Clase 23/02/2010 Prof.

Siham Salmen Halabi

INMUNOLOGIA

Clase N 1

ONTOGENIA Y ORGANOS DEL SISTEMA INMUNE

La Ontogenia se refiere el estudio del origen de las clulas del sistema inmune y su desarrollo, y veremos por qu la importancia del estudio de la ontogenia de estas clulas, particularmente porque durante este proceso los linfocitos establecen los vnculos que ellos deben tener para poder interactuar con la clula presentadora de antgeno y de esa manera reconocer a los antgenos extraos. Como ya sabemos una de las principales funciones del sistema inmune es reconocer a los antgenos extraos, pero adems reconocer a los antgenos propios como propios y evitar el desarrollo de una respuesta agresora. Cuando dicho sistema pierde la capacidad de reconocer a los antgenos propios se desarrollan las enfermedades autoinmunes, entonces todo el balance que debe tener la respuesta inmune se aprende durante su desarrollo en distintos tejidos que funcionan como escuelitas que indican cules son los antgenos propios y de alguna manera evitan el reconocimiento de esos antgenos y la generacin de una respuesta efectora indebida para ese individuo. En este proceso tambin conoceremos la amplia diversidad de receptores, ya que la respuesta inmune frente a antgenos extraos es altamente especfica y tenemos en nuestro organismo una gran cantidad de clonas de clulas capaces de reconocer a esos antgenos extraos, aproximadamente 109 clonas diferentes de clulas que permiten reconocer aproximadamente 109 diferentes determinantes antignicos. Todo esto se aprende durante el desarrollo de los linfocitos T y los linfocitos B. En esta imagen se observa una gran cantidad de elementos como los receptores en la superficie que establecen el contacto entre ambas clulas, durante este proceso el linfocito T debe aprender a establecer la comunicacin con la clula presentadora de antgeno, esto quiere decir que mis linfocitos T solamente van a reconocer antgenos extraos si mis clulas dendrticas se lo presentan, lo que no ocurre si la clula presentadora de antgeno no es ma sino de otra persona, ya que no se generara la respuesta que normalmente se debera esperar durante la interaccin entre el linfocito T y la clula presentadora de antgeno. Esta interaccin debe ser altamente especfica, es lo que determina entonces la especificidad de la respuesta inmune porque la clula presentadora de antgeno le expone al linfocito T pedacitos del antgeno; y el linfocito T tiene que reconocer esa secuencia pequea de aproximadamente 9 aa en el contexto de la molcula TCR (receptor de linfocito T), esta comunicacin debe establecerse durante el desarrollo

de las clulas, si por ejemplo el linfocito es incapaz de conectarse con la clula presentadora de antgeno ocurre la lisis celular, proceso que se denomina muerte por negligencia . El proceso de desarrollo de las clulas es finalmente controlado y adems se debe preservar la tolerancia, en dicho proceso las clulas comienzan a proliferar de manera exagerada pero slo pocas clulas pueden desarrollarse y solamente aquellas que no reaccionan contra los antgenos propios pueden salir a la periferia y es lo que conforma uno de los fundamentos que corresponden a la tolerancia central, llamada as porque se desarrollan a nivel de los rganos linfoides primarios (mdula sea, epitelio intestinal y timo) En esta clase trataremos de comprender los siguientes aspectos: o o o o o de dnde se generan estas clulas? donde maduran (rganos linfoides primarios)? qu factores median ese proceso? cules son las decisiones que deben tomar los linfocitos? qu factores condicionan las decisiones que toman esas clulas durante su desarrollo?

Tambin damos a entender porque existen esos mecanismos tan estrictos y finos de regulacin del desarrollo de estas clulas: o o En primer lugar para asegurarse de contar con un repertorio de clulas capaces de reconocer a todos los antgenos extraos y presentes en la naturaleza Asegurarse que el sistema inmune reconozca como propios a sus antgenos, que es lo que se conoce como tolerancia, y la que ocurre a nivel de los rganos primarios se conoce como tolerancia central En tercer lugar para asegurarse que los linfocitos migren hacia la periferia con las herramientas bsicas para enfrentarse a los antgenos extraos, una vez que dichas clulas salen de los rganos linfoides primarios ya cuentan con las herramientas bsicas para poder reconocer a cualquier antgeno extrao que desafe a la respuesta inmune.

Dicha diversidad antignica o capacidad de reconocer todos los antgenos que existen en la naturaleza depende de asegurarse que se desarrollen los receptores para linfocitos T y para linfocitos B que se conocen como TCR y BCR; y que solamente salgan de los rganos linfoides primarios aquellos que no tengan alta reactividad por los antgenos propios (seleccin positiva) y asegurarse tambin que todos aquellos TCR y BCR potencialmente peligrosos y autoreactivos sean eliminados por un proceso de seleccin negativa. Adems asegurarse que durante este proceso las clulas puedan comunicarse adecuadamente y si eso no ocurre entonces las clulas sufren muerte celular por un proceso denominado muerte por negligencia. Qu elementos participan? o o o Clula progenitora pluripotencial Mediadores solubles como las interleuquinas Interaccin entre las clulas linfoides con elementos del microambiente, veremos cmo las clulas epiteliales fsicas cumplen un papel fundamental para poder asegurar el desarrollo de estas clulas
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ELEMENTOS DEL SISTEMA INMUNE Los microambientes son particularmente importantes, tenemos microambientes corresponden a los rganos linfoides primarios y a los rganos linfoides secundarios. que

