INTRODUCCIN Hay dos tems esenciales en la biologa molecular, las endonucleasas de restriccin que permite que el ADN se corte

en piezas precisas y los vectores de clonaje como plasmidos o fagos que se usan para insertar fragmentos de ADN forneo para producir mas material o producto de protena. El termino ingeniera gentica lo usamos para describir un rango de actividades que incluyen la manipulacin del ADN, la introduccin de cambios especficos en clulas somaticas, animal o planta, incluso cambios en la lnea germinal. NUCLEASAS - nucleasas hidrolizan un enlace ster en un enlace fosfodister - fosfatasas hidrolizan el enlace ester en el enlace fosfomonoester - nucleasas tienen multiples especificidades - endonuclesas de restriccin puede ser usadas para clivar el ADN en fragmentos definidos Nucleasas: son enzimas que degradan acidos nucleicos, lafuncion opuesta de las polimerasas. Ellas hidrolizan o cortan un enlace ester en un vinculo fosfodiester entre nucletidos adyacentes en una cadena polinucleotica. Las diferencias entre una fosfatasa y una nucleasa, es que la fosfatasa solo puede hidrolizar el terminal ester ligado a fosfatasa hacia el terminal nucleotidico de 35 , mientras que la nucleasa puede hidrolizar enlaces internos entre bases adyacentes. Las fosfatasas son importantes ya que permiten remover el terminal fosfatasa de la cadena polinucleotica. Podemos dividir a las nucleasas en : endonucleasas: puede hidrolizar enlaces internos de la cadena polinucleotica. Exonucleasas: deben empezar al final de la cadena e hidrolizar desde esa posicin.

Las nucleasas son especificas para el ADN, ARN como ARNasas, hidridos de ADN/ARN como RNA H. Cuando una nucleasas, endo o exo, hidroliza un enlace ester en una ligacion fosfodiester , puede ser especifico para uno o los dos enlaces ester generando un extremo 5`y un extremo 3`. La exonucleasa quizs ataca a la cadena polinucleotica del extremo 5` e hidrolizan de 5`a 3` o atacan del extremo 3` e hidrolizan de 3`a 5`. Endonucleasas de restriccin usualmente llamadas enzimas de restriccin son endonucleasas de eubacteria y arrquea que reconocen una secuencia especifica de ADN. Las enzimas de restriccin deben hacer dos cosas: - reconocer una secuencia especifica - cortar o restringir esa secuencia existen 3 tipos de estas enzimas, el tipo II es el mas comn, ellas reconocen el sitio y clivan en el mismo sitio, con un tamao de entre 4 a 8 bp. Estos sitios son tpicamente inversamente palindromicos.

Las enzimas de restrccion pueden cortar de dos formas, las mas comn es el corte escalonado, lo que deja las cadenas monocatenarias o sticky ends, la segunda forma es extremos romos que no deja sobresalientes. Las enzimas de restriccin de diferentes bacterias pueden tener el mismo sitio de reconocimiento pero el corte en el ADN es diferente, esas diferentes enzimas son llamadas isesquisomeros. Los tipos I y III difieren del tipo II en que el sitio de reconocimiento y el clivaje son diferentes y usualmente no palindromicos. Con el tipo I el sitio de clivaje puede ser de 1000bp, el tipo III tiene mas sitios de clivaje y puede reconocer entre 20-30 bp. Un mapa de restriccin representa la secuencia lineal de los sitios en una particular enzima de restriccin. Cuando una molecula de ADN corta adecuadamente con una enzima de restriccin clivan en distintos fragmento, estos pueden ser separados por un gel de electroforesis. Para analizar los fragmentos de restriccin del ADN podemos generar un mapa de la molecula original. El mapa muestra las posiciones que corto el ADN la enzima de restriccin. Un mapa de restriccin puede obtener cualquier secuencia de ADN. CLONACION el clonamiento de un fragmento de ADN requiere un vector especifico. Azul/blanco seleccin permite la identificacin de la bacteria que contiene el vector plasmidial del vector que contiene el inserto. Clonacin, es una definicin muy simple, clonar es hacer copias idnticas. El clonamiento del ADN tpicamente incluye el ADN recombinante, esto tambin es una definicin muy simple, una molecula de ADN ( o mas) de diferentes fuentes. Hay dos diferentes ADNs que necesitamos: un vector y un inserto o la molecula a clonar. Las dos clases de vectores mas comunes son derivados de plasmidos o virus. Estos vectores deben ser especficos para dar seguridad, esto quiere decir que el vector no se integre en el genoma ( a menos que ese sea su propsito) y que el vector recombianante no se autotransfiera a otra celula. Ambos, el vector y el inserto, deben estar restringidos con la misma enzima de restriccin para crear compatibilidad. Analizaremos ambos, empezaremos con el inserto. El inserto es el fragmento que se quiere amplicar, este puede venir de diferentes fuentes como un ADN genmico, o uno tomado de un gel de agarosa, fragmento de PCR, o incluso un fragmento sintetizado in vitro. El tamao y la naturaleza del inserto se debe saber. El vector es seleccionado en base a las respuestas de estas preguntas (que vamos a usar para cortar el ADN o que primers utilizaremos para amplificar el ADN). Vamos a utilizar como ejemplo el vetor blue/white selection vector, este vector ha sido construido con un muero importante de elementos. Tiene un ORI, origen de la replicacin, que permita la replicacin del plasmido que proporcionara el paso de amplificacin real. Contiene un gen de resistencia a ampicilina , amp, que permite la seleccin de la bacteria que contiene el vector. Tambin contiene el gen de E.Coli lacZ que permita la seleccin del inserto del fragmento de ADN en el vector. -

