifugan los materiales obtenidos y el sobrenadante se dializa, concentra y liofiliza. 2. Antgenos metablicos:
Se consiguen a partir de filtrados de los cultivos en medios lquidos que han sido incubados a 27C durante 30 das. Los lquidos as obtenidos se separan del crecimiento fngico por filtracin, se les dializa y se concentran y liofilizan. La concentracin del material activo vara de 30 a 100 mg/ml. Los antgenos aspergilarios y los de Candida se emplean en la concentracin de 50 mg/ml para la reaccin de inmunodifusin (Ouchterlony) y de 100 mg para la inmunoelectroforesis. Para la tcnica de electrosinresis las concentraciones utilizadas son: 100, 50 y 25 mg/ml. TCNICA DE LA DOBLE DIFUSIN. La reaccin de precipitacin se efecta mediante la utilizacin de placas Petri (Ouchterlony) n las cuales se formar una capa gelosa. Sobre la superficie del medio se depositar una gota de antgeno y un gramo del suero en estudio que difundir a travs del mismo. Al encontrarse el antgeno con los anticuerpos de suero se formarn lneas opacas de precipitacin que se pueden observar claramente. El medio se prepara con gelosa purificada a una concentracin de 1% utilizando como solvente una solucin buffer de Veronal 0.025 M a pH 8.2. Se le adiciona mertiolate 5000 (concentracin final) como conservador. Si se usa un agar comn deber ser purificado mediante varios lavados con agua destilada. El espesor de la placa de gelosa deber ser de 5 mm. Cuando se utilizan cajas de Petri de 10 cm de dimetro se usarn 15 ml del medio y si las cajas son de 5 cm de dimetro se emplearn 8 ml. Una vez fro el medio, mediante un sacabocado se practicar una perforacin central de unos 12 mm que se destinarn para contener el suero del enfermo. Alrededor de la perforacin central y una distancia de 1 cm, se excavan otros agujeros de 9 mm de dimetro y en ella se ubicarn los antgenos. Para placas de 10 cm se pueden practicar hasta 6 excavaciones laterales y 3 para cajas de 5 cm. Este ensayo puede ser realizado utilizando portaobjeto, cubierto con una capa de agar del mismo espesor y realizando todas las
operaciones ya descritas. Es conveniente porque permite economizar medio y cajas Petri. Cuando los antgenos y anticuerpos difunden, si corresponden y estn en relaciones ptimas, originan lneas o bandas bien visibles de precipitacin. Si las concentraciones son equivalentes, la banda de precipitacin estar situada aproximadamente en la distancia media entre los dos reservorios. Cuando la banda de precipitacin esta ms cerca de uno de los componentes de la reaccin es menor y ser justamente aquella ms cercana al reservorio. TCNICA DEL GRADIENTE. ltimamente se ha adoptado esta tcnica que ofrece resultados ms fieles semicuantitativos. Se prepara una placa de gelosa de la misma manera descrita anteriormente. Se practica un surco central de 3 cm de longitud por 2 mm de ancho y se hacen perforaciones de 5 mm de dimetro a lo largo del surco y en ambos lados. Las dos primeras se hacen a una distancia de 2 mm, las segundas a 3 mm, las terceras a 4 mm y las cuartas a 5 mm del reservorio central, el cual contendr el suero del enfermo, y los agujeros laterales los antgenos correspondientes. Las bandas de precipitacin aparecern ms ntidas con algunos de los sueros a una distancia que vara segn la concentracin de anticuerpos de cada uno de ellos. Lectura de resultados. Las placas se colocan en un recinto de 15-20C y se les observa luego de 1, 2, 5 y 7 das. La precipitacin se produce bajo forma de una o varias bandas opacas en la zona comprendida entre el antgeno y el suero. Las bandas finas en lneas rectas o ligeramente curvas no presentan problemas de especificidad sobre todo si hay varias. Las falsas reacciones aparecen bajo forma de nubes irregulares (banda difusa); ellas pueden deberse principalmente a contaminaciones del suero, hemlisis o lipemia (anillo circular alrededor del reservorio del suero). La presencia de sustancia C n ciertos antgenos fngicos y de la protena C de ciertos enfermos, puede conducir a la formacin de bandas de precipitacin no especficas que desaparecen por la accin del citrato de sodio al 5%. TCNICA DE INMUNOELECTROFORESIS EN GELOSA.
Se utilizan lminas de vidrio (portaobjetos) de 75 X 25 mm, formando sobre ella un depsito de gelosa de 2 mm de espesor. La gelosa purificada se prepara al 1% en un tampn de veronal sdico (pH 8.2) y de fuerza inica de 0.05, adicionado de mertiolate a una concentracin final de 10000. Se marca una perforacin (canaleta) central a lo largo de la lmina, de 65 X 2 mm de ancho, sin retirar del agar. A ambos lados de la canaleta y a una distancia de 3 a 4 mm se practicarn con un sacabocas dos perforaciones redondas de 2 mm de dimetro. En estos reservorios se colocan los antgenos. As preparado el portaobjetos se le ubica en el aparato de electroforesis. Realizando las conexiones pertinentes se efecta la corrida electrofortica bajo un potencial de 5 voltios por cm en los extremos de la lmina durante 30 minutos. Finalizada la operacin se coloca el suero del enfermo quitando previamente el agar de la canaleta central y se ubica al portaobjetos en una cmara hmeda durante 24 a 48 horas, tiempo necesario para que se forme el inmunocomplejo y su precipitacin. Al cuarto da la lmina se sumerge en una solucin de citrato de sodio al 5% durante 24 horas para disolver eventuales precipitados no especficos que se puedan formar entre la sustancia C de ciertos antgenos fngicos y la protena C de los sueros de los enfermos de diversas afecciones no micticas. Las lecturas se realizarn al quinto da. Se puede fotografiar o colorear con Amidoschwart despus de un lavado con solucin fisiolgica durante 24 horas, cambiando la solucin cada 12 horas. Luego se enjuaga con agua y se cubre el portaobjetos con un papel filtro, dejndolo hasta que se seque a temperatura ambiente o a 50C. Se sumerge el colorante durante una hora y se decolora con cido actico al 2-5% en metanol al 50%. Se seca y se conserva. TCNICA DE ELECTROSINRESIS. Recientemente el mtodo de electroforesis desarrollado por Bussard, combina, la electroforesis y la precipitacin inmunolgica entre el antgeno fngico y el suero que contiene los anticuerpos antifngicos sobre un gel de agarosa, siendo una tcnica ms sensible y que permite un rpido resultado a las 2-4 horas.
