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Estudio de la fitoremediacin mejorada de suelos contaminados con plomo mediante la espectroscopia de disociacin inducido por laser Resumen La fitoremediacin conocido popularmente como tecnologa

verde limpia es una nueva tecnologa promisoria usada para eliminar los contaminantes txicos como los metales pesados (HMs) desde el ambiente que adoptan las plantas apropiadas. Este concepto y est siendo adoptado como a una alternativa mtodos econmica ambientalmente amigable los

tradicionales de tratamientos. Este estudio est dedicado al uso de la planta geranio Pelargonium zonale como acumulador o hiperacumulador para la extraccin natural del plomo desde el suelo contaminado artificialmente con diferentes concentraciones de Pb (0, 2000, 5000, 7000 ppm). Tambin ha sido probado el uso del quelato EDTA, que permitira una mayor disponibilidad y captacin del metal por las races de las plantas. La Espectroscopia de Disociacin Inducido por Laser (LIBS) fue usado para seguir las concentraciones de Pb en el suelo y partes cosechables de la planta como los tallos antes y durante y despus de la adicin de plomo en el suelo. Las mediciones de la LIBS fue conducido en forma microdestructiva al enfocar el laser de alta energa Nd:YAG emitiendo 1064 nm, en las muestras del suelo y planta previamente secado, homogenizado y prensado en grnulos. Los espectros de la LIBS emitidos fueron adquiridos por el CCD controlado por una puerta despus de la dispersin en un monocromador y analizado para recuperar las concentraciones relativas del

metal pesado seleccionado en el suelo y plantas en funcin del tiempo despus de una adicin del dopaje o quelator eventual. Encontraron que el EDTA mejora la captacin de Pb desde el suelo aumentando con el tiempo y encontraron una buena correlacin entre los resultados de la LIBS y ICP-OES en el anlisis espectroqumico del tejido de las plantas. 1. Introduccin La contaminacin de los suelos con metales pesados (HMs) es un obstculo serio a las diferentes actividades agrcolas no solo en los pases desarrollados ya desde el inicio de la revolucin industrial [1]. Entre plantas como un los para diferentes la limpieza simple, mtodos de los de remediacin, contaminados y la y fitoremediacin es promisoria, y es una tecnologa basada en suelos contaminantes inorgnicos. Ha surgido desde los aos 1980 [2] mtodo ambientalmente amigable menos costoso que los mtodos tradicionales [3]. El mecanismo de fitoextraccin est basado en el uso de plantas acumuladoras y hiperacumuladoras para extraer o absorber a los metales pesados (HMs) contaminantes desde el suelo contaminado. El transporte del metal pesado ocurre en los tejidos de la planta y finalmente translocado a los tallos de la planta. La eficiencia del proceso de extraccin puede relacionarse a la naturaleza de la planta recomendada o qumicamente mejorado por como: los la quelatores debe de capacidad aadidos algunas crecer la de a propsito. rpidamente de La con planta grandes grandes recomendada cantidades tener caractersticas distintas

biomasa,

capacidad

acumular

cantidades de los metales pesados txicos ambientales en el tejido del tallo [4.5].

El geranio Pelargonium zonale es una planta promisoria usado para la extraccin del plomo de los suelos contaminados. En realidad tiene la capacidad de tolerar y acumular metales pesados (Pb, Cd y Ni) desde el sustrato de crecimiento plantas [6]. En este experimento ha sido seleccionado como metal pesado contaminante al plomo ya que es un metal residual industrial comn que puede dispersarse en el aire, agua, suelo y alimento. Realmente es fcilmente encontrado en la naturaleza en forma oxidada (xidos y sales) que ha sido usado para las extracciones de metales desde casi el principio de la civilizacin. En los suelos, el plomo existe como catin divalente, Pb2+ propenso al intercambio catinico y fenmenos de sorcin/solubilidad asociado a muchos suelos. Por eso, la actividad del Pb2+ libre vara y depende de control de la solubilidad de la fase del plomo [7]. En general, los quelatores son aadidos al suelo contaminado para mejorar la captacin de los metales pesados por las plantas [8-10]. Entre los diferentes quelatores, el cido etilenodiaminotetraactico EDTA es una especie sinttica bien conocida usado para la remediacin altamente eficiente de los metales pesados en medios contaminados con Cd, Ni, Pb, Cu, Zn [11]. La adicin de EDTA al suelo produce la translocacin de Pb dentro de las partes verdes de la planta conocido como tallos [12]. El EDTA es estable en el suelo y forma el complejo Pb-EDTA altamente soluble en agua y por eso est disponible para las plantas [13-15]. La Espectroscopia de Disociacin Inducido por Laser (LIBS) ha sido usada como una tcnica de anlisis de los elementos siendo altamente tolerante respecto a otras

