Instructivo tcnico para Recuento de Microorganismos Aerobios Mesfilos Mediante Tcnica Petrifilm AOAC Official Method 990.12.

INSTRUCTIVO TCNICO PARA RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESFILOS MEDIANTE TCNICA PETRIFILM AOAC OFFICIAL METHOD 990.12

Tabla de Contenidos Contenido 1 2 3 4 Pgina

Objetivos y Alcance .......................................................................................................................... 2 Referencias y Documentos Relacionados ....................................................................................... 2 Definiciones y Abreviaturas .............................................................................................................. 2 Requisitos ......................................................................................................................................... 3 4.1 4.2 4.3 4.4 Requisitos infraestructura equipos, materiales y reactivos .................................................... 3 Requisitos de personal........................................................................................................... 4 Requisitos especficos............................................................................................................ 4 Medios de verificacin de requisitos ...................................................................................... 5

Anlisis/Ensayo ................................................................................................................................ 5 5.1 5.2 5.3 5.3.1 5.3.2 5.3.3 5.4 5.4.1 Captacin y envo de la muestra............................................................................................ 5 Recepcin y manejo de la muestra ........................................................................................ 5 Metodologa............................................................................................................................ 6 Caractersticas del procedimiento de ensayo.................................................................... 6 Preparacin de la muestra................................................................................................. 6 Protocolo de trabajo ........................................................................................................... 7 Clculo y expresin de los resultados.................................................................................... 7 Clculo e informe de los recuentos en placa..................................................................... 7

6 7 8

Registro y envo de resultados ......................................................................................................... 8 Supervisin a los laboratorios acreditados....................................................................................... 8 Anexos.............................................................................................................................................. 8

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OBJETIVOS Y ALCANCE

El objetivo del instructivo es dar a conocer los requisitos especficos para la acreditacin de laboratorios por parte del SAG para la realizacin del anlisis/ensayo para Recuento de Microorganismos Aerobios Mesfilos Mediante Tcnica PETRIFILM AOAC Official Method 990.12. Del mismo modo, en este documento se estipulan instrucciones tcnicas que deben cumplir los laboratorios para que obtengan y mantengan tal acreditacin. Este procedimiento aplica para muestras de piel de cuello de ave, las cuales corresponden a muestreos microbiolgicos oficiales tomados desde plantas de faenamiento de productos pecuarios de exportacin.

REFERENCIAS Y DOCUMENTOS RELACIONADOS

Mtodo Oficial AOAC 990.12: Recuento de Microorganismos Aerobios Mesfilos en alimentos, mtodos del film seco rehidratable. A.O.A.C. Subchapater 2: Chilled, frozen, precooked or prepared foods, and nutmeats, Microbiological Methods, Official Method 966.23 A (m). Manual de Procedimientos para Muestreo Microbiolgico Oficial en Carnes faenadas en Mataderos de Exportacin. SAG. Chile 2005. Programa de Control Microbiolgico de carnes faenadas para exportacin. SAG. Chile 2005. Norma Chilena Oficial NCh-ISO 17025.Of. 2001. Norma Chilena Oficial NCh 2726.Of. 2002. Norma Chilena Oficial NCh 426/2 Of. 97. Actas Reuniones entre Subdepartamento Laboratorios Pecuarios y Laboratorios habilitados. Laboratory Biosafety Guidelines, Medical Research Council, Canad 1999.

DEFINICIONES Y ABREVIATURAS
Documentos emitidos por profesionales del SAG: Protocolo de Toma de Muestra E.coli. Programa de Reduccin de Patgenos, Protocolo de Toma de Muestras y Resultados Laboratorio. Recuento de microorganismos Aerobios Mesfilos. United States Department Agriculture.

Protocolo Oficial SAG

RAM USDA

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FSIS SAG ISO AOAC SAC MVO INN

Food Safety and Inspection Service. Servicio Agrcola y Ganadero. International Organization for Standardization Association of Official Analytical Chemists Sistema de Aseguramiento de la Calidad. Mdico Veterinario Oficial del SAG. Instituto Nacional de Normalizacin.

