Prctica 1 Reaccion de la catalasa y de la deshidrogenasa lctica Introduccion Durante los procesos biolgicos y el constante intercambio con el medio, se generan

especies qumicas conocidas como radicales libres, se caracterizan por presentar un electrn desaparedo y por ser muy reactivas. Los radicales resultan de gran inters las especies reactivas derivadas del oxgeno debido a la estructura biradical de esta molcula y al gran nmero de procesos que las generan y en los que puede verse involucradas. Estas especies estn implicadas en el dao celular de forma que las agreciones oxidantes pueden dirigirse hacia la carcinognesis, enfermedades inflamatorias. Una de las enzimas que intervienen en la proteccin es la catalasa. La catalasa se encuentra en las clulas de tejidos animales y vegetales. La funcin en los tejidos es necesaria porque durante el metabolsmoo celular se forma una molecula toxica H2O2 y la catalasa lo descompone en agua y oxigeno. Objetivo En esta sesin de laboratorios se determinar cualitativamente la actividad enzimtica de la catalaza y de la deshidrogenasa Lactica o LDH. Material 1 gradilla 1 vaso de precipitados de 500 ml. 1 vaso de precipitados de 250ml. 4 pipetas de 5 ml. Procedimiento Catalasa 1. Prepare un bao de agua hirviendo utilizando su vaso de precipitados de 500 ml. Use solamete agua destilada y llene el vaso hasta la mitad. 2. Coloque en una gradilla cuatro tubos de ensaye y numrelos para su identificacin. 3. Adicione perxido de hidrgeno al 3% a cada uno de los cuatro tubos. 4. Agregue cinco gotas de cianuro de sodio al 5% al tubo 3. 5. Agregue cinco gotas de nitrato de plomo al 5% al tubo 4. 6. En un tubo de ensaye aparte, coloque 3 ml de sanre diluida 1:50 y calintela en el bao de agua hirviendo por cinco minutos. Agregue el contenido al tubo 2. 9 tubos de ensaye de 15 x 150 mm. 1 pinza para tubo de ensaye. 1 mechero , tripie y tela de asbesto

7. Aada 3.0 ml de sangre diluida a los tubos 1, 3 y 4. 8. Controle su bao de agua a 37C o utilize el bao de agua del laboratorio a temperatura controlada. 9. Suave, pero rpidamente, agite los tubos y llvelos al bao de agua a 37C. La reaccin de la Catalasa es sumamente rpida, as que no hay que perder de vista ni un momento los tubos, sobre todo el nmero 1 donde est la reaccin normal sin inhibir. 10. Deje todos los tubos en el bao de agua a 37C por cinco minutos . 11. Haga sus observaciones y anote sus resultados.

Lo que se realiz en esta primera parte de la practica fue: Observar la gran actividad de la enzima Catalaza, normal e inhibida.

Deshidrogenasa Lctica 1. 2. 3. 4. Coloque en la gradilla tres tubos de ensaye y numrelos. Agregue 5 ml de azul de metileno al 0.02% a cada uno de los tres tubos. Agregue diez gotas de lactato de sodio al 5% a los tubos 1 y 2. En un tubo de ensaye aparte, coloque 5 ml de suspensin de levadura al 20% y calintela en un bao de agua hirviendo por cinco minutos. Vace el contenido al tubo 2. Agregue 5ml de suspensin de levadura, sin calentar, a los tubos 1 y 3. Mezcle bien y, si es posible, cubra los tubos con una capa, no mayor de dos milmetros, de aceite mineral. Al hacerlo, incline los tubos para que el aceite resbale lentamente por la pared del tubo. Coloque los tubos en un bao de agua a 37C y observe el resultado a los 3, 6, 12, y 15 minutos. Haga sus observaciones y anote sus resultados.

5. 6.

7. 8.

En esta segunda parte se aprendi a: Observar la gran actividad de la enzima Deshidrogenasa Lctica normal e inhibida

Reactivos Peroxido de hidrogeno al 3% (200ml) Agua oxigenada al 30%.............20 ml Agua destilada hasta aforar a200ml Cianuro de sodio al 5% (100ml) Cianuro de sodio.. 5 gr Agua destilada.100 ml Nitrato de plomo al 5% (100 ml) Nitrato de plomo.. 5 gr Agua destilada100 ml Azul de metileno al 0.02% (300 ml) Azul de metileno.60 mg Agua destilada..300 ml Lactato de sodio al 5% ....(100 ml) Lactato de sodio al 30%..............16.6 ml Agua destilada, hasta aforar a .100ml Suspensin de Levadura al 20% (300 ml) levadura60 gr. Agua destilada..300 ml. Aceite mineral (100 ml)

Datos experimentales obtenidos Haga un cuadro resumen de la reaccin de la Catalasa donde se vea claramente los reactantes que contena cada tubo. En ese mismo cuadro anote cul fue la reaccin en cada uno de los tubos.