Las molculas de histocompatibilidad clase I y II (MHC I y MHC II) son fundamentales para poder establecer el reconocimiento, el linfocitos T nunca va a reconocer un antgeno que este en ausencia de la presentacin del antgeno, es decir a l le deben presentar el antgeno para que pueda establecer una reaccin especfica; en cambio las clulas B si son capaces de reconocer macromolculas sin presentacin. Anteriormente mencionamos al receptor del linfocito T (TCR), al receptor de linfocito B (BCR) y a los mediadores solubles como son las interleuquinas. ORGANOS DEL SISTEMA INMUNE rganos primarios: o o o rganos secundarios: o o o

Timo Mdula sea Epitelio intestinal

Ganglios y amgdalas Bazo MALT (tejido asociado a mucosa)

La mdula sea se encarga de madurar a los linfocitos B, mientras que el timo se encarga de madurar los linfocitos T. Los linfocitos T (gamma-delta) son considerados en la actualidad como elementos de la inmunidad innata, estos comienzan a madurar en el timo pero el resto de su desarrollo ocurre a nivel del epitelio intestinal, porque las clulas epiteliales tmicas tienen un origen embriolgico similar al epitelio intestinal?. Son considerados como elementos de la inmunidad innata porque a diferencia de los linfocitos T (que son los que normalmente estn en la circulacin y establecen las defensas contra los antgenos extraos), estos no requieren reconocimiento antignico, estn inmersos en las mucosas y sin procesamiento antignico pueden interactuar con elementos de las arterias que estn a nivel del epitelio intestinal, y son elementos de accin rpida, por eso son considerados como elementos de la inmunidad innata. Tambin conocemos a los elementos de la respuesta inmune que son: De la inmunidad innata: Clulas mieloides (clulas dendrticas, monocitos/macrfagos, polimorfonucleares, mastocitos); clulas linfoides (clulas dendrticas plasmocitoides, NK, T). Y de la inmunidad adaptativa: linfocitos T y B. ONTOGENIA DE LINFOCITOS Existe una clula llamada clula pluripotencial, la cual es capaz de generar diferentes lneas celulares, es una clula inmadura que dependiendo de las condiciones en donde se aloje para madurar puede generar linajes mieloides o linfoides, dentro de los cuales puede generar linfocitos T o linfocitos B, y veremos cmo cada clula es capaz de tomar un camino diferente.

Estas clulas siempre deben estar alojadas en nuestra mdula sea, tienen un marcador importante que se llama CD34 (por lo que al hacer un estudio no deben aparecer en gran porcentaje en una muestra de sangre perifrica), este marcador corresponde a la clula inmadura que identifica a la clula pluripotencial. La clula pluripotencial tiene capacidad de autorenovacin, es decir que se puede dividir manteniendo una reserva. Otra caracterstica importante que permite esta autorenovacin es que mantiene activa a la enzima Telomerasa (que se relaciona con la teora del envejecimiento celular), la cual se encarga de mantener los telmeros, cuando la clula envejece la actividad de la Telomerasa empieza a disminuir y los telmeros se acortan, aparentemente uno de los elementos que mantiene su inmadurez es que se mantenga activa esta enzima. ONTOGENIA: ORIGEN DE LAS HSCs Estas clulas se ubican a nivel de la mdula sea, a nivel de compartimientos que son conocidos como nichos, los cuales facilitan que estas clulas se mantengan en estado inactivo hasta que maduren. Los nichos se establecen alrededor del endostio y lo que hacen es concentrar citoquinas o elementos que mantengan a estas clulas en estado de reposo. Cuando a estas clulas se les da la seal de maduracin, ellas deben desprenderse de los nichos, de la interaccin que tienen con los elementos de la matriz extracelular, se dividen y una de sus hijas vuelve otra vez a establecer contacto con los nichos a nivel de la mdula sea y la otra hija comienza a establecer diferentes periodos de maduracin dependiendo del estmulo que reciba. En estos nichos stas clulas deben mantenerse lo ms intactas posible, evitar por ejemplo el acumulo de radicales libres, que ya estn en una baja tasa de metabolismo celular para mantenerse por largos perodos de tiempo y preservar as ese acumulo de clulas.

Cmo ocurre este fenmeno en el que una clula hija preserva las mismas caractersticas pero otra comienza a madurar?
Aparentemente ocurre a travs de la divisin celular asimtrica, ya que una de sus hijas mantiene sus caractersticas idnticas a las de la clula madre, mientras que la otra comienza a establecer caractersticas hacia una clula que va a diferenciarse hacia un precursor diferente. Esto supuestamente tambin ocurre en la clula madura, por ejemplo los linfocitos T son los que ejercen acciones que van agredir al agente infeccioso pero tambin deben generar otras acciones para actuar de una manera ms rpida. Entonces este fenmeno explica el por qu este tipo de divisiones. As vemos que una clula progenitora es capaz de diferenciarse hacia una clula igual y hacia otra clula con capacidad de desarrollar los diferentes linajes celulares. En la siguiente imagen podemos observar que aparentemente el proceso es lineal, vemos que a partir de la clula progenitora pluripotencial se genera una clula que es un precursor temprano que puede generar clulas del linaje mieloide o de linaje linfoide, luego pasa al siguiente estadio donde debe definirse si va a ser linfocito T o linfocito B, y en otro estadio ms adelante si va a desarrollarse hacia una clula dendrtica o hacia una clula NK.

De qu va a depender esta toma de decisiones hacia un determinado proceso y hasta donde el proceso puede ser reversible? Se dice que por ejemplo si yo tomo linfocitos T que estn en el timo
en el estadio de precursores tempranos y los devuelvo la mdula sea, pudiera revertir el proceso hacia linfocitos B o incluso hasta la clula mieloide. Ms adelante veremos cules son los puntos claves que determinan la irreversibilidad de una clula para regresar hacia su precursor. A continuacin podemos observar uno de los posibles elementos que contribuyen a esa diferenciacin (en cuadros azules) que son conocidos como factores de transcripcin, los cuales son protenas que son capaces de definir hacia dnde va la clula.

