NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 5025
2001-12-19

LECHE Y PRODUCTOS LCTEOS. DETERMINACIN DEL CONTENIDO NITRGENO

DE

E:

MILK AND MILK PRODUCTS. NITROGEN CONTENT

DETERMINATION

OF

CORRESPONDENCIA:

DESCRIPTORES:

leche; producto protena.

lcteo;

nitrgeno;

I.C.S.: 67.100.10
Editada por el Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin (ICONTEC) Apartado 14237 Bogot, D.C. Tel. 6078888 Fax 2221435

Prohibida su reproduccin

Editada 2002-01-31

PRLOGO

El Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin, ICONTEC, es el organismo nacional de normalizacin, segn el Decreto 2269 de 1993. ICONTEC es una entidad de carcter privado, sin nimo de lucro, cuya Misin es fundamental para brindar soporte y desarrollo al productor y proteccin al consumidor. Colabora con el sector gubernamental y apoya al sector privado del pas, para lograr ventajas competitivas en los mercados interno y externo. La representacin de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalizacin Tcnica est garantizada por los Comits Tcnicos y el perodo de Consulta Pblica, este ltimo caracterizado por la participacin del pblico en general. La NTC 5025 fue ratificada por el Consejo Directivo del 2001-12-19. Esta norma est sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en todo momento a las necesidades y exigencias actuales. A continuacin se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a travs de su participacin en el Comit Tcnico 311201 Leche y productos lcteos. ALGARRA S.A. ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS S.A. BIOCONTROL S.A. CARULLA VIVERO S.A. CONSEJO NACIONAL DE LA LECHE Y PREVENCIN DE LA MASTITIS CONSEJO NACIONAL LCTEO COOPERATIVA DE LECHEROS DE ANTIOQUIA, COLANTA CHRISTIAN HANSEN CENTRO AGROLECHERO INDEPENDIENTE - HUGO PARDO INDUSTRIA COLOMBIANA DE LECHES S.A., INDUCOLSA INSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIO, ICA INSTITUTO NACIONAL DE VIGILANCIA DE MEDICAMENTOS Y ALIMENTOS, INVIMA LA ALQUERA S.A. LARKIN LTDA MEALS DE COLOMBIA S.A. NESTLE DE COLOMBIA S.A. PARMALAT COLOMBIA LTDA. PROCESADORA DE LECHES S.A., PROLECHE PLASTILENE S.A.

Adems de las anteriores, en Consulta Pblica el Proyecto se puso a consideracin de las siguientes empresas. ASOCIACIN NACIONAL DE INDUSTRIALES ASOCIACIN NACIONAL DE LECHEROS, ANALAC COOPERATIVA DE LECHEROS DE LA COSTA, COOLECHERA FRIESLAND COLOMBIA COLPURAC FRSKALECHE JAIRO PASACHOA INGENIERO DE ALIMENTOS LA CAMPIA S.A. MINISTERIO DE SALUD SECRETARIA DISTRITAL DE SALUD TETRA PAK LTDA. UNIVERSIDAD JORGE TADEO LOZANO

ICONTEC cuenta con un Centro de Informacin que pone a disposicin de los interesados normas internacionales, regionales y nacionales.

DIRECCIN DE NORMALIZACIN

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NTC 5025

LECHE Y PRODUCTOS LCTEOS DETERMINACIN DEL CONTENIDO DE NITRGENO

1.

OBJETO

Esta norma especifica los mtodos para la determinacin del contenido de nitrgeno en la leche y en productos lcteos. 2. TRMINOS Y DEFINICINES

Para los propsitos de esta norma, se aplican los siguientes trminos y definiciones. 2.1 Contenido de nitrgeno: fraccin msica de sustancias determinadas por los procedimientos especificados en las Partes de la 1, 2 y 4 de esta norma. 2.2 Contenido de nitrgeno no proteico: fraccin msica de sustancias determinadas por el procedimiento especificado en la parte 3 de esta norma.
Nota. El contenido de nitrgeno, el contenido de nitrgeno proteico y el contenido de nitrgeno no proteico se expresan como porcentaje en masa.

3.

REACTIVOS

Slo se emplean reactivos de grado analtico reconocido, a menos que se especifique de otra manera, y agua destilada o desmineralizada o agua de pureza equivalente. 3.1 SULFATO DE POTASIO (K2SO4)

Con bajo contenido de nitrgeno 3.2 SOLUCIN DE SULFATO DE COBRE(II) PENTAHIDRATADO (CuSO4 5H2O)

Se disuelven 5,0 g de sulfato de cobre (II) pentahidratado (CuSO4 5H2O) en agua, en un matraz volumtrico de 100 ml. Se diluye hasta completar los 100 ml y se mezcla.

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3.3 CIDO SULFRICO

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Por lo menos del 95 % (m/m) - 98 % (m/m), libre de nitrgeno, 20 aproximadamente = 1,84 g/ml. 3.4 SOLUCIN DE HIDRXIDO DE SODIO

Con bajo contenido de nitrgeno, que contenga 50 g de hidrxido de sodio (NaOH) por 100 g.
Nota. Se puede emplear una solucin de hidrxido de sodio al 40 % (m/m) en lugar del 50 % (m/m), si se presentan problemas de taponamiento del sistema de flujo en una unidad automtica de destilacin.

3.5

SOLUCIN INDICADORA

Se disuelven 0,1 g de rojo de metilo en etanol al 95 % (V/V) y se diluye con etanol hasta completar 50 ml. Se disuelven 0,5 g de verde de bromocresol en etanol al 95 %(V/V) y se diluye con etanol hasta completar 250 ml. Se mezcla una parte de la solucin de rojo de metilo con 5 partes de la solucin de verde de bromocresol. 3.6 SOLUCIN DE CIDO BRICO (H3BO3)

Se disuelven 40,0 g de cido brico (H3BO3) en un litro de agua caliente. Se deja enfriar la solucin y se ajusta el volumen hasta completar nuevamente 1 litro. Se adicionan 3 ml de la solucin indicadora (vase el numeral 4.5), se mezcla y almacena la solucin en una botella de vidrio de borosilicato. (La solucin ser de color naranja plido). Se protege la solucin contra la luz y fuentes de vapor de amonaco, durante el almacenamiento. 3.7 SOLUCIN VOLUMTRICA ESTNDAR DE CIDO CLORHDRICO

c(HCl) = (0,1 0,0005) mol/l. 3.8 SULFATO DE AMONIO [(NH4)2SO4]

Mnimo de 99,9 % m/m sobre materia seca. Inmediatamente antes de emplearse, se seca el sulfato de amonio a 102 C 2 C durante mnimo 2 h. Se enfra a temperatura ambiente en un desecador. 3.9 TRIPTFANO (C11H12N2O2) CLORHIDRATO DE LISINA (C16H15ClN2O2)

Mnimo de 99 % m/m. No se deben secar estos reactivos en el horno antes de emplearse. 3.10 SACAROSA

Con contenido de nitrgeno inferior a 0,002 % (m/m). 3.11 SOLUCIN DE CIDO TRICLOROACTICO

Se disuelven 15,0 g de cido tricloroactico (CCl3COOH) en agua en un matraz volumtrico de 100 ml. Se diluye hasta la marca y se mezcla. No se deben emplear otras concentraciones de cido tricloroactico, ni volmenes de soluciones diferentes a las especificadas.

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Nota. Otras concentraciones o volmenes de soluciones modificarn el desempeo del mtodo con respecto a su valor medio y caractersticas de desempeo.

4.

APARATOS Y EQUIPOS

Aparatos comunes de laboratorio y en especial los siguientes: 4.1 BAO DE AGUA

Capaz de mantenerse un temperatura de 38 C 1 C. 4.2 MATRACES KJELDAHL

De 500 ml y 800 ml de capacidad. 4.3 BALANZA ANALTICA

Con capacidad para pesar con aproximacin a 0,1 mg. 4.4 REGULADORES DE EBULLICIN

Grnulos de xido de aluminio, Al2O3 fundido, anftero, de alta pureza, tamao de malla 10, los cuales no se deben reutilizar. Tambin se pueden utilizar perlas de vidrio. 4.5 BURETA O PIPETA AUTOMTICA

Con capacidad para medir volmenes de 1,0 ml de solucin de sulfato de cobre (vase el numeral 4.2). 4.6 PROBETAS GRADUADAS

De 50 ml, 100 ml y 500 ml de capacidad, respectivamente. 4.7 APARATOS DE DIGESTIN

Con el fin de mantener los matraces Kjeldahl (vase el numeral 4.2) en una posicin inclinada (aproximadamente 45); con calentadores elctricos o quemadores de gas que no calienten los matraces por encima del nivel de su contenido, y con sistema de extraccin de vapores. Se recomienda ajustar el calentador con el fin de poder determinar el ajuste mximo que se debe usar durante la digestin. Con el propsito de evaluarlo, se precalienta al punto de ajuste del calentador. En el caso de los quemadores de gas el perodo de precalentamiento debe ser de 10 min y para calentadores elctricos, de 30 min. Se determina el punto de ajuste del calentador con el que se logra llevar 250 ml de agua, incluyendo de 5 a 10 reguladores de ebullicin, desde una temperatura inicial de 2 C hasta alcanzar una ebullicin gradual en 5 min o 6 min para cada uno de los calentadores. Este es el mximo ajuste del calentador que se debe usar durante la digestin. 4.8 APARATO DE DESTILACIN

