Universidade Federal de Pelotas Centro de Desenvolvimento Tecnolgico Graduao em Biotecnologia Genmica II

Marcadores Moleculares

Prof. Fabiana Seixas

Pelotas, maro de 2011.

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Resumo Marcadores moleculares so amplamente utilizados para estudos de gentica populacional, mapeamento e anlises de similaridade e ainda, distncia gentica. Alm disso possvel, com estes, identificar acessos de plantas, isolados de um microrganismo ou at completar estudos de sistemtica. Esta reviso, tem o objetivo de esclarecer as utilidades aplicacionais dos marcadores moleculares, e tambm as diferentes tcnicas utilizadas, no estudo dos marcadores moleculares, e suas respectivas particularidades, todas com a meta de detectar polimorfismos em uma molcula de DNA. Introduo Caractersticas de DNA, herdadas geneticamente e que servem como base para diferenciar um ou mais indivduos, so denominadas de marcadores moleculares. Estes, marcadores moleculares, incitaram o desenvolvimento de tecnologias que podem revelar variabilidades em nvel genmico de uma forma rpida, simples e eficaz. O aprimoramento das tcnicas de deteco de polimorfismos no DNA comeou a ser explorado aps o surgimento de outras duas outras grandes tecnologias, as quais foram a do DNA recombinante e a amplificao da molcula de DNA por PCR (Polimerase Chain Reaction), sendo que ambas ajudaram a tornar o uso de marcadores moleculares potencialmente ilimitado. Dentre as variaes da tcnica de anlise de polimorfismos no DNA, as mais utilizadas, tanto por motivos de maior confiabilidade quanto por um menor custo, tempo reduzido, dentre outras particularidades, esto: Single Nucleotide Polymorphism (SNP), Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP), Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP), Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), SequenceCharacterized Amplified Regions (SCAR), Restriction Fragment Length Polymorphism DNA (RFLP), DNA Satlite, Minissatlites ou Variable Number of Tandem Repeats (VNTR), Microssatlites ou short tandem repeats (STRs), Combinao entre SNPs e STRs/microssatlites (SNPSTR), Short Insterspersed Elements (SINEs) e Haplides nos Microssatlites (HAPSR). Estes mtodos sero melhor abordados na sequncia deste trabalho.

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Tamanha a importncia dos inmeros estudos desenvolvidos a respeito desses marcadores, que existem diversos bancos de dados especficos para diferentes tipos de marcados. A disponibilidade dessas ferramentas acrescenta e facilita exponencialmente o andamento dessas pesquisas em todo o mundo. O objetivo principal deste trabalho de reviso elucidar de forma completa e simplificada as diferentes tcnicas utilizadas para analisar similaridades entre genomas, com base nos marcadores moleculares, e caracterizar os detalhes incomuns que cada uma delas apresenta, alm de suas vantagens e aplicaes particulares. Diferentes Tcnicas de Anlise de Polimorfismos Single Nucleotide Polymorphism (SNP Cho et al., 1999) Os marcadores do tipo Polimorfismo de Base nica se baseiam nas alteraes mais elementares da molcula de DNA (Fig. 1), isto , mutaes em apenas uma das bases nitrogenadas da cadeia (Adenina, Citosina, Timina e Guanina). As mutaes mais recorrentes so as do tipo transio, em que h troca de purina por outra purina (A <-> G) ou de uma pirimidina por outra pirimidina (C <-> T). As transverses so menos freqentes e acontecem quando h troca de uma purina por uma pirimidina, ou vice-versa (C <-> G, C <->A, T <-> G ou T <-> A). Os marcadores SNP so geralmente bi-allicos, ou seja, normalmente so encontrados apenas dois variantes em uma espcie (Ex: um alelo corresponde a um par de bases A/T e o outro a um G/C). Os SNPs podem ocorrer em regies codificadoras ou com funo regulatria, porm, na maior parte das vezes so encontrados em espaos intergnicos, sem funo determinada. Os SNPs so a base molecular de vrios tipos de marcadores moleculares que foram desenvolvidos com diferentes metodologias ao longo das ltimas trs dcadas, como RFLPs, RAPDs, AFLPs, entre outros.

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Figura 1: representao de um polimorfismo de base nica (SNP).

Os SNPs so extremamente abundantes nos genomas de espcies no endogmicas e tem ocorrncia significativa (mais de 1%) na populao. Alem disso, so a forma mais frequente de variao gentica (90%). Este tipo de mutao pode-se apresentar, basicamente, de trs formas: Mutao sinnima em que a substituio resulta em um novo cdon que codifica o mesmo aminocido; Mutao no-sinnima na qual a substituio resulta em um novo cdon que codifica um aminocido diferente (Fig. 2 e 3); Mutao silenciosa nesta, o cdon que especifica um aminocido substitudo por um cdon de terminao (Fig. 4).

