Aislamiento de Salmonella en muestras clnicas humanas, animales y alimentos durante 1988-2001

Noseda,R.P.; Bigalli,M.C.; Andrich,M.G.; Cordeviola,J.M.; Bardn,J.C.; Martinez,A.H.; Combessies, G.M. (1). RESUMEN Se describen 287 aislamientos de Salmonella sp. durante un perodo de 13 aos, del total de los mismos: 133 (46%) corresponden a sndromes diarreicos humanos, 81 (28%) a distintos tipos de alimentos de consumo humano y animal y 73 (26%) a sndromes diarreicos de animales. Se caracterizan las 21 serovariedades aisladas conjuntamente con el tipo de muestra analizada. En todos los aislamientos efectuados en materia fecal humana y animal se determina la resistencia a los antimicrobianos, siendo la colistina con un 78 % y la tetraciclina con el 75 % los que demostraron mayor resistencia. Se remarca la importancia epidemiolgica de la tipificacin serolgica que permite identificar serovariedades para la evaluacin y seguimiento de los participantes involucrados en los distintos brotes de sta enfermedad. Del total de las distintas muestras evaluadas las variedades S. enteritidis (39 %), S. typhimurium (25 %) y S. dublin (10 %), resultaron las mas prevalentes. Palabras clave: Enteropatgeno humano,diarrea animal, alimentos contaminados, toxoinfeccin alimentaria. SUMMARY During a period of 13 years, we describe 287 isolation of Salmonella sp, 133 (46%) corresponding to diarrheics syndromes in humans, 81 (28%) to different kinds of food and 73 (26%) to diarrheics syndromes in animals. We characterize the 21 serovarietes isolated with the kind of sample studied. We determine the resistence to antibiotics in isolation of human and animal faecal where the colistin with 78 % and tetracycline with 75 % proved to be the most resistent. We mark again the epidemiologic importance of the serological typification, which allowed to identify serovarietes for the evaluation and following of participanting elements involved in different outbreaks of this desease. The varieties S. enteritidis (39%), S. typhimurium (25%) and S. dublin (10%), were the most important in the different samples studied. (1)-Laboratorio Azul Diagnstico.Calle 25 de Mayo 485.(7300)Azul,Bs. As.Argentina. E- mail: Labazul@satlink.com.
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Introduccin Las Salmonellas transmitidas por alimentos para consumo humano y animal constituyen un problema de salud pblica (3-9). Muchas personas y animales pueden transformarse en portadores inaparentes; la falta de sntomas en la mayora de ellos luego del episodio diarreico disimula una fuente constante de contaminacin al medio ambiente que los transforma en un factor epidemiolgico de riesgo destacable (8). En toda persona o animal con sintomatologa diarreica se debe intentar aislar e identificar Salmonella a fin de constituir el mapa epidemiolgico con las serovariedades ms prevalentes (2) y determinar su sensibilidad a los antimicrobianos. Ante sta enfermedad que se encuentra en expansin, resulta necesario intensificar su bsqueda en alimentos y animales para tomar medidas de control e interrumpir el ciclo de infeccin entre los mismos a travs de las distintas cadenas alimenticias(4-8). El objetivo de ste trabajo fue demostrar las distintas serovariedades halladas y el significado que representa para la salud pblica y animal la presencia del gnero Salmonella en los distintos brotes examinados evaluando adems su resistencia a los antibiticos de uso mas frecuente en medicina humana y veterinaria. Materiales y mtodos Se evaluaron 287 cepas de Salmonella aisladas durante el perodo comprendido entre los aos 1988 al 2001, los mismos se efectuaron en muestras de alimentos y materia fecal de animales y humanos discriminados como se muestra en el cuadro N 1. Cuadro N 1: Constitucin numrica y porcentual de las muestras
N 81 73 133 287 % 28 26 46 100

Alimentos Animales (materia fecal) Humanos (materia fecal) Total

Muestras de alimentos: Las 81 muestras de distintos alimentos estaban constituidas por: 44 carne de liebre cruda, 27 carne de gallina cocida, 3 huevos de gallinas crudos, 3 helados de sambayon, 2 helados de crema, 1 postre de dulce de leche y 1 salsa mayonesa.

