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TEMA

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CARACTERSTICAS DEL CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS. MEDIOS DE CULTIVO PARA CRECIMIENTO Y AISLAMIENTO PRIMARIO. CARACTERSTICAS Y CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO. TCNICAS DE INOCULACIN, AISLAMIENTO Y RECUENTOS CELULARES BACTERIANOS

BIBLIOGRAFA
Clinical Microbiology Procedures Handbook. American Society For microbiology / Washington DC Murray. Pocket guide to Clinical Microbiology. ASM Procedimientos en Microbiologa Clnica. Sociedad Espaola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica (SEIMC) Lennette. Manual de Microbiologa Clnica. Editorial mdica Panamericana. Prescott. Microbiologa. McGraw-Hill interamericana. Mac Faddin. Biochemical test for identification of medical bacterias. Williams & Wilkins. Baltimore/London Pumarola, A. Microbiologa y Parasitologa Mdica. Salvat.

OBJETIVOS
Conocer las caractersticas del crecimiento de los microorganismos Aprender las modalidades de medios de cultivo

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Tema 16

1.

CARACTERSTICAS DEL MICROORGANISMOS

CRECIMIENTO

DE

LOS

Se entiende por crecimiento microbiano el aumento del nmero de microorganismos a lo largo del tiempo. No debe confundirse con ciclo celular, que es el proceso de desarrollo de una nica clula, ya que con crecimiento se est refiriendo al demogrfico de una poblacin. A lo largo del ciclo celular bacteriano tiene lugar la replicacin del material gentico, la sntesis de componentes celulares, la elongacin de la bacteria para alcanzar un tamao doble del inicial y su divisin por biparticin para dar lugar a dos clulas hijas. La duracin del ciclo celular coincide con el tiempo de generacin. El crecimiento de una poblacin resulta de la suma de los ciclos celulares de todos los individuos de dicha poblacin. Los cultivos de microorganismos pueden ser asincrnicos cuando cada microorganismo se encuentra en un punto diferente del ciclo celular. Por consiguiente, en un momento determinado en un cultivo se encuentran clulas que acaban de dividirse, otras que estn replicando su ADN, otras que estn creciendo, otras que estn iniciando la divisin celular, etc. Por el contrario, en un cultivo sincrnico todas las clulas se encuentran simultneamente en la misma fase del crecimiento celular. El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones fsicas, qumicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada. En general, podemos distinguir cultivos lquidos y slidos en funcin de las caractersticas del medio y cultivos discontinuos y continuos en funcin de la disponibilidad de nutrientes en el medio.

1.1 Concepto de cultivo puro


Se denomina cultivo puro (axnico) al que contiene slo un tipo de microorganismo. Se inician a partir de colonias aisladas, de manera que todos los individuos del mismo tengan la misma composicin gentica. Los cultivos puros son esenciales para poder estudiar las caractersticas de los microorganismos y para poder identificarlos con seguridad.

1.2 Crecimiento microbiano en medio lquido


Si el microorganismo crece en un medio lquido, en la mayora de los casos las clulas que se producen en cada divisin continan su vida independientemente formndose una suspensin de clulas libres. Crecen en un cultivo discontinuo o sistema cerrado, es decir, se incuban en un recipiente cerrado, con una cantidad de medio inicial que no es modificada; por lo tanto las concentraciones de nutrientes disminuyen y las de residuos aumentan. Se pueden diferenciar cuatro fases en la evolucin de los parmetros que miden el crecimiento microbiano. 480

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Caractersticas del crecimiento de los microorganismos

A. Fase lag o de adaptacin o latencia


Durante la que los microorganismos adaptan su metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y condiciones de cultivo) para iniciar la fase de crecimiento exponencial. La duracin de esta fase vara considerablemente segn la condicin de los microorganismos y la naturaleza del medio. Pudiendo se bastante larga si el inculo procede de un cultivo viejo, refrigerado o por inoculacin de un cultivo en otro qumicamente diferente. En el caso de transferir un cultivo en fase de crecimiento exponencial vigoroso a un medio nuevo de la misma composicin, la fase de latencia se acorta o no se produce.

B. Fase exponencial o logartmica


En esta fase la velocidad de crecimiento es mxima y constante, es decir, los microorganismos se dividen y duplican a intervalos regulares. La poblacin es ms uniforme, qumica y fisiolgicamente; por ello, los cultivos en esta fase se utilizan para estudios bioqumicos y fisiolgicos. El crecimiento en esta fase es logartmico.

C. Fase estacionaria
No se produce un incremento en el nmero de microorganismos (ni la masa u otros parmetros del cultivo). Las clulas en fase estacionaria desarrollan un metabolismo diferente al de la fase exponencial y durante ella se produce una acumulacin y liberacin de metabolitos secundarios que pueden tener importancia industrial. Las bacterias llegan a esta fase cuando el nivel de la poblacin es de aproximadamente 109 clulas/mL, mientras que protozoos y algas alcanzan la concentracin mxima de 106 clulas/mL. Los microorganismos entran en fase estacionaria porque: Se agota algn nutriente esencial del medio Toxicidad de los productos de desecho que han liberado durante la fase exponencial

La fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente represente con mayor fidelidad el estado metablico real de los microorganismos en los ambientes naturales.

D. Fase de muerte
Se produce una reduccin del nmero de bacterias viables del cultivo, generalmente de forma logartmica.

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1.3 Crecimiento microbiano en medio slido


Las fases, parmetros y cintica de crecimiento discutidas para el caso de los cultivos lquidos se presentan tambin en cultivos slidos. La cintica de crecimiento, en este caso, se puede estudiar siguiendo la evolucin del nmero de clulas viables por unidad de superficie o por unidad de masa. Cuando una clula aislada e inmvil comienza a crecer sobre un substrato slido, el resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una colonia. Por consiguiente, se denomina unidad formadora de colonia (UFC) a una clula bacteriana viva y aislada que si se encuentra en condiciones de substrato y ambientales adecuadas da lugar a la produccin de una colonia en un breve lapso de tiempo. Si el nmero inicial de bacterias por unidad de superficie es muy alto, la confluencia de las colonias da lugar a lo que se llama un csped cuando se realizan los cultivos en placas de laboratorio. En el caso de microorganismos mviles (deslizantes) o en el de los hongos filamentosos que tienen un crecimiento trfico no se producen colonias aisladas sino formaciones ms difusas o miceliares.

1.4 Expresin matemtica del crecimiento


El tiempo de generacin o duplicacin es el tiempo que transcurre, durante la fase exponencial, hasta que se duplica la poblacin. Se calcula mediante la frmula: Nt = No x 2n done No es el n inicial de la poblacin, Nt el n final de clulas en un tiempo t y n el n de generaciones en un tiempo t.

2.

MEDIOS DE CULTIVO PARA CRECIMIENTO Y AISLAMIENTO PRIMARIO

Los medios de cultivo son mezclas ms o menos complejas de sustancias qumicas y/o productos naturales (protenas, sangre, suero, etc.) capaces de soportar el crecimiento de los microorganismos. El objetivo es el aislamiento de los diferentes microorganismos para su identificacin y realizacin de pruebas complementarias. Los medios de cultivo se utilizan, principalmente en los Laboratorios microbilogicos, para el aislamiento de bacterias, hongos y parsitos; tambin, son utilizados en el cultivo de lneas celulares para la inoculacin de muestras para la identificacin de ciertos virus (observacin del efecto citoptico). Otros laboratorios utilizan medios de cultivo para el trabajo con tejidos, leucocitos, lneas celulares hematopoyticas, obtencin de anticuerpos monoclonales, etc. Todos los microorganismos requieren fuentes de nitrgeno, carbono y oligoelementos, que el medio de cultivo debe proporcionarles. Los microorganismos con requerimientos nutricionales especiales se cultivan en medios especficos.

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Caractersticas del crecimiento de los microorganismos

2.1 Tipos de nutricin


Los organismos fotosintticos y los que obtienen energa por oxidacin de compuestos inorgnicos suelen usar generalmente CO2 como fuente nica o principal de carbono (auttrofos). Pero, la mayora de los microorganismos del laboratorio son hetertrofos, es decir necesitan fuentes de carbono orgnico y nitrgeno, asimilables, as como sales minerales y en ciertos casos vitaminas. Pueden sintetizar todos sus constituyentes celulares a partir de un nico compuesto orgnico que sirve tanto de fuente de carbono y de energa, y de una fuente inorgnica u orgnica de nitrgeno (Tabla 1)
TIPO DE ORGANISMOS Fotolittrofos (auttrofos) Fottrofos Fotoorgantrofos Quimiolittrofos (auttrofos) Quimioorgantrofos (hetertrofos) DEPENDIENTES DE: Dadores de electrones Radiacin inorgnicos solar Dadores de electrones inorgnicos Oxidacin de compuestos Compuestos inorgnicos Qumicos Oxidacin o fermentacin de compuestos orgnicos

Quimitrofos

Tabla 1. Metabolismo energtico de los microorganismos Las formas parsitas obligadas obtienen del hospedador los complejos constituyentes de su materia viva En tanto que, los sulfatos pueden ser utilizados por casi todas las bacterias y hongos, los nitratos son a menudo menos adecuados como nutrientes. Sin embargo, la mayora de los microorganismos hace uso del amonio como fuente nica o principal de nitrgeno. Algunas bacterias requieren fuentes de azufre reducido, tal como sulfuro o tiosulfato. Los organismos vivos necesitan tambin muchos otros elementos, como fsforo, potasio, magnesio, manganeso, calcio, hierro, cobalto, cobre, cinc y molibdeno.

2.2 Factores de crecimiento


Son los compuestos, necesarios en pequea cantidad, que debe suministrar el medio para que tenga lugar el crecimiento de algunos microorganismos. Los organismos que requieren un determinado factor de crecimiento son auxotrficos para ese compuesto.

