11/03/2013

Cintica enzimtica de reacciones multisustratos 2013

Curva de progreso de una reaccin enzimtica

Vi o Vo; estado estacionario; equilibrio

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Grfico de Michaelis-Menten Lineweaver-Burk

Vm; Km; eficiencia cataltica

Reaccin enzimtica es una caja negra

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Ecuaciones cinticas

f:forward, r: reverse

Clasificacin de las reacciones segn W.W. Cleland Formacin de complejo ternario

1.- Reaccin Ordenada o secuencial

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Clasificacin de las reacciones segn W.W. Cleland Formacin de complejo ternario

2.- Reaccin al azar o desordenada

Clasificacin de las reacciones segn W.W. Cleland Formacin de un intermediario

Reaccin ping pong o con doble desplazamiento

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Objetivo de estas clases es distinguir cinticamente los tres tipos de esquemas cinticos
Formacin de complejo ternario 1.- Reaccin Ordenada o secuencial Formacin de un intermediario Reaccin ping pong o con desplazamiento 2.- Reaccin al azar o desordenada

Cmo distinguir si la catlisis de la enzima en estudio transcurre con la unin primero de todos los sustratos para formar un complejo ternario o cuaternario o bien se forma un intermediario entre la enzima y uno de los sustratos?

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Ecuaciones que representa una reaccin ordenada con dos Sustratos (a y b) y dos Productos (p y q)

vi

Trabajando en vi, poco producto simplificacin?

Ecuacin simplificada de una reaccin ordenada

Reordenacin a curva hiperblica

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Ecuacin simplificada de una reaccin ordenada

1/Vapp(intercepto)

Graficacin de vs 1/B

Kmapp/ Vapp(pendiente) vs 1/B

Grfico de Lineweaver-Burk a distintas concentraciones de sustrato B

Lneas que se cruzan en 2 o 3er cuadrante o eje X al varias sustrato fijo

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Graficos representativos de una reaccin ordenada o al azar

Igual patrn de lneas que se cruzan al variar uno u otro de los S

Grficos secundarios

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Clasificacin de las reacciones segn W.W. Cleland Formacin de un intermediario

Reaccin ping pong o con desplazamiento

Grafico Lineweaver-Burk de una reaccin ping pong o de doble desplazamiento

Lneas paralelas al varias el sustrato fijo

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Reaccin ping-pong

Slo grfico secundario Intercepto vs 1/B o 1/A

Grfico secundario para una reaccin ping pong: Intercepto vs 1/B

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RESUMEN DE ESTUDIOS EN VELOCIDADES INICIALES

En grfico de 1/vi en funcin de 1/S se pueden distinguir: Lneas que se cruzan: Reacciones que transcurren con la formacin de un complejo ternario (Reaccin Ordenada y Reaccin al azar) Lneas paralelas: Reacciones que transcurren con la formacin de un intermediario (Covalente) Reaccin Ping Pong

Cmo distinguir entre una reaccin ordenada de una al azar?

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Estudios de inhibicin por producto: secuencia entrada de sustrato y salida de productos

En ausencia de P y adicionando Q

Estudios de inhibicin por producto: secuencia entrada de sustrato y salida de productos

En ausencia de Q y adicionando P

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Efecto de la adicin de productos sobre los parmetros cinticos Si Producto y Sustrato se unen a la misma forma enzimtica se espera que sea inhibidor competitivo Si Producto y Sustrato se unen a formas enzimticas distintas se espera que sea un inhibidor no competitivo mixto (Inh Mixto)

Inhibidor competitivo

Inhibidor (I) se une a la misma forma enzimtica que el S (sustrato), pero no implica necesariamente que la unin sea en el sitio activo. Hay competencia por la misma forma enzimtica E (enzima libre)

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Inhibidor competitivo

A conc altas de sustrato se alcanza la misma Vm, pero aumenta Km (mayor cantidad de S para semisaturar a la E)

Inhibidor no competitivo mixto

El inhibidor (I) se une a la E libre y al complejo ES

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Inhibidor no competitivo mixto

Tipos de inhibicin esperables por presencia de producto: Reaccin ordenada

Inhibidor competitivo: Competencia por la misma forma enzimtica que el S (ltimo P con primer S)

Inhibidor no competitivo mixto: Se une a una distinta forma Enzimtica que el S

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Tipos de inhibicin por producto Reaccin ordenada

Producto P P Q Q

S variable A B A B

Tipo inhibicin Mixta Mixta Competitiva Mixta

Tipos de inhibicin por producto: Reaccin al azar/desordenada

Sustrato var

Sustrato Fijo Prod adicionado Tipo Inhibicin

Todas las inhibiciones son competitivas

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Tipos de inhibicin por producto: Reaccin ping pong/intermediario covalente

Producto P P Q Q

S variable A B A B

Tipo inhibicin Mixta Competitiva Competitiva Mixta

RESUMEN DE ESTUDIOS EN PRESENCIA DE UNO DE LOS PRODUCTOS

- Siempre se observa inhibicin competitiva entre el

primer Sustrato (A) y ltimo producto (Q). - Hay inhibicin competitiva cuando el Producto compite por la misma forma enzimtica. - Hay inhibicin no competitiva mixta cuando el Producto y el Sustrato se unen a distintas formas enzimticas. - Patrn de inhibicin caracterstico de cada tipo de mecanismo cintico. - Permite demostrar secuencia de entrada de Sustratos y salida de Productos.

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Graficaciones lineales de la Hiprbola equiltera Grfico de Hanes-Woolf

Graficaciones lineales de la Hiprbola equiltera: Grafico de Eadie-Hofstee

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Tarea para Laboratorio de Cintica multisustratos Traer individualmente para este jueves 14 los cambios en los lugares donde se determinan Km y Vm al graficar segn Hanes-Woolf Eadie-Hofstee al agregar a) un inhibidor competitivo y b) un no competitivo mixto

BIBLIOGRAFIA
Voet y Voet. Bioquimica A. Cornish-Bowden. Fundamentals of Enzyme kinetics Cleland, W. W. (1963) The kinetics of enzyme-catalyzed reactions with two or more substrates or products. Biochim. Biophys. Acta 67, 104137.

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