El gen LacZ fue costruido para que contenga un MCS, sitio de multiclonaje. Esta es una secuencia oligonucleotica con una seria de diferentes endonucleasas de restriccin. Este es el corazn del blue/White selection vector. El gen lacZ codifica para la enzima B-galactosidasa que corta el enlace galactosido en la lactosa. Tambin el enlace galactosido en un sustrato artifical llamado X-gal. Clonacin direccional, se selecciona el vector que tiene los sitios de restriccin apropiados. El siguiente paso es combinar el vector con el inserto, usualmente se usa un radio molar para insertar el vector de 5- o 10 a 1. El tamao del inserto es importante, muy largo (sobre 100kb) es un inserto que no es eficiente en un plasmido vector por lo que se necesitara utilizar otra alternativa. TRANSFORMACION Es un proceso por el cual el ADN es introducido en una celula husped. Hay dos mtodos comunes de transformacin: lavar la bacteria en una alta concentracin de sal, CaCl2, o electroporacion en el cual se aplica corriente elctrica. Ambos mtodos crean pequeos poros o hoyos en la pared celular. Incluso utilizando estos mtodos una pequea porcin de clulas bacterianas es transformada. La cepa de la E.Coli es importante, muestra que no tiene sistema de restriccin o sistema de modificacin. La cepa tambin es compatible con blue/White system, lo que significa que puede contener fragmentos alfa complementarios de LacZ. La transformacin resulta en multiples tipos de bacteria, debemos seleccionar un puado de bacterias que contengan el plasmido recombinante de millones. Las clulas bacterianas transformadas estn en una placa con agar contaminado con ampicilina (antibitico) y el inductor artificial B-gal llamado IPTG (isopropil tiogalactosido). La ampicilina en la placa matara la mayora de las clulas bacterianas, incluso las que no fueron transformadas con el plasmido amp. Ahora las colonias restantes pueden crecer y visualizarse. Se ven de dos tipos de colonias, las azules contiene el vector sin el inserto (porque B-gal rompe x-gal en un compuesto azul) y las blancas, la inactivacin de B-gal no rompi a x-gal por lo que se mantuvieron sin color, se ven. Este no es el final de la historia, falsos clones positivos se forman hay que identificarlos y removerlos. El ADN plasmidial debe correr en un gel para chequiar el tamao del inserto. VECTORES DE CLONAJE TIENEN QUE SER ESPECIALIZADOS PARA DIFERENTES PROPOSITOS - vectores de clonaje pueden ser plasmidos bacteriales, fagos, cosmidios o cromosomas artificiales de levadura. - Transporte de vectores puede ser propogada en mas de un tipo de celula husped. - Expresin vectorial contiene promotores que permiten la transcripcin de cualquier gen clonado. - Genes reporteros pueden ser usados para actividad promotora o la expresin de tejido especifico.

Numerosos mtodos existen para introducir el ADN en diferentes clulas blanco. Las ventajas de los plasmidos y los fagos, se combinan en el cosmidio, que se propaga como un plasmido pero usa el mecanismo del fago lambda para entregar el ADN a las clulas bacterianas. Los cosmidios pueden llevar insertos por sobre los 47 kb. El vector que se usa para clonar este largo posible inserto de ADN es el cromosoma artificial de levadura (YAC). El YAC tiene un origen de levadura para apoyar la replicacin, un centrmero para garantizar una apropiada segregacin y telomeros para la estabilidad. YACs tienen la mayor capacidad que cualquier otro vetor de clonaje y puede propagarse con insertos medidos en MB rango de medida. Vectores de transporte pueden usarse pueden usarse en mas de una especie de celular husped. Otros vectores como, vectores de expresin, contienen promotores para manejar la expresin de genes. En cualquier marco de lectura puede ser insertado el vector sin sufrir modificacin. Estos promotores pueden continuar activos o pueden ser inducibles por lo que solo se expresan bajo ciertas condiciones. Cuando la meta es estudiar la funcin del promotor clonado se prefiere usar un gen actual, genes reporteros, bajo el control del promotor de inters. El tipo de gen reportero depende de lo que nos interese, la cuantificacin de la eficiencia del promotor o la expresin del tejido especifico. Un vector de clonaje es creado en un promotor eucariotico ligado a la regin codificante de la luciferasa., un gen que codifica la enzima responsable de bioluminiscencia de la lucirnaga. El nivel de la actividad de la luciferasa es medido por la adiccin de sustratos de luciferina. Los resultados de la actividad de la luciferasa en una emisin de luz puede ser medida a 562 nanometros y es directamente proporcional a la cantidad de enzima que se hizo, depende de la actividad del promotor.