Elaborado en vidrio de borosilicato u otro material adecuado al que pueda acondicionarse un matraz Kjeldahl (vase el numeral 4.2) que conste de una cabeza difusora eficiente conectada a un condensador recto y a un tubo de salida de menor dimetro conectado a su extremo 3

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inferior. Las mangueras de conexin y el (los) tapn(es) deben ajustarse con precisin y preferiblemente deben ser de neopreno. 4.9 MATRACES CNICOS O ERLENMEYER

De 500 ml de capacidad, graduados cada 200 ml. 4.10 BURETA

De 50 ml de capacidad, graduada por lo menos cada 0,1 ml, que rena los requisitos de la NTC 2175 (ISO 385), clase A. 4.11 BLOQUE DE DIGESTIN

Bloque de aleacin de aluminio o aparato equivalente, acondicionado con un control de temperatura ajustable y dispositivo para medicin de la temperatura del bloque. 4.12 TUBOS DE DIGESTIN

Con capacidad de 250 ml, acondicionados para ser usados con el bloque de digestin (vase el numeral 4.11). 4.13 RECOLECTOR DE VAPORES

Para usarlo con los tubos de digestin (vase el numeral 4.11). 4.14 APARATO LAVADOR CENTRFUGO O BOMBA DE FILTRACIN O ASPIRADORA

Construido de material resistente al cido y para uso con suministro de agua corriente. 4.15 UNIDAD DE DESTILACIN

Manual o semiautomtica, para destilacin al vapor, adecuada para recibir los tubos de digestin de 250 ml (vase el numeral 4.12) y los matraces cnicos o erlenmeyers de 500 ml (vase el numeral 4.9).
Nota. Dependiendo del mtodo seleccionado para la determinacin del nitrgeno en el filtrado, ya sea mediante el mtodo Kjeldahl (parte 1) el mtodo de digestin de bloque (parte 2), se requieren los aparatos mencionados en dicho mtodo, con excepcin de los mencionados a continuacin que se requieren en la parte 3.

4.16

MATRACES CNICOS

Con capacidad de 25 ml. 4.17 PIPETAS

De capacidades de 10 ml y 20 ml. 4.18 EMBUDO DE VIDRIO PARA FILTRACIN

De 75 mm de dimetro.

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4.19 PAPEL DE FILTRO

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De 15 cm de dimetro, libre de nitrgeno, Whatman No 1, o equivalente. 4.20 VASO DE PRECIPITADO

De 50 ml de capacidad.
Nota. Dependiendo del mtodo seleccionado para la determinacin del nitrgeno en el filtrado, ya sea mediante el mtodo Kjeldahl (parte 1) el mtodo de digestin de bloque (parte 2), se requieren los aparatos mencionados en dicho mtodo, con excepcin de los siguientes adicionales que se requieren para el mtodo de la Parte 4.

4.21

PIPETAS,

De 5 ml de capacidad. 4.22 PIPETA AUTOMTICA

Pipeta de bomba de pistn para suministro de porciones de 10 ml de la solucin de cido tricloroactico (vase el numeral 4.11). 5. 5.1 PARTE 1. DETERMINACIN DE NITRGENO MEDIANTE EL MTODO KJELDAHL PRINCIPIO

Se digiere una muestra para ensayo con una mezcla de cido sulfrico concentrado y sulfato de potasio, empleando sulfato de cobre (II) como catalizador para as convertir el nitrgeno orgnico presente en sulfato de amonio. Se adiciona hidrxido de sodio en exceso a la muestra digerida enfriada para liberar amonaco. Se destila el amonaco, el destilado se recoge en un exceso de solucin de cido brico y se titula con solucin de cido clorhdrico. Se calcula el contenido de nitrgeno a partir de la cantidad de amonaco. 5.2 TOMA DE MUESTRAS

La toma de muestras no hace parte del mtodo especificado en la presente norma. En la NTC 666 (ISO 707) se ofrece un mtodo de muestreo recomendado. Es importante que el laboratorio reciba una muestra verdaderamente representativa y que no se haya deteriorado durante el transporte o almacenamiento. 5.3 PREPARACIN DE LA MUESTRA PARA ENSAYO

Se calienta la muestra a 38 C 1 C en el bao de agua (vase el numeral 4.1). Se mezcla con suavidad la muestra inmediatamente antes de pesarla (vase el numeral 5.4.1). 5.4 PROCEDIMIENTO

5.4.1 Muestra para ensayo y tratamiento previo En un matraz Kjeldahl limpio y seco (vase el numeral 4.2), se adicionan de 5 a 10 reguladores de ebullicin (vase el numeral 4.4), 15 g de sulfato de potasio (vase el numeral 4.1), 1,0 ml de la solucin de sulfato de cobre (vase el numeral 4.2), aproximadamente 5 ml 0,1 ml de la 5

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muestra para ensayo preparada (vase el numeral 6.3), pesada con aproximacin a 0,1 mg y 25 ml del cido sulfrico (vase el numeral 4.3). Los 25 ml de cido sulfrico se usan para lavar cualquier solucin de sulfato de cobre, sulfato de potasio o muestra para ensayo remanente en el cuello del matraz. Se mezcla con suavidad el contenido del matraz Kjeldahl. 5.4.2 Determinacin 5.4.2.1 Digestin. Se enciende el sistema de extraccin de vapor del aparato de digestin (vase el numeral 4.7) antes de comenzar. Se calienta el matraz Kjeldahl y su contenido (vase el numeral 5.4.1) en el aparato de digestin regulando el ajuste del calentador lo ms bajo posible de manera que la muestra para ensayo digerida no suba hasta alcanzar el cuello del matraz Kjeldahl. Se realiza la digestin con este ajuste del calentador durante al menos 20 min o hasta que aparezca vapor blanco en el matraz. Se incrementa la temperatura del calentador hasta la mitad del ajuste mximo determinado en el numeral 4.7 y se contina el perodo de calentamiento durante 15 min. Al finalizar dicho perodo se incrementa el calor al ajuste mximo determinado en el numeral 4.7. Despus que la muestra para ensayo ha sido digerida (presenta color azul verdoso claro) se contina la ebullicin durante 1 h a 1,5 h en el ajuste mximo. Si el lquido no hierve, puede ser que el calentamiento sea muy bajo. El tiempo de digestin total estar entre 1,8 h y 2,25 h.
Notas 1) Con el fin de determinar el tiempo de ebullicin especfico requerido para las condiciones de anlisis en un laboratorio particular empleando un conjunto especfico de aparatos para anlisis de leche, se selecciona una muestra de leche con contenido de protenas y contenido graso altos y se determina su contenido protenico empleando diferentes tiempos de ebullicin (1 h a 1,5 h) despus de que aclare. El resultado medio de protenas se incrementa al aumentar el tiempo de ebullicin, se hace consistente y luego disminuye cuando el tiempo de ebullicin es demasiado largo. Se selecciona el tiempo de ebullicin que produce el resultado mximo de protenas. Si al finalizar la digestin se evidencian pequeos puntos de material no digeridos adheridos a las paredes del matraz Kjeldahl, se deja enfriar el matraz, se lavan las paredes de ste con agua, para arrastrar las partculas a la superficie del cido sulfrico. Se debe reiniciar el calentamiento muy suavemente hasta la evaporacin total del agua. El calentamiento progresivo debe permitir la desaparicin normal de las partculas no digeridas. Al finalizar la digestin, la muestra para ensayo digerida debe ser clara y hallarse libre de material no digerido. Se deja enfriar la muestra para ensayo digerida en el cido, en matraces abiertos, en una campana separada a temperatura ambiente durante un perodo de aproximadamente 25 min. Si se dejan los matraces sobre los quemadores calientes para que se enfren, llevar ms tiempo alcanzar la temperatura ambiente. La muestra para ensayo digerida y enfriada debe ser lquida o lquida con algunos cristales pequeos en el fondo del matraz, al finalizar el perodo de enfriamiento de 25 min. No se debe dejar la muestra para ensayo digerida sin diluir, en los matraces, toda la noche, ya que puede cristalizarse durante este perodo y ser muy difcil su disolucin con el fin de evitar esta situacin. 3) La cristalizacin excesiva despus de 25 min es el resultado de una prdida indebida de cido durante la digestin y puede originar valores de ensayo bajos. La prdida indebida de cido se debe a la excesiva aspiracin de vapores, o al tiempo de digestin excesivamente prolongado, causado por un ajuste mximo, incorrecto del calentador. Se adicionan 300 ml de agua a los matraces Kjeldahl de 500 ml, 400 ml de agua al emplear los matraces Kjeldahl de 800 ml. Tambin se emplea agua para lavar el cuello del matraz. Se mezcla el contenido de los matraces, por completo, asegurndose que se disuelva cualquier cristal que se separe. Se adicionan de 5 a 10 reguladores de ebullicin (vase el numeral 4.4). Se deja enfriar nuevamente la mezcla a temperatura ambiente antes de la destilacin. Las muestras de ensayo digeridas y diluidas se pueden tapar y mantener para la destilacin ms tarde.

