Facultad de Qumica, Bioqumica y Farmacia Departamento de Qumica Area de Qumica Orgnica Dr. Antonio T.

DArcangelo

Universidad Nacional de San Luis

QUIMICA ORGANICA II
Licenciatura en Bioqumica Licenciatura en Biologa Molecular
GUIA DE ESTUDIO DIRIGIDO GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS MATERIAL COMPLEMENTARIO

- AO 2010 -

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS DE LABORATORIO

Qumica Orgnica II

Normas de Seguridad

SEGURIDAD EN EL LABORATORIO QUMICO El laboratorio qumico constituye un medio ambiente riesgoso en el que debemos desarrollar nuestras tareas habituales. El riesgo es muchas veces inevitable toda vez que se deben manipular algunas sustancias agresivas. Sin embargo, con ciertas precauciones y normas a respetar escrupulosamente, el laboratorio no ser ms peligroso que el propio hogar. Muchas de las drogas que se utilizarn en el laboratorio para la ejecucin de los Trabajos Prcticos no es posible reemplazarlas, as el cloroformo utilizado para extracciones resulta ser el solvente ideal ya que es poco soluble en agua, excelente solvente de la mayora de las molculas orgnicas de tamao medio, pero..... sospechoso de ser agente cancergeno y probado txico heptico, de igual forma el metanol para el sistema nervioso central y mltiples ejemplos ms. Sin embargo su uso con ciertas precauciones, no conlleva mayor peligro. Todos los que trabajamos en un laboratorio somos responsables de conocer y respetar ciertas normas bsicas de seguridad; en definitiva, cada uno de nosotros deber llevar a cabo su tarea de la manera ms segura para s mismo y su grupo de trabajo. Reglas Esenciales para la Seguridad en el Laboratorio Las reglas esenciales para la seguridad en el laboratorio qumico pueden ser expresadas en dos simples subttulos: SIEMPRE y NUNCA. SIEMPRE Consulte al Jefe de Trabajos Prcticos y Ayudantes ante cualquier duda. Preocpese por conocer las normas de seguridad a aplicar en cada Trabajo Prctico. Tenga en cuenta la Salida de Emergencia del Laboratorio. Identifique los lugares donde se encuentran los matafuegos, no los utilice salvo que se le solicite. Utilice proteccin en los ojos con anteojos adecuados. Utilice guantes aptos para manipular muestras biolgicas. Vista la ropa adecuada. Lave sus manos antes de abandonar el laboratorio. Lea las instrucciones cuidadosamente antes de iniciar cualquier experimento. Utilice propipetas o probetas para medir volmenes de custicos y solventes. Verifique que el equipo a utilizar est perfectamente armado. Maneje todas las sustancias qumicas con el mximo de los cuidados. Mantenga su rea de trabajo limpia y ordenada. No deje papeles ni abrigos cerca de la mesada. Est atento a las salpicaduras de lquidos. 44

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Normas de Seguridad

NUNCA Beba o coma en el laboratorio. Fume en el laboratorio. Caliente solventes con llama directa. Introduzca material enjuagado con solventes inflamables en la estufa de secado. Pipetee custicos o solventes. Descarte las capas orgnicas de las extracciones en la pileta de lavados. Pruebe o inhale sustancias qumicas, salvo que se le indique. Camine por el laboratorio innecesariamente. Distraiga a sus compaeros de trabajo. Corra en el laboratorio, ni an en caso de accidentes. Retire material caliente de la estufa de secado sin utilizar guantes. Trabaje solo en el laboratorio. Lleve a cabo experimentos no autorizados.

Proteccin de los ojos: Recibir instrucciones cada vez que sea necesario utilizar proteccin ocular; es recomendable que adquiera sus propios anteojos para uso personal; puede hacerlo en cualquier comercio de artculos de seguridad industrial. No es aconsejable trabajar en el laboratorio con lentes de contacto, ya que en caso de proyecciones de custicos o solventes stos pueden daar el ojo en forma irreversible antes de lograr remover la lente. Si debe usar lentes de contacto slo puede hacerlo con la proteccin ocular (anteojos) permanente. Ropa: El laboratorio no es el lugar apropiado para vestir sus mejores ropas. Estas deben ser simples y adecuadas. Las proyecciones y salpicaduras de productos qumicos pueden ser inevitables. Por esta razn no es conveniente usar faldas, shorts o guardapolvos cortos ni tampoco calzado abierto. De igual manera es desaconsejable una cabellera larga, y de tenerla llevar el cabello recogido. Disponga siempre en la mesada de un repasador de tela de algodn. Equipos y aparatos: No comenzar a utilizarlos si no se comprende su funcionamiento; por ejemplo bombas de vaco, evaporadores rotatorios, fusimetros o cilindros de gases comprimidos. Se puede arruinar equipo costoso o bien ocasionar un accidente. Siga esta regla de oro: Ante la duda ...Consulte Siempre verifique que el aparato est correctamente ensamblado. 45