En condiciones tcnicas elegidas (soportes, tampn) las gammaglobulinas son dirigidas hacia el ctodo, mientras que el antgenos hacia el nodo. El encuentro entre los dos constituyentes de la reaccin se traduce en una precipitacin que se obtiene hacia el final de la migracin. El dispositivo experimental consiste electroforesis y un rectificador de corriente. en una cmara de
Se usan portaobjetos (75 X 25mm) individualmente o en grupos de 6 en cuadros de poliestireno. Se mojan las lminas de gelosa al 1% en agua destilada, se secan y luego se cubren con gelosa purificada o agarosa al 1% en un tampn de veronal sdico. Esta capa debe tenr alrededor de 2 mm de espesor. Con sacabocado especial se hacen agujeros. Las tres perforaciones destinadas a diferentes concentraciones de antgeno estn en el lado del ctodo (-) y las tres destinadas al suero estn en el nodo (+) separadas por 6 mm de distancia. Miden 2 mm de dimetro y recibirn un volumen de 20l cada una. Los antgenos metablicos (filtrados de cultivo) y los antgenos somticos (triturados de micelio) se utilizan a una concentracin de 100, 50 y 25 mg/ml en agua destilada. El tiempo de migracin es de 90 min para una tensin de 5 V/ cm. La lectura se hace inmediatamente pues en ciertos casos se pueden observar desde la finalizacin de la migracin, 1 o ms anticuerpos. En ausencia de bandas de precipitacin inmediata en el preparado es necesario recurrir a la coloracin con azul de Coomassie, procedida de lavados sucesivos de solucin fisiolgica y agua destilada (24 horas). Seguidamente se deseca. REACCIONES DE INMUNOFLUORESCENCIA. Los trabajos de Coombs demuestran que es sumamente importante el marcado de anticuerpos con isocianato de fluorescena para ubicar a los antgenos bacterianos o virales sobre los cortes de tejido. La aplicacin a la micologa mdica es reciente. El mtodo directo emplea un suero inmune o inmunolgico extrado de este suero, conjugadas al fluorocromo. El suero se agrega sobre la lmina donde se halla ubicado el antgeno del (el hongo) que puede estar preparado bajo la forma de frotis o cortes histolgicos. La reaccin Ag-Ab se produce y la localizacin del hongo sobre el preparado se visualiza a la luz fluorescente.
El mtodo indirecto con la tcnica de capas mltiples o en sndwich es la que ms se usa. Para detectar un hongo sobre la lmina se agrega un suero humano o animal que, lgicamente debe contener anticuerpos antihongos; luego se adiciona un suero antiglobulinas humanas masrcadas con isotiocianato de fluorescena. Si la fluorescena persiste despus del lavado, la reaccin Ag-Ab se produjo. Tcnica: Preparacin del frotis: Se usan portaobjetos delgados, muy limpios; con un diamante se trazan crculos de 1 cm de dimetro y distantes algunos centmetros. Los frotis de levaruas, Criptococcis, Histoplasma, etc., se efectan con suspensiones estandarizadas (4-5 levaduras por campo). La fijacin de los frotis, despus de la desecacin, se hace con una o dos inmersiones en acetona. Sueros: Los sueros de los enfermos, conservados a 20C, adicionados de mertiolate 5000 (concentracin final), son diluidos en el momento del uso mediante la siguiente solucin: cloruro de sodio 8.5 g, fosfato disdico con 12 H2O 2.7 g, fosfato monosdico con 2 H 2O 0. 4 g, agua destilada c.s.p. 1000 cm3 (pH 7.2). Se utilizan diluciones de suero segn la progresin geomtrica de la razn 2. Se deposita 0.05 ml de cada dilucin sobre los crculos del frotis del portaobjetos. Estos se mantiene en contacto con el suero del paciente durante 30 minutos dentro de una cmara hmeda (puede ser una caja Petri). Se lava el exceso de dilucin de suero con la solucin tampn 100 de suero fluorescente antiglobulina humana. Se coloca en una caja hmeda durante 30 min. Luego se lavan las lminas con solucin tampn. Se monta el preparado con una solucin de fosfato disdico con 12 H2O 3.222 g, fosfato monosdico con 2 H2O 0.136 g, glicerina 80 ml agua destilada 20 ml.
El examen se practica con luz UV y, preferentemente, con un microscopio con fondo oscuro. Cada reaccin debe tener un testigo negativo y uno positivo. La inmunofluorescencia permite obtener en las micosis humanas ttulos mas elevados de anticuerpos que las reacciones de fijacin del complemento, son del orden , 1/8, 1/16 y como mximo 1/64. Estos ttulos pueden, a veces, alcanzar y hasta sobrepasar a aquellos observados con las reacciones de aglutinacin, cuya utilizacin es posible en algunas micosis.
OBSERVACIN:
CONCLUSIN:
BIBLIOGRAFA: Diagnstico micolgico, Amadeo DAlessandro; Ed. Panameriacana. Micologa Mdica Bsica; A. Bonifaz; Ed. Mndez Cervantes.
Xalapa, Ver., a
____________________________________________
Vo. Bo.
____________________________________________
PRACTICA 10. MICOSIS PROFUNDAS.