2)

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5.4.2.2 Destilacin. Se abre la llave de suministro de agua al condensador, en el aparato de destilacin (vase el numeral 4.8). Se adicionan 75 ml de solucin de hidrxido de sodio (vase el numeral 4.4) a la muestra para ensayo digerida diluida (vase el numeral 5.4.2.1) vertiendo cuidadosamente la solucin en el cuello inclinado del matraz Kjeldahl de manera que forme una capa en el fondo del bulbo del matraz. Debera existir una interfase limpia entre las dos soluciones. Inmediatamente despus de la adicin de la solucin de hidrxido de sodio al matraz Kjeldahl, se conecta al aparato de destilacin (vase el numeral 4.8), el cual cuenta con un tubo de salida del condensador, cuya punta se encuentra inmersa en 50 ml de la solucin de cido brico (vase el numeral 4.6) contenido en un matraz cnico (vase el numeral 4.9). Se revuelve vigorosamente el matraz Kjeldahl para mezclar su contenido por completo hasta que ya no sean visibles capas separadas de solucin en el matraz. Se coloca el matraz en el calentador. Se enciende ste para lograr una temperatura lo suficientemente alta para hervir la mezcla. Se contina la destilacin hasta que comience la ebullicin irregular (ebullicin intermitente) e inmediatamente se desconecta el matraz Kjeldahl y se apaga el calentador. Se cierra el suministro del agua del condensador. La velocidad de destilacin debe ser tal, que se renan cerca de 150 ml de destilado cuando la ebullicin irregular (ebullicin intermitente) inicie y el volumen del contenido del matraz cnico sea aproximadamente de 200 ml. Si el volumen del destilado recogido es menor a 150 ml, es probable que haya menos de 300 ml de agua adicionada para diluir la muestra para ensayo digerida. La eficiencia del condensador debe ser tal que la temperatura del contenido del matraz cnico no exceda los 25 C durante la destilacin. 5.4.2.3 Titulacin. Se titula la solucin receptora de cido brico con la solucin de cido clorhdrico volumtrico estndar (vase el numeral 4.7) hasta la primera traza de color rosa. Se registra la lectura de la bureta por lo menos con aproximacin a 0,05 ml. Una placa de agitacin iluminada puede contribuir a la visualizacin del punto final. 5.5 ENSAYO DE LOS BLANCOS

Se mantiene un registro de los valores obtenidos para los blancos. Si stos cambian, se debe identificar la causa. Siempre se titulan los blancos con el mismo titulante que se emplea para las muestras de ensayo. Se realiza un ensayo blanco siguiendo el procedimiento descrito en los numerales 5.4.2.1 a 5.4.2.3. Se reemplaza la muestra para ensayo con 5 ml de agua con aproximadamente 0,85 g de sacarosa (vase el numeral 4.10). Se mantiene un registro de los valores obtenidos para los blancos. Si stos cambian, se identifica la causa.
Notas: 1) El propsito de la sacarosa en un blanco o norma de recuperacin es actuar como material orgnico para consumir una cantidad de cido sulfrico durante la digestin que es escasamente equivalente a una muestra. Si la cantidad del cido sulfrico libre residual al final de la digestin es demasiado baja, la recuperacin de nitrgeno mediante ambos ensayos de recuperacin en los numerales 5.6.1 y 5.6.2 ser baja. Si la cantidad de cido residual presente al final de la digestin es suficiente para retener todo el nitrgeno, pero las condiciones de temperatura y tiempo durante la digestin no fueron las adecuadas para liberar todo el nitrgeno de una muestra, entonces la recuperacin de nitrgeno en la seccin 5.6.1 ser aceptable y la recuperacin de nitrgeno en el numeral 5.6.2 ser baja. La cantidad de titulante empleada en el blanco debera ser siempre superior a 0,00 ml. Los blancos dentro del mismo laboratorio deberan ser consistentes en el tiempo. Si el blanco ya es rosado antes de comenzar la titulacin, algo est fallando. Por lo general, en dichos casos, los matraces cnicos o erlenmeyers no estn limpios o el agua que se puede condensar del aire, en la parte externa del aparato condensador, ha cado dentro del matraz de recoleccin causando contaminacin.

2)

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5.6 ENSAYOS DE RECUPERACIN

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5.6.1 Se recomienda verificar la precisin del procedimiento en forma regular mediante los siguientes ensayos de recuperacin, realizados de acuerdo con los numerales del 5.4.1 al 5.4.2.3. 5.6.2 Se verifica que no ocurra prdida de nitrgeno mediante una muestra para ensayo de 0,12 g de sulfato de amonio (vase el numeral 4.8) junto con 0,85 g de sacarosa (vase el numeral 4.10).
Nota. La verificacin de la recuperacin de sulfato de amonio no ofrece informacin acerca de la capacidad de las condiciones de digestin para liberar el nitrgeno que est enlazado en las estructuras protenicas.

El porcentaje de nitrgeno recuperado debe estar entre 99,0 % y 100,0 % para todas las posiciones en el aparato. En caso que las recuperaciones de nitrgeno excedan un porcentaje del 100 %, el sulfato de amonio slo es til para determinar si ha ocurrido perdida de nitrgeno o la normalidad del titulante es inferior al valor establecido. Para recuperaciones inferiores al 99 %, la prdida podra estar en el paso de digestin o de destilacin. Es posible emplear una mezcla de sulfato de amonio y una pequea cantidad de cido sulfrico (la cantidad que permanece como residuo al finalizar una digestin) en un matraz Kjeldahl. Se diluye con el volumen normal de agua, se adiciona la cantidad normal de hidrxido de sodio y se destila. Si la recuperacin del nitrgeno an es baja con la misma cantidad, la prdida de nitrgeno se encuentra en el aparato de destilacin y no en el de digestin. La probable causa sera un tubo con fuga en un sistema tradicional o que las extremidades de los condensadores no estn sumergidas por debajo de la superficie del cido brico al comienzo de la destilacin. El aparato debe pasar este ensayo antes de verificar las recuperaciones mediante el procedimiento especificado en el numeral c). 5.6.3 Se verifica la eficiencia del procedimiento de digestin mediante el uso de 0,16 g de clorhidrato de lisina 0,18 g de triptfano (vase el numeral 4.9) junto con 0,67 g de sacarosa (vase el numeral 4.10). Se debe recuperar por lo menos el 98 % del nitrgeno. Si la recuperacin es inferior al 98 % despus de contar con una recuperacin del 99 % a 100 % en sulfato de amonio, entonces la temperatura o el tiempo de digestin es insuficiente (se sigue el procedimiento en el numeral 5.4.2.1 prrafo 3) o existe material de muestra sin digerir (es decir carbn) en el interior del matraz Kjeldahl. La evaluacin final de desempeo se realiza mejor mediante la participacin en un sistema de ensayos de aptitud del mtodo. 5.6.4 Resultados inferiores ya sean en el ensayo de recuperacin (o mayores al 100,0% en el numeral 5.6.2) indican fallas en el procedimiento y/o una concentracin imprecisa de la solucin de cido clorhdrico volumtrico estndar (vase el numeral 4.7). 5.7 CLCULO Y EXPRESIN DE RESULTADOS

5.7.1 Clculo Se calcula el contenido de nitrgeno, expresado como porcentaje en masa, mediante la siguiente ecuacin:
Wn = 1,4007 (Vs Vb ) M Wt

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Donde: Wn = Vs =

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es el contenido de nitrgeno de la muestra, expresado como porcentaje en masa; es el valor numrico del volumen de la solucin volumtrica estndar de cido clorhdrico (vase el numeral 3.7) empleado en la determinacin (vase el numeral 5.4.2.3), en mililitros, expresados por lo menos con aproximacin a 0,05 ml; es el valor numrico del volumen de la solucin volumtrica estndar de cido clorhdrico (vase el numeral 3.7) empleado en el ensayo blanco (numeral 5.5), en mililitros, expresado por lo menos con aproximacin a 0,05 ml; es el valor numrico de la molaridad exacta de la solucin volumtrica estndar de cido (vase el numeral 3.7), expresado con cuatro decimales; es la masa de la muestra para ensayo (vase el numeral 5.4.1) en gramos, expresada con aproximacin a 0,1 mg.