Por ejemplo, el factor de transcripcin llamado Notch-1, cuyo ligando est ubicado a nivel del timo, una vez que el linfocito llega al timo y recibe seales de activacin para este factor de transcripcin, se activa y va a bloquear los elementos que inducen la maduracin del linfocito B y a favorecer los elementos que inducen la maduracin del linfocito T. Si en el timo ocurre una mutacin del ligando de Notch-1 podemos tener linfocitos B desarrollndose porque no hay un freno que inhiba el desarrollo de linfocitos B. En el caso de los linfocitos B existe otro factor de transcripcin que se llama PAX5 que va a definir la identidad del linfocito B. Entonces podemos ver que los factores de transcripcin y los elementos de maduracin son fundamentales en la decisin de las clulas hacia que linaje se van a diferenciar. Estas clulas van a ser los precursores de clulas linfoides, ellos hasta cierto punto son capaces de madurar en clulas T, B, NK y clulas dendrticas (recientemente se ha descrito que existe una poblacin de clulas dendrticas que son de origen linfoide).
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La finalidad de esta revisin es aportar un conocimiento general sobre las clulas dendrticas (CD), clulas accesorias de la respuesta inmune. Se las reconoce como las clulas presentadoras de antgenos por excelencia (CPA) y por lo tanto expresan antgenos clase II del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Los diversos tipos de CD tienen un origen comn en la mdula sea diferencindose luego bajo la influencia de variados estmulos y distribuyndose en rganos linfoides y no linfoides. Desde los tejidos perifricos migran a los ganglios linfticos donde presentan el antgeno a los linfocitos T. Dependiendo del microambiente expresan diversos marcadores de superficie, siendo responsables de la secrecin de citoquinas como IL-12, IL-1 y TNF. Como CPA cumplen un importante papel en la patogenia de enfermedades autoinmunes y virales destacndose su participacin en la infeccin por VIH. Se las encuentra en el infiltrado de numerosos cnceres humanos donde actuando como CPA podran inducir una respuesta inmune antitumoral. En esta propiedad se basa su utilizacin para el tratamiento de linfomas y melanomas llevada a cabo actualmente en diversos laboratorios. Esta es una poblacin particular de clulas dendrticas que tiene un origen linfoide, recordando que las clulas dendrticas tienen origen mieloide por excelencia, y aparentemente contribuyen con la tolerancia perifrica, por lo que se consideran clulas ontognicas, por lo que participan para la presentacin antignica de antgenos de la periferia, pero no participan en la respuesta efectora como tal. Aquellas clulas que van a madurar como linfocitos B permanecen en la medula sea, mientras que aquellas que van a madurar como linfocitos T se ubican en el timo. En el desarrollo de linfocitos T y B uno de los mediadores comunes ms importantes es la interleucina 7 que es indispensable para su desarrollo, la importancia se puede observar al conocer que hay una inmunodeficiencia donde existe una alteracin en el receptor de la interleucina 7, entonces es comn que estn afectados fundamentalmente los linfocitos T, en mediana proporcin los linfocitos B y no ocurre ninguna alteracin en la poblacin de clulas NK; esto explica que las clulas NK dependen fundamentalmente de la participacin de la interleucina 15 y no 7. El desarrollo de los linfocitos depende de tres procesos bsicos: o Migracin (hacia el timo o hacia la mdula sea) y proliferacin, para aquellos que lograron pasar por los puntos de control. Durante cada una de las fases de la ontogenia todo debe estar bien evaluado por distintos puntos de control durante los procesos de maduracin para evitar autoreacciones. Diferenciacin: Adquisicin de fenotipos maduros, que pueden depender del ambiente en el que se desarrollan diferencindose como clulas maduras o inmaduras, no slo se pueden encontrar clulas CD4+ en la circulacin, tambin se pueden encontrar clulas doble ++, que no deberan estar en la circulacin de manera normal. Hay algunas subpoblaciones de leucemias por expresin de ambos marcadores, que indican que existen clulas inmaduras. Seleccin del repertorio: clulas especficas a los antgenos (Ag) extraos y restringidas por las molculas de histocompatibilidad (MHC) propias.