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Figuras 2 e 3: esquematizao de mutao no-sinnima.

Figura 4: esquematizao de mutao silenciosa.

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Os marcadores SNPs so utilizados para mapeamento gentico, genotipagem, alm de serem a grande aposta para a aplicao da medicina individualizada. No entanto, sua aplicao mais relevante a utilizao na comparao de genomas de coortes. As tcnicas de biologia molecular com utilizao dos SNPs podem se basear em sequenciamento e comparao de alinhamentos de sequncias. No entanto, essas tcnicas, alm de laboriosas, exigem que haja uma sequncia consenso, a qual permita a comparao. Para isso necessrio que o genoma do organismo estudado j tenha sido sequenciado. A genotipagem de SNPs pode tambm ser feita pela utilizao de Real Time PCR, microarranjos cuja principal limitao a dificuldade de padronizao , equipamentos de espectrometria de massa (MALD-TOF) ou de metodologias para genotipar de dezenas de milhares at um milho de SNPs em um nico ensaio (Affymetrix/ParAllele, Illumina IScan). Essas vrias tecnologias vem sendo desenvolvidas para tentar superar as barreiras descritas em realao aplicao da tcnica ao longo dos anos como tcnicas modernas de sequenciamento, por exemplo , permitindo mais rapidez, praticidade e menos custo na aplicao do mtodo. Entretanto, esta ainda uma rea em desenvolvimento, carente de novas tecnologias que garantam a otimizao dos processos. Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP Orita, M., et al.,1989) uma tcnica capaz de diferenciar segmentos de DNA de comprimentos idnticos, atravs da induo de mudanas nas sequncias, as quais so feitas por algumas condies experimentais. Com isso, possvel distinguir por eletroforese em gel de poliacrilamida no-desnaturante marcada com nitrato de prata (Figura 6), as diferentes sequncias pelas suas diferenas conformacionais e a partir da identificar mutaes ou polimorfismos, nestas mesmas sequncias. Esta tcnica foi descrita inicialmente com o intuito de analisar apenas molculas de DNA, porm possvel tambm obter uma boa analise de molculas de RNA, pois esta ultima, tambm possui estruturas secundrias com diferenas conformacionais possibilitando assim a aplicao deste tipo de marcador molecular. Porm importante salientar que aps a deteco pela SSCP necessrio fazer um sequenciamento para confirmar os resultados obtidos.
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Esta tcnica foi testada por Peters et al., em 2000, para analisar a variabilidade das populaes bacterianas, sendo que este pesquisador e sua equipe chegaram a um resultado positivo, afirmando que a tcnica era potencialmente satisfatria para este objetivo. AFLP e RAPD marcadores dominantes

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) e RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) so marcas dominantes que foram propostas como mtodos mais sensveis, rpidos e relativamente simples de revelar polimorfismos no DNA, sendo que ambas so derivadas da PCR (Polymerase Chain Reaction). Estas tcnicas possibilitam revelar diversos locos que esto dispersos pelo genoma, sem ser necessrio o conhecimento prvio da informao de sequncias-alvo e diferentemente das hibridizaes por sonda, estes mtodos no requerem um sistema especial para a revelao destes polimorfismos. Por serem, ambas dominantes, no so capazes de predizerem precisamente, se o genoma homozigtico ou heterozigtico, pois a nica distino apresentada o alelo estar amplificado (classe 1) ou no estar amplificado (classe 2 - homozigoto para ausncia da banda), no sendo levado em conta o motivo pelo qual o fragmento no foi amplificado. Uma exceo para essa dominncia, se d apenas em plantas, numa porcentagem mnima (<5%), pois nesses casos raros, as marcas apresentam-se em codominncia que so detectadas, no caso do RAPD, nos stios de anelamento dos primers (insero/deleo) e no caso do AFLP, entre os stios de restrio. Dentre esses dois marcadores, existem tambm diferenas, bastante significativas, que sero a partir de agora, elucidadas de forma coerente e precisa. Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP Vos et al., 1995) tcnica baseada na amplificao de um subconjunto de fragmentos que so gerados a partir da combinao de enzimas de restrio de corte raro (ApaI, EcoRI, HindIII, PstI) e de corte frequente (MseI, TaqI), que clivam o DNA genmico em stios especficos, essa clivagem pode ser feita em apenas uma etapa, desde que tenha-se disponvel um tampo adequado para as duas enzimas (corte raro/corte frequente), caso contrrio necessrio ser feito o procedimento em duas etapas separadamente. A principal importncia da utilizao dessa combinao de enzimas a digesto completa da molcula de DNA, pois uma digesto parcial pode levar a uma caracterizao de falsos polimorfismos,