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Normas de Seguridad

Manipulacin de Reactivos: Muchos de ellos son txicos, corrosivos, inflamables o explosivos, por lo que su manipulacin deber hacerse con gran cuidado. El fuego es el mayor riesgo en un laboratorio de qumica orgnica y muchos solventes son altamente inflamables. Un fuego producido por solventes puede llevar la temperatura del ambiente por encima de los l00 C en unos pocos segundos!!!!!. Si se trabaja con mecheros cuide no tener solventes inflamables en las proximidades. Nunca transfiera solventes inflamables existiendo una llama prxima. Todo reactivo voltil, en particular los corrosivos o txicos, debe manipularse bajo campana con extraccin forzada de aire. Evite el contacto de los productos qumicos con la piel, en todo momento. Salpicaduras Toda superficie salpicada se deber limpiar de inmediato de la forma que se le indique. En general, cidos se neutralizan con bicarbonato de sodio o carbonato de sodio y los lcalis con sulfato cido de sodio. Si la salpicadura es de un solvente inflamable apagar los mecheros de la zona hasta que se haya evaporado y si se trata de una sustancia altamente txica, alerte de inmediato a sus compaeros de trabajo e informe al Jefe de Trabajos Prcticos. Drogas Peligrosas, su clasificacin Una de las reglas bsicas de seguridad indica que se deben leer cuidadosamente las instrucciones contenidas en la Gua de Laboratorio antes de iniciar cualquier experimento. Las diferentes drogas a utilizar en el laboratorio pueden pertenecer a cualquiera de los siguientes grupos: Inflamables, Explosivos, Oxidantes, Corrosivos, Txicos, Irritantes, Lacrimgenos, agente sospechoso de carcinognesis Tenga presente que un compuesto en uso puede pertenecer a ms de un grupo.En la bibliografia base de este escrito, como as tambin en el Handbook of Chelnistry and Physics, podr encontrar suficiente informacin sobre las drogas que utilizar en los diferentes Trabajos Prcticos, adems en cada jornada ser informado de los cuidados a considerar en la tarea a ejecutar.

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Normas de Seguridad

Bibliogrfa Experimental Organic Chemistry. Harwood L.M. Moody, C.J. Blackwell Scientific Publications, 1989. Microscale Organic Laboratory. Mayo, D.W., Pike, R.M. and Butcher, S.S. John Wiley & Sons. New York, 1989.

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Compuestos Heterocclicos

Trabajo Prctico de Laboratorio COMPUESTOS HETEROCICLICOS PORFIRINAS

Objetivo: Extraer un colorante natural a partir de material vegetal fresco. Registrar y analizar los espectros de absorcin del colorante y derivados.

OBTENCION DE CLOROFILAS A PARTIR DE HOJAS VERDES ESPECTROS DE ABSORCION EN LA ZONA VISIBLE Cortar en tiras finas y pesar 5 g de hojas verdes de acelga. Colocar el material en un mortero con cantidad suficiente de arena lavada, agregar 25 ml de acetona:agua (80:20) y moler finamente las hojas. Filtrar por algodn o lana de vidrio recogiendo el filtrado en un tubo de ensayo. Transferir el slido nuevamente al mortero y practicar dos extracciones con 15 ml de ter etlico cada vez y filtrar. Observar el color y fluorescencia a la luz ultravioleta. Registrar el espectro de absorcin en el rango de 700 a 400 nm. Separacin de Mg++ de la Clorofila "a" (Obtencin de Feofitina) A la solucin etrea de clorofila , utilizada para obtener su espectro de absorcin, agregarle 0,5 ml de c. clorhdrico 0,1 N. Calentar con cuidado en un tubo a B.M. hasta evaporar el ter y luego llevar a volumen original con acetona. Realizar el espectro correspondiente en el rango de 700-400 nm. Introduccin de Zn++ o Cu++ en la Feofitina. A la solucin de feofitina en acetona obtenida en la operacin anterior, adicionar una sal de Zn++ o Cu++, usando 1 ml de solucin concentrada de la sal. Calentar cuidadosamente por un minuto en B.M., hasta que la solucin se torne color verde. Graficar los valores de absorcin en el rango de 700-400 nm.

PRECAUCIONES: Evaporar el ter etlico bajo campana.