Para procesar las muestras se realiz la metodologa que a continuacin se describe: se pesaron 25 gr. de muestra y se la incub en 225 ml. de agua peptonada durante 18 hs. a 35 C (preenriquecimiento); el enriquecimiento se efectu incubando 100 l de esta suspencin en 10 ml. de caldo Rappaport Vassiliadis (Merck) durante otras 18 24 hs. a 35 C y finalmente se repic para su aislamiento en medio XLD (Merck). A las 18 24 hs. de incubacin a 35 C, todas las colonias sospechosas de Salmonella se aislaron en TSA (Britania) fraccionado en pico flauta para su confirmacin bioqumica y serolgica. Muestras de materia fecal: las 73 muestras de animales estaban compuestas por 67 de origen bovino, 2 de equinos, 2 de guanacos, 1 de nutria y 1 de pavo provenientes de animales con sndrome diarreico. Las muestras se sembraron en forma directa con hisopo en agar SS (Britania) y agar EMB (Britania) incubandose durante 18 a 24 hs. a 35 C; otro hisopo fue incubado en caldo Selenito (Britania) y posteriormente repicado a agar SS y XLD. Toda colonia sospechosa se confirm bioqumica y serolgicamente. El mismo procedimiento fue realizado con las 133 muestras de materia fecal humana de las cuales 86 pertenecan a adultos y 47 a nios. Identificacin bioqumica: Para realizar la identificacin bioqumica de las cepas aisladas se les efectu las siguientes reacciones: utilizacin de citrato como nica fuente de carbono, fenilalanina desaminasa, produccin de ureasa, produccin de SH 2, movilidad, produccin de indol, fermentacin de glucosa, fermentacin de lactosa, reduccin de nitratos a nitritos y decarboxilacin de la lisina. Las positivas se complementaron con la tcnica de API 20E, asistido por el programa APILAB PLUS (bioMrieux). Identificacin serolgica: se realiz mediante la utilizacin de sueros OMA-OMB del Instituto Nacional de Microbiologa Dr. Carlos C. Malbrn. Posteriormente las positivas fueron identificadas por serovariedades en la Divisin de Enterobacterias del Instituto Nacional de Microbiologa Carlos C. Malbrn (*). Determinacin de resistencia antimicrobiana: se utiliz el mtodo de difusin en agar (Mtodo de Kirby- Bauer), con discos de papel con concentracin media de antibitico (Britania). La lectura de los halos en mm. se realiz mediante un verniercalipers. Los antibiticos evaluados de uso en medicina humana fueron: gentamicina

(GEN), cloranfenicol (CMP), trimetroprima + sulfametoxazol (TMS), ciprofoloxacina (CIP), neomicina (NEO), norfloxacina (NOR),ampicilina (AMP), colistina (COL). Los antibiticos evaluados de uso en medicina veterinaria fueron: gentamicina (GEN), florfenicol (FLC), ciprofloxacina (CIP), trimetroprima + sulfametoxazol (TMS), tetraciclina (TET). Resultados Se aislaron e identificaron 287 cepas de Salmonellas, 81 (28 %) pertenecientes a alimentos, 73 (26 %) a aislamientos en materia fecal animal y 133 (46 %) a sndromes diarreicos humanos. De las 21 serovariedades encontradas, Salmonella enteritidis fue la ms prevalente aislandose en 112 muestras (39 %), seguida por Salmonella thyphimurium, 73 aislamientos (25%), Salmonella dublin, 28 (10 %) y Salmonella newport, 13 (4 %). El nmero de serovariedades y el porcentaje de las mismas discriminado por tipo de muestra (alimento, animal y humano), se detalla en el cuadro N 2. Cuadro N 2: Serovariedades de Salmonellas presentes en las distintas mues tras analizadas Serovariedad
S. enteritidis S. thyphimurium S. dublin S. newport S. infantis S. hadar S. anatum S. panama S. montevideo S.agona S.bovismorbificans S.derby S.muenchen S. give S. chester S.Saint Paul S. gaminara S. arechavaleta S. oraniemburg S. london S. manhattan

Total Nro %
112 73 28 13 8 6 7 5 5 8 7 4 2 1 1 1 1 1 1 1 2 39 25 10 4 3 2 2 2 2 3 2 1 1 0,35 0,35 0,35 0,35 0,35 0,35 0,35 1 4

Alimento Nro %
12 35 0 6 2 3 4 3 2 2 6 1 0 0 0 1 1 1 1 0 1 15 43 0 7 2 4 5 4 2 2 7 1 0 0 0 1 1 1 1 0 1

Animal Nro %
7 23 28 4 0 3 3 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 10 31 38 5 0 4 4 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 2