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sendo que a alta pureza desse DNA amostral um fator essencial para o sucesso da digesto total (necessrio um excelente mtodo de extrao e quantificao de DNA). O processo de digesto pela combinao das enzimas de corte raro e de corte frequente vai gerar 3 tipos diferentes de fragmentos, que so: os fragmentos de corte frequente/frequente, frequente/raro e raro/raro; sendo que haver uma predominncia dos fragmentos de corte frequente/frequente, se comparada com os fragmentos de corte raro/raro, porm j os fragmentos de corte frequente/raro so preferencialmente amplificados pois h uma baixa eficincia na hibridizao dos inciadores da enzima de corte frequente comparando-a com a hibridizao dos inciadores da enzima de corte raro, somado ao fato de que os fragmentos de corte frequente/frequente possuem uma extremidade terminal invertida (amplificado por um nico iniciador) o que vai favorecer a formao de loop, sendo que este ultimo competir com os inciadores pelo anelamento. As enzimas de restrio deixam extremidades coesivas de sequncia conhecida, aps a clivagem do DNA, sendo com isso possvel a construo de sequncias nucleotdicas fita dupla (adaptadores) que iro se ligar s extremidades dos fragmentos de restrio. Partindo do conhecimento das sequncias dos adaptadores e do stio de restrio possvel construir iniciadores especficos para estas sequncias e com isso pr-amplificar os fragmentos de restrio (Figura 5). Os primers, por sua vez, so construdos a partir de uma sequncia complementar ao do adaptador seguida de outra sequncia especifica para o stio de restrio da enzima e ainda uma extenso de nucleotdeos seletivos na regio 3' terminal. O resultado da digesto e da pramplificao podem ser verificados a partir de uma eletroforese em gel de agarose 1% (p/v), sendo esta verificao importante, pois evita que possveis erros na digesto ou na pr-amplificao sejam detectados apenas no final de todo procedimento, j a anlise final dos resultados feita em gel de poliacrilamida desnaturante corado com nitrato de prata (Figura 6).

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Figura 5: construo de primers especficos, atravs da utilizao de enzimas de restrio.

A grande vantagem da utilizao da tcnica AFLP a

nmero de locos, se comparada s demais tcnicas de identificao dos marcadores moleculares, possibilitando ainda uma ampla cobertura do genoma, assim como um custo reduzido por loco obtido. Os marcadores AFLPs renem todas as capacidades exploratrias dos RFLPs agregando ainda, a tcnica de PCR, devido a isso os marcadores RAPD vem sendo rapidamente substitudos pelos marcadores AFLPs.

Figura 6: anlise final dos resultados de AFLP em gel de poliacrilamida deteco de um maior desnaturante corado com nitrato de prata.

Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD Williams et al., 1990) em 1993 o mesmo pesquisador e sua equipe evidenciaram que as sequncias internas amplificadas dos segmentos poderiam ser de cpia nica at altamente repetitiva. O polimorfismo RAPD detectado pela amplificao de locos cromossmicos usando primers de sequncias curtas (10 bases de sequncias arbitrrias) e posteriormente separados em gel de poliacrilamida ou agarose, sendo a colorao feita com nitrato de prata ou brometo de etdeo sob luz UV (Figura 7), sendo a deteco feita por mutaes ou rearranjos que acontecem no prprio sitio ou entre os sitios de hibridizao dos primers, porm vale ressaltar que mutaes de ponto so capazes de inibir completamente a amplificao. Estes primers, por sua vez, so compostos de pelo menos 50% de GC e tem a capacidade de revelar vrios locos, pois a sua squencia determinada de forma aleatria e como j evidenciado em diferentes espcies, os locos RAPD esto dispersos pelo genoma.

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Figura 7: resultados de amplificao RAPD por

Os pontos negativos na utilizao desta tcnica se concentram principalmente em cinco aspectos, que se no priorizados podem levar a uma baixa reprodutibilidade deste marcador. Os principais cuidados que devem ser tomados so: o manipulador deve possuir alguma experincia em procedimentos moleculares, pois h necessidade de um rigoroso cuidado na preparao das reaes, assim como na leitura e anlise dos fragmentos que sero visualizados posteriormente no gel; a quantidade de DNA amostral e a sua respectiva pureza (ausncia total de protenas, polissacardeos e compostos fenlicos) tambm um item importante, sendo que o excesso de DNA leva a uma falha completa na reao de PCR e a baixa concentrao no permite a obteno de padres de amplificao ideais; outros dois fatores muito importantes so a concentrao de ons magnsio, o qual vai interferir diretamente na ao da Taq polimerase, e por fim, a concentrao da enzima Taq polimerase, em si, pois esta pode ser facilmente inibida pelos possveis contaminantes presentes no DNA, j citados anteriormente. Sequence-Characterized Amplified Regions (SCAR Paran & Michelmore, 1993) SCARs so marcadores baseados em PCR que representam loci nicos geneticamente definidos que so identificados por amplificao do DNA genmico com pares de primers de oligonucleotdeos especficos. Eles podem conter cpia de alta repetio, sequncias genmicas dispersas na regio amplificada (Paran & Michelmore, 1993).