A. Factores orgnicos
Algunos microorganismos carecen de la capacidad de sintetizar ciertos aminocidos, nucletidos o vitaminas. stos son generalmente aportados por los extractos de levadura y carne, agregados al medio. A veces son adicionados en cantidades demasiado elevadas interfiriendo en el metabolismo microbiano. Generalmente, los microorganismos requieren L-aminocidos.

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B. Factores minerales
La ausencia total de metales comporta la muerte o enfermedades carenciales en todos los seres vivos, pero todo es cuestin de dosis pues, el efecto es beneficioso hasta un cierto nivel, traspasado el cual se observan trastornos fisiolgicos. Algunos elementos esenciales, por ejemplo cinc, cobre, cobalto, hierro, molibdeno, son necesarios para la actividad de enzimas especficas. Adems, algunos seres vivos tienen requerimientos minerales especiales.

2.3 Factores ambientales


A. Agua
La disponibilidad de agua en el ambiente se expresa indirectamente en trminos de actividad del agua (aw), la que se define como la razn entre la presin de vapor de agua del substrato o solucin (p) y la presin de vapor del agua pura (po) a la misma temperatura, es decir, aw = p/po. Este concepto se asocia al de humedad relativa de la atmsfera en equilibrio con el sistema, de la siguiente manera HRE = aw . 100 Los lmites de aw dentro de los cuales hay crecimiento, son ms amplios a la temperatura ptima de multiplicacin. La capacidad de los organismos para crecer a una temperatura dada, disminuye a medida que se reduce la aw. La presencia de ciertos elementos nutritivos ampla los lmites de aw dentro de los cuales los organismos pueden sobrevivir. La mayor parte de las bacterias no crecen a una aw por debajo de 0,91 mientras que los mohos pueden desarrollarse con cifras de 0,80. Los valores ms bajos obtenidos para arqueobacterias halfilas son del orden de 0,75 mientras que los mohos xerfilos (amantes de la sequedad) y las levaduras osmfilas (que prefieren presiones osmticas elevadas) se multiplican muy lentamente an con valores de 0,65 y 0,60 respectivamente. Los lmites de aw dentro de los cuales hay crecimiento, son ms amplios a la temperatura ptima de multiplicacin. La capacidad de los organismos para crecer a una temperatura dada, disminuye a medida que se reduce la aw. La presencia de ciertos elementos nutritivos ampla los lmites de aw dentro de los cuales los organismos pueden sobrevivir.

B. Tensin superficial
La tensin superficial de los medios de cultivo afecta al desarrollo de un microorganismo. Por ejemplo BaciIIus subtilis tiende a crecer en la superficie a modo de pelcula o velo en los medios corrientes con una tensin superficial entre 57 y 63 dinas, pero si se disminuye a menos de 40 dinas por el agregado de un detergente crece en forma difusa. La humectabilidad es funcin de la tensin superficial. Las soluciones de detergentes pueden penetrar en grietas y espacios

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Caractersticas del crecimiento de los microorganismos muy pequeos e incluso hasta el centro de los agregados de bacterias, donde el agua quedara por encima sin mostrar penetracin alguna.

C. pH
El pH del medio puede influir sobre la expresin de genes y regular el transporte de protones, la degradacin de los aminocidos, la adaptacin a condiciones cidas o bsicas y an la virulencia. Las clulas perciben los cambios del pH ambiente a travs de diferentes mecanismos. La protonacin y desprotonacin de los aminocidos inducida por el pH, puede alterar la estructura protenica secundaria y por lo tanto la funcin que seala el cambio. La clula puede responder slo a una de las formas de las molculas de seal. Por ejemplo, los cidos orgnicos atraviesan la membrana citoplasmtica solamente en la forma protonada y un aumento de la concentracin intracelular indicara un incremento en la acidez ambiental. El gradiente de protones a travs de la membrana puede servir, por s mismo, como un sensor para ajustar los procesos dependientes de la energa. El pH intracelular puede ser mantenido sobre un valor crtico en el cual las protenas internas se desnaturalizan irreversiblemente. A pH ambiental mayor que 6,0 las clulas bacterianas ajustan su pH interno a travs de la respuesta homeosttica modulando la actividad de las bombas de protones, antiportes y simportes, para aumentar la velocidad a la cual los protones son expelidos del citoplasma. El mecanismo homeosttico es constitutivo y funciona en presencia de inhibidores de la sntesis proteica. La respuesta de tolerancia al cido es iniciada por un pH externo de 5,5 a 6,0. Este mecanismo es sensible a los inhibidores de la sntesis proteica y puede mantener el pH interno por sobre 5,0 teniendo el pH externo valores tan bajos como 4,0. La prdida de la actividad ATPasa, causada por las mutaciones que desorganizan genes o los inhibidores metablicos, anula la respuesta de tolerancia al cido pero no el mecanismo homeosttico. Esta respuesta tambin puede conferir proteccin cruzada frente a otros agentes ambientales de estrs. La sntesis de protenas de 'shock' acdico es la tercera va por la que la clula regula el pH interno. Esta sntesis es generada por un pH ambiental de 3,0 a 5,0 proveyendo un conjunto de protenas reguladoras distintas de las protenas de la respuesta de tolerancia al cido. Aunque para la mayora de las bacterias el pH ptimo para el crecimiento se encuentra entre 8,5 y 7,5; pocas especies son acidfilas (Thiobacillus), algunas son cidotolerantes (lactobacilos), pero muchas crecen en condiciones alcalinas (nitrificadores, rizobios, actinomicetos y bacterias ureolticas). Por su parte, los hongos prefieren valores bajos de pH, y predominan cuando se siembra una muestra de suelo en un medio de pH 5, pero no a pH 8. Algunos organismos productores de cidos no son cidotolerantes y si el medio no posee un regulador de pH se autoenvenenan, por ejemplo ciertas enterobacterias.

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D. Oxgeno
El metabolismo de los microorganismos est fuertemente influido por el oxgeno molecular. Los organismos que dependen de la respiracin aerbica, para los cuales el oxgeno es el aceptor final de electrones, se conocen como aerbicos estrictos. Por el contrario para los organismos anaerbicos estrictos el oxgeno es generalmente txico. Ciertas bacterias aerbicas se cultivan mejor en ambientes donde la concentracin de oxgeno es reducida y se las denomina microaeroflicas.

E. Potencial de reduccin
El potencial de reduccin de un sustrato es aquel en que dicho sustrato gana electrones con mayor facilidad. Cuando pasan electrones de un compuesto a otro, se crea una diferencia de potencial entre ambos, la que se expresa en milivoltios (mV). Cuanto ms oxidada est una sustancia ms positivo ser su potencial elctrico, y cuanto ms reducida el potencial ser ms negativo. El potencial de reduccin de un sistema se expresa con el smbolo Eo'. Los microorganismos aerobios crecen en ambientes con valores Eo' positivos mientras que los anaerbicos necesitan para su desarrollo un medio con Eo' negativo. Entre las substancias que ayudan a mantener condiciones reductoras en el medio de cultivo se encuentran los aminocidos con un grupo tiol (-SH) y los azcares con un grupo aldehdo libre.

F. Temperatura
La temperatura es un factor determinante de crecimiento para numerosos microorganismos. Actuando en muchos casos como un agente selectivo. Los microorganismos se clasifican segn los rangos de temperatura en los que se pueden desarrollar (tabla 2).
Grupo Termfilos Mesfilos Psicrotrofos Psicrfilos T mnima 40-45 5-15 -5-+5 -5-+5 T ptima 55-75 30-45 25-30 12-15 T mxima 60-90 35-47 30-35 15-20

Tabla 2. Clasificacin de los microorganismos Los valores de las temperaturas cardinales (mnima, ptima, mxima) varan ampliamente entre las bacterias, pero algunas tienen una amplitud mayor, como por ejemplo Clostridium perfringens que crece entre 12 y 50C. Los organismos aislados de ambientes fros crecen a temperaturas por debajo de 0C si las altas concentraciones de solutos impiden la congelacin del medio. La mayora de las bacterias con importancia clnica pertenecen al grupo de los mesfilos. 486

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Caractersticas del crecimiento de los microorganismos La velocidad de crecimiento se ve afectada por los cambios de temperatura y, en los rangos inferiores, el tiempo de generacin puede sobrepasar las cien horas. Los microorganismos eucariticos, por ejemplo protozoos, son ms sensibles a las bajas temperaturas que los procariticos, y entre estos ltimos los gram negativos son ms afectados que los gram positivos.

2.4 Composicin
En general los medios de cultivo deben incluir todos los elementos indispensables para la vida bacteriana. Los principales constituyentes generales son: Base de amino-nitrgeno (protena digerida) Factores de crecimiento Fuente de energa Sales minerales Sales para tamponamiento Agentes selectivos Indicadores Agentes gelificantes (para medios slidos)

2.5 Elementos y factores fsico-qumicos


pH: para la mayora de las bacterias el pH ptimo para su crecimiento es cercano a la neutralidad, aunque en algunas excepciones este pH debe ser cido o alcalino. Presin osmtica: preparacin de medios de cultivo en condiciones de isotona, aunque gracias a su pared las bacterias se pueden adaptar a ciertos mrgenes de cambios de presin. Potencial redox: se puede definir como la potencia reductora de un tejido, est en relacin directa con su comportamiento frente a la presencia de oxgeno, que puede ser aerobia estricta, anaerobia estricta, aerobia y anaerobia facultativa o microaerfila. Temperatura: la mayora de las bacterias patgenas presentan una temperatura ptima de 35-37C, aunque existen bacterias cuya temperatura ptima es extrema. Atmsfera: existen determinadas bacterias que para su desarrollo ptimo necesitan determinados gases en su atmsfera; en algunos casos el cultivo debe hacerse en atmsfera de CO2

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3.

