Tcnicas de aislamiento

Una de las actividades ms apasionante del trabajo con hongos es el aislamiento de colonias puras. Entre las miles de especies que existen en la naturaleza el miclogo o el cultivador necesita aislar una para poder trabajar con ella. Todas las materias naturales pueden poseer multitud de hongos creciendo en ellas. Cada hongo es distinto y produce una colonia caracterstica que lo diferenciar de los dems. Las tcnicas de aislamiento se pueden dividir en dos amplias categoras que pueden combinarse de multitud de formas: mtodos directos y mtodos selectivos. -Transferencia directa: Las esporas, tejidos de la seta, etc. se siembran en un medio nutritivo con agar. Esta tcnica favorece a hongos de crecimiento rpido por lo que se debe combinar con la utilizacin de medios especiales (Martins, Rose Bengal) o la utilizacin de una tcnica de dilucin seriada. Si tenemos problemas de bacterias al intentar aislar podemos usar sulfato de gentamicina, en una proporcin aproximada de 60 mg por litro de medio. -Cmara hmeda: En ocasiones es recomendable hacer crecer el hongo desde el sustrato original en que se encuentra para, una vez aflore en la superficie, poder realizar una transferencia directa a un medio nutritivo. Se procede colocando en un pequeo recipiente algn tipo de material estril que sea capaz de almacenar mucha agua para que se mantenga una buena humedad en su interior (algodn, papel filtro, turba, agar con agua, etc.) El material a estudiar se deposita en la pequea cmara y se deja incubar. Esta tcnica se puede utilizar para aislar hongos desde excrementos, madera, hojas, tallos, corteza, semillas, frutos, viejos hongos, insectos muertos, etc. -Cebos: Muchos hongos tienen necesidades muy especficas de nutrientes y utilizan materiales que no pueden utilizar otros hongos. Podemos sacar ventaja de estas necesidades para su aislamiento. Un ejemplo de un hongo que se asla as es el hongo de la creosota, Amorphotheca resiniae. Se colocan palillos impregnados con creosota en el suelo, donde se formarn conidios que ms tarde podrn transferirse directamente a placa nutritiva. Otros tipos de cebos pueden ser piezas de madera, insectos, plsticos, pelo o cualquier cosa que podamos imaginar. Los cebos pueden introducirse en hbitats naturales o en cmaras hmedas. Tcnicas especiales -Tcnicas de estrs: los hongos, como todos los seres vivos, pueden soportar hasta un umbral de estrs. Se utilizan los diferentes umbrales de estrs para aislar los hongos que nos interesan, una vez que hayamos eliminado al resto. Existen esporas de hongos, como la de algunos coprfilos (que se desarrollan en los excrementos de los herbvoros) que son capaces de aguantar las duras condiciones del tracto digestivo de estos animales. Otras esporas de hongos slo germinan despus de ser expuestos al fuego o a la congelacin. Para explorar estas importantes adaptaciones podemos utilizar el calor, alcohol, cidos, bases, u otras sustancias qumicas o tratamientos que se nos ocurran. Una vez sometidos al estrs trataremos la muestra con alguna de las tcnicas de aislamiento directo descritas. -Esterilizacin de la superficie: Consiste en la utilizacin de algn esterilizante qumico para evitar que las esporas que se encuentran en la superficie de las muestras puedan interferir con el aislamiento que se encuentra en el interior. Para ello se puede proceder sumergiendo la muestra en una dilucin al 10% de leja comercial o al 3% de agua oxigenada durante una hora, aunque todo depende del tipo de muestra y de contaminante. Deben probarse distintos tiempos de esterilizacin. Esta tcnica funciona para semillas, grandes hongos, madera, materiales artificiales, insectos muertos, etc. -Nutrientes selectivos: Consiste bsicamente en la tcnica del cebo pero realizada al revs; en esta ocasin es la muestra de la que se quiere aislar el hongo la que dispone sobre el medio. Podemos desear, por ejemplo, aislar aquellos hongos que utilizan la celulosa. Para seleccionar estos hongos elaboraremos un medio como el Czapeks, pero usando la celulosa en vez de la sucrosa; aquellos hongos que no puedan utilizar la celulosa no crecern o lo harn muy lentamente. Las posibilidades son ilimitadas siempre que utilicemos medios sintticos para que los nutrientes modificados sean conocidos. En el agar siempre existen impurezas por lo que se pueden obtener hongos que no utilizan el ingrediente especfico, aunque siempre podrn reconocerse por su raqutico crecimiento. Un ejemplo de medio selectivo muy curiosos fue el desarrollado por el Dr. Barron que hizo crecer nematodos en un caldo de guisantes. Una vez que los nematodos eran abundantes en el caldo aadi un poquito de tierra. Aquellos hongos que se alimentan de nematodos y que viven en el suelo se desarrollaron y finalmente dominaron el caldo. Aqu los nematodos son el nutriente selectivo sobre el que se siembra la tierra.