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A tcnica de utilizao de SCARs como marcadores moleculares uma sada para o problema de baixa reprodutibilidade enfrentado no emprego do mtodo de RAPD-PCR. Como ilustram as figuras 8 e 9, os fragmentos submetidos tcnica de RAPD so clonados e sequenciados, e, ento, so desenhados primers maiores (fig. 9A), os quais justamente por conterem sequncias mais longas sero provavelmente especficos para o locus de interesse, e espera-se que no amplifiquem outros loci. Entretanto, pode ser que esses primers amplifiquem os dois alelos (fig. 9B), e ser possvel detectar polimorfismos internos e esses primers, os quais so polimorfismos entre os dois alelos (fig. 9C). Caso esses polimorfismos possam ser identificados, ento deve ser possvel sintetizar novos primers, os quais amplificaro uma regio de apenas um dos alelos (fig. 9D). esse novo marcador baseado em PCR que denominado SCAR.

Figuras 8 e 9: esquematizaes do procedimento SCAR.

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Restriction Fragment Length Polymorphism DNA (RFLP - Grodzicker et al., 1974) este polimorfismo, derivado de mutao pontual, insero ou deleo, uma diferena em sequncias de DNA homlogas que pode ser detectada pela presena de fragmentos com diferentes comprimentos, aps a digesto das amostras de DNA em questo com endonucleases de restrio especficas. Enquanto marcador molecular, o RFLP especfico para cada combinao clone/enzima de restrio. A maioria dos marcadores RFLP alm de serem altamente locus-especficos so codominantes, isto , ambas as amostras de alelos em heterozigose sero detectadas. Um ou mais fragmentos da amostra de DNA digerida, depois de separados por eletroforese, hibridizam-se sonda de RFLP, revelando, assim, um padro nico de bandas, caracterstico de um gentipo especfico, num locus especfico. Essa sonda se constitui de uma sequncia marcada de DNA (geralmente uma cpia curta, simples ou de baixo peso de DNA genmico ou clones de cDNA), complementar aos fragmentos hbridos. A anlise de RFLP atravs de sondas frenquentemente utilizada em mapeamento gentico e na anlise de variaes (genotipagem, forense, testes de paternidade, diagnstico de doenas hereditrias, etc). Vale ressaltar que a preciso da tcnica muito maior para seqncias que ocorrem uma s vez no genoma, denominadas de cpia nica (single copy). A tcnica funciona da seguinte maneira (Fig. 10): 1) a amostra de DNA extrada da clula e purificada, para ento ser 2) clivada por enzimas de restrio. Em seguida, 3) os fragmentos resultantes da clivagem so separados por eletroforese e 4) transferidos para a membrana (tcnica chamada Southern Blot) marcada com as sondas de DNA radioativo, as quais 5) se ligaro a fragmentos complementares. A ltima etapa, chamada 6) autoradiografia, trata-se da exposio da membrana hibridizada com a sonda radioativa a um filme de Raio X, que queimado somente onde houve as hibridizaes. A sonda, sendo radioativa, emite radiao que pode ser detectada por filmes de Raio X. Levando-se em considerao que a sonda s hibridiza com fragmentos complementares, pode-se afirmar que h preciso na tcnica. Os resultados dos padres radioativos sero, finalmente, comparados com padres conhecidos.

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Figura 10: aplicao, passo a passo, da tcnica de RFLP.