CARACTERSTICAS Y CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

3.1 Clasificacin
Los medios de cultivo para bacterias son los que presentan mayor diversidad. Se pueden clasificar segn diferentes criterios, algunos de ellos son:

A. Por su consistencia
a. Medios lquidos
Son medios de cultivo que se encuentran en estado lquido y se denominan caldos. El crecimiento de las bacterias se detecta por la aparicin de turbidez, que puede surgir (generalmente son aerobias estrictas) en la superficie o en el fondo formando sedimentos (generalmente anaerobias), otra posibilidad es que aparezca en general en todo el caldo. Entre los ms usados tenemos: caldos nutritivos, el caldo-tioglicolato, el agua de peptona, etc. Son medios que suelen emplearse para enriquecimiento.

b. Medios slidos
Se obtienen al aadir agar a los medios lquidos, con el fin de solidificar el medio manteniendo la difusin de nutrientes. La principal ventaja de los medios slidos es la posibilidad de obtener colonias aisladas.

c. Medios semislidos
Se obtienen aadiendo agar en concentraciones mnimas a los medios lquidos, y se emplean para detectar la movilidad de los microorganismos y mantener cepas.

B. Por su origen
a. Medios naturales
Tambin denominados empricos, son mtodos de cultivo formados a partir de sustancias animales o vegetales: leche, suero, patatas..., y por ello no tienen una composicin qumica constante.

b. Medios sintticos o definidos


Son aquellos que se obtienen al disolver en agua destilada una serie de sustancias necesarias para el crecimiento bacteriano como son, vitaminas, una fuente de carbono y nitrgeno, factores de crecimiento y compuestos minerales. Su composicin es conocida.

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Caractersticas del crecimiento de los microorganismos

c. Medios semisintticos
Son medios sintticos a los que hemos aadido componentes orgnicos para completar su composicin.

C. Por su composicin
a. Medios comunes
Son utilizados para el crecimiento de grmenes poco exigentes; pueden ser lquidos o slidos.

b. Medios enriquecidos
Son medios de cultivo a los que se les han aadido ciertos productos para satisfacer las necesidades de determinados grmenes exigentes. Ejemplos claros son el agar sangre y el agar chocolate.

D. Por su utilidad
a. Medios de enriquecimiento
Son medios de cultivo que favorecen el crecimiento de microorganismos minoritarios en una muestra, inhibiendo parcialmente el crecimiento de los mayoritarios. Un ejemplo sera el medio de cultivo de Meller-Kauffman, que permite el crecimiento de la Salmonella e inhibe a numerosos coliformes.

b. Medios selectivos
Son medios de cultivo a los que se aaden componentes qumicos o condiciones fsicas especficas para inhibir el crecimiento de las bacterias que no interesan y que estn presentes en la muestra. Para ello, se modifican las condiciones fsicas y qumicas como: pH: los microorganismos son sensibles a los cambios del pH, cada uno presenta un pH ptimo para su crecimiento que suele rondar la neutralidad. De esta forma, si ponemos un pH de 5,4 la mayora de las bacterias quedarn inactivadas, pero el Lactobacillus se ver favorecido. Temperatura: las bacterias presentan una temperatura ptima de crecimiento, de modo que si sometemos el cultivo a temperaturas extremas inactivaremos la mayora de las bacterias. Las bajas temperaturas (4C) favorecen el crecimiento de la Listeria. Concentracin osmtica: aunque las bacterias en general soportan cierto margen de presin osmtica, existen algunas capaces de vivir en situaciones ms extremas como los estafilococos, que soportan un porcentaje de concentracin osmtica del 7,5%.

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Tema 16 Antispticos: son sustancias antimicrobianas inespecficas que inhiben grupos de bacterias. Entre los medios de cultivo que utilizan este mtodo tenemos el medio S-S que contiene verde brillante, inhibiendo a los gram positivo y sales biliares, que inhiben, a su vez, a muchos gram negativo, siendo ideal para aislar Salmonellas y Shigellas. Antibiticos: son sustancias antimicrobianas especficas que podemos emplear para destruir a las bacterias no deseables. Un ejemplo es el medio de Thayer-Martin, que contiene vancomicina, colistina, nistatina y trimetroprim, y en l se aslan gonococos.

c. Medios de diferenciacin
Son medios que contienen colorantes o indicadores, que usamos para poner de manifiesto la presencia de una bacteria determinada que sabemos que reacciona con el indicador presente en el medio. Un ejemplo de estos medios de cultivo es el medio de Kligler, para la identificacin de grmenes entricos gram negativos.

d. Medios de multiplicacin
Son medios especficos que presentan las condiciones fsicas y qumicas para lograr el mximo de crecimiento bacteriano en el menor tiempo posible.

e. Medios de transporte y conservacin


Los medios de transporte son los utilizados para mantener a las bacterias en ptimas condiciones desde que se extrae la muestra hasta que se analizan en el laboratorio. Un ejemplo es el medio de Stuart. Los medios de conservacin son aquellos que nos permiten mantener las caractersticas y viabilidad de las bacterias mediante congelacin, liofilizacin, etc.

f. Medios especiales y para anaerobios


Son medios que se utilizan para cultivar bacterias muy especficas, como los medios de Lowenstein-Jensen para el cultivo de micobacterias o el de Robertson, que mantiene el estado anaerobio para el cultivo de estos grmenes.

3.2 Caractersticas de los medios de cultivo habituales


A. Agar-sangre
Ofrece informacin sobre la actividad hemoltica del microorganismo cultivado. Podemos observar dos tipos de hemlisis: Hemlisis: desaparicin completa de todos los hemates de la zona que rodea la colonia.

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Caractersticas del crecimiento de los microorganismos Hemlisis: parcial, la zona que rodea la colonia adquiere un tono verdoso por la degradacin de la hemoglobina

Contiene 5 % de sangre desfibrinada, pH de 7,3

B. Agar chocolate
Contiene sangre desfibrinada estril (5-10 %), calentada a unos 80C durante 15 minutos o hasta que el color sea pardo achocolatado. La presencia del factor X (hemina termoestable) y el factor V (dicotn-adenina nucletido) permiten el crecimiento de microorganismos exigentes como el Haemophilus, tambin crecen adecuadamente Neisserias. Posee un pH alrededor de 7,3.

C. Agar Meller-Hinton
Es un medio enriquecido, se utiliza en las pruebas de sensibilidad microbiana. El pH se ajusta a 7,4.

D. Caldo tioglicolato
Es un caldo nutritivo que se usa para el crecimiento bacteriano general. Se ajusta el pH a 7,1. Contiene extracto de levadura y casena que ofrecen nutrientes al medio, el ClNa mantiene el equilibrio osmtico, la dextrosa acelera el crecimiento bacteriano y el tioglicolato disminuye el potencial Redox del medio.

E. Caldo comn (TSB)


Es un medio de uso general que permite el crecimiento tanto de grmenes exigentes como no. Se ajusta el pH a 7,3.

F. Agar Mc Conkey
Es un medio selectivo para las bacterias gram-negativas (enterobacterias y pseudomonas). Las sales biliares y el cristal violeta impiden el crecimiento de las bacterias grampositivas y algunas gramnegativas como las Neisserias. Los microorganismos que fermentan la lactosa, aparecen como colonias rojas, los que no la fermentan formarn colonias incoloras. El rojo neutro es el indicador de pH. Lectura: Colonias lactosa negativa: incoloras (= no hay fermentacin de la Lactosa). Salmonella, Shigella, Pseudomonas Colonias lactosa positiva: rosa/rojo ladrillo rodeadas de un halo de sales biliares precipitadas. Escherichia coli (rosa/roja), Escherichia aerogenes (rosa y mucosa)

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G. Agar de Hektoen
Es un medio altamente especfico para la Shigella y la Salmonella contiene: Indicadores del pH. Bilis, tiosulfato y sales de citrato: inhiben el crecimiento de bacterias gram-positivas y de enterobacterias diferentes a la Shigella o Salmonella. Indicadores de hidratos de carbono.

Lectura:
Microorganismos Shigella spp., Providencia spp Salmonella spp. Proteus spp. Escherichia coli, Klebsiella spp, Enterobacter spp. Colonias Verdes, elevadas, hmedas Verde-azuladas, con o sin centro negro Rosa salmn rodeadas en algunas ocasiones por un precipitado biliar

H. Medio de Thayer-Martin
Es un medio selectivo para la Neisseria gonorrhoeae, aunque en l tambin puede crecer la Neisseria meningitidis. Es una variante del agar-chocolate que, adems de los factores X y V, presenta diferentes antimicrobianos que van a inhibir la aparicin de los diferentes microorganismos. Similar a este medio se puede encontrar el medio NYC.

I. Caldo de cerebro-corazn (BHI)


Es un medio enriquecido usado para el cultivo de microorganismos exigentes, al igual que el agar Colombia. Se ajusta pH 7,4.

J. Agar EMB
Es un medio selectivo para enterobacterias, presenta: Lactosa para reconocer los microorganismos que la fermentan. Eosina y azul de metileno para inhibir el crecimiento de las bacterias gram-positivas.

K. Agar Cled
Es un medio para el cultivo de bacterias de la orina. El medio incluye: Indicadores de la fermentacin de la lactosa, las bacterias que fermenten la lactosa formarn colonias verdes y las que no la fermenten azules. Deficiencia en electrolitos.

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Caractersticas del crecimiento de los microorganismos

L. Agar S-S
Es un medio selectivo para la Shigella y la Salmonella, el medio presenta: Verde brillante y sales biliares para la inhibicin de bacterias gramnegativas. Lactosa. Indicadores de la formacin de cido sulfhdrico.

M. Agar Schaedler
Al igual que el caldo de Schaedler se utilizan para el crecimiento de bacterias anaerobias.

N. Medio de Bordet-Gengou
Enriquecido con sangre, se utiliza para el aislamiento del Gnero Bordetella.

O. Medio Brucella
Es un medio rico utilizado para el cultivo de microorganismos exigentes, especialmente para los del gnero Brucella. Aadindole determinadas sustancias puede utilizarse para el aislamiento de anaerobios como Clostridium, Bacteroides, etc.