Humano Nro %
93 15 0 3 6 0 0 1 2 5 1 3 2 1 0 0 0 0 0 1 0 70 11 0 2 4 0 0 1 1 4 1 2 1 1 0 0 0 0 0 1 0

TOTAL

287

100

81

28

73

26

133

46

Segn la informacin descripta en otros trabajos, Salmonella enteritidis y Salmonella typhimurium son las serovariedades que predominan mundialmente seguidas por otras como Hadar, Agona, Infantis y Newport, considerados agentes importantes de la enfermedad humana debido al consumo de alimentos contaminados (5). En muestras provenientes de alimentos, S. typhimurium fue la serovariedad que prevaleci (43%), seguida de S. enteritidis (15%), S. newport (7%), S.bovismorbificans (7%) y S. anatum (5%). En muestras de origen animal, S. dubln fue la serovariedad ms frecuentemente aislada (38%), S. typhimurium en segundo lugar (31%) y S. enteritidis en tercer lugar (10%). En cuanto a las serovariedades aisladas en las muestras de materia fecal humana, S. enteritidis fu la serovariedad que ocup el primer lugar (70%), seguida de S. typhimurium (11 %), S. infantis (4 %) y S. agona (4%). La presentacin de 4 brotes humanos donde estuvieron involucradas ms de 250 personas permiti mediante la tipificacin serolgica identificar las serovariedades actuantes, el seguimiento de los participantes y el origen de los alimentos involucrados en los distintos brotes. Durante el mes de Febrero del ao 1991, una infeccin alimentaria afect a varias familias (54 personas) de la ciudad de Chillar del partido de Azul (Bs.As.) quienes haban consumido salsa mayonesa de elaboracin casera. En dicha oportunidad, se aisl S. enteritidis en la clara de los huevos (cuya yema se utiliz como materia prima de la salsa mencionada), como en los coprocultivos de las personas afectadas. En el ao 1994, durante el mes de Diciembre, se aisl tambin S, enteritidis de un brote ( 35 personas ) producido en Azul (Bs.As.) por el consumo de mayonesa de ave de elaboracin casera. El agente etiolgico fue aislado tanto del alimento como de muestras de materia fecal de los afectados. En el verano del ao 1997, se produjo un brote (100 personas) producido por el consumo de helados de vainilla de elaboracin artesanal en el partido de Azul. Dicho brote afect tanto a nios como adultos, aislandose en esa oportunidad S. agona. En el mes de Julio del mismo ao tambin en Azul (Bs.As.) una intoxicacin alimentaria afect a una familia (15 personas) debido a la ingesta de un postre de
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elaboracin casera compuesto por huevos crudos, en ese caso se aisl S. enteritidis del alimento y de las muestras de materia fecal de las personas involucradas. Como est descripto en la bibliografa Salmonella dublin es monoplica para bovinos. Est considerada un serotipo adaptado a su hospedador aunque ocasionalmente puede aislarse de otras especies (cerdos, equinos y ovinos) (6-8). Se ha mencionado que puede causar enfermedad en humanos que ingieren alimento contaminado o animales infectados(2). No sera extrao encontrar en un futuro cercano sta serovariedad en muestras de otros orgenes(6). Es de inters sealar que S. chester aislada unicamente en animales (equino), fue causal de aborto en los mismos. Cuadro N 3: Resistencia antimicrobiana de122 cepas evaluadas de Sndromes dia rreicos humanos y animales (1995 2001)

Antibiticos - % de Resistencia Grupo Bact erian Salmonella humanos Salmonella animales N de Cepas GEN 69 53 9 6 CMP 9 ---CIP 0 36 TMS 20 11 NEO 19 ---NOR 36 ---AMP 39 ---COL 78 ---TET ---75 FLC ---21

GEN: Gentamicina; CMP: Cloranfenicol; CIP: Ciprofloxacina; TMS: Trimetroprima + sulfatometoxazol; NEO: Neomicina; NOR: Norfloxacina; AMP: Ampicilina; COL: Colistina; TET: Tetraciclina; FLC: florfenicol.