4
4.1
i)

REQUISITOS
Requisitos infraestructura equipos, materiales y reactivos
Infraestructura: Infraestructura requerida para llevar a cabo las actividades contempladas en el alcance, cumpliendo lo sealado en los puntos correspondientes de la NCh-ISO 17025.Of. 2001. Equipamiento bsico para realizar las actividades comprendidas en el alcance de la habilitacin, de acuerdo a requisitos sealados en NCh-ISO 17025.Of. 2001. El Laboratorio debe poseer infraestructura adecuada a un nivel Bioseguridad 2, de acuerdo a Laboratory Biosafety Guidelines, Medical Research Council, Canad 1999.

ii) Equipos, instrumentos y materiales: Stomacher. Bolsas para Stomacher estriles. Material estril para contener los volmenes de Diluyente Butterfields Tamponado necesarios para el anlisis. Pipetas graduadas estriles y/o micropipetas. Probeta estril. Tubos de ensayo estriles. Balanza. Etiquetas (identificacin de muestras) o lpiz marcador indeleble. Gabinete de Bioseguridad. Mechero. Vortex o Agitador de Tubos.

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Aplicador Petrifilm. Estufa de Incubacin a 35 C 1C. Contador de colonias o equivalente.

iii) Reactivos, soluciones y medios de cultivo Diluyente Butterfields Tamponado (Official Method 966.23 A (m). Ver punto 2) en cantidad necesaria para procesar las muestras y adems dispensada en 9 ml en tubos de ensayo para las diluciones. Placas Petrifilm 3M, para Recuento de Microorganismos Aerobios Mesfilos dentro del perodo de vigencia.

iv) Estndares Se utilizarn como estndares Cepas ATCC de Escherichia coli (25922), u otra equivalente, la cual ser mantenida y utilizada de acuerdo a lo sealado en la Norma Chilena 2726. Las cepas de trabajo obtenidas a partir de dichas cepas ATCC, sern utilizadas tanto para el control de calidad de los medios de cultivo, como para el control del mtodo de ensayo.

4.2
i)

Requisitos de personal
Segn lo dispuesto en el numeral 4.2 del Reglamento Especfico para la acreditacin de laboratorios de anlisis / ensayo, el Laboratorio debe contar con un responsable tcnico, quien ser la contraparte del SAG, en temas tcnicos asociados a su actividad como laboratorio acreditado.

ii) Contar con personal tcnico y/o profesional que debe cumplir el siguiente perfil: Calificado y capacitado en el uso de procedimientos, instructivos, manuales y otros documentos, tanto en los aspectos de gestin como en las metodologas que se desean acreditar, cumpliendo lo sealado en los puntos correspondientes de la NCh-ISO 17025.Of. 2001. Calificado y capacitado en la realizacin del mtodo Recuento de Microorganismos Aerobios Mesfilos Mediante Tcnica PETRIFILM en el tipo de muestras correspondientes al alcance de la acreditacin. Tales capacitaciones y calificaciones debern ser acreditadas y documentadas mediante los correspondientes certificados.

4.3

Requisitos especficos
El Laboratorio debe poseer documentacin tcnica y de gestin que avale el cumplimiento de NCh-ISO 17025.Of. 2001. Una vez que el laboratorio solicitante obtenga la acreditacin de las tcnicas por el SAG, se le otorgar un plazo de 2 aos para lograr la acreditacin de stas ante el INN.

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4.4

Medios de verificacin de requisitos

De acuerdo al punto 6.1 del Reglamento Especfico para la acreditacin de laboratorios de anlisis/ensayo, los interesados en acreditarse para este anlisis deben presentar junto a su solicitud de acreditacin lo siguiente: i) Un dossier con los antecedentes generales del laboratorio que se solicitan en dicho reglamento.

ii) Un dossier para verificar el cumplimiento de los requisitos establecidos en los puntos 4.1 a 4.3 de este Instructivo tcnico, para lo cual debe adjuntar. todos los documentos que avalen el SAC implementado en el laboratorio y/o que demuestren la acreditacin en NCh-ISO 17025.Of. 2001. todos los documentos tcnicos relacionados con las metodologas a acreditar. La documentacin tcnica deber contemplar como mnimo los documentos sealados en el Anexo N1 y deber ser entregada al momento de realizar la postulacin. El Departamento de Laboratorios y Estaciones Cuarentenarias podr solicitar adicionalmente, si lo estima necesario, otros documentos que acrediten esta condicin. Listado de identificacin de personal tcnico y/o profesional, indicando nombre completo, nmero de cdula de identidad y firma. Ttulo (copia legalizada) y Currculum vitae de cada una de las personas identificadas en el listado anterior. Certificado de capacitacin de los analistas de acuerdo al requisito establecido en el captulo 4.2 ii) de este instructivo.

