LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM BIOANALISIS PERCOBAAN 3 PENETAPAN KADAR KARBOHIDRAT TOTAL

Disusun oleh: Kelas/Golongan/Kelompok: 2010B/II/I 1. M. Fikarrotala 2. Maulina 3. Nurlaili Agustine 4. Fitri Aprilia Junaedi 5. Shinta Puspitasari G1F010040 G1F010042 G1F010044 G1F010046 G1F010048

Asisten : Soraya D.

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU-ILMU KESEHATAN JURUSAN FARMASI PURWOKERTO

2013

Percobaan 4 Penetapan Kadar Karbohidrat Total

A. Tujuan Percobaan Mahasiswa dapat melakukan penetapan kadar karbohidrat total menggunakan metode Enzimatik. B. Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah tabung reaksi, mikropipet, dan spektrofotometer uv-vis. Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah reagen, standar kolesterol, serum darah, dan aquadest. C. Prosedur Percobaan Blanko Aquadest diambil 20 L ditambahkan reagen sebanyak 2000 L dicampur diinkubasi selama 20 menit pada suhu 20-25oC atau 10 menit pada suhu 37oC - dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum di daerah visibel (=500 nm) Data

Sampel/Standar Sampel/standar diambil 20 L ditambahkan reagen sebanyak 2000 L dicampur diinkubasi selama 20 menit pada suhu 20-25oC atau 10 menit pada suhu 37oC - dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum di daerah visibel (=500 nm) Data

D. Data Percobaan dan Perhitungan Data Percobaan = 500 nm Absorbansi standar : 0, 836

Absorbansi sampel 1 : - 0,970 Absorbansi sampel 2 : 0,300 Absorbansi sampel 3 : 0,077 Absorbansi sampel 4 : 0,064

Perhitungan - Sampel 1 Konsentrasi kolesterol = = x konsentrasi standar (mg/dL) x 100 mg/dL

= -116,029 mg/dL - Sampel 2 Konsentrasi kolesterol = = x 100 mg/dL x konsentrasi standar (mg/dL)

= 753,588 mg/dL - Sampel 3 Konsentrasi kolesterol = = x 100 mg/dL x konsentrasi standar (mg/dL)

= 9,211 mg/dL - Sampel 4 Konsentrasi kolesterol = = x 100 mg/dL x konsentrasi standar (mg/dL)

= 7,656 mg/dL

- Konsentrasi kolesterol rata-rata = =

= 385.037,50 mg/dL - SD dan CV SD = 358,254

Jadi, konsetrasi kolesterol yang di dapat adalah sebesar 358,254 221,621 mg/dL

E. Pembahasan Penentuan kadar kolesterol dilakukan dalam beberapa tahap, diantaranya yakni mempersiapkan larutan baku pembanding (standar) atau biasa kita kenal sebagai larutan Blanko. Larutan blanko diambil dari reagen kit kolesterol untuk perbandingan sampel dengan larutan baku satndar. Reagen kit yang digunakan kali ini berisi Goods buffer digunakan sebagai penyeimbangan pH dalam darah. Fenol dan 4aminoantypirine dapat menghasilkan senyawa quinoneimine yang dapat

menghasilkan warna. Kolesterol oksidase digunakan untuk mengoksidasi kolesterol bebas menjadi kolestenon(kolesterol 3-one) dan menghasilkan Hidrogen peroksida, sedangkan kolesterol esterase digunakan untuk menghidrolisis kolesterol ester menjadi kolesterol bebas dan asam lemak. Larutan baku standar dimasukkan ke dalam tabung reaksi dengan menggunakan alat khusus yang kita ketahui yakni mikroipet. Alat yang biasa digunakan untuk mengambil sampel maupun larutan baku standar adalah dengan menggunakan mikropipet. Mikropipet yang digunakan juga mempunyai variasi volume yang bereda-beda. Dalam praktikum ini kami menggunakan mikropipet yang mempunyai ukuran 20 l. Larutan blanko yang sudah dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian disimpan (inkubasi) selama 10 menit agar terjadinya reaksi yang optimal minimal pada suhu ruangan (15-25 oC).. Proses inkubasi ini bertujuan memberikan waktu untuk terjadinya reaksi antara kedua larutan dalam campuran tersebut. Pengukuran blanko perlu dilakukan karena dikhawatirkan terjadi perubahan reagen pada saat inkubasi dan memberikan serapan pada panjang gelombang pengukuran. Saat proses inkubasi, terjadi reaksi antara reagen dengan kolesterol yang terdapat pada larutan standard dan sampel. Setelah diinkubasi, kedua larutan yang tadinya berwarna bening dalam masing-masing kuvet berubah menjadi warna merah rosa. Warna merah tersebut menandakan telah terjadinya reaksi antara enzim dengan kolesterol. Warna merah tersebut berasal dari senyawa quinoneimine, yang merupakan hasil reaksi antara reagen dan kolesterol (Day,2002).