P. Agar Manitol salado (Chapman)


Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentracin salina. Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio; las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona roja o prpura. Lectura:
Microorganismos Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Escherichia coli Enterobacter, Klebsiella spp. Vibrio parahemolyticus Colonia Amarilla Roja ----Amarilla Crecimiento Excelente Escaso - Bueno ----Excelente

Q. Agar-V
Medio para el crecimiento de Gadnerella vaginalis. Contiene sangre humana para el ptimo crecimiento esta bacteria.

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R. Medio Lowenstein-Jensen
Medio de cultivo empleado para el crecimiento de micobacterias

S. Medio de Butzler
Medio selectivo utilizado para el aislamiento de Campylobacter

T. Medio Skirrow
Se utiliza para aislamiento de Campylobacter.

U. Medio de Roiron
Es un medio que contiene antibiticos y se utiliza para cultivo de Cndida y Trichomonas vaginalis (protozoo).

3.3 Aislamiento de parsitos


Las principales tcnicas de identificacin de parsitos intestinales y sanguneos dependen de la demostracin morfolgica de fase (fases) del ciclo vital. La identificacin puede ser macroscpica para helmitos maduros y/o microscpica para detectar protozoos, huevos de helmintos y larvas. Para la identificacin de parsitos tisulares las tcnicas de inmunodiagnstico son las ms importantes.

3.4 Cultivo de virus


El aislamiento de virus es muy complejo, al ser stos parsitos intracelulares obligados necesitan clulas vivas para desarrollarse. Uno de los mtodos de identificacin de virus consiste en inocular la muestra acondicionada en diferentes lneas celulares y observar el efecto citoptico que el virus produce en ellas. El diagnstico de las enfermedades vricas se realiza frecuentemente por tcnicas inmunolgicas, generalmente detectando anticuerpos. Las tcnicas de biologa molecular cada vez tienen mayor importancia. El cultivo celular se realiza en medios preparados artificialmente mediante la mezcla de componentes purificados o de soluciones orgnicas complejas.

A. Propiedades fsicas
a. pH y capacidad tamponadora
El pH ptimo de crecimiento para la mayora de tipos celulares es de 7.4, aunque existen pequeas variaciones.

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Caractersticas del crecimiento de los microorganismos El indicador de pH que se suele emplear es rojo fenol, que presenta color rojo a pH 7.4, naranja a pH 7.0, amarillo a pH 6.5, azul-rojo a pH 7.6 y prpura a pH 7.8. El tamponado del medio de cultivo evita los cambios bruscos de pH. La solucin tamponadora ms empleada es el tampn bicarbonato, que equilibra el CO2 atmosfrico. HEPES es la solucin tamponadora de eleccin por su elevada capacidad tamponadora en el rango 7.2 a 7.6, y se emplea en concentraciones de 10 a 20 mM.

b. Temperatura
La temperatura tiene gran influencia en la tasa de crecimiento de las clulas, de ah la importancia de un buen control de sta en la incubacin. Influye, asimismo en el pH del medio, por lo que se recomienda o bien ajustar el pH del medio 0.2 unidades por debajo del ptimo, a temperatura ambiente, o bien preparar el medio completo, incluso suero, dejar equilibrar en la estufa y despus ajustar el pH, antes de aadirlo al cultivo.

B. Composicin
a. Soluciones salinas equilibradas (BSS)
Una solucin salina equilibrada es una mezcla de sales inorgnicas, incluyendo usualmente bicarbonato sdico, y suplementada con glucosa.

b. Aminocidos
Es necesario complementar el medio de cultivo base con los aminocidos esenciales y aquellos que las necesidades especficas de la clula requieran. Un suplemento comn es el de glutamina, a 2 mM final. La glutamina es inestable en el medio, y se recomienda aadirla a partir de un stock concentrado (100x) que se mantiene congelado.

c. Vitaminas
El medio MEM slo se suplementa con vitaminas del grupo B, siendo los dems grupos aportado por el suplemento de suero. En medios ms definidos se suplementan todas las vitaminas. La limitacin de vitaminas se manifiesta en la supervivencia de las clulas y en la reduccin de la tasa de crecimiento ms que en la densidad celular.

d. Glucosa
Es la fuente de energa en muchos medios.

e. Otros suplementos orgnicos de bajo peso molecular


Dependiendo del medio, ste incluye en su formulacin nuclesidos, intermediarios del ciclo de Krebs, piruvato, lpidos,... Editorial CEP

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Tema 16 La adicin de piruvato en el medio permite al cultivo incrementar su produccin endgena de CO2 hacindole independiente de la aportacin exgena de ste.

f. Hormonas y factores de crecimiento (suero)


En los medios no definidos suele aportarlos el suero. Los tipos de suero empleados son suero de ternera ("calf serum", CF), suero bovino fetal ("fetal calf serum", FCS), suero de caballo ("horse serum", HS) y suero humano ("human serum", HuS). El ms usado es el suero de ternera, mientras que el suero bovino fetal es usado en lneas ms exigentes, y el suero humano en lneas humanas.

g. Antibiticos y antifngicos
A fin de evitar el crecimiento de contaminantes en el cultivo se suele suplementar ste con sustancias antibiticas de diferente espectro de accin. La adicin de antibiticos ha de ser estrictamente controlada para evitar efectos nocivos sobre el cultivo. Las mezclas de uso ms comn son: Penicilina (100 U/ml) / Estreptomicina (100 gr/ml). Combinacin antimicrobiana. Penicilina (100 U/ml) / Estreptomicina (100 gr/ml) / Fungizona (Wittaker). Combinacin anti-microbiana y anti-fngica. Gentamicina (50 gr/ml). Anti-microbiana, conviene ir alternndola con la penicilina-Estreptomicina. Amphotericina-B (2.5 gr/ml). Antifngico y antilevaduras. Se han observado algunos efectos secundarios sobre el crecimiento de clulas de mdula sea humana en cultivo.

C. Principales medios empleados y sus aplicaciones


a. Medio Basal de Eagle (BME)
Medio elemental con slo los aminocidos esenciales. Se necesita siempre la suplementacin con suero bovino fetal al 10 %. Crecimiento de fibroblastos de ratn y clulas HeLa.

b. Medio Mnimo Esencial de Eagle (MEM)


Es el medio de uso ms corriente, contiene ms aminocidos y en mayor concentracin que el BME. Se usa para cada casi todo tipo de cultivos y requiere la adicin de suero (10 %).

c. R.P.M.I. 1640
Medio diseado para el crecimiento de linfoblastos y lneas celulares leucmicas en suspensin. Tiene un amplio rango de aplicaciones con suplementos adecuados. 496

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Editorial CEP

Caractersticas del crecimiento de los microorganismos

d. Modificacin de Iscove del medio DMEM (IMDM)


Es un medio muy completo que incluye en su formulacin albmina bovina, transferrina, selenito, etc. Es muy til para el cultivo de linfocitos en medio libre de suero. Tambin sirve para otros tipos celulares, pero en ese caso requiere suero a bajas concentraciones.

e. McCoy 5A
Medio diseado para el crecimiento para el crecimiento de lneas celulares diploides tanto de rata como humanas.

f. Medio 199
Muy usado para el cultivo de clulas no diferenciadas y estudio de cromosomopatas.

3.5 Medios de cultivo de hongos


En lneas generales, todos los medios de cultivo utilizados en micologa contienen los nutrientes suficientes para asegurar el desarrollo de los hongos (carbono, nitrgeno, vitaminas, oligoelementos, etc.). El pH, ligeramente cido, facilita el crecimiento de los hongos e inhibir al mismo tiempo el desarrollo de otros microorganismos. Se aaden antibiticos antibacterianos para inhibir el crecimiento de las bacterias saprofitas que suelen contaminar las muestras. Los ms usados son el Cloranfenicol y la Gentamicina. Se aade tambin actidiona (Cicloheximida) que inhibe el desarrollo de hongos saprofitos ambientales (aunque tiene el inconveniente de que inhibe el crecimiento de Cryptococcus neoformans). Generalmente, se utilizan varios medios de cultivo diferentes para el aislamiento de los hongos, ya sea en placa o en tubo. Los medios en placa tienen la ventaja de ofrecer una gran superficie para el aislamiento pero, para soportar la deshidratacin durante el largo perodo de incubacin a que van a ser sometidos (un mes o ms), has de contener una gruesa capa de medio (25 a 40 ml). Son ms peligrosos a la hora de su manipulacin y fciles de contaminar. Por contra, los medios en tubo tienen una superficie de trabajo mucho ms pequea, pero ofrecen mxima seguridad en su manipulacin y buena resistencia a la deshidratacin y a la contaminacin. Tanto la muestra como las placas y tubos que se van a sembrar deben manipularse, para mayor seguridad del tcnico y para evitar contaminaciones ambientales, en campana de flujo laminar. Han de rotularse adecuadamente, con el n de la muestra y la fecha en que se realiza la siembra. Las placas se precintan con cinta.

