VITAE. REVISTA DE LA FACULTAD DE QUiMICA F ARMACEUTICA lSSN 0121-4004 Volumen 15 nmero 2. alio 2008. Un,'ersidad de Antioquia, Medellin. Colombia.

pgs. 251:258

PRODUCCIN DE ETANOL A PARTIR DE ALMIDN DE YUCA UTILIZANDO LA ESTRATEGIA DE PROCESO SACARIFICACIN- FERMENTACIN SIMULT-NEAS (SSF)
ETHANOL PRODUCTION FROM CASSAVA STARCH USING THE PROCESS STRATEGY SIMULTANEOUS SACCHARIFICATION-FERMENTATION Hader 1. CASTAO
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Carlos E. MEJIA G.2

Recibido: Mayo 9 de 2008 Aceptado: Julio 8 de 2008

RESUMEN
La tendencia mundial en el manejo de los combustibles, en especial los biocombustibles como el etanol, ha llevado a explorar nuevas metodologas de proceso para optimizar su produccin; por tal razn se aborda en esta investigacin el proceso sacarificacin fermentacin simultneas, se evala la influencia de la concentracin de azcares reductores y la dosificacin de la enzima Spirizyme fuel@ sobre la productividad y concentracin final de etanol, bajo el proceso SSF (sacarificacin -fermentacin simultneas), partiendo del licuado de almidn de yuca como sustrato. El proceso SSF se compara con un control con caractersticas de sacarificacin-fermentacin independientes (SHF), proceso convencional. Slo el factor concentracin inicial de sustrato presenta efecto sobre la productividad de etanol. Las cinticas de proceso, frente a las del control, presentan reducciones de tiempo de 47y 33% para los niveles de sustrato evaluados. Los niveles de productividad son mayores en un 33% para el nivel de 150gIJ. de AR (azcares reductores) y se mantiene constante para 200 gIJ.. La glucosa en la estrategia SSF, conforme se produce se transforma en etanol, no permitiendo alcanzar concentraciones superiores a 100 gIJ., lo que se traduce en que no se presentan inhibiciones por sustrato. La concentracin de etanol no afecta la reaccin de la enzima en el proceso de sacarificacin. El proceso SSF demuestra su viabilidad tcnica en la produccin de alcohol, al reducir los tiempos y necesidades de energa en la produccin de alcohol carburante a partir de almidn de yuca

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B"lo'etanol;,oalniidn de"'yuca, SSF, ~S-ftF--"-+_~h -'-~.-,.,~"~ ABSTRACT

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The wor1d trend on fuel management, in special biofuels like ethanol, have gone to eA-plorer new methodologies of process to optimize its production by this reason in this research is about simultaneous sacarification fermentation process and evaluate initial concentration of reducing sugar, and enzyme dosing of Spirizyme fuel@ are eva1uated on productivity and final concentration of ethano1, under SSF (Simultaneous Saccharification and Fermentation) process, from the product of the licuefaction process of cassava starch as substrate. The SSF process is evaluated against SHF (Independent Saccharification and Fermentation) process as control. On1y the factor, initial concentration of substrate presents effect over ethanol productivity. The kinetic ofSSF process, in opposite to the SHF process, presents time diminution of the global process around 47 y 33% to substrate levels of 150 and 200 gil respectively. The productivity values are most at a 33% to 150 gil ofreducing sugar, and they keep constant to 200 gil reducing sugar. The
Politcnico Colombiano de Amioquia, Jaime saza Cadavid. Facultad de Adminisrracin. Escuel; de Microbiologa. A.A. 1226 Medelln, A.A. 4932. Medelln. Colombia. Colombia.

:2

Universidad

AutOr a quien debe dirigir la correspondencia:

hicastano@elpoli.edll.co

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DE ETANOL

A PARTIR DE ALMlDN

DE YUCA

...

.'"