Contenido del tubo 1.Peroxido de hidrogeno 3% Sangre diluida 2. Peroxido de hidrogeno 3% Sangre diluida caliente 3. Peroxido de hidrogeno 3% Sangre diluida Cianuro de sodio 5% Peroxido de hidrogeno 3% Sangre diluida Nitrato de plomo 5%

Reaccin de la catalasa Efervescencia instantnea, formacin de una espuma blanca. Formacin de un sedimento color caf, no haba efervescencia Cambio a color caf, no hubo efervescencia

Se torn turbia la solucin y hubo muy poca efervescencia, al aumentar la temperatura a 37 aumento la efervescencia

Cul fue la diferencia entre el tubo de la reaccin normal y los tubos con la reaccin inhibida? Inhibicin con cianuro: cambio a color caf y no hubo efervescencia Inhibicin con nitrato: Se torn turbia la solucin y hubo muy poca efervescencia, al aumentar la temperatura a 37 aumento la efervescencia Inhibicin con calor: Se formaba un sedimento color caf y no haba efervescencia

Haga un cuadro resumen de la reaccin de la deshidrogenasa lctica donde se vea claramente lo que cada uno de los tubos contena de los reactivos. En ese mismo cuadro anote cul fue la reaccin en cada uno de los tubos. Contenido del tubo Lactato de sodio Suspensin de levadura Azul de metileno Lactato de sodio Suspensin de levadura caliente Azul de metileno Lactato de sodio Suspensin de levadura Azul de metileno Reaccin Cambia el fondo a un color azul verdoso reacciono ms, el fondo tena un color amarillo y cambiaba hasta azul obscuro El color es ms verdoso y claro Reacciono menos El color va igual que el primer tubo pero reacciono menos

Tiempo para que la reaccin se complementara en el tubo 1: 3 min Tiempo para que la reaccin se completara en el tubo 2: 6 min Tiempo para que la reaccin se completara en el tubo 3: 9 min Conclusin: Las enzimas catalizan las reacciones haciendo que estas se lleven a cabo ms rpido, pero hay inhibidores que impiden que las enzimas lleven a cabo su trabajo como catalizadoras, esto pudimos observarlo en esta prctica que llevamos a cabo.

Fundamento de las reacciones Reaccin catalizada por la Catalasa:

La catalasa (E.C. 1.11.1.6. Perxido de hidrogeno: perxido de hidrogeno oxidoreductasa) es una enzima con un grupo hemo, cuya funcin es la destruccin del perxido de hidrogeno, producto de varias oxidaciones biolgicas. La descomposicin del perxido de hidrogeno se puede considerar como la oxidacin de una molcula por otra. La reaccin es: 2H2O2
CATALASA

O2 + 2 H2O

Reaccin catalizada por la Deshidrogenasa Lctica:

Lactato deshidrogenasa es una enzima que cataliza la reduccin reversible del piruvato a lactato, utilizando la coenzima NADH como agente reductor. Algunos autores llaman esta reaccin como la ultima de la glucolisis; y sucede cuando la cantidad de oxigeno es limitada, como en el musculo durante la actividad fsica. Esto la diferencia de otras formas fermentativas anaerobias del catabolismo de los carbohidratos. La forma enzimtica ms comn tiene un peso molecular de 140,000 pero todas las de los vertebrados estn formadas por tetrmeros, con cuatro sitios catalticos independientes de cada tetrmero. CH3COCOO- + NADH + H+ --------------->CH3CH2OCOO- + NAD+

Cuestionario 1. Cul es el efecto del cianuro y del nitrato de plomo en la reaccin de la Catalasa? La catalasa tiene un peso molecular de 250,000 con cuatro grupos heme y un tomo de hierro en el centro de cada heme. El cianuro se combina con el hierro presente en la molcula de la catalasa, por lo tanto tiene un efecto inhibidor. 2. Cul fue la fuente de la enzima en la reaccin de la Catalasa? De los glbulos rojos de la sangre que utilizamos en la prctica. 3. Cul es la funcin normal de la Catalasa en el organismo humano? La conversin del perxido de hidrogeno en agua que se genera como producto secundario de las reacciones oxidativas de los peroxisomas. Tambin utiliza al perxido de hidrogeno para oxidar otros sustratos. 4. Para qu se agrega lactato de sodio a los tubos 1 y 2 en la reaccin de la Deshidrogenasa Lctica? Porque normalmente la reaccin es muy lenta, as que agregamos ms lactato para que se acelere la reaccin y podamos ver el cambio de color ms fcilmente.

5. Qu funcin tiene el azul de metileno en la reaccin de la Deshidrogenasa Lctica? El azul de metileno se utiliza como aceptor de hidrogeno, pues posee la propiedad muy til de cambiar de color al pasar de oxidado a reducido. Es azul de metileno cuando esta oxidado y blanco (incoloro) de metileno cuando esta reducido. 6. Qu sustancia usa el organismo humano en vez del azul de metileno en la reaccin de la Deshidrogenasa Lctica? Sal frrica de la 1-10 ortofenantrolina, cido difenilaminosulfnico.

Bibliografia Practicas de Bioquimica II. Eva Irma Vejar Rivera, Jesus Ruben Garcilazo P.