5
5.1

ANLISIS/ENSAYO
Captacin y envo de la muestra

La captacin de las muestras no es una actividad incluida en la competencia del laboratorio acreditado para este anlisis. Para este tipo de anlisis no se utilizarn contramuestras. La toma y envo de muestras deben ser realizada por el Mdico Veterinario Oficial del SAG (MVO), el cual debe adjuntar las muestras a un Protocolo Oficial SAG, en cuyo documento debe sealar al menos la identificacin de cada una de ellas, el tipo de muestras, la fecha y la hora de la recoleccin de stas. Lo anterior debe realizarse de acuerdo a lo definido en el Manual de Procedimientos para Muestreo Microbiolgico Oficial en Carnes faenadas en Mataderos de Exportacin. SAG, ltima versin vigente.

5.2

Recepcin y manejo de la muestra

La recepcin y manejo de las muestras en el laboratorio debe realizarse de acuerdo a lo sealado en el Manual de Procedimientos para Muestreo Microbiolgico Oficial en Carnes faenadas en

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Mataderos de Exportacin. SAG. Chile 2005. Cabe sealar, la importancia de verificar los siguientes puntos: Temperatura de recepcin (rango aceptado: 4 8 C). Tiempo entre la toma de muestras y la recepcin, ya que DEBEN SER PROCESADAS DENTRO DE LAS 24 HORAS DESDE LA TOMA DE LAS MUESTRAS. Integridad de las muestras. Cantidad suficiente de muestras para el anlisis. Identificacin adecuada. Contenedor con sello SAG intacto. Protocolo fuera del contenedor y con los datos requeridos de acuerdo al Manual anteriormente mencionado.

5.3
5.3.1

Metodologa
Caractersticas del procedimiento de ensayo

Las placas Petrifilm para el Recuento de Microorganismos Aerobios Mesfilos estn diseadas para determinar las poblaciones totales de bacterias aerobias. Se basa en el crecimiento de colonias de la flora aerobia mesfila que lleva la muestra. El diseo de esta placa presenta una pelcula con nutrientes y agentes gelificantes soluble en agua y un indicador rojo de Tetrazolio para brindar un mejor contraste y facilitar el recuento. 5.3.2 Preparacin de la muestra

Piel cuello de ave Aspticamente pesar a lo menos (manteniendo relacin 1:10 con el diluyente) 10 0.1 g de muestra representativa dentro de una bolsa estril Stomacher. Agregar 90 ml de Diluyente Butterfields Tamponado. Esta dilucin es denominada 10-1. No usar tampones que contengan citrato, bisulfito o tiosulfato con las placas Petrifilm, ya que pueden inhibir el crecimiento. Homogenizar la muestra en equipo Stomacher por 1 minuto a velocidad media. Luego depositar 1 ml de esta dilucin de acuerdo a lo descrito en punto 5.3.3. La siembra en duplicado queda a criterio del laboratorio, para lo cual se debe repetir el procedimiento antes descrito. A partir de la dilucin anterior tomar 1 ml y depositarlo en un tubo que contenga 9 ml de Diluyente Butterfields Tamponado. Esta dilucin es denominada 10-2. Con estas 2 diluciones se contina en el punto 5.3.3. En caso de ser necesario, el laboratorio puede realizar ms diluciones sucesivas con el objeto de obtener placas con recuentos contables.

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5.3.3 -

Protocolo de trabajo

Rotular las placas Petrifilm con la identificacin de las muestras y la dilucin correspondiente.

Colocar la placa Petrifilm Recuento de Microorganismos Aerobios Mesfilos en una superficie plana. Levantar el film superior e inocular 1 ml de la dilucin decimal apropiada en el centro del film inferior. Bajar cuidadosamente el film superior encima de la muestra, evitando la formacin de burbujas de aire. Colocar el aplicador con la cara lisa hacia arriba en el centro de la placa. Presionar ligeramente el centro del aplicador para distribuir la muestra uniformemente. Distribuir el inculo por toda el rea de crecimiento del Petrifilm antes de que se forme el gel. No deslizar el aplicador por el film. Sacar el aplicador y esperar al menos un minuto para permitir que solidifique el gel. Por cada dilucin existente siembre en una o dos placas. Incubar las placas en posicin horizontal, cara arriba, en pilas de hasta 20 placas. La incubadora debe estar humidificada Incubar las placas Petrifilm Recuento de Microorganismos Aerobios Mesfilos por 48 3 hrs a 35C 1C.