Vb =

M=

Wt =

5.7.1.1 Expresin de resultados. Se expresa el contenido de nitrgeno con cuatro decimales. 5.7.2 Clculo del contenido de protena cruda El contenido de protena cruda, expresado como porcentaje en masa, se obtiene mediante la multiplicacin del contenido de nitrgeno (vase el numeral 5.7.1) por 6,38. 5.7.3 Expresin de resultados Se expresan los resultados de ensayo con tres decimales. 5.8 PRECISIN

5.8.1 Ensayo interlaboratorio Los valores para la repetibilidad y reproducibilidad se derivaron del resultado de un ensayo interlaboratorio realizado de acuerdo con la norma ISO 57251). En la referencia [1] del anexo B (Bibliografa) se resumen los detalles del ensayo interlaboratorio del mtodo. Los valores derivados de este ensayo interlaboratorio pueden no ser aplicables a los rangos de concentracin y matrices diferentes a los determinados. 5.8.2 Repetibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo nico obtenidos con el mismo mtodo sobre material de ensayo idntico, en el mismo laboratorio, por el mismo operador, empleando el mismo equipo, dentro de un intervalo corto de tiempo, en el 5% de los casos no podr ser mayor a 0,006 %.

Se emple la norma 5725:1986, Precisin de los mtodos de ensayo. Determinacin de la repetibilidad y reproducibilidad para un mtodo de ensayo estndar mediante ensayos interlaboratorio (ahora anulada y reemplazada por la ISO 5725-2:1994 (vase la NTC 3529-2:1999), con el fin de obtener los datos de precisin.

ISO

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5.8.3 Reproducibilidad

NTC 5025

La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo nicos, obtenida con el mismo mtodo, en material de ensayo idntico, en diferentes laboratorios, con diferentes operadores, empleando diferente equipo, en el 5 % de los casos no podr ser mayor a 0,007 7 %. 5.9 INFORME DEL ENSAYO

El informe del ensayo debe especificar:

toda la informacin requerida para la completa identificacin de la muestra; el mtodo de muestreo empleado, si se conoce; el mtodo empleado, citando esta norma; todos los detalles de operacin no especificados en la presente norma, o considerados como opcionales, junto con los detalles de cualquier incidente que pueda haber influido en el (los) resultado(s); el (los) resultado(s) de ensayo obtenidos; los resultados finales obtenidos, si se ha verificado la repetibilidad; los resultados finales obtenidos, si la recuperacin ha sido verificada

6.

PARTE 2. DETERMINACIN DE NITRGENO MEDIANTE EL MTODO DE DIGESTIN DE BLOQUE (MTODO MACRO) PRINCIPIO

6.1

Se digiere una muestra para ensayo, con una mezcla de cido sulfrico concentrado y sulfato de potasio, empleando sulfato de cobre (II) como catalizador para as convertir el nitrgeno orgnico presente en sulfato de amonio. Se adiciona hidrxido de sodio en exceso a la muestra para ensayo digerida y enfriada para liberar amonaco. Se destila el vapor del amonaco empleando una unidad de destilacin de vapor, manual o semi-automtica; se recoge el destilado en un exceso de solucin de cido brico y se titula con cido clorhdrico. 6.2 MUESTREO

El muestreo no hace parte del mtodo especificado en la presente norma. En la NTC 666 (ISO 707) se ofrece un mtodo de muestreo recomendado. Es importante que el laboratorio reciba una muestra verdaderamente representativa y que no se haya deteriorado durante el transporte o almacenamiento. 6.3 PREPARACIN DE LA MUESTRA PARA ENSAYO

Se calienta la muestra a 38 C 1 C mediante el bao de agua (vase el numeral 4.1). Se mezcla con suavidad la muestra inmediatamente antes de pesar la muestra para ensayo (vase el numeral 6.4.1). 10

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6.4 PROCEDIMIENTO

NTC 5025

6.4.1 Muestra para ensayo 6.4.1.1 Muestra para ensayo y tratamiento previo. Se adicionan 12 g de sulfato de potasio (vase el numeral 3.1), 1,0 ml de la solucin de sulfato de cobre (vase el numeral 3.2), aproximadamente 5 ml 0,1 ml de la muestra para ensayo preparada (vase el numeral 6.3), pesada con una aproximacin de 0,1 mg y 20 ml del cido sulfrico (vase el numeral 3.3) en un tubo de digestin limpio y seco (vase el numeral 4.12). El cido sulfrico se adiciona para lavar cualquier solucin de sulfato de cobre, sulfato de potasio o muestra para ensayo remanente en las paredes del cuello del tubo de digestin. Se mezcla con suavidad el contenido del tubo. 6.4.2 Determinacin 6.4.2.1 Digestin. Se coloca el bloque de digestin (vase el numeral 4.11) a una temperatura inicial baja para controlar la formacin de espuma (aproximadamente a una temperatura entre 180 C a 230 C). Se transfiere el tubo al bloque de digestin y se pone el recolector de vapores (vase el numeral 4.13) que se conecta por s mismo a un lavador centrfugo de dispositivo similar (vase el numeral 4.14), en la parte superior del tubo. La tasa de succin de dicho lavador centrfugo o dispositivo similar debe ser apenas suficiente para remover los vapores. Es posible que se requiera mantener el aparato completo dentro de una campana extractora de vapores. Se realiza la digestin de la muestra para ensayo durante 30 min hasta que se desarrollen vapores blancos. Luego se incrementa la temperatura del bloque de digestin hasta una temperatura entre 410 C a 430 C y se continua con la digestin de la muestra para ensayo hasta que sta, una vez digerida, sea clara.
Notas: 1) Para controlar la formacin de espuma puede ser necesario incrementar la temperatura de manera gradual durante un perodo de aproximadamente 20 min. En ningn evento, se permite que la espuma suba ms de 4 cm a 5 cm por debajo de la superficie del recolector de vapores que se encuentra insertado en la parte superior del tubo de digestin. Despus que la muestra para ensayo digerida se aclara (presenta color azul verdoso claro) se contina la digestin a una temperatura entre 410 C a 430 C, durante mnimo 1 h. En este perodo el cido sulfrico debe estar hirviendo. Si la ebullicin visible del lquido claro no se hace evidente a manera de burbujas formndose en la superficie del lquido caliente alrededor del permetro del tubo, entonces la temperatura del bloque puede ser demasiado baja. El tiempo de digestin total estar entre 1,75 h y 2,5 h Para determinar el tiempo de ebullicin especfico requerido para las condiciones de anlisis en un laboratorio empleando un aparato cualquiera, se selecciona una muestra de alto contenido de protenas y grasas y se determina su contenido protenico empleando diferentes tiempos de ebullicin (1 h -1,5 h) despus de la limpieza. El contenido medio de protenas se incrementa al aumentar el tiempo de ebullicin, se hace consistente y luego disminuye cuando el tiempo de ebullicin es demasiado prolongado. Se selecciona el tiempo de ebullicin que produzca el resultado mximo de protenas. 2) Si al finalizar la digestin se evidencian pequeos puntos de material no digeridos adheridos a las paredes del matraz Kjeldahl, se deja enfriar el matraz, se lavan las paredes de ste con agua, para arrastrar las partculas a la superficie del cido sulfrico. Se debe reiniciar el calentamiento muy suavemente hasta la evaporacin total del agua. El calentamiento progresivo debe permitir la desaparicin normal de las partculas no digeridas. Al finalizar la digestin, la muestra para ensayo digerida debe ser clara y debe hallarse libre de material no digerible. Se retira el tubo del bloque con el recolector de vapores en su lugar.

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Se deja enfriar hasta temperatura ambiente durante un perodo de aproximadamente 25 min. La muestra para ensayo digerida y enfriada debe ser slo lquida, o lquida con unos pocos cristales pequeos en el fondo del tubo. No se deben dejar las muestras de ensayo digeridas, enfriadas, sin diluir toda la noche, ya que pueden solidificarse y ser muy difcil solubilizarlas con agua. 3) La cristalizacin excesiva despus de 25 min es el resultado de una prdida indebida de cido durante la digestin y puede originar valores de ensayo bajos. La prdida indebida de cido se debe a la excesiva aspiracin de vapor o a un tiempo de digestin excesivamente prolongado causado por digestiones durante un perodo demasiado prolongado a una temperatura por debajo de la temperatura mxima del anlisis. Para reducir la prdida de cido, se reduce la velocidad de aspiracin del vapor.

Despus que se ha enfriado la muestra para ensayo digerida a temperatura ambiente, se retira el recolector de vapores y cuidadosamente se adicionan 85 ml de agua a cada tubo. Se agita para mezclar y disolver cualquier cristal que se separe. Se deja enfriar de nuevo el contenido del tubo a temperatura ambiente. 6.4.2.2 Destilacin. Se abre el agua de refrigeracin del condensador del aparato de destilacin. Se pone el tubo de digestin que contiene la muestra para ensayo digerida y diluida, a la unidad de destilacin (vase el numeral 4.15). Se pone un matraz cnico (vase el numeral 4.9) que contenga 50 ml de la solucin de cido brico (vase el numeral 4.6) debajo de la salida del condensador, en forma tal que el tubo de salida se encuentre por debajo de la superficie de la solucin de cido brico. Se ajusta la unidad de destilacin para dispensar 55 ml de solucin de hidrxido de sodio (vase el numeral 4.3).
Nota. Cuando se emplee el 40 % (m/m) de la solucin de hidrxido de sodio se recomienda ajustar el volumen dispensado a 65 ml. Si el suministro automtico de la solucin de hidrxido de sodio es extremadamente variable debido al taponamiento parcial del tubo de suministro, entonces ocurrir gran variabilidad en el resultado del duplicado.