para los gases, lquidos y slidos desde hace ms de dos dcadas y ha sido ampliamente revisado [16,17]. Las aplicaciones de la LIBS utilizan tpicamente un laser de pulsos enfocando la alta densidad de potencia mxima para formar una chispa (para la disociacin) en el medio a ser analizado. La temperatura aumenta hasta valores bastante altos (10,000 a 25,000K en tiempos tan cortos como 10 s) para disociar las molculas a tomos y excitar los electrones de los tomos y iones neutrales formados la pluma del plasma hacia estados electrnicos ms excitados. Cuando se enfra el plasma, los electrones excitados en los tomos y iones retornan a sus estados bsicos desprendindose de la energa originalmente absorbida mediante la emisin de luz a las frecuencias atmicas caractersticas. Cualitativamente, las lneas espectrales atmicas emitidas representan la huella de las especies atmicas presentes en la pluma plasmtica (y consecuentemente proporcional adecuadamente a la [19]. del material de estudiado) las especies de la [18]. atmicas estn Cuantitativamente, la intensidad de las lneas espectrales es concentracin Muchas correspondientes, siempre que todo el proceso es modelado aplicaciones LIBS principalmente concentradas en muestras no-biolgicas como suelos, minas y aleaciones de metales [20]. Recientemente, la LIBS ha sido usada en diferentes aplicaciones biolgicas y ambientales [21], que incluye a la piel humana [22], deteccin e identificacin de bacterias y esporas fungales [23,24] y medicin del carbono total del suelo [25]. En la investigacin actual, la LIBS es usada como una tcnica rpida para monitorear la contaminacin de la planta y suelo incorporado a las plntulas de geranio. Esas plantas fueron probadas como hiperacumuladores con y sin adicin de

EDTA como quelator eficiente para mejorar la extraccin del plomo desde los suelos contaminados. 2. Experimento El geranio P. zonale, cortados a un mes y medio de edad fueron colocados en macetas de plstico (7 x 10 x 10 cm) conteniendo 60 gr del suelo contaminado artificialmente. El suelo fue previamente dopado con acetato de plomo trihidratado (C2H3O2)2-Pb-3H2O como fuente de plomo. El plomo fue aadido al suelo con tres concentraciones diferentes (2000, 5000, 7000 ppm), y para la comparacin mantenido al grupo del testigo con la concentracin natural del Pb (6.5 ppm). Cada grupo fue repetido por triplicado. Todos los grupos fueron duplicados durante la aplicacin sucesiva de EDTA. El crecimiento de las plantas probadas fue seguido diariamente para diferenciar morfolgicamente entre las plantas estresadas y no-estresadas. Cuatro das despus de la plantacin fue aplicada una concentracin de 5 mmol/kg de EDTA a la mitad de los grupos. 2.1. Equipo experimental de la LIBS En el trabajo actual ha sido usado un equipo experimental normal para las mediciones de la LIBS: como es completamente descrito en todas partes [26], aqu solo es descrito brevemente. La fuente de laser es Nd:YAG desde el Sistema Quanta (modelo Handy) que emite 1064 nm. En el rgimen de un solo pulso aqu adoptado, solo es emitido un disparo de laser con un intervalo de tiempo de 8 ns y la energa es ajustada en el rango de 1-800 mJ/pulso. La energa del laser emitido por pulso puede controlarse finamente cambiando el alto voltaje de la lmpara de descarga, pero la nica

desventaja

es

un

cambio

ligero

(<300

ns)

en

la

sincronizacin del pulso que por otra parte es eliminado mediante el uso de un activador ptico. Una seal desde el fotodiodo del dentro del de la cavidad de laser del fue laser proporciona mediante el un sincronismo del activador con el pulso del laser. El perfil tiempo pulso medido fotodiodo unido a un osciloscopio LeCroy 9534C y monitoreada la energa con un joulmetro (GenTec ED100 y ED200). El rayo del laser fue enfocado por las lentes (f=25 cm) sobre la muestra colocada en un sujetador con una plataforma para la traslacin. La huella del laser en la superficie de la muestra fue ajustada cambiando la altura del sujetador. Puede alcanzar su valor mximo en una posicin de enfoque donde la mancha del laser tiene un dimetro de casi 300 m (rea superficial de 6 x 10-4 cm2). La radiacin del plano focal puede alcanzar un mximo de 70 GW/cm2, pero fueron usados valores menores en un orden de magnitud menor para evitar un severo quemado de las muestras biolgicas aqu examinadas. Un cambio pequeo en geometra de las pticas de recoleccin introducido agujereado laser. respecto para al equipo al la anteriormente receptor usado con pulso la fue un de reemplazar para biaxial del