COMPARACIN Y CRTICA DE LOS TRABAJOS SOBRE MICOSIS PROFUNDAS MICOSIS PROFUNDAS 1 Y MICOSIS PROFUNDAS (GRUPO 802)
Xalapa, Ver., a
______________________________________________
Vo. Bo.
_________________________________________
PRACTICA 11.
HISTORIA CLNICA
FORMATO DE UNA HISTORIA CLINICA
IDENTIFICACIN DEL PACIENTE Nombre: Edad: Sexo: Direccin: Silvia Cuevas Irisson 41 aos Femenino Avenida Puerto de Veracruz 21, Col. El Pireo, C.P. 92360, San Rafael, Veracruz. Ocupacin: Ama de Casa, Costurera. DATOS DE LA LESIN Entrevista: Cree que la micosis pudo haber sido originada por haber hacer el aseo de un criadero de puercos durante mucho tiempo. Segn el Dr. F. Becerra Lpez fue debido a una crisis de nervios, lo que hacia que la seora se rascara de la rodilla para abajo. Se untaba alcohol.
Medicamentos usados: Microrgan 500mg, caja con 14 tabletas., una cada 12 horas; Dafln 500mg grageas, dos juntas en cada comida; Neurobion 1000 ampolletas, una caja, va IM, una cada tres das; Acifur comprimidos 200mg, una cada 5 horas por 10 das; Alin, tomaba 6 pastillas, al siguiente da 5 y sucesivamente hasta llegar a media pastilla, descansaba 15 das y comenzaba de nuevo. Dej estos tratamientos por presentar mareos intensos y debilidad. Se ha sometido a tratamientos alternativos como baos con agua vinagre, agua carbonato, baos de sol. Tom un preparado de composicin desconocida, con lo que aparentemente tuvo una ligera mejora. Tratamiento actual: Sporanox 15D, combinada con la pomada Barmicin compuesto (Betametasona, clotrimazol y gentamicina). Suspendi el tratamiento 20 das antes de la toma de muestra. Tiempo de aparicin: Un ao aproximadamente. Caractersticas de la lesin: Micosis comenzada en pie derecho, que posteriormente comenz en pie izquierdo. Se manifiesta como una resequedad que avanza hasta formrsele llagas y grietas con apariencia llorosa y con pus. Localizacin: Piel de planta del pie. DATOS DE LABORATORIO Examen en fresco: Cultivo: Medio: Temperatura: Tiempo de crecimiento: Colonia: Microcultivo: Tincin de Gram: Tincin de Zielh-Nelssen RESULTADO POSITIVO Sabouraud Ambiente 10 das Blanca, aterciopelada. No se realiz Gram negativo. No AAR
Se identific Trichophyton mentagrophytes FRMACOS RECOMENDADOS Medidas locales Crema de Miconazol al 2%, crema o locin de clotrimazol al 1%, crema de ketoconazol al 2%, crema o locin de econazol al 1%, crema de ciclopitrox al 1%, crema de oxiconazol, crema o gel de naftifina al 1%, crema de butenafina y de terbinafina al 1%. El tratamiento debe continuarse 1 2 semanas despus de la remisin clnica. Medidas sistmicas Griseofulvina 250 o 500 mg dos veces al da, durante 2 4 semanas, itraconazol en dosis de 200mg al da durante dos semanas o 400mg diarios por una semana; terbinafina, 250mg al da por 2 4 semanas. Atte
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UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE QUMICO FARMACUTICO BILOGO.