Cuando se dice: la expresin antignica del linfocito est restringida por la presencia de complejos de histocompatibilidad II, esto quiere decir que solamente las clulas dendrticas presentan el antgeno a mis linfocitos T. Si una clula dendrtica de otro tejido le presenta a un linfocito T un antgeno, la reaccin no va a ser especfica contra ese antgeno y no va a generar una respuesta de tipo alergnica porque la activacin de linfocitos T no va a ser especfica. Por ejemplo al hacer un trasplante, una de las pruebas corresponde a la reaccin de las clulas de los dos individuos in vitro para conocer el rechazo al trasplante a corto o largo plazo, debido a la respuesta alergnica, la especificidad alergnica y la presentacin antignica en el contexto de las molculas de histocompatibilidad. Uno de los objetivos fundamentales de la ontogenia: Generacin del receptor antignico funcional en linfocitos B (BCR) y en linfocitos T (TCR) El BCR es una inmunoglobulina que no perdi su tallo de insercin natural, entonces la tenemos como una inmunoglobulina M con su cadena pesada y su cadena liviana que puede ser de dos tipos (kappa o lambda). En la imagen derecha observamos el TCR que tiene la cadena que pudiera ser anloga a la cadena pesada de la inmunoglobulina, y tenemos la cadena que es el anlogo a la cadena liviana de la inmunoglobulina. A los lados se puede observar el complejo CD3 que sirve como ayuda a la clula para transmitir la seal. Tanto el TCR como el BCR tienen una poltica de accin totalmente distinta, entonces para qu la clula sepa qu es lo que est sucediendo en la superficie requiere de los complejos CD3 que le permite comunicarse con el ncleo o con los elementos del citoplasma para decir que est pasando, por lo que es necesario por ejemplo que se produzca interleucina 2 en funcin de las caractersticas del antgeno; o a la inmunoglobulina se le diga cambia de IgM a producir IgA que est en la mucosa, o IgE para estmulo alrgico por ejemplo. Encerrado en crculo podemos observar la regin ms expuesta, la cual determina la especificidad para los antgenos circulantes, corresponde a las regiones ms variables del TCR y del BCR, y veremos cmo ocurre el fenmeno de diversidad por el reordenamiento de genes que permiten la diversidad antignica. ONTOGENIA DE LOS LINFOCITOS T En esta imagen podemos observar a un linfocito T maduro que puede ser CD4+ o CD8+, tambin observamos el TCR y corresponde a un linfocito T provisional que se conoce como , pero recuerden que tenemos un linfocito T que se llama que veremos ms adelante. Y tenemos adems al complejo CD3.

Estas clulas durante su desarrollo deben tomar las siguientes decisiones: o Definirse hacia el linaje linfoide y decidir hacia linfocitos T o B, teniendo como elemento fundamental la migracin hacia el timo y la activacin del receptor para el linfocito T, y para el linfocito B se activar la clula de transcripcin en la mdula sea Reordenamiento del TCR, que permite entonces la diversidad antignica para luego el linfocito: Escoger entre TCR o TCR, lo cual depende tambin de la migracin, aquellos que se mantengan en el timo van a expresarse con el receptor de tipo TCR, mientras que aquellos que emigran del timo estn libres para llegar al epitelio y poder madurar como receptores de tipo TCR, y formar elementos de la inmunidad innata. Seleccin positiva y negativa Escoger entre CD4 y CD8

o o

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MICROAMBIENTE TIMICO Las clulas que estn en la mdula sea y que van a generarse como linfocitos T, tienen que entrar por la regin cortico-medular que es la regin vascularizada, una vez que llegan a esta regin desde la corteza hacia la mdula y durante todo este perodo de migracin dentro del mismo tejido comienzan a pasar por todos los puntos de control para finalmente salir como linfocitos T CD4+ o CD8+ sin capacidad de ser autoreactivos. Vimos que en el timo tenemos al factor de transcripcin llamado Notch-1, que es importante para bloquear el desarrollo de linfocitos B y favorecer el desarrollo de linfocitos T, ya conocemos que durante este proceso comienza tambin a desarrollarse los linfocitos T, se dice que el primer TCR que comienza a desarrollarse es el del linfocito T y gracias a la expresin de otro elemento llamado Pre-TCR se bloquea al T y se favorece el desarrollo de linfocitos TCR. El Pre-TCR es la cadena previa a la cadena del TCR, y debe asociarse con la cadena para dar su punto de control y decir: hubo reordenamiento adecuado de la cadena , vamos a continuar con el proceso de diferenciacin; y adems de eso bloquea el desarrollo de los linfocitos T a nivel del timo.

Decisin T vrs T Clulas T: o o o Comienzan a desarrollarse primero que los precursores de linfocitos T y dependiendo de las seales del Pre-TCR Sin embargo predomina el desarrollo de los T Aquellos que se quedan a nivel del timo reciben las seales del Pre-TCR para que se bloquee la diferenciacin de T, y favorece el desarrollo de los linfocitos T que es lo que finalmente predomina a nivel del timo Emigran del timo para ubicarse en las barreras epiteliales en el epitelio intestinal donde culminan su desarrollo

Se dice que aproximadamente del 90 al 95% de las clulas no llegan a madurar porque se detienen en cada uno de estos procesos o sufren apoptosis y no logran madurar adecuadamente. Timocito temprano o Pro-T: Reordenamiento de la cadena del TCR. Dentro del genoma del receptor del linfocito T, tenemos la regin constante que es lo que va a darle identidad a la cadena del TCR, pero tambin tenemos tres segmentos de genes que son conocidos como familia de genes de la regin variable, diversidad y unin. Estos genes durante el proceso de diferenciacin deben reordenarse unos con otros para poder establecer una secuencia que identifica a un antgeno determinado, y es lo que se llama reordenamiento antignico, y esto ocurre a travs de las enzimas llamadas recombinasas 1 y 2 que toman cada uno de los segmentos y los combinan, originando distintas secuencias para el reconocimiento de numerosos tipo de antgenos. Esta enzima no podra trabajar en otros genes del organismo ya que producira mutaciones importantes, esta enzima tiene que reconocer los segmentos de genes especficos donde pueden actuar, y es lo que nos explica el por qu de la formacin de tantas clonas. Adems, en los puntos de recombinacin deben establecerse conexiones por lo que hay una enzima que incorpora nucletidos de unin de cada uno de estos genes, y esto contribuye mucho ms a la gran diversidad antignica, lo cual explica la alta capacidad que tenemos para responder ante distintos tipos de antgenos. Entonces conocemos ya el primer paso que corresponde al reordenamiento de la cadena del TCR, que es el anlogo de la cadena pesada de la inmunoglobulina. Estas clulas en este paso todava son doblemente negativas (CD4- / CD8-) porque todava no se han definido como CD4+ o CD8+. Si ese reordenamiento ocurre adecuadamente puede pasar a la siguiente fase. El reordenamiento del TCR comienza como dijimos a nivel de la cadena , en el primer alelo. Sin embargo se tienen dos alelos, y se sabe que el reordenamiento exitoso de uno de ellos inhibe el reordenamiento del otro, lo cual se llama EXCLUSIN ALLICA. Esto ocurre mediante
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mecanismos de modificacin de las histonas del ADN, as por ejemplo la hipermetilacin del otro alelo bloquea la maquinaria de recombinacin molecular para su expresin y por lo tanto debe desmetilrse para su expresin. Al ocurrir la recombinacin cmo sabe la recombinasa hacia que alelo actuar? Esto se explica debido a que existen varias enzimas que tambin actan y generan por ejemplo acetilacin de uno de los alelos para que comience la maquinaria de recombinacin que acta sobre el segmento, mientras ocurre esto el otro alelo debe sufrir el proceso contrario, es decir la hipermetilacin para que ste no pueda atraer a su maquinaria de recombinacin y expresarse. Modificacin de las histonas: o o Acetilacin: accesibilidad a la cromatina Desmetilacin del ADN o Un solo alelo o Exclusin allica