monoaxial: la emisin del plasma es recolectado por espejo aluminizado el transmisin del rayo Entonces condensador enfoca seal

hacia un haz de fibra ptica. Despus de la recoleccin, la emisin del plasma es dirigido al monocromador, acoplado a un CCD (Andor Instaspec IV) Intensificado capaz de controlar la puerta en sub-microsegundos y considerar para resolver el tiempo y mediciones cinticas. El sistema completo de deteccin compuesto por el ICCD, fibra ptima y monocromador tiene un rango espectral til de casi 20 nm y una resolucin

de

casi

0.06

nm

532

nm

cuando

es

operado

con

1200

surcos/mm de la reja. Las mediciones de la LIBS fueron realizados enfocando los pulsos de la energa del laser de 80 mJ sobre la superficie de la muestra. Los datos 20 de un solo disparo del fueron estudio adquiridos en diferentes puntos de la muestra y promediado sucesivamente (hasta disparos). Despus cintico en la lnea seleccionada del plomo, el retardo e intervalo optimizado de la puerta fue fijado en 5 s y 15 s, respectivamente. La incorporacin fue realizada en cada pico resuelto presente en el espectro y la sustraccin del fondo fue logrado usando el rango de longitud de onda casi libre desde las lneas de emisin. La regin espectral examinada vara desde 392 a 413 nm; dejando aparte la lnea de Pb en 405.78 nm, y las caractersticas principales all observadas son apropiados al Ca+, Al, Mn, K y Sr+. Ha sido intentado resultados diferentes procedimientos en de normalizacin los sin satisfactorios reducir errores

estadsticos. En realidad, debido al largo retardo desde el pulso del laser, era insignificante la raz cuadrada media de la intensidad de la seal del fondo, y la normalizacin respecto al fondo estuvo introduciendo un error ms grande que las fluctuaciones estadsticas relacionado a la energa del laser. Para compensar la posible falta de homogeneidad de la muestra encontrado tpicamente en los organismos vivos y especialmente encontrados en las muestras de la planta, intentaron hacer normalizaciones internas [26] pero ninguno de ellos era apropiado para reducir la dispersin de los datos. Aunque esas tcnicas de normalizacin han sido muy tiles en otros casos por ejemplo para el anlisis de las

muestras, no sorprende que ahora no sea exitoso, entonces la intensidad adicional. relacionada probablemente Sr). El patrn del suelo dopado con plomo estuvo disponible para construir las curvas de calibracin para el anlisis de datos pero la matriz no era la misma que para las plantas, y los datos preliminares indicaron que podra ser necesario corregir los parmetros del plasma para obtener los datos cuantitativos. No se han hecho intentos en el anlisis de datos cuantitativos ya que la nica regin espectral monitoreada era muy angosta para obtener los parmetros del plasma. Las mediciones de la LIBS solo fueron realizadas para monitorear un gran conjunto de las muestras, evolucin de la concentracin del plomo desde el suelo contaminado hasta la planta y no para lograr los valores absolutos de la concentracin Espectroscopio verificados de Emisin independientemente ptica con el mediante el Plasma Acoplado de Una a la la LIBS fue monitoreado de los del sin esa en otros procesamiento falla la est planta posible diferente explicacin a todos

distribucin

plomo

elementos

considerados detectados en el mismo rango espectral (K, Mn y

Inductivamente (ICP-OES). 2.2. Preparacin de la Muestra Aunque las seales de la LIBS llevan informacin sobre la recoleccin del Pb desde el suelo que puede obtenerse en las hojas fresca y an in vivo a la mxima energa disponible del laser, la distribucin de metales no-homognea intensa en el espacio observado dentro de las diferentes partes y hojas [27,28] no recomienda realizar esta clase de mediciones con el propsito de verificar la capacidad de

fitoremediacin de las plantas examinadas. Para recolectar los datos estadsticamente significativos, el muestreo tuvo que lograrse promediando las diferentes partes de la planta, lo que requiri algunas pocas preparaciones adicionales de la muestra para el anlisis de la LIBS. Las muestras del suelo y planta fueron recolectadas despus de 1 y 2 semanas del momento de la plantacin. Las muestras de la planta fueron secadas a 80C por 3 hr, molido para evitar la distribucin no-homognea del plomo a lo largo de las diferentes partes de la planta, y finalmente prensado en pastillas para ser analizado por la LIBS (6 mm de radio, 5 mm de espesor). Las muestras del suelo recolectado desde las macetas donde crecieron las plantas fueron secadas al aire, molido para obtener una muestra homognea y prensado para formar grnulos del mismo tamao para el anlisis de la LIBS. La ICP-OES tambin para fue utilizada como de de la de una la referencia muestra, fue cido cido cuantitativa 95C y algunos La anlisis