Bibliografa: H. Dujardin; P. Lazlo and D. Sacks. "The chlorophylls and experiment in bio inorganic chemistry. J. Chem. Ed. (1975),62, 11, 742-744.-

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Compuestos Heterocclicos

EXTRACCION DE CAFEINA DEL TE Y SU PURIFICACION

Objetivo: Extraer, purificar e identificar cromatogrficamente un producto natural.

Extraccin de cafena: En un vaso de precipitacin de 200 ml colocar 5 g de hojas de t y 150 ml de agua y calentar a ebullicin durante 15 minutos. Filtrar en caliente y agregar a la solucin filtrada 20 ml de solucin de acetato de plomo al 10 %. Calentar 5 minutos, con agitacin y dejar reposar en bao de hielo durante 20 minutos. Centrifugar y decantar el sobrenadante. En ampolla de decantacin extraer dos veces con una solucin de cloroformoetanol 3:1 con un volumen de 15 ml en cada caso. Posteriormente, juntar los extractos clorofrmicos y, utilizando siempre la misma ampolla de decantacin, lavar con 20 ml de hidrxido de sodio 2 N (en caso de observar emulsiones, agregar pequeos volmenes de etanol) y finalmente lavar con 30 ml de agua. Separar la capa orgnica, secar con sulfato de sodio anhidro y filtrar. Evaporar a seco los extractos clorofrmicos y observar las caractersticas de los cristales obtenidos.

Identificacin: Cromatografa en capa delgada: En una placa de slica gel, sembrar, previa disolucin en cloroformo (pequeas cantidades), la cafena obtenida y un patrn de cafena. Desarrollar el cromatograma en capa delgada utilizando como solvente de corrida cloroformo-etanol en una proporcin 9:1 y revelar con solucin etanlica de cido fosfomolbdico al 10%.

Analice y asigne las seales del correspondiente espectro de RMN de 1H.

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Compuestos Heterocclicos

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Compuestos Heterocclicos

Trabajo Prctico de Laboratorio

Reduccin de acetofenona mediada por alcohol-deshidrogenasas dependientes de NAD(P)H - Anlisis por CG-FID.

Objetivo: Evidenciar la actividad biocataltica de tejidos vegetales en la reduccin asimtrica de cetonas proquirales mediadas por alcohol deshidrogenasas dependientes de NAD(P)H.

Reduccin biocataltica de acetofenona con races de zanahoria (Daucus carota) Lavar bien una zanahoria y quitar su cscara. Cortar en lminas de 0,2 cm de espesor o en cubos. Colocarlos en un erlenmeyer de 250 mL conteniendo 100 mL de agua. Agregar con pipeta automtica 50 l de acetofenona (sustrato) e incubar en un agitador orbital (shaker) a 120 rpm durante 24 h. Reduccin qumica de acetofenona con NaBH 4 (borohidruro de sodio). A un baln seco se adicionan ml de acetofenona (equivalentes) y mg de NaBH 4 disueltos en ml de metanol, se tapa con un septum de goma provisto de una va de desprendimiento de gases y se agita a 0C hasta completar la reaccin; posteriormente se adiciona agua, luego se extrae con ter etlico en ampolla de decantacin. La fase etrea se seca con sulfato de sodio anhidro, se evapora el solvente en evaporador rotativo de vaco. El monitoreo de la reaccin se realiza por CCD (cromatografa en placa delgada) utilizando como eluyente una mezcla de n-hexano: acetato de etilo en relacin 7:3. Se puede evidenciar la presencia de reactivos y productos bajo lmpara UV o utilizando un revelador como solucin de anisaldehdo que se roca sobre la placa cromatogrfica desarrollada y se calienta en estufa a 180 C. Extraccin Transcurridas las 24 horas, separar las races de zanahoria del medio de reaccin por decantacin (esta etapa se realizar con los ensayos llevados a cabo en la comisin de trabajos prcticos de laboratorio del da anterior). Realizar una particin lquido-lquido utilizando como solvente 50 mL de AcOEt (acetato de etilo). Repetir este procedimiento por duplicado. Colocar la fase orgnica en un vaso de precipitado perfectamente seco y agregar Na 2 SO 4 anhidro. Dejar reposar durante 5 minutos y filtrar, recolectando el filtrado en un baln seco. Concentrar la muestra en evaporador rotatorio (rotavapor) y transferirla con una pipeta Pasteur a un vial o eppendorf para su posterior anlisis por cromatografa gaseosa.