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Los sistemas SSF (sacarificacin-fermentacin simultneas) vs SHF (hidrlisis y fermentacin separadas) han presentado mayores conversiones globales de etanol. Reduccin de los tiempos de proceso al desarrollar la sacarificacin enzimtica y la fermentacin en forma simultnea. La menor temperatura del proceso de sacarificacin enzimtica se compensa con una mayor adicin de enzimas, de forma tal que no afecte la velocidad global del proceso. La reduccin en el tiempo de proceso permite aumentar la capacidad instalada de las plantas, mejorando la productividad y reduciendo los costos de produccin. Existen antecedentes del uso de la estrategia de proceso SSF en la produccin de etanol a partir de sustratos como harina integral de trigo y harirra integral de maz. Montesinos y Navarro (6), desarrollando los procesos de sacarificacin fermentacin simultneos, encontraron rendimientos de 87-89% de valor terico, adems de reducir en 5 horas el tiempo de proceso, lo que aument la productividad. Mojovic (11), realiz ensayos de sacarificacin-fermentacin simultneos a partir de hidrolizados de harina de maz a una temperatura de 32 C, disminuyendo los costos energticos del proceso de sacarificacin, que generalmente se realizan a 60 C. Los resultados obtenidos por SSF fueron muy similares a los obtenidos por el proceso convencional (etapas separadas), demostrando que el etanol no presenta ningn efecto inhibitorio sobre la cintica de la enzima glucoamilasa utilizada en los ensayos (Supersan@). Durante el proceso SSF, la concentracin de glucosa fue mantenida por debajo de concentraciones inhibitorias (100 gil), lo que favorece la cintica de crecimiento celular y, por ende, la cintica de formacin de etanol, al ser ste un metabolito primario. Mojovic (11), alcanz concentraciones de 8% en volumen de etanol al cabo de 35 horas de proceso, partiendo de un hidrolizado de harina de maz 1:3 (harina/agua), 85 C, pH 6.0 y 1 hora de proceso como condiciones de la licuefaccin. Las condiciones de sacarificacinfermentacin simultneas fueron pH 5.0, T 32 C, 1.35% p/p inculo y 36 AGU de Supersan@. Pese a desarrollar el proceso a una temperatura inferior a la ptima para la enzima, su actividad a 32 C no se afect drsticamente, factor importante para extrapolar esta estrategia en los procesos de obtencin de etanol a partir de almidn de yuca.

MATERIALES Y MTODOS
Almidn de yuca refinado (Empresa Productos del Maz, Cali Colombia), adquirido localmente se utiliza como sustrato para la obtencin de etanol utilizando la estrategia de proceso de sacarificacin-fermentacin simultnea (SSF). Se determinan los contenidos de humedad y almidn del producto comercial. Como control de los procesos de SSF, se realiza un proceso en el que las etapas se realizaron en forma independiente (SHF), con las siguientes condiciones de operacin: licuefaccin (T 83C, pH 5.5, dosis de enzima 0.5 mVl Liquozyme@ (a amilasa), agitacin 400 rpm); sacarificacin (T 60 C, pH 4.5, dosis de enzima 1.5 mVl Spirizyme fuel@ (glucoamilasa], agitacin 400 rpm); fermentacin alcohlica (T 30 C, pH 4.5, inculo 8 gil en peso seco, agitacin 400 rpm). La estrategia de proceso de SSF se realiza bajo las siguientes condiciones de operacin: la etapa previa de licuefaccin se realiza en las mismas condiciones de operacin descritas previamente para el proceso de SHF; temperatura 30 oC, pH 4.5, concentracin de azcares reductores segn diseo de experimentos, dosis de enzima spirizyme fuel@ segn diseo de experimentos, inculo 8.0 gil peso seco de levadura Sacchlromyces cerelJisiae (0.8% p/v) y agitacin 400 rpm. El diseo experimental (Vase Tabla 1) se basa en el uso de un diseo factorial completamente aleatorizado de dos factores evaluados a dos niveles, con dos rplicas. Los anlisis de laboratorio se desarrollaran por duplicado. El anlisis estadstico se realiza con la ayuda del paquete estadstico Stat Graphics 4.0@,empleando la herramienta de

ANOVA tipo II
Tabla 1. Valores de los niveles de los factores a evaluar
en el proceso de obtencin de etanol utilizando la estrategia de proceso SSF.
Ensayo Control 1 2 3 Sustrato 200 150 150 200 200 gIl AR Enzima/sustrato 1,5 3,0 1.5 3,0 1,5 mili Proceso SSH SSF SSF SSF SSF

En los procesos de licuefaccin sacarificacin SSF y fermentacin se hace segui~iento a las con~ centraciones de biomasa (x), azcares reductores

