Universidad Nacional Autnoma de Nicaragua

Recinto universitario Rubn Daro Facultad de Ciencias medicas

Asignatura de Bioqumica

Seminario #1: Demostracin de la presencia de Metabolitos y enzimas en sangre.

Nombre: Giselle Adriana Ruiz Ortega

Profesora: Martha Mendieta

Grupo 3

Subgrupo 5

Martes 9 de abril, 2013

Objetivos:
1. Calcular la concentracin de metabolitos en sangre mediante espectrofotometra.

2. Calcular la actividad de enzimas en sangre mediante espectrofotometra.

3. Familiarizarse con los procedimientos correctos de manipulacin de equipos bsicos de qumica sangunea (espectrofotometra, micropipetas automticas de rango variable, centrifuga, etc.).

4. Familiarizarse con las normas de seguridad en el manejo de muestras biolgicas.

Preguntas para orientar la discusin:

1. Qu son valores normales o de referencia? Son intervalos de referencia que se obtienen analizando el resultado de la prueba en un gran nmero de personas sanas y calculando estadsticamente lo que se puede considerar normal en esta muestra. 2. Qu requisitos deben tener los valores para ser confiables? Los criterios de salud que caracterizan a los individuos de referencia y que por lo tanto constituyen los criterios d la inclusin en la muestra de referencia. Factores de variacin biolgica que eventualmente puedan exigir la estratificacin de la muestra de referencia, estimando valores de referencia en cada grupo. Un control riguroso y continuo de la calidad analtica utilizada. La aplicacin de mtodos estadsticos apropiados en la obtencin de los valores de referencia. 3. Cmo interpretas los resultados de glucosa y GTP de tu prctica? Los valores de glucosa y GPT obtenidos en la prctica se encuentran en los rangos normales de 60-100 para la glucosa y de GPT: En el hombre: de 8 a 35 UI/L (unidades internacionales/litro) y en la mujer: de 6 a 25 UI/L. Se encuentran entre los valores normales y por lo tanto no indican variaciones u anormalidades.

4. Qu requisitos deben cumplir un metabolito o una enzima para poder aplicarse en la qumica sangunea con fines de diagnostico? Que se encuentre en concentraciones en la sangre que sean identificable por medio de reactivos y medibles por medio de la espectrofotometra. Se mide la actividad de una enzima de una ruta o la concentracin de algn metabolito de esa ruta.

Que se pueda hacer una inferencia sobre el estado funcional del tejido u rgano donde se encuentra dicha ruta. 5. Cules de los requisitos anteriores fueron cumplidos por el mtodo para la determinacin de glucosa t GTP en sangre? La mayora. La glucosa se encuentra en el tejido sanguneo, se midi la concentracin de la glucosa en la sangre (la glucosa es un metabolito) La inferencia: segn la cantidad de glucosa presente en el tejido sanguneo pudimos saber si la insulina est permitiendo que la membrana celular sea permeable para que la glucosa la atraviese. 6. Ahora para saber si realmente has comprendido, haz el siguiente trabajo: si aun no has recibido la conferencia sobre glucolisis, toma cualquier libro de bioqumica revisa el tema y haz una propuesta de como, utilizando los mtodos que hemos utilizado en esta prctica podramos diagnosticar el funcionamiento de esta ruta. Si los niveles de glucosa fueran altos, se podra diagnosticar una hiperglicemia causada porque la secrecin de insulina es retrasada o reprimida mientras el glucagn no es suprimido. En relacin a la gluclisis el glucagn tiene un efecto inhibidor. En adicin al aumento de la gluconeognesis el glucagn inhibe la

gluclisis al inhibir la FPK-1 (fosfofructoquinasa 1), al igual que inhibe el piruvato quinasa evitando que este catalice la transferencia de un grupo fosfato desde el fosfoenolpiruvato hasta ADP produciendo piruvato y ATP. Lo que resulta una disminucin en la gluclisis y un incremento en la gluconeognesis. 0 7. Resume en tus propias palabras la ley de Lambert- Beer Relaciona la absorcin de la luz con las propiedades del material atravesado, relaciona la intensidad de la luz en un medio con la intensidad saliente despus que en un dicho medio se produzca absorcin.