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Qumica Orgnica II Cromatografa gaseosa (GC)

Compuestos Heterocclicos

Objetivo: Identificar cualitativamente mediante cromatografa gaseosa quiral el producto de reduccin de acetofenona por va qumica y biolgica.

Parte experimental:

El anlisis por cromatografa gaseosa ser llevado a cabo en un cromatgrafo Perkin-Elmer Clarus 500 con detector de ionizacin de llamas (FID) provisto con una columna quiral Supelco -DEX (60 m, 0.25 mm ID y 0.25 m df). Horno: T 1 =120C, T 2 =160C
(T=2.5C/min), 5 min. Inyector: 200 C, carrier: N 2 a 28 cm/s. Detector 300C.

Registro del cromatograma: Inyectar 1 l de la solucin del sustrato (acetofenona) disuelto en AcOEt y registrar el correspondiente cromatograma. Repetir la operacin inyectando una mezcla racmica de 1feniletanol obtenido por reduccin qumica con NaBH 4 . Finalmente, inyectar el extracto en AcOEt de la biotransformacin llevada a cabo con la zanahoria. Comparar los tiempos de retencin identificando cada uno de los picos y analizar la estereoselectividad del proceso biocataltico. Realizar el clculo de los correspondiente ee s (excesos enantiomricos) aplicando alguna de las siguientes ecuaciones:

ee = % del mayor estereoismero - % del menor estereoismero

ee = (fraccin molar del mayor estereoismero - fraccin molar del menor estereoismero)/100

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Hidratos de Carbono

Trabajo Prctico de Laboratorio HIDRATOS DE CARBONO Parte 1: Reacciones de Oxidacin Objetivo: Obtener cidos aldricos por oxidacin de monosacridos con HNO 3 (d) y realizar reacciones de oxidacin de mono y disacridos con agentes clivantes de glicoles.

1. Oxidacin con cido ntrico: Tcnica: En un vaso de precipitacin de 30 ml, disolver 1,0 g de galactosa ( 2,0 g de lactosa) en 10 ml de cido ntrico (sp.gr.1,15; 25% p/v); calentar suavemente bajo campana hasta reducir el volumen a aproximadamente 2 ml. Dejar enfriar a temperatura ambiente y diluir con 3 ml de agua helada. Separar el precipitado por filtracin o centrifugacin. Purificar el cido mcico obtenido disolvindolo en el mnimo volumen de solucin de hidrxido de sodio 10 % y reprecipitarlo con cido clorhdrico diluido. Separar el slido, procediendo de la misma manera que en la etapa anterior, secar entre papeles de filtro y determiniar su punto de fusin (212-213 C). Formular las reacciones correspondientes.

2. Oxidacin con cido peridico: Reaccin de Malaprade. Tcnica: Coloque 2 ml del reactivo de cido peridico en un pequeo tubo de ensayo, agregue 1 gota (no ms) de c. ntrico concentrado y agite vigorosamente. Luego, aada 1 gota o un cristal del compuesto que se va a ensayar. Agite la mezcla durante 10-15 segundos y aada 1-2 gotas de solucin acuosa de nitrato de plata 5%. La formacin instantnea de un precipitado blanco de iodato de plata indica que el compuesto orgnico ha sido oxidado por el periodato, el cual por consiguiente, se reduce a iodato. Esta reaccin constituye una prueba POSITIVA. Cuando no hay formacin de precipitado o aparece un precipitado color caf que se redisuelve al agitar, se considera que la prueba es NEGATIVA. Es importante usar cantidades exactas de reactivo y cido ntrico.

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Hidratos de Carbono

Fundamento de la prueba: El iodato de plata es muy poco soluble en cido ntrico diluido, mientras que el periodato es muy soluble. Sin embargo, si hay presente demasiado cido ntrico el iodato de plata no precipitar. En estas condiciones, las olefinas, los alcoholes secundarios, los 1,3-glicoles, las cetonas y los aldehdos no se ven afectados por el cido peridico. Aplique la prueba a las sustancias siguientes: a) alcohol isoproplico b) acetona c) etilenglicol d) glicerina e) glucosa f) cido lctico g) sacarosa

Anotar las observaciones y formular las reacciones correspondientes.

Preparacin del reactivo de Malaprade: El reactivo de cido peridico se prepara disolviendo 0,5 g de cido peridico (H 5 IO 6 ) en 100 ml de agua destilada.