Teniendo en cuenta las instrucciones del fabricante, se opera la unidad de destilacin en forma tal que se evapore el destilado de amonaco liberado mediante la adicin de la solucin de hidrxido de sodio, recogiendo el destilado en la solucin de cido brico. Se contina con el proceso de destilacin hasta que se haya recolectado por lo menos 150 ml de destilado. Se retira el matraz cnico de la unidad de destilacin. 6.4.2.3 Titulacin. Se titula la solucin receptora de cido brico con la solucin de cido clorhdrico volumtrico estndar (vase el numeral 3.7) hasta obtener la primera traza de color rosa. Se toma la lectura de la bureta por lo menos con aproximacin a 0,05 ml. Una placa de agitacin iluminada puede contribuir a la visualizacin del punto final. 6.5 ENSAYO DE LOS BLANCOS

Siempre se titulan los blancos con el mismo titulante que se emplea para las muestras de ensayo. Se realiza un ensayo blanco siguiendo el procedimiento descrito en los numerales 6.4.2.1 a 6.4.2.2. Se reemplaza la muestra para ensayo con 5 ml de agua que contenga aproximadamente 0,85 g de sacarosa (vase el numeral 3.10). Se mantiene un registro de los valores de los blancos. Si stos cambian, se identifica la causa.
Nota 1. El propsito de la sacarosa en un blanco o norma de recuperacin es actuar como material orgnico para consumir una cantidad de cido sulfrico durante la digestin que es escasamente equivalente a una muestra para ensayo. Si la cantidad de cido sulfrico libre residual al final de la digestin es demasiado bajo, la recuperacin de nitrgeno mediante ambos ensayos de recuperacin en los numerales 6.6.1 y 6.6.2 ser baja. Si la cantidad de cido residual presente al final de la digestin es suficiente para retener todo el nitrgeno, pero las condiciones de temperatura y el tiempo durante la digestin no fueron los adecuados para liberar todo el nitrgeno de una muestra,

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entonces la recuperacin de nitrgeno de acuerdo con el numeral 6.6.1 ser aceptable y la recuperacin de nitrgeno en el numeral 6.6.2 ser baja.

El titulante empleado en el ensayo blanco debe ser siempre superior a 0,00 ml. Los blancos dentro del mismo laboratorio deben ser consistentes en el tiempo. Si el blanco ya es rosado antes de comenzar la titulacin, algo est fallando. Por lo general, en dichos casos, los matraces cnicos o erlenmeyers no estn limpios o el agua que se puede condensar del aire, en la parte externa del aparato condensador ha cado dentro del matraz de recoleccin causando contaminacin. 6.6 ENSAYOS DE RECUPERACIN

6.6.1 Se recomienda verificar la precisin del procedimiento en forma regular mediante los siguientes ensayos de recuperacin, realizados de acuerdo con los numerales del 6.4.1 al 6.4.2.2. 6.6.2 Se verifica que no ocurra perdida de nitrgeno mediante una muestra para ensayo de 0,12 g de sulfato de amonio (vase el numeral 3.8) junto con 0,85 g de sacarosa (vase el numeral 3.10).
Nota. La verificacin de la recuperacin de sulfato de amonio no ofrece informacin acerca de la capacidad de las condiciones de la digestin para liberar nitrgeno que est enlazado a las estructuras protenicas.

El porcentaje de nitrgeno recuperado debe estar entre 99,0 % y 100,0 % para todas las posiciones en el aparato. En caso que las recuperaciones de nitrgeno excedan un porcentaje del 100 %, el sulfato de amonio slo es til para determinar si ha ocurrido prdida de nitrgeno o la normalidad del titulante es inferior al valor establecido. Para recuperaciones inferiores al 99 %, la prdida podra estar en la digestin o destilacin. Es posible emplear una mezcla de sulfato de amonio y una pequea cantidad de cido sulfrico (la cantidad de remanente residual al finalizar una digestin) en un matraz Kjeldahl. Se diluye con el volumen normal de agua, se adiciona la cantidad normal de hidrxido de sodio y se destila. Si la recuperacin del nitrgeno an es baja con la misma cantidad, la prdida de nitrgeno se encuentra en el aparato de destilacin y no en el de digestin. La probable causa sera un tubo con fuga en un sistema tradicional o que los extremos de los condensadores no estn sumergidos por debajo de la superficie del cido brico al comienzo de la destilacin. El aparato debe aprobar este ensayo antes de pasar a verificar las recuperaciones mediante el procedimiento especificado en el numeral 6.6.1. 6.6.3 Se verifica la eficiencia del procedimiento de digestin mediante el uso de 0,16 g de clorhidrato de lisina 0,18 g de triptfano (vase el numeral 3.9) junto con 0,67 g de sacarosa (vase el numeral 3.10). Se debe recuperar por lo menos el 98 % del nitrgeno. Si la recuperacin es inferior al 98 % despus de contar con una recuperacin del 99 % a 100 % en sulfato de amonio, entonces la temperatura o tiempo de digestin es insuficiente (se sigue el procedimiento en el numeral 6.4.2.1 prrafo tercero, o existe material de muestra sin digerir (es decir carbn) en el interior del matraz Kjeldahl. La evaluacin final de desempeo se realiza mejor mediante la participacin en un sistema de ensayos de aptitud del mtodo. 6.6.4 Resultados inferiores ya sean en el ensayo de recuperacin (vase el numeral 6.6.1) indicarn fallas en el procedimiento y/o concentracin imprecisa de la solucin volumtrica estndar de cido clorhdrico (vase el numeral 3.7). 13

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6.7

NTC 5025

CLCULO Y EXPRESIN DE RESULTADOS

6.7.1 Clculo Se calcula el contenido de nitrgeno, expresado como porcentaje por masa, mediante la siguiente ecuacin:
Wn = 1,4007 (Vs Vb ) M Wt

Donde: Wn = Vs = es el contenido de nitrgeno de la muestra, expresado como porcentaje en masa; es el valor numrico del volumen de la solucin volumtrica estndar de cido empleada en la determinacin (vase el numeral 6.4.2.3), en milmetros, expresados con aproximacin a 0,05 ml; es el valor numrico del volumen de la solucin volumtrica estndar de cido empleado en el ensayo blanco (vase el numeral 6.5), en milmetros, expresado por lo menos con aproximacin a 0,05 ml; es el valor numrico de la molaridad exacta de la solucin volumtrica estndar de cido (3.7), expresado con cuatro decimales; es el valor numrico de la masa de la muestra para ensayo (vase el numeral 6.6.1) en gramos, expresada con aproximacin a 0,1 mg.

Vb =

M=

Wt =

6.7.1.1 Expresin de resultados. Se expresa el contenido de nitrgeno con cuatro decimales. 6.7.2 Clculo de contenido de protena cruda El contenido de protena cruda, expresado como porcentaje en masa, se obtiene mediante la multiplicacin del contenido de nitrgeno (vase el numeral 6.7.1.1) por 6,38. 6.7.3 Expresin de resultados Se expresan los resultados del ensayo con 3 decimales. 6.8 PRECISIN

6.8.1 Ensayo interlaboratorio Los valores para la repetibilidad y reproducibilidad se derivaron del resultado de un ensayo interlaboratorio realizado de acuerdo con la norma ISO 57251). En la referencia [1] del anexo B (Bibliografa) se resumen los detalles del ensayo interlaboratorio del mtodo. 6.8.2 Repetibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo nico obtenidos con el mismo mtodo sobre material de ensayo idntico en el mismo laboratorio por el mismo operador empleando el 14

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mismo equipo dentro de un intervalo corto de tiempo, en el 5 % de los casos no podr ser mayor a 0,006 %. 6.8.3 Reproducibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo nico, obtenida con el mismo mtodo en material de ensayo idntico en diferentes laboratorios con diferentes operadores empleando diferente equipo, en el 5 % de los casos no podr ser mayor a 0,0077 %. 6.9 INFORME DEL ENSAYO

El informe del ensayo debe especificar:

toda la informacin requerida para la completa identificacin de la muestra; el mtodo de muestreo empleado, si se conoce; el mtodo empleado, citando esta norma; todos los detalles de operacin no especificados en la presente norma, o considerados como opcionales, junto con los detalles de cualquier incidente que pueda haber influido en el (los) resultado(s); el (los) resultado(s) de ensayo obtenidos; los resultados finales obtenidos, si se ha verificado la repetibilidad; los resultados finales obtenidos, si la recuperacin ha sido verificada

7. 7.1

PARTE 3. DETERMINACIN DEL CONTENIDO DE NITRGENO NO PROTEICO PRINCIPIO

Se precipitan las protenas de una muestra para ensayo mediante la adicin de solucin de cido tricloroactico, tal que la concentracin final de dicho cido en la mezcla sea aproximadamente del 12 %. Se remueve la protena lctea precipitada mediante filtracin; el filtrante restante contiene los componentes de nitrgeno no proteico. Se determina el contenido de nitrgeno del filtrado mediante el procedimiento descrito en la parte 1 2 de la presente norma.
Nota. Cuando el contenido total de nitrgeno de la muestra de leche se ha determinado previamente, el contenido real de nitrgeno proteico puede calcularse como la diferencia entre el contenido total de nitrgeno y el contenido de nitrgeno no proteico.