Se reordeno el primer alelo, la cadena se expreso adecuadamente y para darle la seal a la clula de que sobreviva, debe expresarse la cadena junto con el Pre-TCR. Si el Pre-TCR no se adosa adecuadamente con la cadena , entonces ocurre una seal negativa y la clula muere porque no se expres adecuadamente la protena, y se produce la inhibicin de la seal para TCR. Si el Pre-TCR se expres adecuadamente en conjunto con la cadena , se le da la seal positiva para que comience el reordenamiento de la cadena del TCR y comience el proceso definitivo de maduracin del linfocito T. El Pre-TCR media seales debido a su localizacin constitutiva en microdominios de membrana (rafts-lipdicos o balsas lipdicas): o Fosforilacin y degradacin de recombinasas (RAG1 y 2), asegura que no ocurra mas reordenamiento de (exclusin allica) o Favorece reordenamiento de la cadena o Proliferacin y da paso a timocitos doble Positivos (coexpresin de CD4+ y CD8+)

Cmo hace el Pre-TCR para dar la seal positiva o negativa para que se reordene la cadena que permita el paso al proceso de maduracin?
Esto es debido a que ellos controlan la expresin de las recombinasas. Cuando la cadena se expresa adecuadamente junto al Pre-TCR, se dan seales para que se inhiba las recombinasas y se apague el proceso de recombinacin, luego la clula prolifera y se expresan nuevamente las recombinasas para que se inicie el proceso de formacin de la cadena que finalmente va a conformar el TCR definitivo. Otra caracterstica importante es que este Pre-TCR no depende de un ligando para su activacin. El Pre-TCR se expresa a nivel de microdominios de membrana plasmtica o tambin llamados raftslipdicos, que corresponden a segmentos organizados por colesterol, que son importantes
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para la activacin celular y estas protenas se ubican a ese nivel para poder cumplir esa funcin, independientemente del ligando, y fundamentalmente mediado por el Pre-TCR. Luego de que ocurri el reordenamiento de la cadena , tambin se da la seal para que se coexprese como CD4+ y CD8+. Una vez que se expresa el TCR ya tenemos una molcula que tiene la capacidad de reconocer un determinante antignico especfico, lo cual depende de la posibilidad de recombinacin de los segmentos de genes de la regin variable. En segundo lugar tenemos la combinacin entre la cadena y la cadena , lo cual representa otro factor que da la diversidad. Y en tercer lugar la expresin de las enzimas TdT. Entonces en sntesis podemos decir que los mecanismos involucrados en la generacin de la diversidad son: Diversidad en las posibilidades de combinacin o Familias de genes V, D y J o Combinaciones entre las cadenas y (en el caso de linfocitos T) o pesadas y livianas (en el caso de linfocitos B) o Mediado por las Recombinasas (Rag1 y Rag2) Diversidad en los sitios de unin de los genes mediado por la enzima deoxiribonucleotiltransferasaterminal o TdT, que es la que incorpora los nucletidos en los sitios de combinacin de los diferentes segmentos genticos La sumatoria de factores permite la diversidad antihiginica. A continuacin comienzan las fases definitivas del desarrollo de linfocitos T en el que salen a la periferia y deciden si sern CD4+ o CD8+. Timocito doble positivo (DP): En esta imagen podemos observar un linfocito T inmaduro doblemente positivo.

Esta grfica representa la tcnica de citometra de flujo, que es una herramienta de laboratorio que permite marcar clulas, que se utiliza para establecer por ejemplo poblaciones de linfocitos CD4+ o CD8+, y que consiste en marcar las clulas con anticuerpos adosados a fluorocromo de distintos colores, y luego el aparato permite establecer poblaciones CD4+ o CD8+ solas, las cuales son -- o ++. Ahora comienza el proceso de seleccin positiva que simplemente corresponde al control de calidad donde se puede evaluar que el TCR no sea potencialmente autoreactivo y que sea capaz de comunicarse adecuadamente con la clula presentadora de antgeno.

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Cmo sabe el timo cules son los antgenos propios?