Con respecto a la resistencia antimicrobiana (cuadro 3), entre las cepas de Salmonellas aisladas de humanos, se determin que el 78 % fue resistente a la colistina, el 39 % a la ampicilina y el 36 % a la norfloxacina como valores destacados a tener en cuenta. Respecto a las cepas aisladas de animales, la tetraciclina con un 75 % y la ciprofloxacina con un 36 % fueron los que mostraron mayor resistentes. Discusin Los alimentos evaluados, aportaron el 28 % de las salmonellas aisladas, en los 4 brotes de intoxicacin alimentaria donde ms de 250 personas se vieron involucradas, se nmero de cepas

debieron al consumo de productos alimenticios contaminados ya sea por la materia prima o la manipulacin ineficiente (3-9). Las serovariedades S. enteritidis y S. agona fueron aisladas tambin de la materia fecal de los afectados como de los alimentos contaminados. La identificacin serolgica de las serovariedades presentes en cada uno de los casos donde estuvieron involucradas personas, permiti observar la relacin entre los alimentos contaminados y las personas enfermas, encontrandose en stas el 46 % del total de las salmonellas aisladas, marcando el grado de importancia de este gnero bacteriano en las toxiinfeccines alimentarias. Esta relacin alimentos contaminados con repercusin infectocontagiosa en la enfermedad diarreica, en hombres y animales, plantea la necesidad de instrumentar sistemas de evaluacin sanitaria para la produccin de alimentos que incluyan: a) la evaluacin ambiental del sector de produccin, b) los utensilios y maquinarias, c) la higiene de los operarios y de los productos alimenticios terminados, d) esquemas de limpieza definidos y evaluables. Adems de incluir en forma permanente cursos de manipuladores de alimentos acorde a la magnitud de la empresa elaboradora de stos (4). En la produccin de alimentos tanto para consumo humano o animal, la inocuidad de los mismos debe ser una caracterstica requerida de la calidad. Asegurar esa calidad y generar habilidades junto a cambios de actitudes en los manipuladores es el futuro desafo. Se debera disponer de un programa de vigilancia de sta zoonosis para prevenir riesgos en la salud humana y animal. Referido a la resistencia antibitica observada, donde la colistina con un 78 % y la ampicilina y norfloxacina con un 39 % y 36 % respectivamente, marcan la magnitud del problema planteado, no es menos importante en Medicina Veterinaria donde las tetraciclinas con un 75 % y la ciprofloxacina con un 36 % demuestran la necesidad de instrumentar polticas lgicas en el manejo de los antibiticos tanto para la salud humana como veterinaria ya que ambas poseen una amplia interrrelacin.

Agradecimiento
(*) Al Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas Dr. Carlos C. Malbrn. Divisin Enterobacterias. Dra. Mara Ins Caffer y Dra Raquel Terragno.
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A la Dra. Teresa Eiguer, creadora de una conciencia nacional en el diagnstico de las bacterias enteropatgenas desde el Centro Nacional de Referencias de Enterobacterias (C.N.R.).

Bibliografa
1-Caffer, M. I. Y col. Evaluacin de Salmonella y Shigella en el perodo 19951997. Libro de Resmenes VIII Congreso de Microbiologa (181). 2-Eiguer,T; Butta,N; Picandet,A.M. Serotipos de Salmonella en la Repblica Argentina aisladas de fuentes humanas y no humanas durante el perodo 1979-1981. Revista Argentina De Microbiologa. Vol. 15. N 1. 1983. (25-31). 3-Fernandez, M.C.; Frade, A.H. Salmonelosis. Infectologa y Microbiologa Clnica. Vol III, N 3 (79-80), 1991. 4-Fundacin CEDA. Programa de capacitacin para la industia alimentaria. Documentos. 1996-2000.San Martn N 772. (7300). Azul.Bs. As. ARGENTINA. 5- Khakhria, R., D. Woodeard, W. M. Johnson, and C. Poppe. 1997. Salmonella isolated from humans, animals and other sources in Canada, 1982-92. Epidemiol. Infect. 119:15-23. 6-Mc Donough, P.L.; Fagelman,D.; Shin,S.J.;Brunner,M.A. and Lein, D.H.. Salmonella entrica Serotype Dublin Infection: an Emerging Infections Disease for the Northeastern United States. Journal of Clinical Microbiology, Aug,1999. Vol 37 N 8 (2418-2427). 7-Noseda,R.P.;Bernagozzi,J.A. Epizootia por Salmonella enteritidisen una colonia de Mus musculus variedad albinus. Gaceta Veterinaria .N 328- Abril 1978 (116120). 8-Noseda, R.P.; Martinez, A.H.; Bardon, J.C.; Cordeviola, J.M. Salmonelosis humana y animal. Veterinaria Argentina. Vol VI N 54 (254-257), Junio,1989. 9-Terzolo, H.R; Salmonellosis, su impacto en produccin animal y los alimentos. Programa y Libro de resmenes VII Congreso Argentino de Ciencias Veterinarias. (104)- Noviembre, 1994.