ANALISIS KARBOHIDRAT DAN VOLATIL ASAM LEMAK MENGGUNAKAN HPLC UNTUK MEMANTAU PRODUKSI PERMENTASI BIOHIDROGEN.

Hidrogen dapat diproduksi dari material yang terbaharukan melalui proses biological atau sering disebut dengan proses fermentasi anaerobic. Proses fermentasi anaerobic terdiri dari 3 tahap utama : hidrolisis, acidogenesis, dan metanogenesis. Tahap pertama, bakteri hidrolitik mengkonversi substrat yang komplek menjadi lebih sederhana, polimer karbohidrat menjadi monomer gula yang sederhana. Selanjutnya pada tahap acidogenesis, larutan dihasilkan dari tahap sebelumnya dikonversikan menjadi komponen yang umum, seperti volatile asam lemak, hydrogen, dan karbon dioksida. Tahap yang terakhir adalah pengkonversian H2 dan asam asetik menjadi metana dan karbon dioksida yang dilakukan oleh metanogenik archaea. Pada umumnya, analisis karbohidrat dan volatile asam lemak dalam medium fermentasi anaerob masing-masing menggunakan metode kolorimetrik dan gas kromatografi. Metode kolorimetrik menghasilkan jumlah total karbohidrat yang constant, tetapi tidak bisa sulit untuk menghitung karbohidrat yang berbeda-beda. Pada kromatografi gas, merupakan metode lama untuk menentukan volatile asam lemak. Untuk itu digunakan HPLC dengan 2 detektor, yaitu detector indek bias (untuk karbohidrat) dan detector UV (untuk volatile asam lemak). Adapun mekanisme percobaannya adalah : 1. Persiapan sampel - Konsentrasi total volatile lemak padat yang ada pada kotoran anaerobic adalah 45 g/L. - Kotoran anaerobic disentrifugasi selama 5 menit pada 3000rpm. - Supernatant dimasukkan ke fermentasi bath untuk validasi sebanyak 100 mL dalam botol glas dengan penyumbat untuk menghindari kontak langsung dengan udara selama 120 jam. - Media kultur yg digunakan sebanyak 52 mL mengandung 36,5 mL sukrosa 10 g/L (substrat) dan 1,5 mL larutan nutrient. - pH media 5,5 0,1 merupakan pH optimum untuk memproduksi H2. - Botol glas dibersihkan dengan gas N2 untuk memastikan lingkungan anaerobiknya. - Dimasukkan ke dalam rotary shaker pada 35oC dan 100 rpm. - Sampel cair disentrifugasi pada 3000 rpm selama 5 menit supernatant u/ analisis. - Supernatant disaring dengan menggunakan 0,22 m penyaring Millipore sebelum diinjeksikan ke dalam HPLC. 2. Kondisi kromatografi - Analisis dilakukan pada suhu 55oC di bawah kondisi isocratic. - Fase gerak mengandung larutan H2SO4 0.005 mol/L. larutan ini disaring menggunakan 0.45m membran Millipore sebelum digunakan. - Laju alir 1.0 mL/menit dan volume injeksi 20L. - Menggunakan kolom HPX-87H Aminex dengan katrik guard. - Variasi suhu oven adalah 60oC(2 min)-80oC/min -100oC(12 min). - Suhu injector 150oC dan suhu detector 250oC. - Gas nitrogen digunakan sebagai gas pembawa.

Hasilnya : Digunakannya RI detektor adalah untuk mengukur kadar karbohidrat (sukrosa, glukosa dan fruktosa) dengan detesi terbaik pada konsentrasi di bawah konsentrasi 100 mmol/L. Namun, ada juga beberapa volatile asam lemak yang terdeteksi oleh RI detektor. Begitu juga dengan fruktosa yang terdeteksi oleh UV detektor. Karbohidrat dapat dideteksi oleh RI pada panjang gelombang 210nm.

Detektor indeks bias merupakan detektor yang juga luas penggunaannya setelah detektor ultraviolet. Dasarnya ialah pengukuran perbedaan indeks bias fase gerak murni dengan indeks bias fase gerak yang berisi komponen sampel, sehingga dapat dianggap sebagai detektor yang universal pada HPLC. Detektor ini kurang sensitif dibanding dengan detektor ultraviolet dan sangat peka terhadap perubahan suhu.
Prinsip deteksi melibatkan pengukuran perubahan indeks bias tembusan kolom yang melewati arus-cell. Semakin besar perbedaan RI antara sampel dan fase gerak, semakin besar ketidakseimbangan yang terjadi. Dengan demikian, kepekaan akan lebih tinggi untuk perbedaan lebih tinggi di dalam RI antara sampel dan fase gerak. Di sisi lain, dalam campuran kompleks, komponen sampel dapat menutupi berbagai nilai-nilai indeks bias dan beberapa mungkin cocok dengan fase gerak, menjadi terlihat detektor. RI detektor adalah alat diferensial murni, dan perubahan dalam komposisi eluent

memerlukan rebalansing detektor. Faktor ini sangat membatasi aplikasi detektor RI dalam analisis yang memerlukan elution gradien, yang mana komposisi fase gerak yang diubah selama analisis berefek pada pemisahan. Skema optik detektor defleksi ditampilkan dalam di bawah. Detektor ini didasarkan pada prinsip defleksi refractometry, dimana defleksi cahaya sinar berubah ketika komposisi dalam sel-aliran sampel berubah yang berkaitan dengan sisi referensi (sebagai contoh eluting bergerak melalui sistem). Ketika sampel tidak hadir di dalam sel, cahaya melewati kedua sisi difokuskan pada sensor cahaya (biasanya resistor foto). Sebagai contoh elutes yang melalui satu sisi, mengubah sudut refraksi. Hal ini mengakibatkan perubahan dalam foton yang jatuh pada detektor yang yang tidak seimbang. Sejauh mana ketidakseimbangan (yang dapat berhubungan dengan konsentrasi sampel) direkam pada perekam bagan strip.

Keuntungan dari jenis detektor adalah: (1) respon universal; (2) rendah kepekaan terhadap kotoran dan gelembung air dalam sel; dan (3) kemampuan untuk menutupi seluruh indeks bias berkisar dari 1.000 sampai 1.750 RI dengan sel tunggal, mudah seimbang. Kerugiannya adalah sensitivitas yang relatif rendah, tidak sesuai untuk elusi gradien, dan juga memerlukan kontrol suhu yang ketat 0.001oC untuk beroperasi pada kepekaan tertinggi.