O isolamento de quantidade suficiente de DNA para anlise de RFLP consome muito tempo e extremamente laborioso. Uma alternativa perante tais limitaes utilizar a tcnica de PCR para atingir os nveis necessrios de DNA. Desta forma, mais amostras podero ser analisadas em menor espao de tempo. Algumas das vantagens dessa tcnica so a alta reprodutibilidade, o alcance de ampla cobertura do genoma, o fato de as sondas poderem ser de regies transcritas ou no, o que permite anlise tambm de ntrons e o nmero de marcadores ser praticamente ilimitado. Por outro lado, requer mo-de-obra intensiva e qualificada e instalaes adequadas. Outra limitao da tcnica a inexistncia de uma biblioteca de sondas disponveis. DNA Satlite (SUEOIIA, 1961) Cientistas descobriram que, quando centrifugavam o DNA sob certas condies, este se apresentava em duas ou mais camadas: uma banda principal contendo genes; e bandas secundrias, formadas em posies diferentes da maior parte do DNA celular, que foram chamadas de bandas satlites, para diferenci-las da banda de DNA principal. As bandas satlites mostraramse como sendo constitudas de seqncias de DNA repetidas e muito longas. O DNA satlite consiste em sequncias curtas (de 5 a poucas centenas de pares de bases de comprimento) que so repetidas muitas vezes para formar grandes aglomerados de at milhes de pares de bases. Uma espcie pode termais de uma sequncia de DNA satlite; Drosophila virilis, por exemplo, possui trs diferentes, cada
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uma com sete nucleotdeos e todas com sequncias muito similares, indicando uma origem gentica comum. Em 1985, Alec. J. Jeffreys encontrou regies menores contendo seqncias de DNA repetitivo, as quais chamou de minisatlites, que consistiam de repeties de 15 ou mais pares de bases. Jeffreys e seus colegas tambm determinaram que o nmero de repeties de um dado minisatlite diferia entre indivduos, um procedimento que levou a inveno posterior da tcnica de DNA-fingerprinting. Minissatlites ou Variable Number of Tandem Repeats (VNTR Jeffreys, 1985) as seqncias minissatlites variam de 12 a 100 pares de base em comprimento e so encontradas em conjuntos contendo cerca de 3.000 repeties. Assim, estas seqncias ocupam seguimentos consideravelmente mais curtos do genoma do que as sequncias satlites, por exemplo, TTAGGG TTAGGG TTAGGG. Por uma razo desconhecida, os minissatlites tendem a ser instveis, e o nmero de cpias de uma sequncia particular frequentemente aumenta ou diminui de uma gerao outra. Cada repetio em tandem se constitui em um loco de minissatlite cujos alelos se diferenciam por variaes no tamanho total do minissatlite Como resultado, o comprimento de um lcus particular de minissatlite altamente varivel na populao, mesmo entre membros da mesma famlia. Como eles so to polimrficos, as sequncias de minissatlites so utilizadas como marcador gentico para identificar indivduos em casos criminais ou de paternidade atravs da tcnica de identificao individual pelo DNA (DNA fingerprinting). Mudanas nas sequncias de minissatlites podem alterar a expresso (transcrio) de genes vizinhos, o que pode ter conseqncias srias (por exemplo, mudanas de certos loci de minissatlites tm sido apontadas como causadoras de cncer e diabetes. A sua utilizao nas tcnicas moleculares permite seguir taxas de mutao, localizar regies especficas para splicing alternativo, regulao na expresso gnica. No fim dos anos 80s, um grupo de pesquisadores isolou satlites compostos de repeties de bases ainda menores e chamaram essas repeties de microssatlites. Um microssatlite remanescente de um minissatlite, exceto se as unidades repetidas estiverem menores.

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Microssatlites ou short tandem repeats (STRs Weber et al., 1990) tambm chamados sequncias simples repetitivas (SSRs do ingls, simple sequence repeats), os microssatlites consistem em motivos de sequncias de 1 a 6 pares de bases que se repetem em tandem (Fig. 11), por exemplo, CA CA CA CA e totalizando menos de 150 pares de bases (Tabela 1). Tabela 1: Exemplos de microssatlites. Tipo Monmeros Dmeros Trmeros Tetrmeros Pentmeros Hexmeros Motivo/Arranjo (A)n (AT)n (CG)n (ATG)n (CCG)n (CGTA)n (TATC)n (ATGGC)n (CGCAA)n (ATTGGC)n Loco AAAAAAAAAAAAAAAA ATATATATATATATATATAT CGCGCGCGCGCGCGCGCG ATGATGATGATGATGATG CCGCCGCCGCCGCCGCCG CGTACGTACGTACGTACGTA TATCTATCTATCTATCTATC ATGGCATGGCATGGCATGGC CGCAACGCAACGCAACGCAA ATTGGCATTGGCATTGGC

Estas regies ocorrem frequentemente e randomicamente nos genomas de plantas e animais e tipicamente exibem uma grande variao. De maneira geral so os marcadores moleculares mais informativos para estudos de gentica ao nvel de espcies e tm sido aplicados em um grande nmero de estudos em plantas (fitomelhoramento), animais e populaes humanas. So marcadores codominantes e altamente multiallicos, de alto polimorfismo, apresentando maior contedo informativo por loco gnico entre todas as classes de marcadores moleculares (GOLDSTEIN e SCHLOTTERER, 1998). Os microssatlites so altamente frequentes no genoma humano, sendo que ocorrem a cada 1.000 a 2.000 pares de bases. Tais caractersticas permitem analisar desde indivduos at espcies proximamente relacionadas. O deslizamento (slippage) da DNA polimerase durante a replicao do DNA tida como a principal causa da variao no nmero de repeties nesses locos, como pode se observar na Figura 11. Os diferentes nmeros de repeties caracterizam os diferentes alelos, que podem ser detectados na tcnica de eletroforese em gel de poliacrilamida.
Figura 11: representao esquemtica de um microssatlite.