recolectada las muestras de la planta, secado durante 6 hr a homogenizado. con el 1200) (HNO3), disolucin de los muestra realizado (Milestone ntrico sistema cido digestin Reactivos microondas y

mediante

Suprapure:

perclrico

(HClO4)

fluorhdrico (HF) con una relacin de 5:1:1, y las muestras fueron finalmente solubilizadas y formado hasta 50 ml con HCl 0.5 M. Los elementos fueron determinados por la ICP-OES usando al Perkin Elmer OPTIMA 2000. La precisin del anlisis elemental fue controlada al incluir las muestras duplicadas y CRM (Materiales de Referencia Certificados) en que la desviacin estndar fue considerada satisfactoria. Las mediciones de la ICP-OES fueron realizadas en 2

muestras

por

cada

concentracin

de

plomo.

Notar

que

en

teora, el procedimiento aplicado en la recoleccin de los datos de la LIBS permite examinar una cantidad mucho mayor de muestras que la ICP-OES con el consecuente mejoramiento en la estadstica en el caso de distribuciones nohomogneas. Los patrones de calibracin fueron preparados con el mismo procedimiento que las muestras. 2.2.1. Procesamiento de los Datos y Anlisis Estadstico Las diferencias en los diferentes parmetros medidos fueron analizados con la prueba del ANVA de una va (P=0.05) entre los promedios. Las barras de error fueron calculados como error estndar ( desviacin estndar). 3. Resultados y discusin El Pelargonium sp es considerado una planta tolerante al Pb adems de las plantas bien conocidas para la fitoremediacin como el girasol y mostaza hind [5]. Los resultados obtenidos confirman la aptitud del geranio para tolerar la alta concentracin del plomo. En realidad solo a 7000 ppm murieron el 50% de las plantas. Para los menores niveles de plomo (2000, 5000 ppm) crecieron bien las plantas. Ha sido examinado los espectros de la LIBS de las muestras de plantas con y sin plomo. La concentracin de Pb fue calculado usando la lnea de intensidad espectral de Pb de 405.78 nm como es descrito en la parte experimental. Despus del tratamiento del EDTA, las concentraciones de Pb en los tallos y suelo aumentaron linealmente al aumentar las cantidades aadidas de plomo al suelo. La figura 1 muestra una buen resultado de la relacin lineal (R2=0.99).

Fig. 1. Correlacin lineal de la intensidad del Pb de la LIBS con las diferentes concentraciones de Pb detectado en las hojas de plantas cultivado con tres niveles de Pb.

Fig 2. Concentracin del plomo obtenido por la LIBS medido en las muestras del suelo recolectado despus de 2 y 3 semanas del tiempo de plantacin. A) Sin EDTA, B) con EDTA, en funcin del tiempo despus del dopaje y de una concentracin aadida del dopante.

Las Figs. 2 y 3 resumen los resultados principales de la investigacin actual, con las muestras del suelo y planta examinado a 2 y 3 semanas despus del dopaje con el plomo. En cada caso es comparado los resultados obtenidos con y sin adicin de EDTA. Para las muestras del suelo, aument la concentracin del plomo el al aumentar la el nivel de Pb aadido al suelo. a Los la aumentos fueron ms pronunciados en el grupo que no contuvo EDTA, diferencia podra estar relacionada extraccin ms eficiente de la planta en presencia de EDTA. Al comparar la Fig. 2 A y B, el efecto del EDTA parece menos pronunciado en la 3ra semana, aunque an es observado una mayor eficiencia en presencia del quelator. Para las muestras de Pb de la planta, podra del aumentar dopaje la del concentracin versus concentracin

suelo. Notar que cada concentracin de dopaje en cada suelo, el efecto observado de la fitoremediacin era la eliminacin de la concentracin real del plomo en el suelo. Un aumento en el contenido de plomo en las plantas es observado en todas las plantas examinadas, y este resultado concuerda con las investigaciones anteriormente publicadas [13,25].

Fig. 3. Concentracin de plomo obtenido por la LIBS medido en los tallos del pelargonium zonale en las muestras recolectadas despus de 2 y 3 semanas de plantacin. A) sin EDTA, B) con EDTA. El eje y representa la concentracin de Pb aadido al suelo como dopante que respectivamente fueron 0, 2000, 5000 and 7000 ppm.

