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Curso de Boas Prticas Laboratoriais

Preparo, Identificao e Armazenamento de amostras biolgicas


Silene Peres Keusseyan Maio/2011

Centrifugas
Poucos experimentos so realizados sem pelo menos uma passagem pela centrfuga Usadas para separar partculas de uma soluo Em laboratrios de pesquisa biolgica: Sangue Clulas Separao de fases Organelas Isolamento de macromolculas (DNA, RNA, vrus, protenas)

Centrifugao
Qual velocidade? rpm x rfc (g) ? Qual o tipo de separao desejado? Qual centrfuga usar? Que temperatura? Qual o tubo apropriado? Qual o rotor? Como centrifugar

Fora centrfuga
A fora centrfuga relativa (Rcf) cuja unidade o g gerada quando uma partcula ou conjunto de partculas sujeito a um movimento circular de acelerao Rcf (g) = 1,12 x 10-5 x R x N2 R = raio em centmetros N = velocidade de centrifugao em rpm 1 g equivalente acelerao da gravidade na superfcie da Terra

Fora centrfuga

Tipos de centrifugao
Centrifugao diferencial (separao de fases)
Amostras centrifugadas a certa velocidade resultam em sobrenadante e plete (baseada no tamanho das partculas) Tamanho maior sedimenta mais rpido Ex: separao do sangue em elementos figurados e plasma / soro,

Tipos de centrifugao
Centrifugao por gradiente de densidade
Centrifugao de escala zonal Separao de partculas com diferentes densidades Ex: separao de mononucleares por Ficoll-Hypaque Hemcias:1095 densidade, mononucleares 1065 e Ficoll 1077 Utiliza gradiente de meio viscoso

Sangue diludo FicollHypaque

soro plaquetas Mononucleares nuvem Ficoll-Hypaque eritrcitos granulcitos

Centrfugas
Centrfuga de bancada Centrfuga de bancada refrigerada Centrfuga de alta velocidade Ultracentrfuga Microcentrfuga Citocentrfuga

Centrfuga de bancada
Mltiplos fins: peletizar clulas e bactrias, sedimentao de soro, urina, clulas e sangue Suporte oscilante: at 3.800g ou 6.000 rpm Capacidade: normalmente 32 x 5mL ou 16 x 10mL Com ou sem tacometro Controle de tempo Sem freio

Fanem Excelsa Baby mod 206

Centrfuga de bancada refrigerada


Mltiplos fins: peletizar clulas e bactrias, sedimentao de soro, urina,clulas e sangue ngulo fixo 2 tipos de rotores: 28 x 2 mL mx 14500rpm 17400rcf (g) 10 x 10 mL mx 13500rpm 16900rcf (g) Refrigerao : -8 C at +40 C Controle de acelerao/desacelerao (alta para peletizao, baixa para gradientes) Memria para programas Sensor tampa fechada Jouan MR 18.22

Centrfuga de alta velocidade refrigerada


Precipitaes de grandes volumes 2 tipos de rotor (R24A e R12A3) ngulo fixo R24A: 8 x 50mL mx 24000rpm 68900rcf (g) R12A3: 6 x 300mL mx 12000rpm 23800rcf (g) Refrigerao: -20 C at +40 C Controle de acelerao/desacelerao Controle de tempo Sensor tampa fechada
Hitachi Himac CR21

Ultracentrfuga
Sedimentao de macromolculas, ribossomos, vrus... ngulo fixo ou suporte oscilante At 100.000rpm - 800000rcf (g) Tubos tamanhos variveis , Cho ou bancada Programvel Sorvall WX Sempre refrigerada Cmara fechada vcuo (atrito com ar eleva temperatura e diminui velocidade) Programvel

Microcentrfuga
Volumes pequenos, precipitao de clulas (baixa velocidade), retirada de debris, extraes com etanol e minifenol ngulo fixo: mx 14000rpm Capacidade :tubos eppendorf 20 x 2mL Sensor tampa Sem refrigerao

Jouan A14

Citocentrfuga
Produo de monocamada de clulas em rea definida Ex: lminas para deteco de Anca Cytofunnel sada nica ou dupla Programvel Capacidade at 12 cmaras Suporte oscilante:200 a 2000rpm Sensor tampa fechada + tampa de segurana

Cytospin 2 Shandon

Rotor

Tubos
Seleo do tubo adequado: De acordo com o tipo de rotor Evitar vazamento ou perda da amostra (mecanismo de lacre) Assegura compatibilidade qumica (resistncia) Permite fcil recuperao da amostra (transparncia)

Como centrifugar
Conhea as limitaes de velocidade da centrfuga e dos rotores Equilibre todos os tubos com seus suportes, tampas, proteo e pinos Se usar um tubo para equilibrar, encha-o com material similar ao que vai centrifugar - gua = contrabalancear fora do meio Utilize tubos, tampas e suportes apropriados (filme plstico) Preencha os tubos at 1 ou 2 cm da borda Tubos ntegros ( sem rachaduras)