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Figura 12: Deslizamento da DNA polimerase durante a replicao do DNA.

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Como o DNA microssatlite normalmente no carrega informao, as adies ou delees de unidades repetitivas no so selecionadas, o que proporciona alta variabilidade de alelos. Microssatlites como agentes de Evoluo Uma importante funo dos microsatlites na evoluo tem sido mostrada em bactrias patognicas como Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Mycoplasma spp. e Streptococcus spp. Em todos os organismos descritos, alteraes no nmero de repeties de microsatlites provocam a produo de protenas ligeiramente diferentes que, em certas condies ambientais, so mais teis para o patgeno do que a protena com o nmero de repeties normal, proporcionando uma melhor adaptao ao ambiente (van Belkun, 1999). Por exemplo, N. gonorrhoeae possui uma famlia de 12 protenas de sua membrana externa, responsveis pela aderncia e invaso de clulas epiteliais, que so produzidas por genes chamados de Opa. Esses genes contm uma composio de microsatlites contendo mltiplas cpias da seqncia CTCTT. Uma mutao nessa seqncia que estima-se que ocorra a cada 100 ou 1000 clulas filhas pode levar produo de uma protena menor, que faz com que a bactria no consiga se aderir e invadir clulas hospedeiras. Um subsequente deslizamento, entretanto, pode produzir novamente a protena funcional. Essa troca reversvel chamada variao de fase uma adaptao incrvel dessa bactria, pois algumas vezes vantajoso para o micrbio aderir e penetrar nas clulas, como numa infeco de um novo hospedeiro. Entretanto, quando a infeco j ocorreu, mais vantajoso para a bactria no interagir com as clulas do hospedeiro, especialmente com clulas fagocitrias, que podem engolfar e destruir a bactria (Moxon and Wills, 1999). Em H. influenzae, bactria responsvel por alguns tipos de meningite e pneumonia, a mudana no nmero de repeties de microsatlites CAAT fazem com que um lipopolissacardeo de sua membrana externa, que importante na infeco das vias respiratrias e garganta, possua ou no uma parte de colina-fosfato. Foi demonstrado que estirpes de H. influenzae que contm colina-fosfato, chamadas de ChoP+, colonizam as vias nasais e a garganta mais eficientemente do que aquelas que

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no contm (ChoP-). Entretanto mostrou-se tambm que as bactrias ChoP- so mais resistentes ao ataque do sistema imune. A maioria dos micrbios encontrados so ChoP+, os ChoP-, produzidos pelo deslizamento da polimerase, no conseguem se manter no trato respiratrio pois aderem-se menos eficientemente. Entretanto, quando as clulas hospedeiras contraem uma infeco viral, a inflamao pode aumentar a exposio da bactria ao sistema imune e a as formas ChoP- tero vantagem. Uma vez que a infeco terminar mutantes ChoP+ podem ser produzidos por um novo deslizamento, tornando-se rapidamente predominantes (Moxon and Wills, 1999). Os microssatlites esto espalhados de forma bem homognea no DNA- pelo menos 30.000 loci diferentes de microssatlites esto presentes no genoma humano. Enzimas que duplicam o DNA tm problemas para copiar as regies do genoma que contm essas repeties , o que faz com que elas apresentem taxa de mutao alta. Por causa de sua variabilidade nas populaes, os microssatlites tm sido utilizados para analisar as relaes entre diferentes etnias humanas. Muitos antroplogos argumentam que a espcie humana moderna se originou na frica. Se isso for verdade, os membrros das diferentes populaes africanas devero ter uma maior variao nas sequncias de DNA do que as populaes que vivem em outros continentes porque os genomas das populaes africanas tiveram um tempo maior para divergir. O argumento para a gnese na frica tem recebido suporte de estudos de sequncias de DNA humano. Em um desses estudos quee analisou 60 loci diferentes de microssatlites, foi constatado que os membros das populaes africanas tinham uma divergncia gentica maior do que populaes da sia ou da Europa. Mudanas no nmero de cpias de certas sequncias de microssatlites so responsveis por vrias doenas debilitantes herdadas como a distrofia miotnica, a doena de Kennedy, a ataxia espinocerebelar (SCA) tipos 1, 2 e 3, a doena de Huntington e a atrofia dentatorubral-palidoluisiana so causadas por alteraes no nmero de repeties de tripletes (Heringa, 1998). Grande parte dessas doenas envolve funes neurolgicas e nenhuma delas foi ainda demonstrada em outros primatas, como o chimpanz. Se essas doenas so nicas humanidade elas podem representar um custo gentico acarretado pela rpida evoluo de nossos crebros. possvel que longos microssatlites dentro ou perto de certos genes possam ter contribudo para a