Parte 2: Obtencin de osazonas: Objetivo: Determinar la presencia del carbono anomrico libre, mediante la obtencin de osazonas. Tcnica: Disolver en un tubo de ensayo 0,4 g de un hidrato de carbono en 5 ml de agua que contienen 0,6 g de acetato de sodio anhidro. Agregar 3 ml de una solucin que contiene 0,4 g de fenilidrazina, como clorhidrato, y 0,15g de acetato de sodio anhidro. Agitar unos minutos. Calentar el tubo de agua a ebullicin, anotar el tiempo que transcurre hasta la formacin de un precipitado. Enfriar a temperatura ambiente, dejar reposar unos minutos y filtrar. Lavar con agua fra varias veces el precipitado.

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Qumica Orgnica II Parte 3: POLISACARIDOS Almidn

Hidratos de Carbono

Objetivo: a. Comprobar las propiedades de almidn en solucin. b. Hidrolizar almidn por mtodos qumicos. c. Comprobar el poder reductor de almidn y su producto de hidrlisis. Los siguientes ensayos muestran algunas de las propiedades del almidn. 1. Ensayo de iodo para almidn: Se prepara una solucin de almidn mezclando ntimamente 2 g de almidn con 10 ml de agua y volcando esta mezcla en 200 ml de agua a ebullicin. Coloque 5 ml de la solucin de almidn en un tubo de ensayo y agregue una gota de una solucin muy diluida de iodo en solucin acuosa de ioduro de potasio (solucin lugol). Observe el color de la mezcla. Luego caliente a ebullicin y observe el efecto. Tambin observe lo que ocurre al enfriar la solucin. 2. Hidrlisis del almidn: En un erlenmeyer de 100 ml provisto de refrigerante de aire, coloque 25 ml de solucin de almidn y adicione 1 ml de cido clorhdrico concentrado. La solucin se calienta a ebullicin suave y, a intervalos pequeos, se toma 1 ml de la mezcla reaccionante, se enfra y se realiza el ensayo de iodo. Anotar el color de los ensayos en cada intervalo. Cuando la solucin ya no da positiva la reaccin con iodo, se neutraliza y se ensaya una pequea porcin con reactivo de Fehling. Repita este ensayo con la solucin de almidn sin hidrolizar y compare los resultados. Formule los productos finales de la hidrlisis del almidn (un disacrido y un monosacrido), y plantee el mecanismo general de hidrlisis cida de un glicsido. 3. Almidn y reactivo de Fehling: Con 3 ml de la solucin de almidn se ensaya la accin reductora del reactivo de Fehling y se anota el resultado. Reactivo de Fehling: El reactivo de Fehling es bsicamente sulfato cprico en medio bsico. Est compuesto por dos soluciones: - La solucin A contiene sulfato cprico disuelto en agua. - La solucin B contiene tartrato doble de sodio y potasio disuelto en medio alcalino de hidrxido de sodio. Ambas soluciones se mezclan en volmenes iguales en el momento de ser utilizada

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Qumica Orgnica II Trabajo Prctico de Laboratorio ESTEROIDES Parte 1: ESTROGENOS EN ORINA

Esteroides

Objetivo: Extraer y reconocer cromatogrficamente estrona, estradiol y estriol. Tcnica: Muestra: Orina recolectada durante 24 horas, sin conservadores y mantenida en la heladera. Si el volumen total es inferior a 1200 ml, diluir con agua hasta alcanzar ese volumen. 1.- Hidrlisis: Colocar en un baln de 500 ml, provisto de refrigerante a reflujo, 200 ml de orina y calentar hasta ebullicin (agregar al baln piedra pmez, para evitar proyecciones). Agregar a travs del refrigerante, 15 ml de HCl conc. y continuar el calentamiento durante 1 hora ms, manteniendo siempre una ebullicin suave. Concluido el tiempo de calentamiento, enfriar el baln bajo canilla y trasvasar su contenido a una ampolla de decantacin. Realice tres extracciones con ter etlico, empleando 20 ml de ter en cada extraccin. 2.- Extraccin de las fracciones fenlicas: Al extracto etreo anterior, se lo lava 4 veces con solucin buffer de carbonato de sodio pH 9,7 empleando, para cada extraccin, 30 ml de solucin. Desechar la capa acuosa alcalina. Extraer la capa etrea tres veces con NaOH 1N empleando, para cada extraccin, 20 ml de solucin. Reunir en un baln los extractos alcalinos, y con sumo cuidado, eliminar en rotavapor, el ter, que pudiera contener la solucin. Eliminado totalmente el ter, calentar la solucin alcalina a ebullicin, por espacio de 15 minutos. Transcurrido ese tiempo, acidificar la solucin (realizar esta operacin en bao de hielo) con H 2 SO 4 conc.; y luego sature la solucin con NaHCO 3 slido. Trasvasar todo el contenido del baln a una ampolla de decantacin, y realizar tres extracciones con ter etlico, empleando para cada extraccin, 20 ml de ter. Al extracto etreo lavarlo 2 veces con 50 ml de agua, se seca con Na 2 SO 4 anhidro durante 15 minutos, se filtrar y concentrar hasta sequedad. 3.- Identificacin: Se realiza mediante la tcnica de cromatografa en placa delgada, utilizando patrones comerciales de estrona, estradiol y estriol: Solvente de corrida: Benceno:EtOH (9:1) Revelador : Acido fosfomolbdico