7.2

TOMA DE MUESTRAS

La toma de muestras no hace parte del mtodo especificado en la presente norma. En la NTC 666: 1996 (ISO 707) se ofrece un mtodo de muestreo recomendado. Es importante que el laboratorio reciba una muestra verdaderamente representativa y que no se haya daado o alterado durante el transporte o almacenamiento. 15

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7.3

NTC 5025

PREPARACIN DE LA MUESTRA PARA ENSAYO

Se calienta la muestra a 38 C 1 C mediante el bao de agua (vase el numeral 4.1). Se mezcla con suavidad la muestra inmediatamente antes de pesar la muestra para ensayo (vase el numeral 8.4.1). 7.4 PROCEDIMIENTO

7.4.1 Muestra para ensayo Se pipetean 10,0 ml 0,1 ml de la muestra de ensayo preparada (vase el numeral 8.3), en un matraz cnico o Erlenmeyer previamente pesado (vase el numeral 4.16). Se vuelve a pesar el matraz y su contenido registrando los pesos con aproximacin a 0,1 mg. 7.4.2 Determinacin 7.4.2.1 Precipitacin y filtracin. Se adicionan 40 ml 0,5 ml de solucin de cido tricloroactico (vase el numeral 4.11) al matraz cnico. Se pesa el matraz y su contenido de nuevo con aproximacin a 0,1 mg. Se mezcla con movimientos circulares y se deja el matraz verticalmente durante cerca de 5 min para permitir que el precipitado sedimente. Se filtra el contenido del matraz mediante un papel de filtro (vase el numeral 4.19). Se recoge todo el filtrado entero en un matraz cnico limpio y seco (vase el numeral 4.16). El filtrado debe ser claro y estar libre de material particulado, de lo contrario, se repite el proceso de precipitacin y filtracin. 7.4.2.2 Porcin filtrada. Se agita con movimientos el filtrado para asegurar una buena mezcla. Se pipetean 20 ml del filtrado en un vaso de precipitados de 50 ml (vase el numeral 4.20) y se pesa. Se vierte el filtrado desde el vaso de precipitados al matraz Kjeldahl (vase el numeral 4.2) o al tubo de digestin (4.12) que contenga la cantidad apropiada de reguladores de ebullicin (vase el numeral 4.4), sulfato de potasio (vase el numeral 4.1) y solucin de sulfato de cobre (vase el numeral 4.2) de la manera especificada en la parte 1 (procedimiento Kjeldahl) Parte 2 (procedimiento de digestin de bloque) de esta norma. De inmediato se vuelve a pesar el vaso de precipitados vaco. 7.4.2.3 Digestin y destilacin. Se adiciona la cantidad apropiada de cido sulfrico (vase el numeral 4.3) especificada en la Parte 1 Parte 2 al contenido del matraz Kjeldahl o tubo de digestin (vase el numeral 4.12) Se contina con el procedimiento de digestin y destilacin mediante el procedimiento descrito en la Parte 1 Parte 2 de esta norma. 7.4.2.4 Digestin y titulacin. Se emplea la solucin de cido clorhdrico 0,01 mol/l (vase el numeral 4.7) para titular el amonaco liberado (en vez de la solucin de cido clorhdrico 0,1 ml/l de la forma como se emplea en la parte 1 2 de esta norma. 7.5 ENSAYO DEL BLANCO

Se digiere, destila y titula un blanco que contenga cerca de 0,1 g de sacarosa y 16 ml 0,5 ml de solucin de cido tricloroactico (vase el numeral 4.11) Siempre se titulan los blancos con la misma solucin que se emplea para las muestras de ensayo. Se mantiene un registro de los valores de los blancos. Si stos cambian, se identifica la causa.

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7.6

NTC 5025

CLCULO Y EXPRESIN DE RESULTADOS

7.6.1 Clculo Se calcula el contenido de nitrgeno, expresado como porcentaje en masa, mediante la siguiente ecuacin:
1,4007 (Vs Vb ) M1 W f x Wm / W f 0,065 Wm

Wn =

Donde: Wn = Vs = es el contenido de nitrgeno de la muestra, expresado como porcentaje en masa; es el valor numrico del volumen de la solucin volumtrica estndar de cido clorhdrico empleada en la determinacin (vase el numeral 7.4.2.4), en ml, expresados por lo menos con aproximacin a 0,05 ml; es el valor numrico del volumen de la solucin volumtrica estndar de cido empleado en el ensayo blanco (vase el numeral 8.5), en ml, expresado con aproximacin a 0,05 ml; es el valor numrico de la molaridad exacta de la solucin de cido (4.7), expresado con cuatro decimales; es el valor numrico de la masa del filtrado de 20 ml (vase el numeral 7.4.2.2) en g, expresado con aproximacin de 0,1 mg.

Vb =

Mr = Wf =

Wm = es el valor numrico de la masa de la muestra para ensayo de leche (vase el numeral 7.4.1), en g, expresado con aproximacin de 0,1 mg. Wt = es el valor numrico de la masa de la muestra para ensayo de leche ms 40 ml de la solucin de cido tricloroactico (vase el numeral 4.11) en g, expresada con aproximacin a 0,1 mg.

Nota. El factor 0,065 en el denominador hace suponer que la leche contiene cerca del 3,5 % de grasa y 3,0 % de protena verdadera (por tanto 0,035 + 0,030). Puede requerirse ajustar el factor para otros productos lcteos lquidos.

7.6.1.1 Expresin de resultados.Se expresa el contenido de nitrgeno con cuatro decimales. 7.6.2 Clculo de contenido de nitrgeno no proteico El contenido de nitrgeno no proteico, expresado como porcentaje por masa, se obtiene mediante la multiplicacin del contenido de nitrgeno (vase el numeral 8.6.1.1) por 6,38. 7.6.3 Expresin de resultados Se expresan los resultados de ensayo con 3 decimales.

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7.7

PRECISIN

7.7.1 Ensayo interlaboratorio Los valores para la repetibilidad y reproducibilidad se derivaron de los resultados de un ensayo interlaboratorio realizado de acuerdo con la norma ISO 57251). En las referencias [2,3] del Anexo B (Informativo) se han reportado estos resultados. 7.7.2 Repetibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados de un ensayo nico obtenidos con el mismo mtodo sobre material de ensayo idntico en el mismo laboratorio por el mismo operador, empleando el mismo equipo, dentro de un intervalo corto de tiempo, en el 5 % de los casos no ser inferior a 0,0025 % del contenido de nitrgeno no proteico de la muestra. 7.7.3 Reproducibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo nico, obtenida con el mismo mtodo en material de ensayo idntico en diferentes laboratorios con diferentes operadores empleando diferente equipo, en el 5 % de los casos no ser mayor al 0,0052 % del contenido de nitrgeno no proteico de la muestra. 7.8 INFORME DEL ENSAYO

El informe del ensayo debe especificar:

toda la informacin requerida para la completa identificacin de la muestra; el mtodo de muestreo empleado, si se conoce; el mtodo empleado, citando esta norma; todos los detalles de operacin no especificados en la presente norma, o considerados como opcionales, junto con los detalles de cualquier incidente que pueda haber influido en el (los) resultado(s); el (los) resultado(s) de ensayo obtenidos; si se ha verificado la repetibilidad los resultados finales obtenidos;

8. 8.1

PARTE 4: DETERMINACIN DEL CONTENIDO DE NITRGENO PROTEICO PRINCIPIO

Precipitacin de protenas de una muestra para ensayo mediante la adicin de solucin de cido tricloroactico tal que la concentracin final de ste en la mezcla sea de aproximadamente el 12 %. Separacin del precipitado de protena mediante filtracin (el filtrado contendr los componentes de nitrgeno no proteico). Determinacin del contenido de nitrgeno del precipitado mediante el procedimiento descrito en la parte 1 2 de la presente norma. 18

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8.2 MUESTREO

NTC 5025

El muestreo no hace parte del mtodo especificado en la presente norma. En la NTC 606 (ISO 707) se ofrece un mtodo de muestreo recomendado. Es importante que el laboratorio reciba una muestra verdaderamente representativa y que no se haya deteriorado durante el transporte o almacenamiento. 8.3 PREPARACIN DE LA MUESTRA DE ENSAYO

Se calienta la muestra a 38 C 1 C mediante el bao de agua (vase el numeral 6.1). Se mezcla con suavidad la muestra inmediatamente antes de pesar la porcin de ensayo (vase el numeral 8.1). 8.4 PROCEDIMIENTO