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funo cerebral e podem ter persistido ao longo do tempo evolutivo mesmo que ocasionalmente aumentem muito e causem doenas (Moxon and Wills, 1999). Combinao entre SNPs e STRs/microssatlites (SNPSTR Mountain et al., 2002) SNPSTRs so marcadores genticos que combinam um microssatlite (STR) com um ou mais SNPs intimamente ligados. Nessa combinao, os microssatlites e SNPs tem menos de 250 pb, de modo que cada SNPSTR pode ser considerado um pequeno hapltipo, sem ocorrncia de recombinao entre os dois marcadores individuais. Cada um desses pequenos segmentos autossmicos, isto , os marcadores, inclui um ou mais SNPs e um locus STR. Com taxas de mutaes extremamente diferentes, esses dois tipos de marcadores oferecem informaes evolutivas complementares. Visto que desafios tcnicos e a recombinao tem limitado os estudos e aplicaes sobre a variao gentica, os SNPSRTs so apontados como potencialmente capazes de se tornarem mais uma ferramenta til no campo da gentica de populaes. A tcnica consiste em 1) consultar os STRs presentes no genoma de interesse, atravs de busca aos bancos de dados disponveis; 2) determinar se h presena de pelo menos um SNP na distncia de ~400pb na regio flanqueadora upstream, downstream ou ambas. Ento sero desenhados primers de forma que abranjam um alvo o mais prximo possvel do STR, com 400pb a mais na regio upstream e 400pb a mais na regio downstream. A regio amplificada ser, ento, examinada por um mtodo barato de screening. Aps a descoberta do SNP, deve ser feito 3) design de primers alelo-especficos, cada um marcado com uma cor fluorescente diferente. Os primers reversos no sero marcados com fluorescncia e o produto da PCR mostrar o SNP numa extremidade e o STR na outra. H variao entre os cromossomos no comprimento do produto da PCR, dependendo exclusivamente do nmero de cpias de repeties na STR. Uma vez que os primers e correspondentes parmetros de PCR estejam otimizados, poder-se- determinar o geno-hapltipo de cada indivduo, atravs de eletroforese, em um instrumento de anlise gentica que utilize deteco fluorescente. Para assegurar a determinao acurada do nmero de repeties de alelos STR, a cada locus SNPSTR, ao menos um produto individual de PCR deve ser tambm sequenciado, possibilitando comparaes.

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Short Insterspersed Elements (SINEs A maior parte da frao de DNA moderadamente repetitiva no codifica nenhum tipo de produto. Em vez de ocorrerem como conjuntos de sequncias em cadeia, os membros dessas famlias so dispersos dentro do genoma como elementos individuais. Muitas dessas sequncias repetitivas podem se encaixar numa classe referida como SINEs, que tm tipicamente menos que 500 pares de bases de comprimento (o nmero varia de 100 a 400 pares de base). As sequncias de nucleotdeos desses elementos variam muito de uma espcie para outra. Os SINEs so a classe mais abundante de elementos mveis no genoma humano, constituindo cerca de 13% do total do DNA. No codificam protenas, porm contm uma sequncia rica em A/T na extremidade 3. So transcritos pela RNA polimerase III, a mesma RNA polimerase nuclear que transcreve os genes que codificam os tRNAs, os 5S rRNAs, e outros pequenos RNAs estveis. Aparentemente, as protenas ORF1 e ORF2, expressas pelos LINEs (sequncias de DNA repetitivas sem funes codificadoras, semelhantes aos SINEs, porm mais longas, com mais de 1.000 pares de base de comprimento) promovem a transposio dos SINEs pelo mecanismo de retrotransposio representado na figura 13.

Figura 13: Mecanismo proposto para a transcrio reversa e a integrao dos LINEs.