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Esteroides

Parte 2: DETERMINACION SEMICUANTITATIVA DE PREGNANDIOL EN ORINA. Objetivo: Extraer y determinar pregnandiol en orina. Diagnstico de embarazo Tcnica: El ensayo se lleva a cabo de la siguiente manera: 2 ml de HCl conc. (densidad 1,19) se aaden a 20 ml de orina filtrada, recolectada durante 24 horas y llevada a un volumen final de 1200 ml, y se somete a calentamiento durante exactamente 10 minutos a 90 C con un refrigerante de aire . Despus de enfriar rpidamente bajo agua corriente, la muestra se transfiere a una ampolla de decantacin, donde se extrae con ciclohexano, utilizando 15 ml en cada extraccin (dos extracciones en total). El extracto obtenido, se lava 2 veces, en ampolla de decantacin, con 20 ml de NaOH 1N cada vez; del mismo modo 2 veces con 30 ml de agua y por ltimo se deja secar 15 minutos con Na 2 SO 4 anhidro. El extracto seco se filtra y el Na 2 SO 4 se lava con unos pocos ml de ciclohexano a efecto de una transferencia cuantitativa. La solucin se lleva a sequedad en evaporador rotatorio de vaco.

Evaluacin cualtitativa: El residuo anterior, se retoma con pequeos volumenes de cloroformo y, posteriormente, se siembra en una placa de slica gel paralelamente con un patrn de pregnandiol. La placa se corre en cloroformo:acetona 9:1, y como revelador se emplea una mezcla de H 2 SO 4 :HAcO: : H 2 O (oleum) y se somete a calentamiento a 120 C durante unos minutos. La evaluacin se hace por comparacin visual del Rf de las manchas de pregnandiol de la muestra con la del patrn.

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Aminocidos y Protenas

Trabajo Prctico de Laboratorio AMINOACIDOS Y PROTEINAS

Parte 1: Propiedades anfotricas de los aminocidos. Curva de Titulacin de Glicina

Objetivo: Obtener la curva de titulacin, en funcin del pH, de glicina, en ausencia y presencia de formaldehido. Comparar las curvas obtenidas, calcular los pK a correspondientes y el punto isoelctrico del aminocido. Conocimientos necesarios para la realizacin e interpretacin del trabajo: a.- Equilibrio cido-base. Nomenclatura y formulacin de Bronsted-Lowry y Lewis. pH. Curva de titulacin de cidos dbiles. b.- Aminocidos como iones dipolares. Curvas de titulacin, en medio acuoso y con el agregado de formol, etanol o acetona. pH observados. Formas inicas. c.- Punto isoelctrico de un aminocido. Clculo del mismo.

Se realizarn las siguientes curvas de titulacin: 1) 200 ml de glicina 0,05 M en agua, titulado con NaOH 1 M. 2) 200 ml de glicina 0,05 M en agua, con formol (glicina 0,05 M; formol 1 M) titulado con NaOH 1 M. Para realizar la curva 1 prepare la siguiente solucin: Glicina 1 M.............. 10,00 ml (exacto) HCl 1 M.................. 10,00 ml (exacto) Agua destilada......... 180,00 ml (exactos)

Para realizar la curva 2 prepare la siguiente solucin: Glicina 1 M.............. 10,00 ml (exacto) HCl 1 M................. 10,00 ml (exacto) Formaldehdo............ 01,00 ml (exacto) Agua destilada.......... 170,00 ml (exactos)

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Aminocidos y Protenas

Colocar en un erlenmeyer de 500 ml la mezcla inicial a titular, preparar la bureta con la solucin titulante (NaOH 1M). Asegure el buen funcionamiento de los robinetes. El pHmetro deber estar calibrado con buffer pH 4,0 a temperatura ambiente.

Precauciones: La medicin de los volmenes de glicina, cido clorhdrico y formaldehdo deber realizarse con exactitud, para ello se utilizar pipetas de doble aforo (usar una pipeta para cada caso).