Blanko

yang

sudah

disimpan

kemudian

diperiksa

oleh

instrumen

spektofotometri untuk mengetahui panjang gelombang () yang nantinya akan digunakan dalam pemeriksaan sampel..Setelah itu lalu masuk ke dalam perlakuan sampel darah yang akan digunakan dalam pemeriksaan kali ini. Sampel terbaik adalah serum (berasal dari yang tidak hemolisis). Sama seperti pada blanko sampel juga didiamkan 10 menit agar terjadinya reaksi yang optimal minimal pada suhu ruangan (15-25 oC). Sampel dibaca pada spektrofotometri pada gelombang visible =500nm dan menghasilkan absorbansi.

F. MONOGRAFI 1. Phosphate Buffer

Rumus Molekul : H4NaO5P Berat Molekul : 137,992291 Densitas : 2,04 g/cm3 Sensitive : Higroskopis Stabilitas : stabil dibawah kondisi normal (Msds, 2011). 2. Phenol

Fenol (C6H5OH), mengandung tidak kurang dari 99,0 %. Pemerian hablur bentuk jarum atau massa hablur : tidak bewarna atau merah jambu; bau khas; kaustik. Kelarutan larut dalam 12 bagian air; mudah larut dalam etanol, kloroform, eter, gliserol, dan minyak lemak. Penyimpanan dalam wadah tertutup rapat, terlindung dari cahaya, ditempat sejuk. Khasiat dan penggunaan antiseptikum-ekstern (Anonim, 1979).

3. 4-aminoantypirine

Rumus Molekul : C11H13N3O Berat Molekul : 203,24 Titik Leleh : 105-110o C Titik Didih : 340o C Densitas : 0,8 g/cm3 Kelarutan : larut dalam air Sensitive : Higroskopis Stabilitas : Stabil dibawah kondisi normal Inkompatibilitas : agen oksidasi kuat, asam kuat (Msds, 2005). 4. Glucose Oxidase

Reagent ini digunakan untuk diagnosa in vitro penentuan kuantitatif glukosa dalam serum, plasma atau urin manusia. Penyimpanan di tempat yang dingin dan terhindar dari sinar matahari secara langsung, jangan disimpan dengan asam mineral kuat, tembaga, mercuri, perak dan agen oksidasi. Reagent yang sudah dibuka stabil jika disimpan pada suhu 2-8o C. Pemerian serbuk putih tanpa rasa, tidak larut dalam air, pH 7,1 0,1. Stabil dibawah kondisi normal yang digunakan. Inkompatibilitas dengan asam mineral kuat (sulfur, nitrat dan hidrocloric) (Msds, 2009).

5. Peroxidase

Warna serbuk coklat-kemerahan atau merah muda gelap, larut dalam air. Penyimpanan pada suhu -20o C, jangan disimpan dengan bahan yang inkompatibel. Hindari kontak dengan mata, kulit, dan inhalasi (Msds, 2008). 6. Glukosa

Glukosa mengandung tidak kurang dari 99,0 % dan tidak lebih dari 101,5 % C6H12O6 dihitung terhadap zat yang telah dikeringkan. Pemerian, hablur tidak berwarna, serbuk, hablur atau butiran putih; tidak berbau; rasa manis. Kelarutan, mudah larut dalam air; sangat mudah larut dalam air mendidih; agak sukar larut dalam etanol (95 %) P mendidih; sukar larut dalam etanol (95 %) P. Penyimpanan dalam wadah tertutup baik. Khasiat dan penggunaan, kalorigenikum (Anonim, 1979). G. Hasil vs pustaka Pada proses pengambilan larutan, yaitu aquadest, reagen, dan sampel dilakukan dengan menggunakan mikropipet (pipet piston). Hal ini dikarenakan jumlah larutan yang diambil sangat sedikit yaitu 20 L. Sebelum pipet piston digunakan, bagian atas pipet yang disebut thumb knob sebaiknya ditekan berkali-kali untuk memastikan lancarnya mikropipet. Setelah itu tip bersih dimasukkan ke dalam nozzle / ujung pipet piston sampai pas (tidak jatuh). Thumb knob ditekan sampai hambatan pertama / first stop, jangan ditekan lebih ke dalam lagi karena cairan yang terambil akan lebih besar daripada jumlah yang sebenarnya. Setelah itu, tip dimasukkan ke dalam cairan sedalam 3-4 mm karena jika kurang dari nilai tersebut dikhawatirkan