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Tema 16

A. Medios para aislamientos primarios


a. Medio Sabouraud dextrosa (SAB)
El agar Sabouraud dextrosa, modificado por Emmons, contiene un 2% de glucosa y es ligeramente cido (pH=6.9), se considera el medio estndar para recuperar y mantener una amplia variedad de hongos que pueden aislarse en el laboratorio de micologa clnica. Este medio permite observar la morfologa tpica de los hongos, el crecimiento de actinomicetos aerobios, pero no es el medio ideal de crecimiento o para estudiar la esporulacin. Se utiliza indistintamente en tubo o en placa.

b. Medio Sabouraud con Cloranfenicol y Gentamicina (SAB G+C / SABHI G+C))


Es el medio SAB clsico con la incorporacin de los antibiticos Gentamicina y Cloranfenicol, que permiten el crecimiento de casi todos los hongos filamentosos y levaduras al mismo tiempo que inhiben a una gran mayora de bacterias. Se utiliza en tubo o en placa.

c. Medio BHI y 10% de sangre de carnero (BHI sangre)


El agar BHI (Brain-Heart infusion) es un medio enriquecido que facilita la recuperacin de Criptococcus neoformans (sobre todo en muestras estriles como LCR) y que se utiliza para la conversin hongo-levadura de hongos como Sporothrix sp y Paracoccidioides sp.

d. Medio BHI con Cloranfenicol, Gentamicina, Cicloheximida y 10% de sangre de carnero (BHI sangre C+G+C)
Los antibiticos aadidos inhiben el crecimiento de la mayora de las bacterias y hongos saprofitos (aunque tambin de algunos hongos patgenos). La incorporacin de sangre de carnero mejora el crecimiento de hongos dimrficos

B. Medios para aislamientos especiales


a. Medio de patata
Se prepara con pulpa de patata como base. Se utiliza para estimular el desarrollo in vitro de las estructuras de reproduccin sexual de la mayor parte de los hongos. Tambin estimula la produccin de pigmentos en hongos como por ejemplo, Trichophyton. rubrum. Se puede aadir zanahoria y bilis (para favorecer la obtencin de clamidosporas de Cndida albicans) o glucosa/dextrosa (para diferenciar Trichophyton rubrum)

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Caractersticas del crecimiento de los microorganismos

b. Medio de arroz
Medio a base de granos de arroz blanco que se utiliza para diferenciar Microsporum auduinii (que no se desarrolla en este medio) de otras especies de Microsporum

c. Medio de Czapek
Se utiliza para estimular las caractersticas diferenciales de Aspergillus spp y para estimular la filamentacin de Sporothrix schenckii

d. Medio de Alpiste
Es el medio indicado para deteccin de Criptococcus neoformans. Esta levadura es la nica conocida actualmente, de inters clnico, que produce la enzima fenoloxidasa. El agar de Alpiste contiene sustratos para esta enzima por lo que el crecimiento de Criptoco se detecta por la formacin de colonias de color pardo.

e. Medio Chromagar Cndida


Es un medio diferencial que permite la identificacin presuntiva de algunas especies habituales de Cndida en funcin del color y morfologa que adoptan cuando crecen en este medio. Puede utilizarse como medio para aislamiento primario.

3.6 Preparacin medios slidos y lquidos


Los constituyentes habituales de los medios de cultivo son: Agar Se utiliza como agente solidificante. Es un polisacrido que se obtiene de ciertas algas marinas. Una vez que funde en agua hirviendo, puede enfriarse hasta una temperatura de 40-42C, sin endurecerse, y no fundir de nuevo hasta que no se alcance una temperatura de 80-90C. La mayora de los microorganismos no pueden degradarlo. Si se necesitan medios slidos para cultivar microorganismos en superficie, se puede solidificar un medios lquido aadiendo agar, al 1.0-2%, emplendose habitualmente al 1.5%. Azcares Son una fuente de carbono para los microorganismos. Los ms empleados son la glucosa, la lactosa y la sacarosa.

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Tema 16 Extractos Son preparados de ciertos rganos o tejidos animales o vegetales obtenidos con agua y calor. Ej.: extracto de carne, de levadura, de malta, etc. Peptonas Son protenas hidrolizadas, se obtienen por digestin qumica o enzimtica de protenas animales o vegetales. Fluidos corporales Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguneo son aadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos microorganismos patgenos. Sistemas amortiguadores Son sales que se aaden al medio para mantener el pH dentro del rango ptimo del crecimiento bacteriano. Ej.: fosfatos bisdicos o bipotsicos. Indicadores de pH Son indicadores cido-base que se aaden para detectar cambios de pH en el medio. Agentes reductores. Sustancias que se aaden al medio para crear las condiciones que permitan el desarrollo de los grmenes microaerfilos o anaerobios. Ej.: cistena y tioglicolato. Agentes selectivos Sustancias como el cristal violeta, las sales biliares etc. que a determinadas concentraciones en el medio actan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos.

A. Medios slidos
Generalmente, la preparacin de medios se realiza a partir de medios deshidratados.

a. Disolucin del medio de cultivo deshidratado


Para la preparacin de medios de cultivo se utiliza agua limpia, recin destilada o recin desmineralizada y cuya reaccin sea lo ms cercana posible al pH neutro. Los recipientes destinados a la preparacin (por lo general matraces Erlenmeyer) se limpiarn escrupulosamente con el agua destilada o desmineralizada, con el fin de eliminar totalmente eventuales residuos de otras sustancias. Los recipientes destinados a la preparacin de medios de cultivo deben ser lo suficientemente grandes para que el medio de cultivo que se prepara pueda ser agitado con facilidad y concienzudamente. A ser posible, no se prepararn ms de 1-2 litros por recipiente. Al medio de cultivo deshidratado y pesado se le aade una pequea cantidad de agua para saturarlo y se agita suficientemente

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Caractersticas del crecimiento de los microorganismos para conseguir una suspensin homognea. Despus se incorpora la cantidad de agua restante, aprovechando esta adicin para desprender e incorporar al conjunto las partculas de medio de cultivo que hubieran quedado adheridas a la pared interna del recipiente. Todo tipo de medio de cultivo es sensible al calentamiento. Por este motivo, no debe calentarse ms de lo estrictamente necesario. Los medios nutritivos que no contienen agar ni gelatina se pueden disolver, por lo general, en agua fra o bajo ligero calentamiento. A fin de obtener una preparacin adecuada se recomienda hacer uso de estas indicaciones. Los medios nutritivos que contienen agar o gelatina deben ser calentados para conseguir su disolucin. Este calentamiento se realiza en bao mara o en marmita de vapor (por ejemplo, autoclave sin sobrepresin). En el caso de medios de cultivo que no deban ser sometidos a ulterior esterilizacin en autoclave es imprescindible prestar atencin a su disolucin completa. Puede reconocerse que se ha alcanzado este grado cuando, al agitar, no se adhiere a la pared interna del recipiente partcula alguna de agar y la solucin, viscosa, resbala libremente. Algunos medios de cultivo muestran una turbidez inevitable (entre otros, por ejemplo, el Agar-bismuto-sulfito). Para estos medios hay que procurar una turbidez homognea, distribuyendo lo mejor posible las partes insolubles. Si es imprescindible la preparacin de ms de 2 litros, es recomendable proceder segn la siguiente norma: Desler el medio de cultivo en 1/10 aproximadamente de la cantidad prevista de agua y dejarlo remojar durante 15 min. Calentar a ebullicin el agua restante Reunir esta agua hirviente, bajo constante agitacin, con el medio de cultivo remojado Calentar adicionalmente hasta su completa disolucin

b. Ajuste del pH
El valor del pH depende mucho de la composicin del medio de cultivo, de la temperatura que tenga este medio de cultivo en el momento de su medicin y del tratamiento a que se haya sometido dicho medio de cultivo durante su obtencin (disolverlo, esterilizarlo). Por este motivo, la medicin del pH se hace despus de la esterilizacin. En los medios de cultivo slidos, la medicin del pH (y, eventualmente, la correccin que fuese precisa) se realiza a 45-50C (medio de cultivo lquido) y en los medios nutritivos lquidos se hace a temperatura ambiente. El pH se ajusta al valor indicado para cada medio de cultivo. A la temperatura de incubacin, el valor del pH quedar dentro de los lmites de oscilacin previstos. La correccin se logra por adicin de solucin 1 N o 1/10 N de cido clorhdrico o de hidrxido sdico Editorial CEP

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Tema 16 estriles, a una muestra de medio de cultivo exactamente medida (por ejemplo, 50 mL). La cantidad de solucin correctora necesaria para la totalidad del producto preparado se calcula fcilmente a partir de la cantidad de solucin correctora empleada para la muestra del medio de cultivo. Las soluciones de cido clorhdrico y de hidrxido sdico pueden hacerse estriles por filtracin, hacindose pasar a travs de filtros adecuados de vidrio o filtros especiales de membrana).

c. Esterilizacin
Antes de su esterilizacin, y dentro de lo posible, es conveniente repartir el medio de cultivo en porciones ms pequeas, por ejemplo, en los recipientes definitivos o en los que ulteriormente se lleve a cabo el trabajo de investigacin de que se trate (excepto placas de Petri). Si las normas de preparacin no indican otra cosa, la esterilizacin se lleva a cabo en autoclave, a 121 C, durante 15 min. Los periodos de calentamiento y enfriamiento, que dependen del tipo de aparato y del volumen del preparado a esterilizar, no se han tenido en cuenta al indicar la cifra anterior. La esterilidad slo se consigue con seguridad cuando se ha desalojado correctamente el aire de la cmara de vaporizacin del autoclave y de los recipientes en ella contenidos. Con este fin, se deja fluir ampliamente la corriente de vapor manteniendo abierta la vlvula de purga durante el comienzo de la fase de calentamiento del autoclave. Tras la esterilizacin y despus de haber alcanzado el equilibrio de presiones (entre el interior y el exterior del autoclave) y para evitar la sobrecarga trmica del medio de cultivo, deben sacarse enseguida del autoclave los recipientes y enfriarlos rpidamente, por ejemplo a la temperatura de "vertido". Se recomienda para ello baar los recipientes con agua corriente fra. Temperaturas ms altas y calentamientos ms prolongados de lo previsto, perjudican la calidad del medio de cultivo. El autoclave es la forma de esterilizacin ms segura para los medios de cultivo.

d. Vertido en placas
Para evitar, considerablemente, la formacin de gotitas de condensacin de agua en la tapa de las placas de Petri, debe verterse en ellas el medio de cultivo a una temperatura de 45-55 C. El volumen a dispensar depende del tamao de la placa, pero en las placas habitualmente utilizadas para el cultivo, de 90 mm de dimetro, se suelen dispensar de 30-40 mL. Previamente hay que remover bien el medio de cultivo haciendo oscilar en sentido circular su recipiente, para garantizar el entremezclamiento uniforme de dicho medio de cultivo. Las burbujas de aire en la superficie de la placa se eliminan "abanicando" brevemente la superficie con la llama no luminosa de un mechero Bunsen. Antes de sembrar las placas puede secarse la superficie hmeda del Agar (que podra favorecer el desplazamiento de microorganismos o el desmembramiento de colonias) en

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Caractersticas del crecimiento de los microorganismos estufa a 30-40 C. Para ello, se coloca la parte inferior de la placa de Petri, con su cara interna hacia abajo, algo desplazada sobre la tapa que ahora le sirve de apoyo. Este tiempo de secado alcanza 20-30 min., como mnimo. En estufas con circulacin de aire se precisa menos tiempo.

e. Tubos de agar inclinado


Para algunas aplicaciones microbiolgicas se ha mostrado como muy interesante, realizar siembras superficiales en tubos de cultivo (por ejemplo, conservacin de cepas). Para ello se precisa una superficie grande de medio de cultivo, que se puede obtener mediante "agar inclinado". Los tubos llenos con medio de cultivo esterilizado, todava lquido, se colocan en una posicin inclinada, de tal forma que se forme una capa de aprox. 3 cm. y una superficie inclinada de iguales dimensiones. El medio de cultivo se deja solidificar en la posicin lograda.