8.4.1 Muestra para ensayo Se pesan 5 ml 0,1 ml, con aproximacin a 0,1 mg, de la muestra de ensayo preparada (vase el numeral 8.3), en un matraz Kjeldahl (vase el numeral 4.2) o en un tubo de digestin (vase el numeral 4.12). Inmediatamente se adicionan 5 ml 0,1 ml de agua al matraz Kjeldahl (vase el numeral 4.2) o en el tubo de digestin (vase el numeral 4.12), enjuagando cualquier cantidad de leche que haya en el cuello del matraz o en el tubo hasta el fondo del mismo. 8.4.2 Determinacin 8.4.2.1 Precipitacin y filtracin. Se adicionan 40 ml 0,5 ml de solucin de cido tricloroactico (vase el numeral 4.11) al matraz o al tubo y se agita con movimientos circulares hasta mezclar bien el contenido. Se deja el matraz o tubo verticalmente durante aproximadamente 5 min para permitir que el precipitado se sedimente. Se pasa la mezcla del matraz Kjeldahl o del tubo de digestin por el papel de filtro (vase el numeral 4.19) y se recoge el filtrado. Una parte del precipitado permanecer en el matraz Kjeldahl o en el tubo de digestin y otra parte se recoge en el papel de filtro. No es necesario retirar todo el precipitado del matraz o tubo. Inmediatamente despus de filtrar la mezcla y de manera que no se seque ningn precipitado en el cuello del matraz Kjeldahl o del tubo de digestin, se adicionan mediante una pipeta automtica (vase el numeral 4.22), 10 ml de la solucin de cido tricloroactico (vase el numeral 4.11). Se usa tambin la solucin de cido tricloroactico para enjuagar cualquier precipitado que se encuentre en el cuello del matraz o del tubo y se pasa todo al papel de filtro. Se revuelve hasta mezclar el contenido. Se agita la mezcla del matraz o del tubo por medio del mismo papel de filtro, recogiendo el filtrado sobre el recolectado previamente. Inmediatamente se enjuaga de nuevo el cuello del matraz o el tubo con una cantidad adicional de 10 ml de solucin de cido tricloroactico (vase el numeral 4.11). Se revuelve hasta mezclar el contenido y nuevamente se vierte la mezcla del matraz o del tubo por medio del mismo papel de filtro, adicionando el filtrado al recogido previamente. El filtrado debe ser claro y encontrarse libre de materia particulada.
Nota. En este punto, ya no se requiere ms del filtrado y se puede desechar de manera apropiada.

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NTC 5025

8.4.2.2 Precipitado. Con cuidado y usando guantes se retira el papel de filtro del embudo y se dobla el papel a fin de encerrar el precipitado. Si queda algn precipitado (vase el numeral 8.4.2.1) ya sea en el borde interno o externo del matraz Kjeldahl o del tubo de digestin, se frota con el papel de filtro doblado de modo que no se adhiera el precipitado al papel y luego se deja caer el papel de filtro dentro del matraz Kjeldahl o el tubo de digestin. 8.4.2.3 Digestin y destilacin. Se adiciona la cantidad apropiada de reguladores de ebullicin (vase el numeral 4.4), sulfato de potasio (vase el numeral 4.1), solucin de sulfato de cobre II (vase el numeral 4.2) y cido sulfrico (vase el numeral 4.3) como se especifica en la parte 1 (procedimiento Kjeldahl) en la parte 2 (procedimiento de digestin de bloque) de la presente norma. Se determina el contenido de nitrgeno del precipitado y del papel de filtro ya sea mediante el procedimiento descrito en la parte 1 parte 2 de esta norma. 8.5 ENSAYO DEL BLANCO

Se realiza un ensayo para un blanco. Se cambia la muestra para ensayo por un papel de filtro (vase el numeral 4.19) lavado con solucin de cido tricloroactico (vase el numeral 4.11). Se mantiene un registro de los valores blancos. Si stos cambian, se identifica la causa. 8.6 CLCULO Y EXPRESIN DE RESULTADOS

8.6.1 Clculo Se calcula el contenido de nitrgeno proteico, expresado como porcentaje en masa, mediante la siguiente ecuacin:
1,4007 (Vs Vb ) M Wt

W pn =

Donde: Wpn = es el contenido de nitrgeno proteico de la muestra, expresado como porcentaje por masa; Vs = es el valor numrico del volumen de la solucin volumtrica estndar de cido empleada en la determinacin, en mililitros, expresados por lo menos con aproximacin a 0,05 ml; es el valor numrico del volumen de la solucin volumtrica estndar de cido empleado en el ensayo blanco, en mililitros, expresado con aproximacin a 0,05 ml; es el valor numrico de la molaridad exacta de la solucin volumtrica estndar de cido, expresado con cuatro decimales; es el valor numrico de la masa de la porcin de ensayo, en gramos, expresada con aproximacin a 0,1 mg.

Vb = M= Wt =

8.6.1.1 Expresin de resultados. Se expresa el contenido de nitrgeno con cuatro decimales.

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8.6.2 Clculo del equivalente de protena El contenido de nitrgeno proteico, expresado como equivalente de protena, se obtiene mediante la multiplicacin del contenido de nitrgeno proteico (vase el numeral 8.6.1.1) por 6,38. Esto corresponde al contenido proteico verdadero de la leche. 8.6.3 Expresin de resultados Se expresan los resultados de ensayo con 3 decimales. 8.7 PRECISIN

8.7.1 Ensayo interlaboratorio Los valores para la repetibilidad y reproducibilidad se derivaron de los resultados de un ensayo interlaboratorio realizado de acuerdo con la norma ISO 5725. En la referencia [2,3] se han reportado estos resultados. 8.7.2 Repetibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados de un ensayo nico obtenidos con el mismo mtodo sobre material de ensayo idntico en el mismo laboratorio, por el mismo operador, empleando el mismo equipo, dentro de un intervalo corto de tiempo, en el 5 % de los casos no ser mayor de 0,0038 %. 8.7.3 Reproducibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo nico, obtenida mediante el mismo mtodo en material de ensayo idntico en diferentes laboratorios con diferentes operadores empleando diferente equipo, en el 5 % de los casos no debe ser mayor al 0,0092 %. 8.8 INFORME DEL ENSAYO

El informe del ensayo debe especificar:

toda la informacin requerida para la completa identificacin de la muestra; el mtodo de muestreo empleado, si se conoce; el mtodo empleado, citando esta norma; todos los detalles de operacin no especificados en la presente norma, o considerados como opcionales, junto con los detalles de cualquier incidente que pueda haber influido en el (los) resultado(s); el (los) resultado(s) de ensayo obtenidos; si se ha verificado la repetibilidad los resultados finales obtenidos;

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9.

NTC 5025

NORMAS QUE DEBEN CONSULTARSE

Las siguientes normas contienen disposiciones que, a travs de la referencia en este texto, constituyen disposiciones de la presente norma. Dichas publicaciones no se aplican para referencias fechadas, subsecuentes enmiendas o actualizaciones. No obstante, se invita a las partes que lleguen a acuerdos con base en la presente norma a indagar sobre la posibilidad de aplicar las ediciones ms recientes de las normas indicadas a continuacin. Para referencias no fechadas, se aplica la ltima edicin de la norma referenciada. NTC 2175: 1986, (Reaprobada 1999) Material de vidrio para laboratorio. Buretas. Requisitos generales. (ISO 385-1:1984, Laboratory glassware Burettes Part 1: General requirements) NTC 666: 1996, Leche y productos lcteos. Gua para muestreo. (ISO 707:1997, Milk and milk products Guidance on sampling) NTC 3529-1: 1999, Precisin de los mtodos de medicin y de los resultados. Principios generales y definiciones. (ISO 5725-1:1994, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results. Part 1: General principles and definitions). NTC 3529-2: 1999, Exactitud (veracidad y precisin) de mtodos de medicin y resultados. Parte 2. Mtodo bsico para la determinacin de repetibilidad y reproducibilidad en un mtodo normalizado de medicin. (ISO 5725-2:1994, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results. Part 2: A basic method for the determination of repeatability and reproductibility of a standard measurement method). 10. DOCUMENTOS DE REFERENCIA

INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Milk. Determination of Nitrogen Content. Part 1: Kjeldahl Method. Switzerland, ISO, 1998. 9 p. (ISO/DIS 8968-1). INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Milk. Determination of Nitrogen Content. Part 2: Block Digestion Method (Macro Method). Switzerland, ISO, 1998. 7 p. (ISO/DIS 8968-2). INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Milk. Determination of Nitrogen Content. Part 4: Determination of Non-Protein Nitrogen Content. Switzerland, ISO, 1998. 6 p. (ISO/DIS 8968-4). INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Milk. Determination of Nitrogen Content. Part 5: Determination of Protein Nitrogen Content Switzerland, ISO, 1998. 6 p. (ISO/DIS 8968-5).