Titulacin: Colocar en el vaso de precipitacin la solucin a titular, a temperatura ambiente, con el agitador. Introducir con mucho cuidado el electrodo de vidrio hasta que el lquido cubra el bulbo y el orificio de unin lquida del electrodo de referencia. Acercar la bureta de modo que el pico de la misma est dentro del vaso de precipitacin. Agitar por un momento; dejar reposar el lquido y medir el pH inicial de la solucin. Dejar caer un volumen de la solucin titulante y agitar suavemente (los volumenes a agregar se encuentran en la tabla de valores). Dejar de agitar y proceder a la lectura del pH. Continuar agregando el reactivo titulante segn lo indicado en la tabla de valores, agitando despus de cada agregado y dejando de agitar, para luego realizar la lectura de pH. Proseguir la titulacin hasta pH extremo, (alrededor de pH 10-12) con NaOH.

Precauciones: Al llegar al pH extremo no dejar el electrodo de vidrio sumergido en la solucin por ms de dos 3 minutos (especialmente en medio alcalino), dado que el vidrio especial con que est fabricado el elctrodo es atacado y pierde sensibilidad. Inmediatamente, sacar el electrodo y lvelo con abundante agua bidestilada. Esta precaucin es esencial y se considerar falta grave no tratar el electrodo con estos cuidados. Al finalizar el trabajo prctico, lavar la microbureta con HCl al 10% y con agua destilada, para evitar de esta forma que se pegue el robinete y quede inutilizado.

Trace una curva de titulacin con pH en las ordenadas y miliequivalentes de reactivo agregado en las absisas. Comparar las curvas de glicina con formaldehdo y sin formaldehdo; para ello rena las dos curvas de glicina en una misma hoja de papel milimetrado. Indique los respectivos pK y calcule el punto isoelctrico del aminocido glicina.

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Aminocidos y Protenas

Tabla de valores NaOH 1M (ml) 0 Glicina pH Glicina + Formaldehdo pH

20.0 Parte 2: AMINOACIDOS Y PROTEINAS 1. Hidrlisis de Insulina Objetivo: Realizar la hidrlisis qumica de un pptido natural y observar sus aminocidos constituyentes, por anlisis cromatogrfico en CCD.

Tcnica: Colocar 1 ml de insulina (80-100 U) en un tubo ampolla y con cuidado, adicionar 1ml de HCl conc. Observe la coagulacin de la protena por adicin del cido. Cierrar, sobre llama de mechero, el extremo del tubo y colcarlo en un bao de agua a ebullicin durante 45 minutos. La temperatura del bao no debe ser inferior a 100 C, en caso contrario, utilizar un bao de glicerina. 60

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Aminocidos y Protenas

Transcurrido el tiempo de calentamiento, cortar el extremo del tubo ampolla y volcar, con cuidado, su contenido en un pequeo vidrio reloj. Llevar a seco sobre un bao de evaporacin. Retome el extracto seco con 2-3 gotas de cido actico diluido y realizar los cromatogramas correspondientes.

2. Cromatografa en placa del hidrolizado de insulina Condiciones de la cromatografa: Material: Fase estacionaria: Slica gel. Solvente de corrida: Butanol: cido actico: agua (60:20:20) Revelador: Ninhidrina (solucin alcohlica 1.5 %) Con el extracto obtenido, realizar el correspondiente cromatograma, empleando los patrones de aminocidos disponibles disueltos en cido actico. Una vez desarrollada la cromatografa, se seca, se revela y se coloca la placa en la estufa a 120 C, durante unos minutos.

Parte 3: ELECTROFORESIS Fraccionamiento de protenas sricas por electroforesis Objetivo: Separar mediante la tcnica electrofortica las proteinas presentes en el suero, utilizando como soporte acetato de celulosa. 1. Obtencin de suero: A partir de 10 ml de sangre extrada sin anticoagulante, separar el suero por centrifugacin a 3000 rpm durante 5-10 minutos. 2. Puesta a punto de soporte: Se sumergen las tiras de 8,5 cm por 2,5 cm de acetato de celulosa en solucin buffer de veronal-veronal sdico, pH 8,6 y fuerza inica 0,036, debiendo permanecer como mnimo 10 minutos, o bien hasta saturacin. Eliminar mediante suave presin entre papeles de filtro el exceso de buffer. 3. Ubicacin del soporte en la cmara de electroforesis: Valindose de pinzas colocar las tiras en el puente correspondiente. El contacto soporte- buffer, se efecta mediante papel de filtro Whatman N1 del mismo ancho de la tira. Se debe evitar el contacto directo de las tiras de soporte con la solucin buffer, para prevenir distorsiones del frente.