Si durante un proceso de instauracin del tejido de un ratn ocurre un proceso infeccioso logran ingresar agentes extraos en ese territorio, probablemente ese individuo puede presentar infeccin. Aparentemente hay tres mecanismos por los que el timo reconoce a los antgenos propios: 1. Las clulas epiteliales tmicas a nivel medular son capaces de expresar casi todos los antgenos de los distintos tejidos (rin, piel, hgado, pulmn) porque expresan el factor de transcripcin llamado ?, e inducen la expresin de casi todos los antgenos que tenemos en el organismo y de esta manera reconocen lo que est en la periferia 2. Las clulas dendrticas del tejido linfoide tienen la capacidad de transportar Ag propios directamente hacia el tejido y evaluar la capacidad de reactividad 3. Autofagia, las clulas fagocitan sus antgenos secuestrados en vesculas de doble membrana y liberados dentro del lisosoma para su descomposicin y eventual reciclado de las macromolculas resultantes, para as reconocer a los antgenos propios Seleccin positiva y negativa Esto corresponde al desenlace definitivo del proceso. Si la clula es incapaz de establecer contacto con la clula dendrtica o con la clula epitelial tmica es negligente y debe morir. Si la clula reconoce pero con baja afinidad el antgeno presentado puede sobrevivir y salir. Pero si el linfocito T reconoce con alta afinidad y avidez, entonces corresponde a una clula potencialmente autoreactiva y debe ser eliminada por apoptosis, pero no todas las clulas son eliminadas, hay algunas que simplemente sufren anergia (linfocitos

presentes pero sin capacidad de respuesta efectora).

Mecanismos involucrados en la anergia: o Reciclaje acelerado del TCR, por ubiquitinacin mediado por la fosforilacin constitutiva de Cbl (ligasa de ubiquitina) o Proceso reversible Linfocito T maduro:

De qu depende que linfocito T madure como CD4+ o CD8+?

El modelo clsico indica que si el antgeno es presentado por las molculas del CMH II van a madurar como linfocitos T CD4+ y si son activados o evaluados en el contexto de las molculas del CMH I van a madurar como CD8+.

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Seleccin positiva (rescate de la apoptosis): Todos aquellos TCR que tengan baja afinidad por los Ag propios Clulas epiteliales tmicas Seleccin negativa: Todos aquellos TCR con alta afinidad por el Ag propio o incapaz de interactuar con MHC (I y II) Corteza profunda, unin crtico-medular y mdula Clulas interdigitantes DESARROLLO DE CLULAS T REGULADORAS Existe otra poblacin que tambin va a madurar durante el proceso de seleccin positiva y negativa y se conoce como seleccin positiva por agonista, son los responsables de favorecer el desarrollo de las clulas T reguladoras. Las clulas T reguladoras son otra poblacin de clulas que pueden madurar en presencia de alta afinidad por los antgenos propios, adems de las anergicas; se encargan de liberar citoquinas, es decir que van a bloquear todos aquellos linfocitos autoreactivos durante algn proceso de inflamacin, por medio de la liberacin de interleucina 10 por ejemplo; y a diferencia de las clulas anergicas si se genera respuesta efectora porque liberan sustancias que compiten para evitar la autoinmunidad fundamentalmente que pueda ocurrir a nivel perifrico. ONTOGENIA DE LOS LINFOCITOS B Ahora vamos a establecer la diferencia en la ontogenia de los linfocitos B, que expresan BCR (receptor de clulas B). Su desarrollo se inicia en el hgado fetal 8va-9na semana y luego contina en la mdula sea. El repertorio de clulas se genera por recombinaciones de segmentos de los genes del receptor de linfocito B (BCR). Tambin estn sujetos a mecanismos de seleccin positiva y negativa. El proceso de maduracin es muy similar al proceso de los linfocitos T en los estadios previos a ser una clula madura. Pro B: El proceso de reordenamiento gentico es similar al del linfocito T, que inicia por la cadena pesada de las inmunoglobulinas: cadena (mu) y depende fundamentalmente de la accin de la interleucina 7 y de la interleucina 3.

Reordenamiento de los genes que codifican para las inmunoglobulinas:

Dos alelos: el reordenamiento exitoso de uno de ellos inhibe el reordenamiento del otro: EXCLUSIN ALLICA, similar a lo que ocurre en el proceso de maduracin de linfocitos T.

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Pre-B: Este linfocito B que comienza su reordenamiento inicia con la expresin de la cadena pesada de la Ig (), y simultneamente expresa el pre-BCR y cumplen las mismas funciones que para linfocitos T, va a mediar la exclusin allica y va a favorecer el reordenamiento adecuado de la cadena . Entonces pasa al siguiente estadio para desarrollarse como linfocitos B inmaduros con expresin solamente de la IgM, no culmina su desarrollo a nivel medular sino que debe salir a la periferia donde va a tener capacidad para responder, establecindose a nivel del bazo y rganos linfoides primarios.

Finalmente cuando ya culmin su maduracin se identifica como linfocito B que coexpresa la IgM/IgD, y esto ocurre slo a nivel de la periferia (bazo y zona ganglionar). En el caso de linfocito B podemos tener la cadena , pero tambin podemos tener las cadenas (kappa) y (lambda), lo cual le permite ms posibilidades de sobrevivir en comparacin con el linfocito T, ya que ste tendra menor posibilidad de reordenar sus genes. El linfocito B tendra cuatro posibilidades por la presencia de sus cuadros alelos a sobrevivir. Una vez que el linfocito B reorden adecuadamente su BCR comienza el proceso de seleccin positiva y negativa, que inicialmente pasa la primera evaluacin a nivel de la mdula sea a travs de la funcin de las clulas estromales que pueden expresar antgenos propios. Los anticuerpos naturales le permiten a estas clulas adosar antgenos propios en forma de complejos inmune? a nivel de clulas del estroma y de esta manera evaluar la posibilidad de que las clulas sean monoautoreactivas, si las clulas pasan este punto de control pueden llegar a nivel del bazo y finalmente culminar su proceso de maduracin o a nivel de los ndulos linfticos, es decir que pasan dos estadios: o T1 (Transitorio 1): donde las clulas no han sido evaluadas y no expresan o tiene bajos niveles de IgD, CD21 y CD23 Fase donde ocurre la seleccin negativa y la gran mayora muere (autoreactivas) o re-editan BCR Altos niveles de Fas y ausencia de Bcl2 Activacin del BCR = apoptosis T2 (transitorio 2): las clulas entran y sobreviven en el bazo y expresan IgM/IgD, CD21, CD23. Este estadio se hacen ms resistente a la apoptosis. T3 (transitorio 3): CD23+, bajos niveles de IgM