Como centrifugar
Suportes no utilizados podem desequilibrar a centrfuga Materiais infecciosos SOMENTE EM TUBO FECHADO Retire as amostras da centrfuga assim que terminar amostras paradas = plete disperso Centrfugas refrigeradas: feche a tampa no intervalo das centrifugaes (evitar queda de temperatura e condensao) e deixe aberta quando terminar (secar) Limpe com pano macio e hipoclorito/lcool 70% quando acabar de usar

Como equilibrar os tubos


Tubos frente a frente = mesmo peso Microcentrfuga ajuste por volume, no por peso Alta velocidade ou ultra centrfuga pesar tubos em duplas com balana de pratos Suportes de 4 tubos ou mais equilibrar dois conjuntos em balana de pratos e coloc-los frente a frente Suportes no completos = equilibre na diagonal Amostras estreis equilibre o volume dos pares a olho, se necessrio ajustar suportes use lcool 70% fora do tubo Use o mesmo meio que sua amostra para ajustar tubos sem par

Armazenamento de amostras
Tubos e caixas apropriados e identificados

Identificao
Canetas permanentes e durex sobre o escrito para tubos e caixas NUNCA identifique amostras de pacientes pelas iniciais Ex: MCO = Maria Cristina Oliveira quantas ? Todo material coletado pela disciplina, pertence disciplina , no ao ps-graduando Material devidamente identificado pode ser utilizado no futuro

001 LESa SPK 03/05/11

Caixa 1 De 001 a xxx LESa ou protocolo YY NPS ano 2011

Banco de dados
001 LESa SPK 20/07/2004
data coleta N ENSAIO 20/07/2004 1 27/09/2004 2 17/08/2004 3 14/09/2004 4 28/09/2004 5 19/10/2004 6 15/07/2004 7 16/08/2004 8 19/04/2005 9 RG HSP Nome 1058511 Bruna Suzuki Donoso 1485459 Helen Micaela A Aguiar 10068367 Fernando de Souza 10070001 Liliam Bruna O Magalhes 1061544 Juliane B de Oliveira 10099595 Paula Ferreira 10052027 Thiago L de Oliveira 1134111 Isabela C de Souza 10104632 Jaqueline R S Albuquerque SEXO Idade Sledai ETNIA ACR FAN DNAifi DNA EIA CH100/C2 F 14 6 NC 4 PF 1:320 NEG 101 182U/>100% F 6 6 C 9 PF>1:320 NEG 94 161U/67 NEG 50 150 M 16 8 C 5 NEG F 17a 11m 8 C 6 PF 1:80 NEG 81 263/88% F 18a 11m 12 C 7 PF 1:80 NEG 173 234/>100% F 16 13 C 6 PF1:640 NEG 74 <30/43% M 14 16 C 9 PF 1:320 NEG 81 203/100 F 18 14 NC 6 HO >1:640 1/40 505 239/>100% F 11 8 C 5 PG >1:640 NEG 173 277/>100%

Entregue ao orientador ao final da tese

Conservao de amostras

Conservao de amostras
Geladeira: material biolgico temporariamente, reagentes e solues pelo prazo de validade dos mesmos Sangue total: utilizao imediata para ensaios hemodinmicos e dosagens bioqumicas, geladeira por 1 semana* ou -20C somente para futura extrao de DNA Soro ou plasma: -20C por tempo indeterminado (selado) Clulas sempre em soluo de tamponamento para morte celular -70C por tempo limitado, nitrognio lquido (-196 C ) por tempo indeterminado Tecidos ou orgos: -70C

Conservao de amostras
Alquotas
Por que fazer?
Prevenir decomposio por congelamentos e descongelamentos repetidos Prevenir contaminao por mltiplos usos Por convenincia fsica Para economizar tempo no preparo de uma soluo ou tempo de descongelamento

Freezers -20 e -70C


S abra a porta quando necessrio e por pouco tempo Se precisar manipular alguns tubos, retire a caixa do freezer e coloque no gelo enquanto procura Todas caixas ou recipientes colocados no freezer devem estar devidamente ROTULADOS e TAMPADOS Periodicamente descarte material que no for mais utilizar Mantenha um registro da localizao de seus materiais Respeite os espaos No altere localizao de material alheio Providencie descongelamento quando necessrio (s -20C)

UNIFESP Disciplina de Reumatologia


Na Bancada - Manual de iniciao cientfica em laboratrio de pesquisas biomdicas, Kathy Baker, Editora Artmed, 2002 Boas Prticas de Laboratrio , Maria de Ftima da Costa Almeida, Editora Difuso, 2008 Centrifugation: Essential Data, by David Rickwood et al, 1994