cairan tidak terambil sempurna (ada gelembung udara yang terambil), sedangkan jika lebih dari nilai tersebut dikhawatirkan terdapat kontaminan dari tip pipet. Selanjutnya pipet ditahan dalam posisi 8 standard kemudian tekanan dari thumb knob dilepaskan sehingga cairan masuk ke tip. Ujung tip dipindahkan ke dalam kuvet. Untuk mengeluarkan cairannya, thumb knob ditekan sampai hambatan kedua / second stop atau ditekan semaksimal mungkin sehingga semua cairan keluar dari ujung tip. Pipet piston digunakan dalam percobaan ini karena memiliki ketelitian, sensitivitas, dan spesifisitas yang tinggi bila dibandingkan dengan pipet gelas. Pada kuvet blanko, setelah dimasukkan aquadest dan larutan reagent, kuvet digoyang agar larutan tercampur secara sempurna. Setelah itu kuvet diinkubasikan pada suhu ruang yaitu 27oC selama 10 menit. Proses inkubasi ini bertujuan memberikan waktu untuk terjadinya reaksi antara kedua larutan dalam campuran tersebut. Inkubasi ini juga dilakukan untuk kuvet 8 standard an kuvet sampel. Pengukuran blanko perlu dilakukan karena dikhawatirkan terjadi perubahan reagen pada saat inkubasi dan memberikan serapan pada panjang gelombang pengukuran. Saat proses inkubasi, terjadi reaksi antara reagen dengan kolesterol yang terdapat pada larutan 8tandard an sampel. Setelah diinkubasi, kedua larutan yang tadinya berwarna bening dalam masing-masing kuvet berubah menjadi warna merah rosa. Warna merah tersebut menandakan telah terjadinya reaksi antara enzim dengan kolesterol. Warna merah tersebut berasal dari senyawa quinoneimine, yang merupakan hasil reaksi antara reagen dan kolesterol (Day,2002). Reaksi yang terjadi yaitu sebagai berikut:

(Wirahadikusumah,1985). Hydrogen peroksida + 4-aminoantipyrene + fenol + 4H2O (Wirahadikusumah,1985). quinonimine(merah)

Perubahan warna (menjadi berwarna merah) diperlukan agar campuran larutan dapat diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis, khususnya dengan sinar visibel. Quinoeimine akan terukur absorbansinya pada panjang gelombang 498 nm dan nilai absorbansi tersebut sebanding dengan kadar kolesterol dalam darah. Setelah inkubasi selesai, masing-masing larutan blanko, standard dan sampel diukur absorbansinya dengan spektrofotometer. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang 498 nm yang merupakan panjang gelombang

maksimum untuk quinoeimine. Untuk larutan sampel, pengukuran dilakukan sebanyak empat kali agar kesalahan pada saat pengukuran dapat dihindari sehingga hasilnya lebih akurat. Ketiga hasil yang didapat dirata-ratakan dan dihitung kadar kolesterol dalam sampel (Nilawati,2008). Absorbansi yang diperoleh pada saat pengukuran larutan sampel adalah 0,612 ; 0,061 dan 0,332. Sedangkan absorbansi larutan standar 200mg/dl adalah 0,214. Nilai dari kedua absorbansi tersebut dapat digunakan untuk menghitung kadar kolesterol dalam sampel dengan menggunakan rumus :

(Nilawati,2008).

KESIMPULAN Kolesterol adalah suatu zat lemak yang beredar di dalam darah, diproduksi oleh hati dan sangat diperlukan oleh tubuh. Hasil praktikum ini didapatkan rata-rata kadar kolesterolnya dalam darah yaitu 313,084 257,488 Dari data tersebut diketahui bahwa sampel darah manusia yang digunakan dalam percobaan memiliki nilai yang lebih dari rentang daerah batas normal.

DAFTAR PUSTAKA .

Anonim. 1979. Farmakope Indonesia Edisi Ketiga. Depkes RI. Jakarta. Day, R. A. and A. L. Underwood, 2002, Analisis Kimia Kuantitatif, Penerbit Erlangga, Jakarta. Msds.2005. Material Safety Data Sheet, 4-aminoantypirine. http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927068 diakses tanggal 27 Mei 2013. Msds. 2008. Material Safety Data Sheet, Peroxidase Ex. Horseradish. http://www.setonresourcecenter.com/msdshazcom/htdocs//MSDS/G/genzyme/Perox idase-RZ%202.0.pdf diakses tanggal 27 Mei 2013.

Msds.

2009. Material Safety Data Sheet, Glucose Oxidase HP S100. http://www.setonresourcecenter.com/msdshazcom/htdocs/MSDS/G/genzyme/Glucos e%20Oxidase%20HP%20S100.pdf diakses tanggal 27 Mei 2013. 2011. Material Safety Data Sheet, Phosphate Buffer. http://www.cellsignal.com/support/msds/9872_pbs1x_MSDS.pdf diakses tanggal 27 Mei 2013.

Msds.

Nilawati, S., Krisnatuti, D., Mahendra, B., Djing, OG., 2008, Care Yourself Kolesterol, Penebar Plus, Jakarta. Wirahadikusumah. 1985, Metabolisme Energi, Karbohidrat & Lipid, ITB Press, Bandung. .