PRODUCCIN

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de la licuefaccin, enriquecido con las sales descritas en la preparacin del sistema SSF y activado durante cuatro horas, a 30.0 :!::0.1 C, en un agitador orbital a 110 :t 1 rpm, a partir de levadura Saccl1.aromyces cerevisiae granulada. Durante los procesos SSF se determinan las concentraciones de glucosa y azcares reductores por los mtodos de glucosa oxidasa y DNS respectivamente; adicionalmente se hace . seguimiento a la biomasa por la tcnica de peso seco. El etanol se cuantifica por cromatografa lquida de alta eficiencia (CLAE), utilizando una columna Supelcogel C-160H, 300x7.8 mm; como fase mvil se utiliza una solucin de 0.1% cido fosfrico grado HPLC con un flujo de 0.5 m1/min, utilizando detector de IR. El proceso SSF se desarrolla en un biorreactor B-Braund@ con un volumen til de 5 litros, agitado mecnicamente con control de pH, temperatura y frecuencia de agitacin.

RESULTADOS Y DISCUSIN
El proceso de licuefaccin del almidn de yuca en las condiciones de proceso descritas anteriormente, presenta una conversin de almidn a maltode:A1:rinas de un 47.2 :!::1.1 % al cabo de 2.5 horas. En el caso del seguimiento al proceso de sacarificacin de las maltodextrinas producto de la etapa de licuefaccin, se alcanza una conversin de 98.0 :!::1.4% de almidn a glucosa en un tiempo de proceso de 12 horas. Los perfiles de concentracin de etanol, biomasa, glucosa y azcares reductores para el control y los tratamientos se muestran en la figura 5. Cada grfica muestra el comportamiento medio de las dos rplicas de cada tratamiento experimental. El tratamiento de control (SHF) presenta un perfil de concentracin de los analitos caracterstico de un proceso de fermentacin por lotes, con un tiempo de proceso de 60 horas.
Ensayo 1

Fennenlacin Control
220 200 '" 180 ;160 '0140 <; 120
;;: 100

120
110 _100 -+-

Biomasa pro

-+-ARIlIO Glucosa llIom ........Etan~ prom

C. 90 .~ 80 ' 70
~ 60

-.-Biomasa
- .., ....Azcares Reductores

~ 80 :; 60 ~ 40 20

~ 50 ~ 40 ~ 30 ~ u 20 10
O

Glucosa .." ... Etanol

o o
10 20 30 40 50 80 Tiempo (horas)

10 15 20 25 30 35 40 Tiempo (horas)

B
Ensayo 3
140

Ensayo 2
200

120 ~150
'0

i
e

-+--

Siamasa Glucosa Etand

~100
.; 80

....... A.R.

.- .... AA Glucosa -Etanol

100 50

g
U

:oE
u

:~ 20

. .

10

15

20

25

30

35

-20 TIempo (horas)

Tiempo (horas)

e
Ensayo 4
140 '20 100

'O
60 40 20

_Biomasa AA Glucosa Etanol

o
-20 Tiempo (horas)

Figura 5. Concentracin de biomasa, azcares reductores (AR), glucosa y etanol durante experimentos SHF (A) y SSF (B, C, D y E) con inculo de 8 gil, utilizando como sustrato glucosa proveniente de hidrlisis total de almidn de yuca (A) y maltodextrinas productos del proceso de licuefaccin del almidn de yuca (B, C, D Y E); T 30.0 :t O.1C, pH 4.50 :t 0.01 Y agitacin mecnica 400 :t1 rpm. (A) So 200 gil glucosa, (B) So como AR 150 gil, relacin enzima/sustrato 3.0, (C) So como AR 150 gil y relacin enzima sustrato 1.5, (D) So como AR 200 gil y relacin enzima/sustrato 3.0, (E) So como AR 200 gil y relacin/ enzima sustrato 1.5. En todos los experimentos se usa Splrizyme fuel@como enzima sacarificante. En el proceso de licuefaccin se usa la enzima Liquozyme@ a una dosis 0.5 ml/l dispersin