5.4
-

Clculo y expresin de los resultados

Contabilizar todas las colonias rojas de borde regular, independientemente del tamao o intensidad en el color. El rea de crecimiento circular del Petrifilm es aproximadamente de 20 cm2. Pueden realizarse estimaciones en placas que contengan ms de 300 colonias contando el nmero de colonias en uno o ms cuadrados representativos y obteniendo el promedio. Multiplicar dicho nmero por 20 para obtener el recuento total por placa. Altas concentraciones de colonias en las placas ocasionar que toda el rea de crecimiento se vuelva roja o rosada. Ocasionalmente, en placas demasiado cargadas, el centro de la placa puede carecer de colonias visibles, pero pueden apreciarse muchas colonias pequeas en los bordes. Cuando esto ocurre, diluir ms la muestra para obtener un recuento ms preciso. Algunos organismos pueden licuar el gel, pudindose producir una difusin que oculte la presencia de otras colonias. Si la licuacin del gel interfiere con el recuento, debe realizarse un recuento estimado contando las reas no afectadas. Tras la incubacin, las placas pueden conservarse, para recuentos posteriores, en congelacin a temperaturas bajo o igual a los 15 C por un mximo de una semana, para efectuar el conteo. Esto es slo para casos de emergencia, no se debe establecer como procedimiento rutinario. Clculo e informe de los recuentos en placa

5.4.1 -

Seleccionar las placas que presenten un rango de conteo entre 30 300 colonias.

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Para muestras de piel de cuello, en caso de realizar diluciones en duplicado se deben promediar el N colonias encontradas en ambas placas de la misma dilucin y multiplicar por el inverso de la dilucin. En caso de realizar slo una placa en diluciones consecutivas, registrar el nmero de colonias de cada dilucin, multiplicar por el inverso de la dilucin y luego determinar el promedio del recuento bacteriano entre ambas diluciones. Los recuentos se informarn con 2 dgitos. Cuando el tercer dgito es 5, agregar una unidad al segundo dgito si ste es impar y mantener el segundo dgito si ste es par. Usar ceros para los dems dgitos hacia la derecha. Se informar como UFC/ g. En el caso de valores obtenidos sobre o bajo el rango deben ser informados como Recuento Estimado en Placa (RESP). En caso de recuentos incontables se informar como Muy Numeroso Para Contar (MNPC). En caso de no obtener desarrollo en las placas se debe informar de acuerdo al lmite de deteccin de la tcnica. Ejemplo: < 10 UFC / g Muestras de piel de cuello de ave en dilucin 10-1.

REGISTRO Y ENVO DE RESULTADOS

Los resultados deben ser registrados en el Protocolo Oficial del S.A.G., el cual debe contener la firma y nombre del responsable del laboratorio. El responsable del laboratorio debe enviar los resultados en el Protocolo Oficial del S.A.G. al MVO, este ltimo, una vez que verifique los datos remitidos en el protocolo, despachar cada una de las copias de acuerdo a lo sealado en los Manuales correspondientes (ver punto 2). Cabe sealar, que adems debe mantener una copia de los resultados para sus registros.

7
i)

SUPERVISIN A LOS LABORATORIOS ACREDITADOS

Todo laboratorio acreditado ser supervisado mediante visitas de auditoras de seguimiento al menos una vez al ao.

ii) Los laboratorios debern participar en programas de ensayos interlaboratorios nacionales y/o internacionales, al menos una vez al ao, cuyos resultados debern ser remitidos al Departamento de Laboratorios y Estaciones Cuarentenarias. iii) El laboratorio acreditado deber estar dispuesto a recibir auditoras nacionales y/o internacionales, en el momento que el Servicio lo requiera.

ANEXOS

Anexo N 1: Listado de Documentos Tcnicos. iv) Procedimiento/Instructivo Manejo de Muestras involucrados en el alcance de la acreditacin. v) Procedimiento e Instructivos Preparacin de Medios de Cultivo involucrados en el alcance de la acreditacin.

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vi) Procedimiento /Instructivo Preparacin y Esterilizacin de Material de Vidrio vii) Procedimiento /Instructivo Eliminacin y Descontaminacin de Residuos y Materiales viii) Procedimiento /Instructivo Aseo y Limpieza de Laboratorios ix) Procedimiento /Instructivo Control Biolgico de Esterilidad en Autoclaves. x) Procedimiento /Instructivo de Verificacin de Equipos xi) Procedimiento /Instructivo Control Material de Lavado xii) Procedimiento /Instructivo Control de Calidad Interno xiii) Procedimiento /Instructivo Control de Ambiente xiv) Procedimiento /Instructivo Manejo de Cepas Control xv) Lista Maestra de Equipos e Instrumentos de Medicin involucrados en el alcance de la acreditacin. xvi) Instructivos de Uso de los equipos involucrados en el alcance de la acreditacin. xvii) Programa de Mantencin /Verificacin / Calibracin de los equipos involucrados en el alcance de la acreditacin.

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