B. Medios lquidos
Los medios lquidos se preparan de forma similar a los slidos, pero no llevan agar. Los tubos de llenan unos de su capacidad y el tapn debe estar parcialmente desenroscado, cuando se vayan a esterilizar. Cerrndose al sacarlos del autoclave.

C. Consideraciones generales
Almacenar siempre en lugares frescos, a temperatura ambiente (25 C) y protegidos contra la humedad y la luz. Indicar en el frasco la fecha de apertura. Verificar antes de su uso: fecha de caducidad, lote y aspecto macroscpico. Si se observan cambios sustanciales, tales como hidratacin, endurecimiento y cambio de color, deben descartarse. Se recomienda utilizar agua recin destilada o completamente desmineralizada para la rehidratacin. El grado de disolucin de un medio deshidratado, as como la eficacia del mismo ya preparado, depende en gran medida del procedimiento empleado en la rehidratacin. Cuidar las condiciones de esterilizacin. Generalmente una temperatura de 121C, 1 atmsfera de presin y un tiempo de esterilizacin de 15 minutos, son suficientes para la mayora de los medios. Enfriar el medio a 45-60C en un bao mara, para evitar la formacin de agua de condensacin. Evitar la formacin de burbujas y cogulos, durante la dispensacin.

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Tema 16 Rotular todos los medios preparados, tanto en placas Petri como en tubos, indicando adems, la fecha de preparacin y caducidad. Los medios ya preparados deben mantenerse preferiblemente en sitios oscuros, ya que la luz puede afectar algunos de sus componentes. Evitar la desecacin, se aconseja que se guarden en bolsas plsticas bien cerradas. Las placas Petri deben mantenerse con el fondo hacia arriba. El agua de condensacin puede afectar a la individualidad de las colonias en el aislamiento o en los casos de pruebas de sensibilidad a los antibiticos en los que el exceso de agua puede afectar la dilucin de las colonias y, por lo tanto, a la lectura del halo de inhibicin. Colocar los medios preparados, por fecha de caducidad.

D. Causas de error en la preparacin de medios de cultivo


a. Valor de pH incorrecto
Medir el pH por encima de los 25C Sobrecalentamiento en la esterilizacin, vuelta a fundir o calentamiento prolongado a 50C Solucin incompleta del medio Mala calidad del agua Recipiente mal lavado o con residuos qumicos Mala conservacin del medio deshidratado o caducado

b. Turbidez o precipitacin
Mala calidad del agua Sobrecalentamiento Ph incorrecto Solucin incompleta

c. Oscurecimiento
Sobrecalentamiento Solucin incompleta Alteracin del Ph

d. Gel blando
Bajo porcentaje de agar en el medio

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Caractersticas del crecimiento de los microorganismos Errores en la pesada del medio deshidratado o en los suplementos Sobrecalentamiento Mala homogenizacin del medio Exceso de agua

e. Crecimiento bacteriano pobre


Exceso de calentamiento Substancias inhibidoras en el agua o en el recipiente Alteracin en el pH

3.7 Almacenamiento y conservacin


Los medios de cultivo aptos para usar, se almacenan teniendo en cuenta la fecha de caducidad y el nmero de lote. Generalmente, los medios de uso habitual en el laboratorio de microbiologa se conservan refrigerados alrededor de 4C. Es importante tener en cuenta unas consideraciones bsicas: No utilizar medios con signos de contaminacin evidentes, si existe duda desechar Observar cuidadosamente el medio antes de utilizarlo Utilizar los medios a la temperatura adecuada de uso, generalmente a la temperatura ambiente Evitar la contaminacin de los medios con la manipulacin

3.8 Distribuidores de medios


La distribucin de los medios de cultivo tanto slidos como lquidos se realiza habitualmente con equipos de distribucin, que pueden ser simples o complejos dependiendo de la actividad del laboratorio. La utilizacin de estos equipos permite la distribucin uniforme del medio en las placas o tubos y disminuye el riesgo de contaminacin del medio, siempre que se tengan en cuentan las instrucciones de manejo del equipo y se pongan en practica las consideraciones generales del trabajo en esterilidad. Existen en el marcado, distintos modelos, pero con caractersticas bsicas comunes. Sistema de alimentacin de placas Petri Sistema de alimentacin de tubos Bomba peristltica para impulsar el medio

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Tema 16 Fuente de radiaciones ultravioletas para la esterilizacin de la zona cuando se dispensa el medio Mecanismo de ajuste de volumen del medio que se desea dispensar

4.

TCNICAS DE INOCULACIN. AISLAMIENTO RECUENTOS CELULARES BACTERIANOS

4.1 Tcnicas de inoculacin. Aislamiento


Los estudios necesarios para la identificacin del microorganismo productor de la enfermedad infecciosa determinan la tcnica de cultivo y aislamiento a realizar. El primer paso es el cultivo de la muestra, cuya finalidad es obtener lo ms diferenciados posibles los distintos microorganismos. La utilizacin de medios de cultivo selectivos y una buena tcnica de cultivo, para bacterias y algunos hongos, generalmente en placas. Para el estudio bioqumico y antibiograma, en Microbiologa se trabaja, en general, con cultivos puros de microorganismos. Un cultivo puro es aqul en que todas las clulas provienen de una sola clula inicial. Una colonia de cualquier microorganismo es un cultivo puro, ya que todas sus clulas proceden de una inicial; por lo tanto, cuando se desea aislar un microorganismo de una muestra cualquiera, es preciso ver colonias del mismo, lo que implica que el aislamiento ha de realizarse en medio slido en placa.

A. Normas generales
Las asas deben esterilizarse antes de utilizarlas y enfriarse sobre el agar o el material de vidrio (en zonas estriles) antes de tomar la muestra de microorganismos, con objeto de no destruirlos por calor. Despus de utilizarlas, las asas se vuelven a esterilizar. Las bocas de los tubos y matraces de vidrio se flamean ligeramente una vez destapadas, y despus de la inoculacin. Durante la inoculacin, los tapones se mantienen en la mano sujetndolos por la parte que no entra en contacto con tubos y matraces Los tubos abiertos deben mantenerse en posicin inclinada para que el riesgo de contaminacin sea mnimo. Las tapas de las placas Petri no deben colocarse nunca sobre la mesa de trabajo.

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Caractersticas del crecimiento de los microorganismos

B. Medios slidos en placa


a. Inoculacin en placa
Tambin denominado inoculacin por estras, es un mtodo simple mediante el cual se consiguen colonias separadas por agotamiento, para poder realizar las distintas tcnicas de identificacin, susceptibilidad antimicrobiana, etc. Procedimiento: Flamear el asa de platino, si la muestra es lquida se puede depositar en la placa con una pipeta Pasteur estril. Tomar la muestra. Diseminar la muestra en la placa. Imaginar la placa dividida en 4 cuadrantes e inocular la muestra en cada uno de ellos realizando estras cada vez mayores. El asa slo deber coger muestra 1 vez. Realizar estras transversales e ir girando la placa, las estras sern cada vez ms separadas. Acabar en el centro de la placa con estras muy separadas. Imaginar la placa dividida en 2 partes iguales, en una inocular de forma contigua y en la otra con estras muy separadas. Realizar una estriacin en el centro de la placa para despus proceder al flameado del asa y al aislamiento a partir del primer inculo.

Existen varias formas de diseminar la muestra y las principales son:

Si la muestra se procesa de un escobilln se realiza la siembra directamente con ste, si se hace en una jeringuilla podemos realizar una descarga previa y pasar a la inoculacin posterior.

b. Siembra masiva en superficie


Es una tcnica utilizada fundamentalmente para el recuento de colonias y antibiograma; para realizarla podemos utilizar el escobilln, la esptula de Drigalsky o el asa de platino.

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Tema 16 La siembra se realiza partiendo de una descarga central en que se irn distribuyendo de forma uniforme la muestra, para ello realizaremos estras confluyentes a lo largo de toda la placa, sta se ir girando para favorecer la siembra.

c. Siembra en masa
Para realizar esta tcnica se mezclan un volumen determinado de la muestra con uno del medio de cultivo a la temperatura adecuada para que permita la mezcla sin dificultades y no estropee las caractersticas del medio de cultivo. Tras la mezcla verter el contenido en una placa y la dejar que solidifique para su posterior recuento de colonias.

