Biotecnologa Aplicada Gua Laboratorio n4: Verificacin o screening de clones recombinantes

Luego de realizar las reacciones de ligacin (con nuestro vector + DNA o inserto) y la posterior transformacin bacteriana en nuestras clulas competentes, necesitamos verificar que el fragmento de DNA que clonamos se haya insertado de manera correcta en el vector y que corresponda al tamao indicado (nmero de pares de bases). Sabemos que el primer acercamiento para la verificacin es posible lograrlo al utilizar vectores que contienen un gen de resistencia antibitica, permitiendo a las clulas que contienen el vector sobrevivir en un medio suplementado con el antibitico apropiado. Adems, el uso de un vector con screening basado en -complementacin (que contengan el gen lacZ), cuya transformacin ser cultivada luego en placas con indicador X-Gal/IPTG (ej: pGEM-T opGEM-T Easy Vector) permitir la seleccin previa de los clones recombinantes con colonias de color blanco y el descarte de las colonias con tonalidad azul. Luego de esta primera seleccin, se pueden utilizar dos mtodos que nos permitirn realizar la verificacin de los clones obtenidos: 1) PCR: Es posible realizarlo utilizando como templado una suspensin de las colonias obtenidas al transformar. El objetivo es amplificar el inserto clonado con partidores especficos o bien amplificar la regin de multiclonamiento (MCS) con partidores comerciales (especficos del vector) para verificar la insercin del fragmento de DNA clonado en esta regin del vector. Este mtodo permite adems verificar la orientacin del inserto en el vector. Considerando que la orientacin del inserto es importante al clonar en vectores de expresin, de modo que el gen, este orientado en la misma direccin en la que se encuentra el promotor incorporado en el vector. Para esto se utiliza la combinacin de un partidor especfico del vector con un partidor especfico del inserto, como se muestra en la siguiente figura:

A
GEL

En el caso anterior, se observa en A que el fragmento clonado se encuentra orientado en la MISMA DIRECCION que el promotor T7, por lo tanto es el caso correcto y sera un clon a seleccionar. En el gel, esto correspondera a los clones 1 y 2, los que presentan amplificado con la combinacin de partidores T7 y Reverse. Caso contrario ocurre en el caso B, en donde el gen esta clonado de manera invertida respecto al promotor T7, lo que no permitira la expresin de la protena codificada en el fragmento clonado. A travs del PCR, esto se observa en los clones 3 y 4, los que presentan un amplificado con los partidores T7 y Forward, por lo que estos clones seran descartados.

2) Digestin con enzimas de restriccin: Para esto es necesario realizar previamente la purificacin del plasmidio, desde cada una de las colonias transformantes a analizar. Este anlisis o screening de clones recombinantes utilizando enzimas de restriccin es ms laborioso que el PCR de colonias, ya que involucra 1) aislamiento del DNA plasmidial desde cultivos lquidos realizados de colonias individuales de la clula hospedera, 2) digestin con enzimas de restriccin y, 3) determinacin del correcto tamao del inserto a travs de la separacin de los productos de la digestin en geles de agarosa. Una vez que se purifica el DNA plasmidial, se somete a una digestin con enzimas de restriccin. Para plsmidos de alto numero de copias, se pueden obtener 410g de DNA plasmidial por purificacin (1-5ml). Para plsmidos de bajo nmero de copias, se obtendrn 13g de DNA plasmidial por purificacin (10ml). Se recomienda utilizar 0.51g de plsmido en la digestin y utilizar un plsmido sin digerir como control al comprobar la digestin en el gel de electroforesis. El correcto diseo del protocolo de digestin ayudar a determinar de manera fcil si el plsmido contiene el inserto deseado.

**Finalmente es necesario establecer que la comprobacin final de la identidad e integridad del inserto clonado debe realizarse a travs de un proceso de secuenciacin, en donde se lograr determinar de manera precisa la secuencia de nucletidos del DNA clonado, la ausencia de posibles mutaciones, as como deleciones o inserciones**

Actividades. Realizaremos una verificacin de clonamiento utilizando los vectores ya purificados que le sern proporcionados en el laboratorio. Para este fin, los vectores sern digeridos con la enzima de restriccin EcoRI y los resultados sern analizados en geles de agarosa. 1) Preparar la digestin enzimtica: 4 l 1 l 1 l 4l Vector Bfer 10X EcoRI dH2O Incubar la reaccin a 37C por 2 horas. Luego analizar los productos obtenidos en un gel de agarosa 0,8% (con bromuro de etidio) preparada en TAE 1X.