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Anexo A (informativo)

Procedimiento modificado para el anlisis de otros productos lcteos cuando no existe una norma separada para dicho producto

A.0

INTRODUCCIN

El procedimiento descrito en la parte 1 de la presente norma se ha optimizado y su desempeo se ha evaluado para el anlisis de leche de bovino. Es probable que el analista desee emplear el mismo procedimiento, con una leve modificacin, para la determinacin del contenido de nitrgeno de una serie de productos lcteos. Cuando no existe una norma separada para dichos productos, se debe observar, sin embargo, que el procedimiento y su desempeo no se han validado para los usos indicados. A.1 PROCEDIMIENTO

Se pesa, con aproximacin a 0,1 mg, la masa requerida de muestra para ensayo, tomado de una muestra para ensayo preparada en forma adecuada, como se describe a continuacin. Se procede con la determinacin del contenido de nitrgeno empleando el mtodo descrito en los numerales del 6.1 al 6.4. Las cantidades de cido sulfrico (vase el numeral 3.3) y la solucin de hidrxido de sodio (vase el numeral 3.4) empleadas en los procesos de digestin y destilacin no deben cambiar. Al cambiar la proporcin de cido con respecto a otros componentes mediante el incremento de la cantidad de cido disminuye el punto de ebullicin inicial de la mezcla en la digestin, lo cual no es recomendable. Se aconseja emplear un tamao de muestra adecuado con respecto al material de ensayo, con los reactivos de la manera como se especifica en la Parte 1 o en la Parte 2. El tamao de la muestra adecuado para cualquier material puede calcularse de la siguiente manera: La cantidad ptima de protena por matraz se encuentra entre 0,15 g y 0,30 g para cualquier muestra. Por tanto, si una muestra de queso Cheddar promedio contiene 24,00 % de protena, entonces la cantidad de muestra de queso Cheddar debera estar entre 0,625 g y 1,25 g. La decisin de emplear pesos de muestra que se promedien en el extremo inferior o superior de la serie depende de cuanto cido consumir el remanente de componentes de la muestra (es decir, grasa y carbohidrato) durante la digestin. En el mtodo descrito en la parte 1, el analista comienza con 25 ml (aprox. 46 g) de cido sulfrico. Al finalizar la digestin se deben dejar cerca de 15 g de cido sulfrico en el matraz Kjeldahl para retener todo el nitrgeno. La crema con contenido graso del 40 % es un ejemplo de producto difcil. En este caso el contenido de protena o nitrgeno de la muestra es bajo y el contenido de grasa es alto. Se asume que una muestra de crema promedio contiene cerca del 40 % de grasa, 1,9 % de protena y 2,9 % de lactosa. Para lograr 0,15 g de protena en el matraz, sera necesario emplear una muestra de crema de 7,89 g. Esta muestra contendra 3,16 g de grasa y la grasa sola consumira 56,8 g (aproximadamente, 30,9 ml) de cido sulfrico en la digestin. En estos casos debe reducirse la cantidad de muestra para permitir que una cantidad adecuada de cido sulfrico permanezca al finalizar la digestin. En el caso del material de muestra como la crema, tambin sera mejor emplear un titulante que cuente con una concentracin inferior (por ejemplo 0,01 mol/l). La cantidad de sacarosa requerida para un blanco o para normas de recuperacin para productos diferentes a la leche de bovino puede determinarse de la siguiente manera: 23

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Primero se requiere un clculo del contenido aproximado de grasa, protena y carbohidratos para el tipo de material de muestra y el tamao de muestra aproximado por emplearse en la digestin. En segundo lugar, durante la digestin, 1 g de grasa consumir cerca de 18 g de cido sulfrico, 1 g de protena consumir cerca de 9 g de cido sulfrico y 1 g de carbohidrato consumir cerca de 7 g de cido sulfrico. Con base en esta informacin se puede calcular la cantidad de cido consumido por una muestra y la cantidad de sacarosa requerida para consumir la misma cantidad de cido durante la digestin. Esta cantidad de sacarosa debera emplearse para el blanco y la norma de recuperacin de sulfato de amonio. Para la norma de recuperacin de nitrgeno aminocido (vase el numeral 6.6), se reduce la cantidad de sacarosa mediante la cantidad de cido que va a consumir (calculada como protena) el clorhidrato de lisina o triptfano. Se asume que la recuperacin de nitrgeno en la digestin del aparato empleado es la misma para productos diferentes a la leche, sin realizar experimentos de recuperacin con el fin de producir condiciones que logren niveles similares de cido sulfrico residual al finalizar la digestin. Para los productos deshidratados, o en polvo se pesan 2 g con precisin de 0,1 mg, en el material volumtrico de 50 ml, y se disuelven directa en el material volumtrico de 50 ml, con 20 ml de agua a 40 C, se agita la mezcla bien y se deja enfriar a 20 C. Luego se aplica el procedimiento para la determinacin de nitrgeno.

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Anexo B (Informativo) Bibliografa

1.

BARBANO, D.M., Clark J.L., Dunhais, C.E., Fleming, J.R. (1990) J. Assoc., Off. Anal. Chemistry 73, 849-859 SERTL, D. and MALONE, W.J.A.O.A.C. Int. 76: 711-719 (1993) AOAC, Official Methods of Analysis (1990) 15th ed., 4th Supplement (1993), Method Nr. 992.22

2. 3.

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Anexo C (Informativo)

Otras normas internacionales sobre el mismo tema

Nota. Las normas citadas a continuacin se relacionan nicamente para informacin; se invita a consultar las respectivas ediciones vigentes.

Organismo internacional ISO

Nmero norma

Tema

Principio

ISO

Parte 1. Titulacin kjeldahl Parte 2. Digestin en bloque titulacin kjeldahl Parte 3. Digestin en bloque (mtodo rpido), titulacin kjeldahl Parte 4. titulacin kjeldahl, despus de la eliminacin de las protenas. Parte 5. titulacin kjeldahl sobre precipitado de protena. INTERNATIONAL IDF Standard 98 Leche. Determinacin del Mtodo del DIARY A:1985 contenido de protena. colorante negro FEDERATION, Mtodo del colorante negro amido IDF amido (mtodo de rutina) Oficial Methods of AOAC Official Nitrgeno total en crema Titulacin Analysis of AOAC, Method 920.109 kjeldahl 17 TH Edition, 2000. Oficial Methods of AOAC Official Nitrgeno en leche (Total). Titulacin kjeldahl. Analysis of AOAC, Method 991.20 Mtodo Kjeldahl 17 TH Edition, 2000. Oficial Methods of AOAC Official Nitrgeno no proteico en Titulacin kjeldahl, leche entera despus de la Analysis of AOAC, Method 991.21 17 TH Edition, eliminacin de las 2000. protenas. INTERNATIONAL DIARY FEDERATION, IDF

ISO 5542:1984 Leche. Determinacin del Confirmada 2000 contenido de protena. Mtodo del colorante negroamido (Mtodo de rutina) ISO 9622:1999 Leche entera. Determinacin del contenido de grasa lctea, protena y lactosa. Gua sobre la operacin de instrumentos en medio infrarrojo. IDF Standard 20 Leche Determinacin del B:1993 contenido de nitrgeno. Parte 1: Mtodo kjeldahl Parte 2: Mtodo de digestin de bloques (mtodo marco) Parte 3: Mtodo de digestin de bloques (mtodo de rutina semi-micro-rpido. Parte 4: Determinacin del contenido de nitrgeno no proteico. Parte 5: Determinacin del contenido de nitrgeno proteico.

Norma ISO relacionada -----

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ISO/DIS 8968-1 ISO/DIS 8968-2 ISO/DIS 8968-3 ISO/DIS 8968-4 ISO/DIS 8968-5

ISO 5542:1984

991.20

ISO/DIS 8968-1

ISO/DIS 8968-4

Contina...

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(Final)

Organismo internacional Oficial Methods of Analysis of AOAC Oficial Methods of Analysis of AOAC

Nmero norma

Tema

AOAC Official Contenido de nitrgeno Method 991.22 proteico en leche AOAC Official Contenido de nitrgeno Method 991.23 proteico en leche

Oficial Methods of AOAC Official Protein in milk. Dye binding Analysis of AOAC, Method 967.12 Method I 17 TH Edition, 2000.

Oficial Methods of Analysis of AOAC, 17 TH Edition, 2000. Oficial Methods of Analysis of AOAC, 17 TH Edition, 2000.

AOAC Official Protein in milk. Dye binding Method 975.17 Method II

AOAC Official Mid-Infrared Method 975.18 Method

Spectroscopic

Norma ISO relacionada Titulacin kjeldahl ISO/DIS 8968-5 sobre precipitado de protena Diferencia entre la determinacin de nitrgeno total y nitrgeno no proteico. Mtodo del colorante negro amido con espectrofotometra o colormetro fotoelctrico. 5542:1984 Espectrofotometra ISO o colormetro (2000) IDF Standard 98 fotoelctrico A:1985 ISO 9622:1999

Principio

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