8. Podemos determinar ms de un metabolito o ms de una enzima simultneamente en una misma muestra mediante la

espectrofotometra? Argumente su respuesta. Aparentemente si porque el aparato se puede ajustar para otros metabolitos o enzimas. Pero es un No porque se usa un reactivo exclusivo para la glucosa. 9. Qu normas de seguridad biolgica aplicaste en esta prctica? Justifica tu respuesta Ingreso con uniforme de trabajo exclusivo (uso de gabacha) Normas estandarizadas: no pipetear con la boca, no llevarse manos a la boca, no hablar durante la realizacin de una tcnica, mantenerse es su puesto de trabajo durante toda la jornada. Llevar el cabello recogido. Mantener el rea de trabajo limpio y ordenado. 10. Si una centrifuga genera mltiplos de g entonces, para cul de las 3 partculas A, B, C (en orden decreciente de masa) se necesita ms aceleracin? Para la C; a mayor masa se necesita una fuerza de aceleracin menor, por tanto para la C que es la de menor masa se necesita una aceleracin mayor para que esta se precipite. 11. Qu es oxidacin? La oxidacin es una reaccin qumica muy poderosa donde un elemento cede electrones, y por lo tanto aumenta su estado de oxidacin. Se debe tener en cuenta que en realidad una oxidacin o una reduccin es un proceso por el cual cambia el estado de oxidacin de un compuesto. Este cambio no significa necesariamente un intercambio de electrones. Suponer esto -que es un error comn- implica que todos los compuestos formados mediante un proceso redox

son inicos, puesto que es en stos compuestos donde s se da un enlace inico, producto de la transferencia de electrones. Por ejemplo, en la reaccin de formacin del cloruro de hidrgeno a partir de los gases de hidrgeno y dicloruro, se da un proceso redox y sin embargo se forma un compuesto covalente. Estas dos reacciones siempre se dan juntas, es decir, cuando una sustancia se oxida, siempre es por la accin de otra que se reduce. Una cede electrones y la otra los acepta. Por esta razn, se prefiere el trmino general de reacciones redox. La propia vida es un fenmeno redox. El oxgeno es el mejor oxidante que existe debido a que la molcula es poco reactiva (por su doble enlace) y sin embargo es muy electronegativo, casi como el flor. La sustancia ms oxidante que existe es el catin KrF+ porque fcilmente forma Kr y F+. Entre otras, existen el permanganato de potasio (KMnO4), el dicromato de potasio (K2Cr2O7), el agua oxigenada (H2O2), el cido ntrico (HNO3), los hipohalitos y los halatos (por ejemplo el hipoclorito de sodio (NaClO) muy oxidante en medio alcalino y el bromato de potasio (KBrO3)). El ozono (O3) es un oxidante muy enrgico: Br + O3 BrO3 El nombre de "oxidacin" proviene de que en la mayora de estas reacciones, la transferencia de electrones se da mediante la adquisicin de tomos de oxgeno (cesin de electrones) o viceversa. Sin embargo, la oxidacin y la reduccin puede darse sin que haya intercambio de oxgeno de por medio, por ejemplo, la oxidacin de yoduro de sodio a yodo mediante la reduccin de cloro a cloruro de sodio: 2 NaI + Cl2 I2 + 2 NaCl Esta puede desglosarse en sus dos semirreacciones corresponden 2I I2 + 2 e Cl2 + 2 e 2 Cl Ejemplo

El hierro puede presentar dos formas oxidadas:

xido de hierro (II): FeO. xido de hierro (III): Fe2O3

12. Qu es reduccin? En qumica, reduccin es el proceso electroqumico por el cual un tomo o ion gana electrones. Implica la disminucin de su estado de oxidacin. Este proceso es contrario al de oxidacin. Cuando un ion o un tomo se reducen presenta estas caractersticas: Gana electrones. Acta como agente oxidante. Es reducido por un agente reductor. Disminuye su estado o nmero de oxidacin. Ejemplo El ion hierro (III) puede ser reducido a hierro (II): Fe3+ + e Fe2+ En qumica orgnica, la disminucin de enlaces de tomos de oxgeno a tomos de carbono o el aumento de enlaces de hidrgeno a tomos de carbono se interpreta como una reduccin. Por ejemplo: CHCH + H2 CH2=CH2 (el etino se reduce para dar eteno). CH3CHO + H2 CH3CH2OH (el etanal se reduce a etanol).