C. Medios slidos en tubo


La inoculacin en medios slidos en tubos se practica para la transferencia de cultivos puros y estudios bioqumicos. El medio puede ir dispuesto tal cual, inclinado hasta unos 45, o con ligera inclinacin (pico de flauta), tambin se prepara es estado semislido.

a. Tubos de agar inclinados o en pico de flauta


Preparar todo el material necesario y disponerlo de la forma adecuada. Flamear el asa y dejar enfriar. Tomar una muestra. Retirar el tapn del tubo con el dedo meique y flamear la boca del tubo. Introducir el asa y realizar una suspensin del inculo en el agua de condensacin del fondo del tubo. Realizar movimientos en zigzag desde el fondo hasta la superficie para inocular la muestra. Flamear la boca del tubo y tapar. Incubar a 370C durante 1 - 2 das.

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Caractersticas del crecimiento de los microorganismos

b. Siembra en picadura
La tcnica es la que sigue: Flamear el hilo y dejar enfriar. Tomar una muestra. Destapar el tubo con el dedo meique. Flamear la boca del tubo. Introducir el hilo con un movimiento preciso y recto hasta 2/3 de su profundidad y sacar por el mismo camino. Flamear la boca del tubo. Cerrar e incubar.

Esta tcnica se puede realizar en tubos con medios inclinados o no inclinados y suele usarse para determinar la movilidad de los microorganismos.

D. Medios lquidos en tubo


a. Inoculacin con asa
La tcnica es la siguiente: Preparar todo el material necesario y disponerlo de la forma adecuada. Flamear el asa y dejar enfriar. Tomar una muestra. Retirar el tapn del tubo con el dedo meique y flamear la boca del tubo. Inclinar el tubo y frotar suavemente las paredes con el asa justo por encima del lquido, de esta forma dejaremos suspendido el inculo. Flamear la boca del tubo. Cerrar el tubo. Mover suavemente el tubo para lograr una suspensin homognea. Limpiar y guardar el material de la forma adecuada.

b. Inoculacin con pipeta de Pasteur


Esta tcnica se puede realizar tambin con una jeringuilla estril: Preparar todo el material necesario y disponerlo de la forma adecuada. Tomar una muestra con la pipeta o la jeringuilla. Retirar el tapn del tubo con el dedo meique y flamear la boca del tubo.

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Tema 16 Inclinar el tubo y frotar suavemente las paredes con la pipeta justo por encima del lquido, permitiendo que salga la muestra, de esta forma dejaremos suspendido el inculo. Flamear la boca del tubo. Cerrar el tubo. Mover suavemente el tubo para lograr una suspensin homognea.

c. Inoculacin con escobilln


En este caso se puede procesar bien realizando una inoculacin con el escobilln en el medio o bien introduciendo directamente el escobilln en el medio e incubar el tubo con el escobilln dentro. En el primer caso se proceder: Preparar todo el material necesario y disponerlo de la forma adecuada. Tomar una muestra con el escobilln, es posible que la muestra haya sido recogida directamente con el escobilln. Retirar el tapn del tubo con el dedo meique y flamear la boca del tubo. Introducir el escobilln dentro del medio de cultivo y realizar rotaciones suaves para inocular el microorganismo. Flamear la boca del tubo. Cerrar el tubo. Limpiar y guardar el material de la forma adecuada.

4.2 Tcnicas de recuento bacteriano


Existen muchas formas de cuantificar el crecimiento microbiano para determinar la velocidad de crecimiento y el tiempo de generacin. El crecimiento de clulas, microorganismos, clulas vegetales y animales, puede mirarse bajo dos aspectos o tipos de crecimiento reproductivo: Clulas individuales o poblacin de clulas en crecimiento sincronizado para estudio del ciclo de vida celular. Procesos en laboratorio. Divisin estocstica de la poblacin, o divisin al azar.

La divisin celular se efecta despus de un aumento en el tamao de la clula, duplicacin del ncleo, divisin celular, divisin citoplasmtica (salvo los organismos centicos). De sta manera una clula da nacimiento a dos clulas hijas de tamao idntico y conteniendo los mismos elementos estructurales y potencialidades. En el caso de las levaduras, y otros microorganismos, se presenta una variante que es la gemacin o botn. Se forma una pequea protuberancia que aumenta progresivamente de tamao, luego se produce la

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Caractersticas del crecimiento de los microorganismos divisin en el ncleo y migra hacia el botn. Finalmente crece hasta un tamao suficiente y posteriormente se separa formando otra clula idntica a la madre. Las clulas hijas, sin importar el procedimiento de divisin celular, deben heredar todo el potencial gentico y son idnticas. El clculo del nmero de clulas que existen en una suspensin se puede llevar a cabo mediante el recuento celular (microscopa, nmero de colonias), masa celular (peso seco, medida del nitrgeno celular, turbidimetra) o actividad celular (grado de actividad bioqumica con relacin al tamao de la poblacin). Todos estos mtodos se clasifican en mtodos directos y mtodos indirectos.
Recuento del nmero de clulas en una cmara Thoma Peso seco celular Determinacin de nitrgeno o de protenas totales Determinacin de DNA Recuento de colonias en placa Recuento sobre filtro de membrana Consumo de oxgeno Liberacin de dixido de carbono Concentracin de un enzima constitutivo Decoloracin de un colorante Incorporacin de precursores radiactivos Medida de la turbidez

Mtodos directos

Mtodos indirectos

A. Medida de masa celular


a. Mtodos directos
Es necesario que las preparaciones estn limpias, sin partculas extraas.
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Determinacin del peso hmedo Tarar un tubo de centrfuga Centrifugar el cultivo y eliminar el sobrenadante Determinar el peso del sedimento

Inconvenientes: grandes errores, debido al lquido intercelular retenido, cuya cuanta depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del empaquetamiento, etc.
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Determinacin del peso seco Tarar un tubo de centrfuga Centrifugar el cultivo y eliminar el sobrenadante

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Tema 16 Secar el sedimento (105C, toda la noche), hasta peso constante Determinar el peso del sedimento

Las medidas de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso hmedo. Es un mtodo tedioso que requiere mucho tiempo y con bastantes errores, es difcil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. 1 mg de peso seco equivale a unas 5 x 10 9 bacterias.
z

Determinacin del nitrgeno total Tcnica de micro-Kjeldahl Consiste en la digestin en condiciones cidas enrgicas con peroxidisulfato hasta pasar todas las especies a amonio, el cual se mide por fotometra.

Determinacin de un componente caracterstico Peptidoglucano, ADN, ARN, protenas, ATP, clorofilas en organismos fotosintticos, etc. Se suele usar en bacterias para las que otros mtodos ms fciles dan errores debido a que forman grumos no dispersables, crecen en filamentos, etc. Se emplean en determinaciones de crecimientos en ambientes naturales.

b. Mtodos indirectos
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Medida de consumo de nutrientes o de produccin de algn metabolito por unidad de tiempo Como el consumo de oxgeno (QO2) y consumo de carbnico (QCO2), produccin de cidos.

Mtodos turbidimtricos (pticos) Se usan frecuentemente en el lboratorio. Consisten en la medicin de la cantidad de luz dispersada o transmitida a travs de un cultivo bacteriano. Recordemos aqu que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier partcula pequea suspendida en agua (efecto Tyndall). La dispersin de la luz es, dentro de ciertos lmites, proporcional a la masa del cultivo. Espectrofotmetro Mide la densidad ptica (D.O.), es decir la absorbancia (una medida de la luz transmitida a travs de la supensin). Por supuesto, hay que realizar una curva estndar

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Caractersticas del crecimiento de los microorganismos para relacionar los valores de A con la masa bacteriana en una muestra problema. La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente entre el tamao de la partcula y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la tcnica aumenta pues a longitudes de onda cortas. La proporcionalidad entre A y masa bacteriana slo es vlida para >107cls/ml. Nefelmetro Se caracteriza por presentar el sensor situado en ngulo recto respecto de la direccin de la luz incidente, y se mide la luz dispersada directamente por la preparacin. Posee mayor sensibilidad que el espectrofotmetro.

B. Medida del nmero de individuos


a. Mtodos directos
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Recuento microscpico Es una tcnica comn, rpida y barata que utiliza un equipamiento fcilmente disponible en un laboratorio de microbiologa. Para estos recuentos se utilizan generalmente cmaras de recuentos, aunque tambin pueden realizarse a partir de muestras filtradas en membranas y transparentizadas o teidas con colorantes fluorescentes (Naranja de acridina). La mayor dificultad del recuento en cmara es obtener reproductibilidad en el llenado de la cmara con lquido. Otra dificultad es la adsorcin de las clulas en las superficies del vidrio, incluyendo pipetas. Esta adsorcin es crtica en el proceso de dilucin de la muestra y se minimiza al realizar las diluciones en medios de alta fuerza inica (solucin fisiolgica o medios mnimos sin fuente de carbono). Las cmaras ms utilizadas son las de Hawksley y la de Petroff-Hausser. La primera tiene la ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersin, aunque la mayora de los recuentos se realizan con objetivos secos. Una de las mayores ventajas del recuento microscpico es brindar informacin adicional sobre el tamao y la morfologa de los objetos contados.