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del proceso (p :s: 0.05). El anlisis del efecto de la relacin enzima/sustrato sobre la productividad, al menos para los niveles evaluados, no presenta significancia estadstica, lo que implica que se puede trabajar con el nivel inferior evaluado, con el objetivo de reducir costos de enzima en el proceso (Vanse tablas 5 y 6). Tabla 5. Efecto cruzado de la concentracin de sustrato y dosis de enzima sobre el tiempo total de proceso
Enzima mili Sustrato

gIl
1.5

3.0
36,2 48,85

150 200

39
47,4

Tabla 6.Efecto cruzado de la concentracin

y dosis de enzima sobre la productividad
Enzima mili Sustrato g/l

de sustrato de etanol

1.5

3.0
1,32

150 200

1,33

De esta forma se puede evidenciar que los ensayos 1 y 2 presentan valores de 1.32 ::t 0.07 g/lh Y 1.33 ::t 0.04 g/lh de productividad respectivamente, lo que permite concluir que no hay efecto significativo de la variable dosis enzima/sustrato sobre la productividad a concentraciones iniciales de sustrato de 150 g/l (p menor 0.05 anlisis de varianza); pero dan como resultado una productividad 33% mayor frente al control del diseo experimental (1.33 ::t 0.07 g/lh vs 1.02 ::t 0.08 g/lh respectivamente). Si bien los valores de concentracin final de etanol son mayores para el control, los procesos de produccin de etanol demandan mucho menor tiempo (50%, 72.0 ::t 2.2 vs. 36.2 ::t 1.2 horas) en los ensayos 1 y 2, presentando mayor efecto sobre la productividad la reduccin en el tiempo de proceso. Si se comparan las productividades del ensayo SSH con las productividades de los ensayos 3 y 4, se observa que no hay diferencia significativa estadstica entre las dos estrategias de proceso segn prueba de anlisis de varianza (p menor 0.05). La menor concentracin de etanol al final del proceso en las cmtIcas de los ensayos 3 y 4 frente al control (58.0 ::t 0.6,49.0 ::t 0.7 vs. 61.0 ::t 5.6), se ve compensada en la reduccin de un 33% en los tiempos de proceso (48.8 ::t 3.1,47.74 ::t 0.71 vs. 72.0 ::t 2.2 horas). (Vase tabla 4). Al cruzar el efecto de los factores de concentracin inicial de sustrato y dosis de enzima sobre la productividad de etanol, se presenta la misma reduccin en la productividad para las dos dosis de enzima evaluadas (Vanse tablas 5 y 6).

1,09

1,07

Anlisis del tiempo de proceso Se observa una reduccin muy importante en el anlisis comparativo del tiempo total del proceso para la estrategia SSF. El control demanda 72 horas de proceso por causa de efectos inhibitorios de sustrato, mientras que los ensayos 1 y 2 demandaron 36 y 38 horas respectivamente, lo que equivale a reducciones del 50 Y 47%, muy significativas a la hora de valorar el ahorro en tiempo y el incremento en productividad. Los ensayos 3 y 4 presentan reducciones del 33% en el tiempo de la cintica del proceso. Los menores porcentajes de reduccin de los ensayos 3 y 4, frente a los ensayos 1 y 2, se explican por la mayor concentracin de sustrato al inicio del proceso SSF (Vase tabla 4). El tiempo total de proceso se aumenta al incrementar la concentracin inicial de sustrato, sin presentar ningn efecto al incrementar en un 100% la dosis de enzima usada en el proceso, lo que permite inferir que el proceso de sacarificacin-fermentacin simultneos est gobernado por el metabolismo de la levadura y no por el proceso enzimtico de sacarificacin. Anlisis de la productividad Los valores de productividad de etanol se ven afectados, tanto por la concentracin final como por el tiempo en el que se obtiene dicha concentracin.

CONCLUSIONES
La estrategia de proceso de sacarificacin-fermentacin simultneas permite reducir en promedio 24 horas (33%) el tiempo de los procesos evaluados a una concentracin inicial de sustrato de 200 gil, y en 36 horas (50%), el tiempo de los procesos cuya concentracin inicial de sustrato fue de 150 gil. Las productividades de los procesos de produccin de alcohol a partir de almidn de yuca, usando la estrategia SSF, para concentraciones iniciales de sustrato de 200 gil y los dos niveles de la enzima Spirizyme fueeiY evaluados (1.5 y 3.0m1/1), se mantienen constantes frente al proceso convencional, donde las etapas de sacarificacin y fermentacin se realizan en forma independiente. Para el nivel de concentracin inicial de sustrato de 150g/1, se alcanza una