13. De qu sirve saber el comportamiento enzimtico en estas reacciones? Sirve para conocer la velocidad y la concentracin de las enzimas de una ruta especifica, el comportamiento de ellas y para hacer una inferencia acerca de su funcin en el organismo. 14. Rangos normales de GPT y de que me sirve medirla. Valores normales de la enzima GPT En el hombre: de 8 a 35 UI/L (unidades internacionales/litro). En la mujer: de 6 a 25 UI/L.

Definicin: La transaminasa GPT es una enzima con gran concentracin en el en el hgado y en menor medida en los riones, corazn los msculos. Cuando hay una lesin de estos rganos la enzima es liberada a la sangre y aparece elevada en los anlisis. Como es una transaminasa ms especficamente heptica que la GOT, aparece ms elevada en las enfermedades hepticas que en otras, por eso el cociente GPT/GOT ser mayor de 1 en enfermedades ciertas enfermedades hepticas como la hepatitis vrica. Al contrario aparece menor de 1 en la cirrosis heptica, congestin heptica o tumores hepticos. Para qu se realiza este estudio Se realiza en el contexto de otras pruebas hepticas (GammaGT, GOT, bilirrubina, fosfatasa alcalina) y se utiliza para evaluar problemas o alteraciones del hgado. Su elevacin es directamente proporcional al dao celular y puede servir como indicativo de la evolucin de la enfermedad 15. Consecuencias de valores anormales de GPT. Valoracin de resultados anormales Los niveles aumentados de GPT pueden indicar:

Alcoholismo Anemia hemoltica Cncer de hgado Cirrosis Distrofia muscular Enfermedades renales agudas Enfermedades musculares primarias. Enfermedad de Wilson Hepatitis Infecciones vricas (mononucleosis, ) Infarto de miocardio Intervenciones de ciruga cardiaca Isquemia heptica Medicamentos txicos del hgado Necrosis heptica Pancreatitis aguda Traumatismos musculares.

16. Cmo

se

calculan

las

concentraciones

enzimticas

en

el

espectrofotmetro? MTODOS FOTOMTRICOS DE ANLISIS 1. NATURALEZA DE LA RADIACIN ELECTROMAGNTICA La Radiacin Electromagntica es una forma de Energa radiante que se propaga en forma de ondas. En este fenmeno ondulatorio se define: a) Longitud de onda (l): es la distancia entre dos mximos de un ciclo completo del movimiento ondulatorio. Se expresa, segn el S.I. en nanmetros (nm) y sus equivalencias son: 1nm = 1mm =10 A0 = 10-9 m. b) Frecuencia (n): es el nmero de ciclos por segundo. Es inversa a la longitud de onda. Su frmula es: n = c/l, y se mide en ciclos por segundo o hertzios. c) Fotones: la luz est formada por fotones, y estos son paquetes discontinuos de E. La E de un fotn depende de la frecuencia y de la longitud de onda, segn la siguiente expresin: E = h x n = h x c/n (h = Cte. de Planck = 6,62.10-27erg/seg.). La Energa Electromagntica se mide el Ergios. La relacin entre la longitud de onda y la Energa es inversa, por lo tanto a menor longitud de onda mayor Energa y viceversa. d) Espectro Electromagntico: cubre un amplio intervalo de E radiante, desde los rayos g de longitud de onda corta hasta las ondas de radio, de longitud de onda larga. Se divide en varias regiones, las ms interesantes para nosotros son: Regin Ultravioleta: l = 10-380 nm Regin Visible: l = 380-780 nm Regin Infrarroja: l = 780-30.000 nm

En la Regin Visible, la luz se descompone en colores. La luz blanca contiene todo el espectro de longitudes de onda. Si interacciona con una molcula puede ser dispersada o absorbida. 2. FENMENOS DE INTERACCIN ENTRE LUZ Y MATERIA. A. FENMENO DE ABSORCIN. Cuando una partcula que se encuentra en estado de reposo o estado fundamental interacciona con un haz de luz, absorbe E y se transforma en una partcula en estado excitado. La molcula absorbe la E de la onda y aumenta su energa, y ese aumento de energa es igual a la E de la Radiacin