Las intensidades de la LIBS medidos despus de 2 semanas es ms bien bajo y no es observada una diferencia significativa con la adicin de EDTA. Por el contrario, el panorama es ms claro despus de un tratamiento ms largo, cuando es ms detectable el efecto del EDTA del aumento del contenido de plomo en las muestras de plantas. Notar que la intensidad del plomo en las plantas con la LIBS es menor al suelo, este no es un dato significativo ya que el efecto diferente de la

matriz puede ser parcialmente responsable de eso.

Cuadro 1. Concentraciones de Pb detectado en los tallos del Pelargonium zonale recolectado despus de 3 semanas desde el momento de la plantacin con la tcnica del ICP.

Pb en los tallos de la planta Pb en el suelo (mg/kg) 2000 5000 7000 Sin EDTA 54 478 672 (mg/kg) Con EDTA 257 727 2291

Fig. 4. Concentracin de Pb por los datos de la LIBS versus ICP en los tallos de la planta recolectado despus de 3 semanas desde el tiempo de la plantacin sin aplicacin de EDTA.

Sin embargo, los datos muestran que los sistemas de la LIBS pueden detectar una baja concentracin de plomo en las muestras de la planta extrado desde el suelo y observar el mejoramiento de la eficiencia debido a la adicin del EDTA despus de 3 semanas. Ha sido confirmada la eficiencia del EDTA como quelatante para la captacin de Pb al formar el complejo Pb-EDTA [1214]. Los resultados actuales tambin muestran que el proceso de fitoremediacin comienza pronto y puede detectarse claramente el efecto de la adicin del quelator dentro de las

2 semanas en los suelos y 3 semanas en las plantas debido a la captacin y estado de translocacin. Cuando considera la evolucin del tiempo, es evidente desde los datos en las Figs. 2 y 3 que al aumentar el tiempo de extraccin del plomo por los tallos de la planta disminuye la concentracin de plomo en el suelo. Esta conducta es normal ya que la fitoremediacin es una tecnologa de largo plazo explicado por el factor del tiempo, afectando el xito del proceso de remediacin. En los procesos reales de campo, el tiempo necesario vara desde 1-20 aos dependiendo del tipo y magnitud de la contaminacin del metal, la duracin de la poca de crecimiento, y eficiencia de la eliminacin por las plantas [5, 27]. El monitoreo de la LIBS ha sido completado por el anlisis de la ICP-OES realizado para algunas muestras de la planta. Los resultados mostrados en el Cuadro 1 indican que las hojas tienen la misma tendencia en absorber el plomo sin aplicar el EDTA, la cantidad de plomo extrado es mucho mayor en presencia de EDTA. La Fig. 4 ilustra una buena correlacin entre las tcnicas analticas usadas que apoya el uso de la LIBS para analizar las muestras de la planta. La ventaja de la LIBS respecto a la ICP-OES es la posibilidad de una determinacin rpida en el lugar para las contaminaciones elementales del suelo, y requiere poco pretratamiento para las muestras de la planta y la posibilidad de examinar una gran cantidad de las muestras. En este caso, el ltimo punto tiene una importancia especial, dando una importancia estadstica al anlisis que de otro modo sufrira una gran variabilidad en los materiales biolgicos que pueden producir los datos dispersados difciles de ser interpretado.

4. Conclusin Los experimentos actuales en la maceta seguido por el anlisis de la LIBS han confirmado que el uso de la EDTA como quelator mejora la extraccin de Pb con el P. zonale. La planta examinada probada es un candidato ideal a usar para la fitoextraccin contaminados, del teniendo metal en pesado el desde factor los suelos del cuenta apropiado

tiempo an sin la adicin del quelator. Ha sido demostrado que la tcnica explotada por la LIBS es rpido y exacto para seguir cualitativamente al fenmeno de fitoremediacin elemento (en al examinar caso y el las al suelo en el lugar y la con el extraccin de las plantas. Los datos sobre la composicin del este plomo) fueron obtenidos para seguir suficiente velocidad estadsticas

proceso involucran la recoleccin del metal pesado por las plantas. La posibilidad del anlisis cuantitativo para las muestras de la planta, como en otros casos depende de la disponibilidad apropiados laboratorio contaminacin monitorear naturaleza. un la para los patrones las con curvas de matrices de semejantes Los la construir la los gran calibracin. la LIBS una de

datos de la ICP-OES pueden ser sugeridos como una tcnica de para de calibracin metales grupo pesados de sobre clase

especfica de la planta. En cualquier caso, la LIBS permite muestras, promediando debido a la efectivamente posible no-homogeneidad