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Estas sequncias ocorrem em cerca de 1,6 milhes de locais no genoma humano. Desses, cerca de 1,1 milho so elementos Alu, assim chamados porque na sua maioria contm um nico stio de reconhecimento para a enzima de restrio Alu I. Estes elementos exibem uma considervel homologia com a sequncia do 7SL RNA, componente de uma partcula que auxilia no endereamento de polipeptdeos, quando estes so recm sintetizados. Os elementos Alu esto distribudos em regies do genoma humano em que sua insero no provocou perda da expresso gnica: entre os genes, nos ntrons e nas regies 3no- traduzidas de alguns mRNAs. Assim como outros elementos mveis, a maioria dos SINEs acumulou mutaes desde que foi inserido na linhagem germinativa de um ancestral antigo at os humanos modernos. Como os LINEs, muitos SINEs tambm tm a extremidade 5 truncada. Os SINEs tem provado que podem marcar filogeneticamente, identificando grupos monofilticos (clados). Tipicamente, SINE um RNA transportador derivado de um retropseudogene residente em um local especfico do cromossomo. Grande nmero de SINEs est disperso pelos genomas de organismos eucariotos, mas cada um ocupa um stio, que representa presumivelmente um evento de insero evolucionria singular. A partir dos produtos do PCR, so encaixados em cada txon marcado pela presena ou omisso de cada elemento SINE. A taxa que prova a investigao sempre uma ou um pouco independente SINE quase certamente podem pertencer a um clado porque a presena de um dado SINE provavelmente sinaliza uma aquisio evolucionaria simples. SINEs so estveis uma vez inseridos, porm a omisso do SINE para um dado stio do cromossomo presumivelmente uma condio original de ancestralidade. Similarmente, uma grande importncia tem se dado aos SINEs por estarem entre os mais poderosos marcadores moleculares para anlises filogenticas. Haplides nos Microssatlites (HAPSR) uma tcnica que est em fase de desenvolvimento, a qual utiliza recombinaes de tcnicas moleculares capazes de explorar as diferentes foras dos diferentes tipos de marcadores moleculares. Um grande exemplo disso o SRT loci, que altamente polimrfico o qual atravs da evoluo apresenta mutaes no comprimento dos seus alelos, sendo que atravs do estudo dessas

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mutaes se torna possvel uma combinao dos sinais filogenticos com o elevado polimorfismo de suas sequncias e, com isso, utilizar regies haploides destes STRs para revelar, por meio de estimativas, as haploidias individuais na genealogia. Estes STRs apresentam sinais genealgicos claros, porm sofrem uma grande desvantagem, que reflete diretamente nas reconstrues microevoluvionrias, que so as taxas evolutivas muito lentas, sendo ento necessria uma comparao das suas sequencias atravs da utilizao de regies codificantes do DNA para argumentar sobre a filogenia. Comparativo entre as tcnicas utilizando marcadores moleculares Algumas caractersticas peculiares a cada espcie de marcador puderam ser observadas, como no caso dos RFLPs, seu alto custo por dado gerado, baixa distribuio pelo genoma e dificuldade de uso, o que o torna uma das tcnicas mais laboriosas e complexas. J os polimorfismos de nucleotdeo nico (SNPs), pela facilidade de aplicao da tcnica, extensa distribuio no cdigo gentico e baixo custo na gerao de dados, so o grande alvo das pesquisas em biologia molecular e genmica funcional. Num futuro muito prximo representaro ferramentas indispensveis da medicina personalizada. Conclui-se, do mesmo modo, que as vrias tcnicas envolvendo os demais marcadores moleculares so aplicadas de acordo com caractersticas e limitaes nicas de cada tipo. Este fator exemplifica a importncia de se ter uma gama opes de marcadores, visto que dificilmente uma variedade suprir todas as prticas de gentica e biologia molecular que os empregam. Anlises comparativas entre essas tcnicas esto evidenciadas nas tabelas 2 e 3.

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Tabelas 2 e 3: comparaes entre os vrios tipos de marcadores moleculares, levando-se diferentes fatores em considerao.

Concluses Esta reviso de literatura relacionada s diversas espcies de marcadores moleculares existentes permitiu um maior aprofundamento nos estudos destes, que cada vez mais vm sendo aplicados em diagnsticos mdicos, anlises genticas, dentre outros focos de interesse biotecnolgico. Com o advento das tecnologias modernas de gentica e biologia molecular, surgiram diversas tcnicas que utilizam estes tipos de marcadores moleculares para detectar o polimorfismo gentico diretamente no DNA. Assim, o princpio da utilizao dos marcadores moleculares baseado no dogma central da biologia molecular e na pressuposio de que diferenas genticas no DNA significam, na maioria das vezes, diferenas fenotpicas. Aps a reviso e estudo do tema, possvel afirmar que dentre as vantagens dos marcadores podemos citar a obteno de um nmero praticamente ilimitado de polimorfismos genticos, a identificao direta do gentipo sem influncia do ambiente, a possibilidade de deteco em qualquer estdio do desenvolvimento do organismo ou a partir de cultura de clulas ou tecidos e a possibilidade de gerar maior quantidade de informao gentica por loco no caso de marcadores co-dominantes.

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Por fim, ressalta-se que os marcadores moleculares, em um futuro prximo, podero exercer um papel fundamental como ferramenta auxiliar no melhoramento animal e vegetal. Isto pode ser ressaltado ainda mais devido aos avanos nos estudos do seqenciamento dos genomas de vrias espcies de interesse, levando a um maior conhecimento sobre suas caractersticas genticas. O uso de marcadores para estas caractersticas, mais o uso de mtodos de seleo quantitativa, podem aumentar a acurcia da correlao entre o fentipo e o gentipo das diversas comunidades de organismos.

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