Electromagntica absorbida (E = h.n). La partcula en estado excitado tiende a volver de forma espontnea a su estado de reposo desprendiendo la E absorbida en forma de calor. Espectro de Absorcin. Cada especie absorbente, que recibe el nombre de cromgeno, tiene un determinado espectro de absorcin. El espectro de absorcin es un grfico donde se representa en ordenadas la Absorbancia y en abcisas la longitud de onda. La medida de la cantidad de luz absorbida por una solucin es el fundamento de la espectrofotometra de absorcin. Por eso es importante trabajar a la longitud de onda a la que la sustancia estudiada absorbe la mayor cantidad de luz (a mayor cantidad de luz, mayor cantidad de sustancia). B. FENMENO DE EMISIN. Algunos compuestos, tras ser excitados por la luz, vuelven al estado fundamental produciendo la emisin de energa radiante. En este caso, lo que se mide es la energa emitida y, en este fenmeno se basa la fotometra de llama o la fluorescencia. 3. LEYES DE ABSORCIN. Cuando un haz de luz pasa a travs de un medio, se registra una cierta prdida de intensidad, debido a la absorcin por parte de la sustancia. Se llama TRANSMITANCIA (T) a la relacin entre la luz incidente y la luz transmitida: T = Is / I0; %T = (Is / I0) x 100.

Se puede perder intensidad por la interaccin con la cubeta o el solvente. Para evitar este error se hace una primera medida con una solucin de referencia o BLANCO, que contiene todos los posibles compuestos que intervienen en la lectura menos el que vamos a medir. Todas las medidas que se hagan con posterioridad sern referidas a esta medida inicial y se harn en la misma cubeta que se utiliz en la medida del blanco. La Transmitancia se usa poco, se emplea ms la Absorbancia (A) porque la relacin entre A y la concentracin de una solucin es directamente proporcional y la de la T es inversamente proporcional. La relacin entre la absorbancia y la transmitancia es la siguiente: Si el %T = 100 A = 2-log T = 2-log 100 = 0

Si el %T = 0

A = 2-log 0 =

En los aparatos que se usan actualmente se presentan absorbancias, pero el aparato lo que mide realmente es %T que luego transforma a absorbancia. 3.1. LEY DE BEER La absorbancia de una solucin es directamente proporcional a la concentracin y a la longitud del paso de la luz. A = e. b. c Siendo: A: absorbancia. No tiene unidades. e: el coeficiente de extincin molar, tambin llamado coeficiente de absorcin. Es constante para un compuesto dado siempre que se fijen condiciones de longitud de onda, de pH, de temperatura, de solventes, etc. Sus unidades son 1/ (mol/cm). b: es la longitud de paso de la luz, en cm. c: es la concentracin del absorbente. Se mide en mol/L. La aplicacin prctica de la Ley de Beer es, que conociendo la absorbancia de una sustancia podemos averiguar su concentracin y esto lo podemos hacer de dos formas: 1. Por comparacin con una solucin conocida: si tenemos 2 soluciones, una problema (P) y una estndar (S), podemos establecer la siguiente relacin matemtica entre ellas: 2. A travs de una curva de calibracin: la curva de calibracin es la representacin grfica en un eje de coordenadas de la Absorbancia (eje de ordenadas) frente a la Concentracin (eje de abscisas). Se ensayan varias soluciones de concentracin conocida y se determinan sus A, construyndose la curva de calibrado, que es una recta. Una vez ensayadas las soluciones problemas, su concentracin se averigua por interpolacin de las A de las soluciones problema en la curva de calibracin. Hay que tener en cuenta la LINEALIDAD, que es el intervalo de concentraciones del cromgeno entre las cuales existe una relacin lineal entre Absorbancia y Concentracin. Cuando la concentracin del cromgeno sobrepasa los lmites de linealidad se deja de cumplir la Ley de Beer, convirtindose la recta en una curva. La lectura de

la Absorbancia fuera de los lmites de linealidad se traduce en una concentracin falsamente baja de cromgeno. En esta situacin, hay que diluir la muestra para que su concentracin entre en los lmites de la linealidad. Empleo de los Factores de Calibracin: Para reactivos estables y sistemas fotomtricos estables, este factor se puede mantener constante, siendo slo necesario ensayar las muestras problema multiplicando la A resultante por el factor F. 17. Mencionar la ley de primer orden. Una reaccin de primer orden es aqulla en la que la velocidad de reaccin depende nicamente de un reactivo. Por ejemplo, la isocianuro de metilo, CH3NC. Este tipo de reacciones se pueden representar como: AB Y la velocidad de desaparicin de A se puede escribir de la siguiente manera: V= - 1 A d[A] = k[A] dt isomerizacin de