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MECANISMOS DE SELECCIN DE LINFOCITOS B o o Seleccin positiva Seleccin negativa: Muerte Anergia Re-edicin del BCR: escape de la seleccin negativa por cambio de la especificidad antignica. Si por ejemplo al observar linfocitos B en la periferia y su BCR tiene alta afinidad por un antgeno propio, entonces las recombinasas no son apagadas del todo y tienen la posibilidad de reordenar nuevamente la cadena liviana y poder expresar un nuevo BCR y reevaluar su autoreactividad. No es exclusivo de B, tambin se ha demostrado en T.

SUBPOBLACIONES DE LINFOCITOS B EN LA PERIFERIA Finalmente tenemos linfocitos B maduros que pueden ser de dos poblaciones diferentes: o B-1: tambin considerado como partcipe de la inmunidad innata, al igual que linfocito T, ubicados fundamentalmente a nivel de las mucosas y que actan como elementos de la inmunidad innata CD5+ Ubicadas preferencialmente en cavidad peritoneal Potencialmente autorreactivos No son eliminadas por antgenos propios o B-2: es el linfocito B ms conocido encargado reproducir los anticuerpos contra los antgenos extraos. Predominan en la periferia CD5-

En resumen tenemos que los linfocitos B van a madurar en dos territorios diferentes: a nivel de la mdula sea y a nivel de la periferia, a diferencia de los linfocitos T, los B pueden presentar el fenmeno de Re-edicin del BCR que es otro chance de maduracin.

Qu eventos regulan la migracin y alojamiento dentro de un tejido o de un tejido a otro?

Una vez que las clulas maduraron definitivamente deben alojarse en los ndulos linfticos, esto ocurre a travs de mecanismos de recirculacin porque ellos salen y migran hacia los epitelios donde van a poder interactuar y van a tener la puerta de entrada y alojamiento a nivel de los ndulos linfticos. RECIRCULACIN Y ALOJAMIENTO DE LOS LINFOCITOS: DE QU DEPENDE? Estas clulas no llegan a ubicarse en cualquier lugar, tienen receptores que les permiten alojarse en diferentes zonas a nivel del ndulo linftico. Qu determina esta distribucin y trfico diferencial? o Expresin y activacin diferencial de receptores de quimiocinas y de integrinas o Interacciones entre las clulas endoteliales, la matriz extracelular, quemokinas y las molculas de adhesin.

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En esta imagen se pueden observar coloreados en rojo los linfocitos T y los linfocitos B marcados en verde ubicados entre folculos linfoides de las regiones paracorticales del ndulo linfoide. Se distribuyen de esta manera para favorecer la respuesta, as como las clulas dendrticas van a tomar los antgenos de la periferia y se van a dirigir a los ndulos linfticos donde se va a generar la respuesta inmune. Una vez que las clulas dendrticas entran en contacto con los linfocitos T y los activan tienen el permiso para llegar a la zona C para ayudar a que los linfocitos B maduren, generalmente la maduracin de los linfocitos B es dependiente de la ayuda de los linfocitos T, y es quien va indicar qu tipo de globulina deben generar dependiendo del agente infeccioso. Este fenmeno de recirculacin y alojamiento depende fundamentalmente adems de los elementos de la matriz extracelular, como: o Quemokinas y sus receptores interleuquinas con actividad quimiotctica o Integrinas o Cadherinas o Selectinas o ICAM Unas vez maduras las clulas migran a travs de las vnulas endoteliales hacia los rganos linfoides secundarios. Este proceso ocurre de manera fisiolgica, los linfocitos T inmaduros nada mas tienen posibilidad de migrar de rgano linfoide secundario a otro, o a la piel y a ningn otro rgano.

Solamente las clulas de memoria pueden llegar a alojarse por ejemplo en el epitelio de la piel, esto est estrictamente regulado por las CAM. Estas clulas tienen que llegar especficamente al sitio donde se les permita entrar, dicha permisibilidad depende de que la clula epitelial tenga por ejemplo quimiocinas que le permiten la entrada al linfocito que exprese su receptor de membrana (TCR o BCR). Por ejemplo, el linfocito T expresa al CCR7, y las clulas endoteliales de los ndulos linfticos expresan en su superficie ligando para ese receptor, lo cual le permite a esa clula llegar a los ndulos linfticos y permitirle la entrada.