Manual de Laboratorio de Micologa.

Xalapa de Enrquez, Ver; a 16 DE NOVIEMBRE DEL 2012

LABORATORIO DE MICOLOGIA. UNIVERSIAD VERACRUZANA FACULTAD DE Q.F.B.

Prctica 5. Microcultivo 57 Prctica 6. Cndida.65 Gnero

Prctica 7. Gnero Aspergillus 77 Prctica Dermatofitos...85 Prctica 9. Micolgica.93 8.

Prctica 10. Micosis Profundas 108 Historia 110 Clnica

PABLO BECERRA LARA.

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PRACTICA 1. EXAMEN EN FRESCO.

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Esporas internas y externas y sus clulas productoras

Micelio continuo y fructificacin asexuada de Phycomycotes con esporangiforos, esporangios y esporangiosporos

ESQUEMAS DE REPRODUCCIN SEXUADA

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Fusarium encontrado en tomate Alternara 40 40x x

Talo vegetativo encontrado en moho de tomate con esporas

Hifas de moho de pepino

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Talo unicelular: levaduras, candida, etc.

Esporos: rganos de reproduccin del hongo: pieden der sexuados o asexuados.

Endoesporos: cuando se originan reproduccin, ejemplo: esporangio.

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Micelio en espiral o espirales: hifas enrolladas como si fuera un resorte.

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Artrosporos: esporos asexuados originados por fragmentos de un talo o una hifa.

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PRACTICA 2. TINCIN DE HONGOS.

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