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Aminocidos y Protenas

4. Sembrado de la muestra y desarrollo del electroforetograma: Se siembra con capilares de vidrio el suero en una banda estrecha que no alcance los bordes de la tira de acetato de celulosa y a 2 cm del extremo catdico. Desarrollar la corrida electrofortica durante 60 minutos aplicando un potencial de 200 voltios, resultando un amperaje de 1 a 1,5 Amp. por tira. 5. Coloracin: Una vez finalizada la operacin anterior, se retiran las tiras y sin secar, se sumergen en la solucin colorante constituida por Negro de Amido 10 B (Amidoschwarz 10 B) al 0,5% en agua, durante 30 a 60 segundos. 6. Decoloracin: Se procede a remover el exceso de colorante usando una mezcla de metanol-cido actico (95:5), renovando la solucin de lavado hasta que no extraiga ms colorante. 7. Elucin y medida de la absorcin a 620 nm: Las tiras as tratadas se colocan sobre un portaobjetos cuidando de eliminar el aire que pudiera haber debajo de las mismas. Dividir las tiras en secciones de 3 mm de ancho a partir de ambos extremos no coloreados. Preparar tantos tubos de ensayo como secciones se dispongan, conteniendo cada una 3 ml de cido actico al 80 %. Separar ordenadamente las secciones de las tiras sumergindolas en el tubo correspondiente (apropiadamente identificado), agitar hasta disolucin. Leer en espectrofotmetro la absorbancia de cada fraccin a 620 nm, usando para calibrar el lquido eluyente (blanco). Graficar los resultados obtenidos. Algunas consideraciones a tener en cuenta a. Conservacin de las tiras de acetato de celulosa: El paquete abierto debe conservarse en posicin vertical hasta que se utilicen todas las tiras. Si las 25 tiras se usan en el lapso de una semana , agregar agua dentro del paquete; pero si se usan en un perodo superior a los 15 das, conservarlas en un recipiente conteniendo metanol. No dejarlas secar al aire porque las tiras pierden las dimensiones y las caractersticas del gel. b. Reconocimiento de la superficie permeable por las protenas: Slo una superficie es permeable por las protenas y se reconoce fcilmente porque es ms opaca, despus de secarse entre dos hojas de papel de filtro. c. Buffer pH 8.6 - Veronal sdico 0.04 (recomendado) - Veronal sdico 5.15 + EDTA - Veronal sdico + Veronal cido Precauciones: Utilizar guantes para manipular el suero. No abrir ni sacar las tiras de la cuba electrofortica mientras el equipo se encuentre enchufado. 62

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Acidos Nucleicos

Trabajo Prctico de Laboratorio ACIDOS NUCLEICOS

Obtencin y caracterizacin de los constituyentes de los cidos nucleicos

Objetivos: Aislar, purificar e hidrolizar el ADN. Caracterizar qumicamente sus componentes.

Tcnica: Colocar en un erlenmeyer 5 g de levadura y agregar 10 ml de solucin de NaOH al 40%. Dejar en contacto durante 30 minutos, calentando en bao mara y agitando peridicamente. Posteriormente agregar, 20 ml de agua destilada calentada previamente a 50-60 C. Filtrar a travs de un trozo de algodn. Colocar el residuo en un vaso de precipitacin y agregarle 15 ml de agua destilada (50-60 C), filtrar nuevamente por un trozo de algodn recogiendo sobre el filtrado anterior. Agregar al filtrado HCl concentrado hasta dbil reaccin cida al tornasol. Verter sobre el lquido igual volumen de alcohol. Recoger el precitado de cido nucleico sobre papel de filtro en un Buchner o separarlo por centrifugacin. Lavarlo con pequeas porciones de alcohol. Colocar el precipitado en un erlenmeyer, agregarle 30 ml de H2 SO4 al 10% y calentar a bao mara durante 30 minutos. En caso de excesiva evaporacin agregar agua destilada.

Reconocimiento de glcidos. Reaccin de Molisch. A 5 ml de la solucin anterior, agregar 4 gotas de solucin de -naftol, agitar y aadir por las paredes del tubo 3 ml de H2 SO4 concentrado. Observar los resultados.

Caracterizacin de fosfatos: Colocar 3 ml de la solucin en un tubo de ensayo y alcalinizar con NH4 OH. Acidificar con HNO3 concentrado y agregar luego, 3 ml de molibdato de amonio al 30%. Calentar y observar los resultados.

Caracterizacin de bases pricas: A 3 ml de la solucin agregarle NH 4 OH hasta la reaccin alcalina y luego, gota a gota, solucin de AgNO 3 al 10 %. Observar los resultados.

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