-Temperaturas selectivas: Los hongos que crecen fcilmente a las temperaturas ambiente de nuestras casas se denominan mesfilos. La mayora de los hongos que conocemos son mesfilos y su crecimiento es inhibido por las temperaturas inusualmente altas o bajas. Aquellos hongos que necesitan temperaturas superiores a 40 C para crecer se denominan termfilos y los que requieren temperaturas por debajo de 15 C se denominan psicrfilos. En los nidos de los pjaros se encuentran gran cantidad de termfilos, mientras que en los excrementos de los conejos o en materiales compostados se encuentran multitud de psicrfilos. Los termfilos son los hongos que ms rpidamente crecen, aunque tambin existen psicrfilos de crecimiento rpido, probando que no es slo la temperatura el factor que influye en la rapidez del crecimiento. Algunos hongos termfilos, sobre todos los que pueden crecer a 37 C, pueden causar serias infecciones en humanos y animales, por lo que no es recomendable incubar a estas temperaturas sin el conocimiento de la biologa de estos hongos. -Osmofilia: muchos productos almacenados, como granos, especmenes de museo, libros, etc. son atacados por hongos. Todos estos daos son causados por hongos que prosperan en condiciones inusualmente secas. Estos hongos se denominan osmfilos, un trmino que hace referencia al gran potencial osmtico del ambiente. Los osmfilos prosperan en ambientes relativamente secos o azucarados. La mayora de los hongos que se pueden encontrar en vieja ropa o materiales de cuero, en las jaleas y mermeladas son osmfilos. Los hongos osmfilos crecen pobremente en medios de cultivo normales y deben adaptarse aadiendo grandes cantidades de azcares. Otra fuente excelente de hongos osmfilos son las frutas deshidratadas. Por lo que se sabe, los hongos de las frutas deshidratadas no producen toxinas, no as como algunos de los que se desarrollan en los frutos secos. -Esporada: Existen multitud de formas para obtener una esporada segn el tamao del hongo o su pertenencia a los ascomicetos o basidiomicetos (los ascomicetos lanzan sus esporas ms lejos). Para obtener esporadas de las setas comestibles que nos interesan debemos tener sobre todo en cuenta su color y la cantidad de humedad que posee la seta. Normalmente las setas pequeas con lminas deben protegerse de la evaporacin, colocando un vaso sobre ellas para que le d tiempo a formarse el depsito de esporas. En las setas grandes debemos dejar que se sequen un poco si no queremos obtener un caldo de esporas en las que podrn reproducirse gran cantidad de bacterias. Una vez obtenida la esporada podemos sembrar las esporas, como mejor opcin, utilizando la tcnica de siembra por agotamiento. Mtodo de Pitt para identificacin de Penicillium, Aspergillus y otros hongos Se deposita el inculo en tres puntos equidistantes de cada placa de los medios Malta-Glucosa, Czapek-Levadura y Czapek-Glicerol vaciados en sendas en cajas de Petri medianas, que se incuban a 25C durante 7 das y si es necesario se prolonga hasta 14 21 das. Tambin se inoculan dos placas de Czapek que se incuban a 5 y 37C, respectivamente, durante 7 das. Con los resultados obtenidos se accede a las claves. Microcultivo Se deposita un cuadrado del medio Zapallo o Papa estril sobre un portaobjetos previamente flameado y fro, se siembra el hongo en sus bordes, se coloca un cubreobjetos que tambin fue flameado y enfriado. Se apoya el conjunto sobre dos varillas de vidrio, dentro de una caja de Petri en cuyo fondo hay un papel absorbente estril embebido en agua. Se incuba a temperatura ambiente con alternancia de luz solar indirecta y obscuridad durante el tiempo necesario. BIBLIOGRAFIA

Ainsworth GC. (1976), Introduction to the History of Mycology, Cambridge, UK: Cambridge University Press, ISBN 0-521-11295-8 Introductory Mycology, John Wiley and Sons, 1996, ISBN 0471522295 Deacon J. (2005), Fungal Biology, Cambridge, MA: Blackwell Publishers, ISBN 1-4051-3066-0