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Las clulas dendrticas que estn en la periferia, que son inmaduras y que no son activadas por ningn antgeno, no tienen CCR7; cuando ellas captan un antgeno extrao y se les induce madurar ellas salen de los tejidos perifricos y expresan el receptor CCR7 para poder entrar al tejido que lo amerite y encontrar al linfocito T especfico. Desde el punto de vista molecular en esta imagen podemos observar todas las molculas que participan, recordando la participacin de las quimiocinas, que son crticas para poder identificar hacia que tejido las clulas van a migrar. Y las integrinas una vez que se activa el receptor de quimiocinas favorecen la unin entre las clulas y de esa manera poder llegar especficamente al tejido donde se requiere. La localizacin o el alojamiento tambin van a depender de los receptores de quimiocinas, por ejemplo los linfocitos B expresan CXCR5 y eso les permite ubicarse especficamente en el tejido. Cuando el linfocito T expresa CXCR5 puede llegar a la regin solicitada y ayudar a linfocitos B a madurar y eso le permite migrar en el mismo tejido de un territorio a otro. rganos secundarios y maduracin final de los linfocitos Funcin: Facilitan el trabajo de los linfocitos Sitios de encuentro entre clulas presentadoras de antgeno (CPA) y linfocitos Proveen el microambiente adecuado para la expansin de linfocitos T Optimizan la activacin de linfocitos B naive La siguiente imagen representa la caricatura de un ndulo linftico con un folculo primario y un folculo secundario, que se diferencian porque en el folculo secundario ya se encuentran clulas maduras.

FOLICULO SECUNDARIO:
En el observa una zona de alta proliferacin de linfocitos T, aqu ocurre lo contrario que en los rganos linfoides primarios, aqu se debe chequear la afinidad por el antgeno extrao, todo lo que tenga baja afinidad debe ser eliminado y lo que tenga alta afinidad tiene seal para sobrevivir. Este proceso depende de la presencia de las clulas dendrticas foliculares Para captar a los antgenos extraos y llevados desde la periferia hacia el centro germinal. Aqu puede ocurrir otro fenmeno llamado hipermutaciones somticas: Cambio de isotipo (CSR)

Cambio de la regin constante conservando la misma especificidad antignica

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Hipermutaciones somticas:

Introduce mutaciones en la regin variable, seguido de seleccin positiva o negativa

Ambos activados por la interaccin entre BCR/CD4 o en los centros germinales Las hipermutaciones somticas van a ocurrir a nivel de los centros germinales, estas se acompaan de la activacin de enzimas que establecen mutaciones puntuales en esos sitios variables para promover la maduracin de la afinidad del BCR o de la inmunoglobulina, a nivel de los rganos linfoides secundarios. A la par de esto tambin debe ocurrir el cambio de isotipo, el linfocito B inmaduro tiene la capacidad innata de poseer IgM pero en presencia de un antgeno tiene que madurar, esto ocurre a nivel de los ndulos linfticos. Hay una inmunodeficiencia conocida como sndrome de IgM?, estos individuos producen cantidades sustanciales de IgM pero no son capaces de eliminar adecuadamente las anemias, porque la IgM no ha pasado por el fenmeno de hipermutacin somtica ni de cambio de isotipo, lo cual contribuye a la eliminacin del agente infeccioso. La IgM y la IgE conformacionalmente facilitan la unin sobre los antgenos para poder opsonizarlos y eliminarlos adecuadamente; entonces estos individuos poseen una alta sensibilidad a agentes bacterianos porque el IgM es inmadura y es incapaz de eliminar adecuadamente a esos antgenos.

CORDONES PRECORTICALES
Esta imagen representa el sitio donde se van a ubicar los linfocitos T, en una especie de cordones en escalera de caracol que les permite a la clula dendrticas llegar ms rpidamente y poder hacer un sondeo rpido para encontrar antgenos para el linfocito T especfico y de esa manera hacer ms eficiente la respuesta para preservar la integridad. Finalmente tenemos un sistema inmune maduro encargado de activar la respuesta a nivel de los ndulos linfticos como rganos linfoides secundarios, de esta manera estas clulas estn capacitadas para responder ante todos los antgenos que tenemos en la naturaleza. Todo el proceso de la ontogenia permite al linfocito estar preparados para reconocer de manera especfica a los antgenos extraos.

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PROBLENA N 1: La protena BTK (una tirosin kinasa de los linfocitos B), involucrada en la ontogenia de los linfocitos B, media la transicin de clulas Pro-B a Pre-B y participa en la activacin de los linfocitos B maduros. Ciertas mutaciones en el gen que codifica para esta protena conducen a fallas en su expresin originando un sndrome conocido como Agammglobulinemia ligada al cromosoma X o sndrome de Bruton.

Interrogantes:
a) Cul elemento del sistema inmunolgico se encuentra alterado en estos pacientes? b) Explique la ontogenia de los linfocitos B c) Si se realiza post-mortem una biopsia de los ndulos linfticos, Qu modificaciones en el microambiente esperara encontrar? d) Uno de los productos finales de la activacin de los linfocitos B es la secrecin de anticuerpos (inmunoglobulinas) qu niveles de inmunoglobulinas esperara encontrar en el suero del paciente? PROBLEMA N 2 La falta de expresin de la molcula de histocompatibilidad de clase II (MCH II) en la superficie de las clulas presentadoras de antgeno profesionales, es debida a mutaciones en los factores de transcripcin responsables de activar la transcripcin del gen que codifica para MHC II (RFX5/CIITA). Este trastorno molecular conduce a un cuadro de inmunodeficiencia severa causado por la alteracin en el desarrollo de los linfocitos T.

Interrogantes:
a) Explique cuales el papel de la presentacin de antgenos en el contexto de MHC-II y MHC-I a nivel de los rganos linfoides primarios. b) Explique cmo se genera el proceso de seleccin positiva y negativa durante la ontogenia de los linfocitos y cuales el papel de las molculas de histocoatibilidaden este proceso. c) Qu consecuencia tiene sobre la tolerancia a los tejidos propios la alteracin de los mecanismos de seleccin positiva o negativa?

Marielyz Martnez

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