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Tema 16

Tipo de cuadro Cuadrado total Cuadrado grande Cuadrado pequeo

Area(cm 2) 1.00 x 10 -2 4.00 x 10 -4 2.50 x 10 -5

Volumen (ml) 2.00 x 10 -5 8.00 x 10 -7 5.00 x 10 -8

Factor (1/Volumen) 5.00 x 10 4 1.25 x 10 6 2.00 x 10 7

1/Dilucin: Inversa de la dilucin utilizada para llenar la cmara de recuento. Nmero de cuadrados contados: Cantidad de cuadrados de la cmara que se utilizaron para contar un el nmero de bacterias. Volumen del cuadrado: Volumen de cada cuadrado de la cmara. Depende del tipo de cuadrado en donde se realiz el recuento. Por ejemplo, cada cuadrado pequeo tiene un volumen de 5 x 10-8 ml (50 m x 50 m x 20 m = 5 x 104 m3 = 5 x 10-8 ml)
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Recuento electrnico Los contadores electrnicos permiten realizar recuentos de bacterias, levaduras no filamentosas y protozoarios, pero no de hongos y microorganismos filamentosos o miceliares. Estos instrumentos constan bsicamente de dos compartimientos comunicados a travs de un pequeo conducto. En ambos compartimientos hay electrodos que miden la resistencia elctrica del sistema, y como el orificio del conducto

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Caractersticas del crecimiento de los microorganismos es muy pequeo y su resistencia es muy alta, la resistencia elctrica de cada compartimiento es independiente. El principio de funcionamiento de estos instrumentos es. un volumen fijo de una suspensin bacteriana es forzada a pasar desde un compartimiento al otro a travs del pequeo conducto, en un breve intervalo de tiempo. Cuando un microorganismo pasa al nuevo compartimiento, la resistencia de ste se incrementa debido a que la conductividad de la clula es menor que la del medio. Estos cambios en la resistencia son convertidos en pulsos o voltaje y contados. Este tipo de recuento presenta algunos inconvenientes. Ciertas bacterias muy pequeas producen cambios en la resistencia que son comparables al "ruido" generado por la turbulencia que se desarrolla al pasar el fluido por el orificio. No pueden medirse clulas que formen filamentos o agregados o soluciones muy concentradas de microorganismos, debido a que el pasaje de ms de una clula en un breve perodo de tiempo va a ser tomado como una clula ms grande. Es comn la obstruccin del orificio por microorganismos muy grandes.

b. Mtodos indirectos
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Recuento de viables en placa Los mtodos de recuento de nmero de clulas vistos hasta ahora (los directos) no distinguen entre clulas vivas y muertas. En muchos casos conviene contar las clulas vivas, y esto en laboratorio se suele hacer mediante el recuento de viables. (Una clula se define como viable cuando, colacada en un medio adecuado, es capaz de dividirse y dar descendencia). El mtodo habitual de lograr esto es sembrar pequeas alcuotas de diluciones adecuadas de un cultivo original sobre placas de Petri con medio slido (con agar). Cada clula viable dar origen a una colonia visible despus del tiempo adecuado de incubacin. Contando las colonias visibles, teniendo en cuenta la dilucin de la que proceden y el volumen de alcuota utilizado, es fcil deducir el nmero de clulas viables en la suspensin original. Especificaciones: Para minimizar los errores estadsticos de muestreo, se recomienda sembrar 5 placas de cada dilucin; Hay que usar pipetas nuevas en cada dilucin; Contar las placas donde existan entre 50 y 300 colonias. Como no se puede garantizar que cada colonia no proceda de ms de un individuo (y esto es especialmente cierto para bacterias que forman agrupaciones de 2 o ms clulas), el recuento se refiere no a "clulas viables reales" sino a "unidades formadoras de colonia" (UFC). Por lo tanto, una UFC corresponde,

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Tema 16 como mnimo, a una bacteria, pero sobre todo en bacterias con agrupaciones, la medida por siembra en placa infravalora el nmero real de individuos, porque cada UFC puede corresponder a dos o ms individuos que estaban juntos al ser sembrados en la placa.
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Recuento sobre filtros Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se hace pasar un gran volumen de suspensin a travs de una membrana de nitrocelulosa o de nylon estriles (con un dimetro de poro que retiene las bacterias pero permite el trnsito de sustancias). Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo slido. Las colonias se forman sobre el filtro a partir de las clulas retenidas. Dichas colonias se cuentan, deducindose la concentracin original de viables en funcin del volumen de suspensin que se hizo pasar por el filtro.

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Caractersticas del crecimiento de los microorganismos

ESQUEMA

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CARACTERSTICAS DEL CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS


Se entiende por crecimiento microbiano el aumento del nmero de microorganismos a lo largo del tiempo. No debe confundirse con ciclo celular, que es el proceso de desarrollo de una nica clula, ya que con crecimiento se est refiriendo al demogrfico de una poblacin.

Concepto de cultivo puro Crecimiento microbiano en medio lquido


Fase lag o de adaptacin o latencia Fase exponencial o logartmica Fase estacionaria Fase de muerte

Crecimiento microbiano en medio slido


Las fases, parmetros y cintica de crecimiento discutidas para el caso de los cultivos lquidos se presentan tambin en cultivos slidos. La cintica de crecimiento, en este caso, se puede estudiar siguiendo la evolucin del nmero de clulas viables por unidad de superficie o por unidad de masa.

Expresin matemtica del crecimiento MEDIOS DE CULTIVO PARA CRECIMIENTO Y AISLAMIENTO PRIMARIO
Los medios de cultivo son mezclas ms o menos complejas de sustancias qumicas y/o productos naturales (protenas, sangre, suero, etc.) capaces de soportar el crecimiento de los microorganismos. El objetivo es el aislamiento de los diferentes microorganismos para su identificacin y realizacin de pruebas complementarias.

Tipos de nutricin
Los organismos fotosintticos y los que obtienen energa por oxidacin de compuestos inorgnicos suelen usar generalmente CO2 como fuente nica o principal de carbono (auttrofos).

Factores de crecimiento
Factores orgnicos Factores minerales

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Esquema 16

Factores ambientales
Agua Tensin superficial pH Oxgeno Potencial de reduccin Temperatura

Composicin Elementos y factores fsico-qumicos CARACTERSTICAS Y CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Clasificacin
Por su consistencia
Medios lquidos Medios slidos Medios semislidos

Por su origen
Medios naturales Medios sintticos o definidos Medios semisintticos

Por su composicin
Medios comunes Medios enriquecidos

Por su utilidad
Medios de enriquecimiento Medios selectivos Medios de diferenciacin Medios de multiplicacin Medios de transporte y conservacin Medios especiales y para anaerobios

Caractersticas de los medios de cultivo habituales


Agar-sangre Agar chocolate

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Caractersticas del crecimiento de los microorganismos Agar Meller-Hinton Caldo tioglicolato Caldo comn (TSB) Agar Mc Conkey Agar de Hektoen Medio de Thayer-Martin Caldo de cerebro-corazn (BHI) Agar EMB Agar Cled Agar S-S Agar Schaedler Medio de Bordet-Gengou Medio Brucella Agar Manitol salado (Chapman) Agar-V Medio Lowenstein-Jensen Medio de Butzler Medio Skirrow Medio de Roiron

Aislamiento de parsitos Cultivo de virus


Propiedades fsicas
pH y capacidad tamponadora Temperatura

Composicin
Soluciones salinas equilibradas (BSS) Aminocidos Vitaminas Glucosa Otros suplementos orgnicos de bajo peso molecular Hormonas y factores de crecimiento (suero) Antibiticos y antifngicos

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Esquema 16 Principales medios empleados y sus aplicaciones


Medio Basal de Eagle (BME) Medio Mnimo Esencial de Eagle (MEM) R.P.M.I. 1640 Modificacin de Iscove del medio DMEM (IMDM) McCoy 5A Medio 199

Medios de cultivo de hongos


En lneas generales, todos los medios de cultivo utilizados en micologa contienen los nutrientes suficientes para asegurar el desarrollo de los hongos (carbono, nitrgeno, vitaminas, oligoelementos, etc.). El pH, ligeramente cido, facilita el crecimiento de los hongos e inhibir al mismo tiempo el desarrollo de otros microorganismos.

Medios para aislamientos primarios


Medio Sabouraud dextrosa (SAB) Medio Sabouraud con Cloranfenicol y Gentamicina (SAB G+C / SABHI G+C)) Medio BHI y 10% de sangre de carnero (BHI sangre) Medio BHI con Cloranfenicol, Gentamicina, Cicloheximida y 10% de sangre de carnero (BHI sangre C+G+C)

Medios para aislamientos especiales


Medio de patata Medio de arroz Medio de Czapek Medio de Alpiste Medio Chromagar Cndida

Preparacin medios slidos y lquidos


Agar Azcares Extractos Peptonas Fluidos corporales Sistemas amortiguadores Indicadores de pH Agentes reductores. Agentes selectivos

Medios slidos
Disolucin del medio de cultivo deshidratado Ajuste del pH Esterilizacin

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Caractersticas del crecimiento de los microorganismos


Vertido en placas Tubos de agar inclinado

Medios lquidos Consideraciones generales Causas de error en la preparacin de medios de cultivo:


Valor de pH incorrecto Turbidez o precipitacin Oscurecimiento Gel blando Crecimiento bacteriano pobre

Almacenamiento y conservacin
Los medios de cultivo aptos para usar, se almacenan teniendo en cuenta la fecha de caducidad y el nmero de lote.

Distribuidores de medios
La distribucin de los medios de cultivo tanto slidos como lquidos se realiza habitualmente con equipos de distribucin, que pueden ser simples o complejos dependiendo de la actividad del laboratorio.

TCNICAS DE INOCULACIN. AISLAMIENTO Y RECUENTOS CELULARES BACTERIANOS Tcnicas de inoculacin. Aislamiento


Normas generales Medios slidos en placa
Inoculacin en placa Siembra masiva en superficie Siembra en masa

Medios slidos en tubo


Tubos de agar inclinados o en pico de flauta Siembra en picadura

Medios lquidos en tubo


Inoculacin con asa Inoculacin con pipeta de Pasteur Inoculacin con escobilln

Tcnicas de recuento bacteriano


Existen muchas formas de cuantificar el crecimiento microbiano para determinar la velocidad de crecimiento y el tiempo de generacin.

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Esquema 16 Medida de masa celular


Mtodos directos Determinacin del peso hmedo Determinacin del peso seco Determinacin del nitrgeno total Determinacin de un componente caracterstico

Mtodos indirectos Medida de consumo de nutrientes o de produccin de algn metabolito por unidad de tiempo Mtodos turbidimtricos (pticos)

Medida del nmero de individuos


Mtodos directos Recuento microscpico Recuento electrnico

Mtodos indirectos Recuento de viables en placa Recuento sobre filtros

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